Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekombinant α-β og den ble Synucleins stimulere Protein fosfatase 2A katalytisk delenhet aktivitet i cellen gratis analyser

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne publikasjonen presenterer en protokoll viser hvordan måle aktiviteten av rekombinant protein fosfatase 2A katalytisk delenhet (PP2Ac) i rekombinant α-synuclein, β-synuclein eller γ-synuclein proteiner ved hjelp av en enkel kolorimetrisk analysen. Vi viser funn om α-synuclein spesifisitet mot PP2Ac i musen hjernen.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) og γ-Synuclein (gSyn) er medlemmer av en bevart familie Anstandsdame-lignende proteiner som er svært uttrykt i virveldyr neuronal vev. Av de tre synucleins, har bare aSyn vært sterkt involvert i nevrodegenerative lidelser som Parkinsons sykdom, demens med Lewy organer og flere System atrofi. I studere normal aSyn funksjonen, indikerer data at aSyn stimulerer aktiviteten til den katalytiske delenhet i en rikelig uttrykt dephosphorylating enzym, PP2Ac i vitro og vivo. Tidligere data viser at aSyn samling i menneskelige hjerne reduserer PP2Ac aktivitet i områder med Lewy body patologi, der løselig aSyn blitt uløselig. Men fordi alle tre synucleins har betydelig homologi i amino acid sekvenser, ble eksperimenter utformet for å teste om alle kan modulere PP2Ac aktivitet. Bruke rekombinant synucleins og rekombinant PP2Ac protein, ble aktivitet vurdert av malakitt grønne kolorimetrisk analysen. Data avslørt at alle tre rekombinant synucleins stimulert PP2Ac aktivitet i celle-fri analyser, øke muligheten at de bevarte homologi mellom synucleins kan gi gave alle tre homologs med muligheten til å binde til og aktivere PP2Ac. Co-immunoprecipitation data, tyder imidlertid at PP2Ac modulering trolig skjer gjennom endogene interaksjoner mellom aSyn og PP2Ac i vivo.

Introduction

Studier definere distribusjonen av synucleins i hjernen og ryggmarg viser at alle tre synucleins er anriket på neural vev, men ulike mønstre av lokalisering har vært rapportert1. For eksempel aSyn er mest tallrike på presynaptic steder i hjernebarken og basal ganglia2,3, bSyn har en mer jevn fordeling i hjernen og ryggmarg4,5, og gSyn er mer rikelig i ryggmargen og eksterne Ganglion6. Selv om noen embryonale uttrykk for alle synucleins kan oppstå, blitt de tre homologs mer rikelig under neonatal tidsriktige4,5,6,7,8. Bemerkelsesverdig, data fra synuclein trippel knockout mus, indikerer at tap av alle tre synucleins forårsaker alder utbruddet neuronal dysfunksjon9støtter viktige synuclein funksjoner i sentralnervesystemet (CNS)10, 11. det er ennå ikke kjent om synuclein trippel knockout mus Vis endringer i PP2Ac distribusjon eller aktivitet. Data fra én synuclein knockout mus avslører at tap av aSyn alene er i stand til å redusere PP2Ac aktivitet i hjernen12. I tillegg til CNS lokalisere alle synucleins til andre organer i kroppen13,14,15.

På grunn av sin veletablerte genetisk koblinger til neurodegeneration16,17, er aSyn blant beste studert av de tre synucleins. Perez laboratoriet har lenge jobbet for å definere normale funksjonelle aktiviteter aSyn, spesielt i CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 og nylig i perifere vev24,25. Blant disse var oppdagelsen at aSyn spiller en nøkkelrolle regulatoriske i stimulerende PP2Ac aktivitet19. PP2A aktivitet bidrar mye til normal hjernefunksjon, inkludert for regulering av dopamin produksjon26. PP2A-holoenzyme består av tre uavhengige underavdelinger, katalytisk C delenhet, PP2Ac, et stillas A delenhet og av flere forskjellige regulatoriske/målgruppe B underenheter som hjelper lokalisere PP2A til bestemte subcellular microdomains, altså PP2A funksjonell mangfold27. Dokumentasjon viser at aSyn interaksjon med PP2Ac bidra vesentlig til sin fosfatase aktivitet i vitro og vivo12,19,21,23, 25. Når aSyn akkumuleres i protein aggregater, som det gjør når Lewy organer form inni neurons av Parkinsons sykdom og demens med Lewy organer (DLB), vev med aggregert aSyn har redusert PP2Ac aktivitet23,25, når nivåer av løselig aSyn avtar. Gitt at alle tre synucleins har betydelig homologi28 (aSyn aksjer 66% identitet med bSyn og 56% med gSyn) og at aSyn bidrar til aktivering av PP2Ac, var hypotesen at alle medlemmer av synuclein protein familien kunne øke PP2Ac aktivitet, minst i vitro. For å vurdere dette, ble PP2Ac aktivitet målt svar rekombinant aSyn, bSyn og gSyn bruker en enkel kolorimetrisk analysen, modