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Neuroscience

Recombinante α-β - et γ-Synucleins stimuler l’activité de protéine Phosphatase 2 a sous-unité catalytique en essais libres de cellules

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Cette publication présente un protocole indiquant comment mesurer l’activité de la sous-unité catalytique de la 2 a phosphatase protéine recombinante (PP2Ac) en réponse à recombinant synucléine α, β-synucléine ou γ-synucléine protéines à l’aide d’un simple Dosage colorimétrique. Nous montrons des constatations relatives à la spécificité de la synucléine α vers PP2Ac dans le cerveau de souris.

Abstract

Α-synucléine (asynchrone), β-synucléine (bSyn) et γ-synucléine (gSyn) sont membres d’une famille conservée des protéines semblables à ceux chaperon qui sont fortement exprimée dans les tissus neuronaux vertébrés. De le trois synucleins, seulement asynchrone a été fortement impliqué dans les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy et atrophie. En étudiant la fonction asynchrone normale, les données indiquent qu’asynchrone stimule l’activité de la sous-unité catalytique de l’enzyme de dephosphorylating abondamment exprimée, PP2Ac in vitro et in vivo. Données préalables montrent que l’agrégation asynchrone dans le cerveau humain réduit PP2Ac l’activité dans les régions où la pathologie de corps de Lewy, où soluble asynchrone est devenu insoluble. Cependant, parce que tous les trois synucleins ont une forte homologie avec les séquences d’acides aminés, les expériences ont été conçues pour tester si tous peuvent moduler l’activité PP2Ac. En utilisant synucleins recombinante et protéine recombinante de PP2Ac, l’activité a été évaluée par dosage colorimétrique de vert de malachite. Les données ont révélé que tous les trois synucleins recombinants stimulée PP2Ac l’activité dans les essais acellulaire, évoquant la possibilité que l’homologie conservée entre synucleins peut doter tous les trois homologues avec la capacité de lier et activer le PP2Ac. Co-Immunoprécipitation, cependant, suggèrent que PP2Ac modulation susceptible se produit grâce à des interactions endogènes entre asynchrone et PP2Ac in vivo.

Introduction

Études de définition de la distribution des synucleins dans le cerveau et la moelle épinière Voir la que tous les trois synucleins sont enrichis dans les tissus nerveux, bien que divers modèles de localisation ont été signalés1. Par exemple, asynchrone est la plus abondante sur les sites présynaptiques dans le cortex cérébral et des ganglions de la base de2,3, bSyn a une distribution plus uniforme dans le cerveau et la moelle épinière4,5, et gSyn est plus abondant dans la moelle épinière et les ganglions périphériques6. Bien que certaines expression embryonnaire de tous les synucleins peut-être se produire, les trois homologues deviennent plus abondantes au cours de la période néonatale4,5,,6,7,8. Remarquablement, données de souris synucléine triple, indiquer que la perte de tous les trois synucleins provoque âge apparition dysfonction neuronale9, soutenir les fonctions de la synucléine important dans le système nerveux central (SNC)10, 11. on ne sait pas encore si la synucléine triple souris montrent des changements dans la distribution PP2Ac ou activité. Données de souris knock-out synucléine unique révèlent que la perte du seul asynchrone est capable de réduire de façon significative l’activité PP2Ac dans le cerveau de12. En plus de la CNS, synucleins tous les localiser dans d’autres tissus dans le corps de14,13,15.

En raison de ses liens génétiques bien établie à neurodégénérescence16,17, asynchrone est parmi les meilleurs étudié des trois synucleins. Le laboratoire de Perez a travaillé longtemps pour définir les activités fonctionnelles normales d’asynchrone, en particulier dans le CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 et plus récemment dans les tissus périphériques24,25. Parmi ces derniers, a été la découverte qu’asynchrone joue un rôle réglementaire en stimulant de l’activité de PP2Ac19. PP2A activité contribue largement au fonctionnement normal du cerveau, y compris pour la régulation de la production de dopamine26. L’holoenzyme PP2A est constituée de trois sous-unités indépendantes, la sous-unité catalytique de la C, PP2Ac, une sous-unité d’échafaudage A et celle de plusieurs différentes réglementation/ciblage sous-unités B qui aident à localiser PP2A à spécifiques microdomaines subcellulaires, fournissant ainsi PP2A la diversité fonctionnelle27. Éléments de preuve montrent que les interactions asynchrone avec PP2Ac contribuent significativement à la phosphatase activité in vitro et in vivo12,19,21,23, 25. Lorsque asynchrone s’accumule dans les agrégats de protéines, comme il le fait quand Lewy corps forme à l’intérieur des neurones de la maladie de Parkinson et de démence à corps de Lewy (DLB), tissus avec asynchrone agrégé ont diminué de PP2Ac activité23,25, lorsque niveaux d’asynchrone soluble diminuent. Étant donné que tous les trois synucleins ont une importante homologie28 (asynchrone partage 66 % d’identité avec bSyn et 56 % avec gSyn) et celui asynchrone contribue à l’activation de PP2Ac, il a émis l’hypothèse que tous les membres de la famille des protéines synucléine peuvent être en mesure de augmenter l’activité PP2Ac, au moins in vitro. Pour déterminer cela, a mesuré l’activité de PP2Ac en réponse à recombinant asynchrone, bSyn et gSyn à l’aide d’un simple Dosage colorimétrique, modelé d’après la méthode de Fathi al 29. cette méthode et les nouveaux résultats sont décrits dans les présentes.

Protocol

1. préparation des tampons et réactifs

  1. Préparation du tampon de p-nitrophényl phosphate (pNPP)
    1. Préparer 50 mL de tampon de pNPP comme suit.
    2. Peser à base de Tris 0,30285 g (voir la Table des matières) et dissoudre dans 25 mL d’eau désionisée ultrapure.
      1. Ajouter 41,6 µL de 120 mM CaCl2. Ajuster le pH 7.0 avec 1 M HCl et porter le volume de la solution finale à 50 mL avec de l’eau déionisée ultrapure.
      2. S’assurer que la concentration finale est 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0.
      3. Stocker un tampon pNPP à 4 oC.
  2. Pour les solutions de vert de malachite, préparer ce qui suit.
    1. Préparer les solution A en ajoutant 32,8 mL d’HCl concentré à 67,2 mL d’eau désionisée ultrapure pour créer une solution de HCl de 4 M.
      NOTE : Solution de Malachite est préparée dans une hotte de laboratoire à l’aide de gants à usage unique-masque et des lunettes de sécurité.
    2. Préparer la solution B de peser les 4,2 g de molybdate d’ammonium et l’ajout de 95,8 mL de la solution A.
    3. Préparer la solution C en peser les 0,045 g malachite oxalate de vert de sel et en ajoutant de l’eau déionisée ultrapure pour porter le volume total final à 100 mL.
    4. Préparer la solution D en mélangeant des solutions B et C au rapport de 1:3 (v/v), remuez pendant 1 h à température ambiante.
    5. Filtrer une 0,22 µm pore nitrocellulose membrane filtre unité de taille à l’aide d’une seringue de 50 mL de Solution D .
    6. Stocker la solution malachite préparés à 4 oC à l’abri de la lumière.
  3. Préparation de l’activateur
    1. Pour préparer un 1 % solution de tween 20, prélever 10 µL de tween 20 dans 990 µL d’ultrapure (v/v) d’eau désionisée puis vortex jusqu'à ce que le tween 20 se dissout complètement.
  4. Préparation de la solution de travail de Tween 20 (MTB) de vert de malachite.
    1. Mélanger l’activateur (étape 1.3) avec la solution de vert de malachite (solution D, étape 1.2.5) dans une proportion de 1/100 (par exemple 1 µL de l’activateur à 99 µL de solution de vert de malachite).
  5. Préparation de thréonine phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) substrat.
    1. Pour préparer un lieu de stock, de 2 mM dans une cuvette de phosphopeptide 1 mg sur la glace, ajouter 550 µL d’eau déionisée ultrapure et vortex doucement pour dissoudre.
      1. Faire ~ 10 aliquotes et stocker pT-20oC.
  6. Préparation de la synucléine
    1. Préparer synucleins dans une hotte de laboratoire à l’aide de gants à usage unique-masque et des lunettes de sécurité.
    2. Remettre en suspension de 1 mg de recombinant synucléine dans 1 mL d’eau désionisée ultrapure pour une concentration finale de 1 mg/mL.
    3. Vortex doucement pour dissoudre et placez sur la glace.
    4. Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-80 oC.
  7. Élaboration de normes de phosphate
    1. Préparer la solution mère de phosphate 0,1 mM comme suit.
      1. Peser 0,1361 g KH2PO4 et placer dans un bécher avec 80 mL d’eau désionisée ultrapure. Ajouter une barre de remuer et mélanger pour dissoudre. Transférer l’ensemble de la solution à une éprouvette graduée et porter le volume total final à 100 mL avec de l’eau déionisée ultrapure.
      2. Filtrer la solution entière à travers une 0,22 µm pore nitrocellulose membrane filtre unité de taille à l’aide d’une seringue de 50 mL ; la concentration finale est de 10 mM.
      3. Diluer la solution (10 mM) 1/100 ; la concentration finale sera phosphate 0,1 mM (PO4) à utiliser pour les normes d’essai.
      4. Stocker la solution mère de phosphate à 4 oC.
    2. Voir le tableau 1 pour limiter les dilutions utilisées pour rendre les normes4 PO avec un volume total de 1250 µL de chaque. Ajouter la quantité appropriée de phosphate et d’eau déionisée ultrapure à 1,5 mL tubes conformément au tableau 1.
      1. Magasin établi des normes de4 PO à-20 oC.
Normes de phosphate
solution de 0,1 mM PO4 (mL) 0 75 150 300 600 1 200
Eau déionisée ultrapure (mL) 1 250 1 175 1 100 950 650 50
Concentration finale de PO4 [pmol] 0 150 300 600 1 200 2 400

Tableau 1 : Normes de Phosphate.

2. PP2A Assay en réponse à Synucleins Recombinant

Remarque : Le volume total final de chaque réaction sera 60 µL, donc l’expérimentateur doit ajuster le volume initial de pNPP tampon appropriée pour tenir compte du volume de synucleins utilisé pour chaque échantillon. Dans la plupart des cas, le volume de tampon pNPP se situera entre 40 et 44 µL.

  1. Préparer chaque réaction PP2Ac comme suit.
    1. Dans un tube de 1,5 mL, ajouter 39 µL de tampon de pNPP et place sur la glace.
    2. Ajouter 1 µL (ng/µL 105 ou 0,0007 U/µL) de PP2Ac recombinante humaine (rPP2Ac).
    3. Ajouter 4 µL de 0, 1,5, 7.5, 15 ou 30 µM synucleins à rPP2Ac dans un tampon pNPP pour la concentration finale de 0, 0,1, 0,5, 1,0 et 2,0 µM et incuber à 4 ° C pendant 30 min sur une unité de rotation ; le volume final sera 60 µL.
    4. Après 30 min, déplacer des échantillons de glace et d’ajouter 16 µL de substrat de pT de 2 mM.
    5. Incuber à chaque mélange de dosage PP2A pendant 10 min à 30 ° C dans un bain-marie avec agitation intermittente.
    6. Dans une plaque à 96 puits, fond plat ajouter 25 µL de chaque PO4 standard (0, 150, 300, 600, 1 200 et 2 400 pmol) dans les puits dédoublés de faible à élevé.
    7. Ensuite ajoutez 25 µL de l’échantillon expérimental (PP2A dosage ± synucléine), préparé en étapes 2.1.1 à 2.1.6, de doubler les puits sur la même plaque de 96 puits.
    8. Ensuite, ajoutez 75 µL de solution de travail MGT à chaque cupule contenant les échantillons et étalons.
    9. Laisser la plaque à température ambiante pendant 10 min.
    10. Observez une couleur changent dans les échantillons ayant des différences mesurables au niveau de phosphate.

3. analyse photométrique

  1. Analyser la plaque à 96 puits contenant des normes et des échantillons à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique avec la longueur d’onde définie à 630 nm29.
  2. Tracer la courbe d’absorbance produite (échantillons lire à 630 nm) et note qu’il reste linéaire jusqu'à 2 400 pmol concentration de PO4.

Representative Results

L’activité et la fonction des protéines peuvent être modifiées par des modifications post traductionnelle, telles que la phosphorylation. Beaucoup de protéines peut être phosphorylée par une kinase ou déphosphorylé par une phosphatase. Dans le cas de la protéine phosphatase 2 a (PP2A), cette détermination phosphatase facilite la déphosphorylation des résidus sérine et thréonine sur un grand nombre des phosphoprotéines. Activité anormale de PP2A peut conduire à une dysrégulation de la fonction des protéines qui se produit dans de nombreuses maladies, y compris la maladie de Parkinson où asynchrone peut devenir hyperphosphorylée, et dans la maladie d’Alzheimer où la protéine tau peut devenir hyperphosphorylée. Il fourni une justification pour optimiser une procédure interne pour rapidement évaluer l’activité PP2Ac et déterminer si une activité anormale PP2Ac peut conduire à un dysfonctionnement cellulaire.

À l’aide de ce dosage colorimétrique acellulaire, PP2Ac a mesuré l’activité de quantifier la quantité de libre PO4 clivée du substrat pT (Figure 1 a) et par rapport aux quantités picomoles connues de PO4 dans la courbe d’étalonnage (Figure 1 b ). PP2Ac activité a été également mesurée en réponse à 0,0 0,1, 0,5, 1,0 et 2,0 µM synucleins (Figure 1 a), par rapport à l’activité de la base PP2Ac en l’absence de synucléine ajouté (à la grande flèche Figure1 a).

Figure 1
Figure 1 : Activation PP2A par recombinaison synucleins, est mesurée par rapport aux niveaux de phosphate dans les normes. (A) asynchrone, bSyn et gSyn ont été évaluées dans une plage de 0 - 2 µM concentrations des protéines, à comparer à 0 - 2400 pmol PO4 normes. (B) une courbe d’étalonnage pour le dosage de PP2Ac vert malachite a été généré afin de fournir des quantités connues de phosphate contre lequel les valeurs obtenues dans des conditions expérimentales peuvent être calculés. Dans tous les cas, lorsque l’activité de la PP2Ac augmente, la quantité de libre PO4 clivée du substrat pT augmente et produit une couleur verte plus foncée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les résultats montrent qu’ajout de synucleins à PP2Ac à l’étape initiale d’incubation pourrait augmenter la quantité de libre PO4 mesurée, démontrant ainsi l’augmentation de l’activité PP2Ac. L’analyse statistique après de nombreuses répétitions montrent que tous les trois synucleins recombinantes (asynchrone, bSyn, gSyn) augmenter significativement l’activité PP2Ac (Figure 2). Ces résultats suggèrent que des fluctuations de synucleins cellulaires solubles peuvent modifier l’activité de PP2Ac ; et donc peuvent avoir une incidence homéostasie cellulaire. On ne sait pas, cependant, si tous les trois synucleins contribuent à l’activation du PP2Ac en vivo, bien que les données à la Figure 3 suggèrent qu’asynchrone susceptible contribue à PP2Ac activité in vivo.

Figure 2
Figure 2 : PP2Ac activité est stimulée par toutes les trois synucleins. Représentation graphique de l’activation de PP2Ac en réponse à diverses concentrations de recombinant asynchrone, bSyn ou gSyn est montrée. Tous les trois synucleins recombinants stimulé l’activité PP2Ac. Asynchrone dans la plupart des expériences semble être légèrement plus puissant, bien qu’ANOVA effectuée à l’aide de logiciels statistiques était remarquablement semblables dans l’ensemble. Les données représentent la moyenne ± SEM de 4-9 expériences indépendantes. ns, non significatif ; p < 0,05 ; p < 0,01 ; p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Afin d’évaluer quel synuclein(s) peut interagir avec PP2Ac dans le cerveau, les co-immunoprécipitation (Co-IP) analyses ont été effectuées à l’aide de cerveau de souris de type sauvage et la PP2Ac--anticorps spécifique, 1 6. Protéines ont ensuite été séparés par SDS-PAGE et taches ont été sondés pour PP2Ac, asynchrone, bSyn et gSyn à l’aide de méthodes reconnues,19. Recombinant synucléine contrôles montrent spécificité de l’anticorps asynchrone, bSyn et gSyn (Figure 3 a). Co-IP données révèlent que la synucléine majeur associé à PP2Ac dans le cerveau est asynchrone, car beaucoup moins bSyn est descendu dans le co-IP (Figure 3 b), et aucun gSyn n’est descendu dans le Co-IP (données non présentées). Ceci suggère un rôle distinct pour asynchrone endogène dans la régulation de PP2Ac dans le cerveau. Il soulève également la possibilité que la modulation PP2Ac avec bSyn--thérapies à base pourrait avoir susceptibles de restaurer l’activité PP2A dans ceux avec synucleinopathy, comme bSyn est connu pour être nonamyloidogenic pourtant, comme montré ici peut stimuler PP2Ac30, 31.

Figure 3
Figure 3 : Interaction de PP2Ac avec synucleins endogène dans le cerveau de souris. (A) recombinante asynchrone, bSyn et gSyn ont été sondés avec des anticorps spécifiques de synucléine tel que décrit ci-dessous. (B) à l’aide de la souris homogénat de cerveau Co-IP a été réalisée avec un anticorps 1 6, puis les échantillons ont été analysés par immunoblot. Les données apparaissent pour PP2Ac, asynchrone et bSyn, mais pas pour les gSyn qui n’a pas de Co-IP avec PP2Ac. Début échantillons montrent des niveaux relatifs de PP2Ac (piste 1), asynchrone (piste 4) et bSyn (voie 7) dans les homogénats initiales. Exemples de fin montrent les niveaux restants de PP2Ac (piste 2), asynchrone (piste 5) et bSyn (voie 8) dans des homogénats après les 6 1 PP2Ac Co-IP. Des niveaux importants de PP2Ac ont été immunoprécipitée à l’aide de 1 6 anticorps (piste 3), qui a également ramené de grandes quantités d’asynchrone (voie 6, à la flèche) mais très peu bSyn (piste 9, fortement surexposée pour afficher bSyn faible signal, à la flèche). * Astérisques et marque la non-spécifiques signaux sur les transferts des crochets. Voir la Table des matières pour plus de détails sur les anticorps utilisés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce test de vert malachite avec pT a été utilisé pour mesurer l’activité de PP2Ac parce qu’il est plus facile à réaliser que la méthode classique, qui utilise des substrats marqués P 32. Un autre avantage de ce test sur des essais radioactifs est que radio-isotopes présentent certains risques et peuvent être coûteux, surtout 32de molécules marquées P qui ai courte demi-vie, qui limite le nombre d’essais, on peut effectuer avant réactifs n’expirent. À l’aide de vert de malachite, plutôt que la radioactivité élimine également le besoin de disposer de 32P déchets. Tests de vert de malachite sont également très sensibles lors de la mesure de l’activité des sérine/thréonine phosphatases par rapport à un autre Dosage colorimétrique qui utilise le substrat p-nitrophénylphosphate (pNPP), qui est non sélectif car il peut être déphosphorylé par un grand nombre d’enzymes32.

Kits de vert de malachite commercial pour mesurer l’activité PP2A existent depuis longtemps et ont déjà été utilisées dans le laboratoire. Toutefois, lorsque vous effectuez plusieurs essais de vert de malachite, ces trousses est devenu prohibitifs. En outre, des kits commerciaux pour activité PP2A sont stables seulement pendant un an, tout en ayant des réactifs disponibles en poudre forme et avec bon rangement, fournissent des éléments d’analyse disponibles qui sont structurellement stables pendant de longues périodes de temps.

Avant de tester bSyn et gSyn, asynchrone a été utilisé comme témoin positif pour stimuler l’activité PP2Ac et pour déterminer la quantité de PP2Ac requis pour les tests et aussi pour confirmer que les données qui en résulte restent sur l’échelle de la courbe d’étalonnage (150-2400 pmol de PO4 ). Il est à noter que si asynchrone stimule PP2Ac trop fortement, si la réaction est généralement linéaire, données seront éteint échelle et produits chimiques dans la solution MGT précipitent, rendant impossible de mesurer les quantités exactes sorti libre-PO4 avec une plaque lecteur.

Étant donné qu’asynchrone contribue à PP2Ac activité in vivo et in vitro12,19,21,,du23au25et que tous les synucleins ont une forte homologie avec, il avait été l’hypothèse que tous les membres de la famille synucléine sont susceptibles de stimuler PP2Ac en essais libres sur des cellules. En utilisant le dosage colorimétrique décrit ici, on a constaté qu’en effet, tous les trois synucleins recombinantes (asynchrone, bSyn, gSyn) stimulée PP2Ac activité, ce qui soulève la possibilité que tous les trois synucleins peut exercer des fonctions similaires dans le système nerveux. Cependant, le cerveau de la maladie de Parkinson ou la démence à corps de Lewy cas ont moins d’activité PP2Ac dans les tissus contenant hautement agrégées asynchrone23. Tissus de souris nourrissait Lewy présentent aussi des corps-comme pathologie réduit PP2Ac activité25. Cela, et les nouvelles données à la Figure 3 , ainsi que des données préalables du asynchrone knockout souris12, suggèrent fortement que ni bSyn ni gSyn peut généralement compenser la perte d’asynchrone soluble dans le cerveau, ou, subsidiairement, que ces homologues synucléine ne peuvent pas associer à PP2Ac aussi forte qu’asynchrone comme illustré (Figure 3). L’Atlas du cerveau Allen montre co-localisation des tous les trois synucléine ARNm dans plusieurs régions du cerveau, et bien que les souris knock-out synucléine triple ont été généré9,33, PP2Ac activité n’a pas été évaluée dans ce modèle. Fait intéressant, asynchrone qui est phosphorylé sur Ser129 par Polo-like kinase 2, est moins en mesure d’activer PP2Ac12, mais montré ici pour bSyn suggèrent que la phosphorylation de bSyn est peu probable à l’impact de l’activité PP2Ac, car très peu bSyn est descendu avec PP2Ac dans le cerveau de souris (Figure 3). Pris ensemble, les données suggèrent que PP2Ac endogènes modulateurs de l’activité, comme asynchrone, susceptibles de contribuent au bien-être et à la maladie.

Le protocole décrit ici est une technique simple mais puissante pour déterminer la capacité des PP2Ac à déphosphorylent un substrat phosphopeptide en réponse à divers traitements. Par exemple, cette même méthode peut être utilisée pour tester les autres activateurs de PP2Ac, tels que les céramides ainsi que de nouveaux traitements potentiels34, ou pour évaluer l’impact des inhibiteurs de la PP2Ac in vitro. Il est également important de souligner que des tests similaires peuvent mesurer l’activité de PP2Ac qui a été isolé par 1 6 immunoprécipitation des extraits de cellules ou de tissus de l’organisme, tel que déjà décrits par les auteurs12,19, 25. avenir applications pour le dosage de vert de malachite existent au-delà de mesure de l’activité PP2Ac, comme l’activité ATP peut aussi être déterminée à l’aide d’un tel test.

Remarque, une courbe d’étalonnage doit être générée à chaque fois pour chaque dosage PP2Ac indépendant. Il est obligatoire de s’assurer que tous les réactifs utilisés sont phosphate libre, comme les phosphates gratuits artificiellement augmentent le signal de fond et produisent des résultats erronés. Le jour du test, il est essentiel de préparer la solution MGT assez frais pour tous les échantillons à doser. En outre, MGT est seulement bon le jour où il est fait et a tendance à précipiter après quelques heures. PP2Ac acheté auprès d’un fournisseur doit être aliquoté et stockés congelés peu de temps après sa réception pour empêcher le gel-dégel qui réduisent son activité. Comme autres phosphatases peuvent déphosphorylent le substrat pT (p. ex. PP1 et PP535), lors de l’analyse des extraits cellulaires ou tissulaires dans lequel PP2Ac n’a pas été isolé par immunoprécipitation, les échantillons doivent être passés sur colonnes pour éliminer les phosphates gratuits et des inhibiteurs spécifiques des phosphatases doivent être utilisés pour confirmer la spécificité de la phosphatase, comme précédemment décrit18.

Disclosures

M. Perez a été un membre du corps professoral dans le département de neurologie à l’Université de Pittsburgh School of Medicine de 1999 – 2011.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissants des efforts déployés par les membres du laboratoire préalables Kendra Mackett, Sandra Slusher et Jie Chen, qui a travaillé à optimiser la méthode. Les auteurs remercient également le National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso savante activité recherche projet (SARP), Lizanell et Colbert Coldwell Foundation, plusieurs système atrophie Coalition, Recherche famille Hoy et Anna Mae Doyle cadeau fonds de soutien financier de cette recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences numéro 126 Dosage colorimétrique déphosphorylation malachite phosphate activité de la phosphatase sous-unité catalytique PP2A protéines recombinantes synucleins phosphopeptide de thréonine

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Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

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Brian Marcus

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Brian S. Marcus

Recombinante α-β - et γ-Synucleins stimuler l’activité de protéine Phosphatase 2 a sous-unité catalytique en essais libres de cellules
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Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

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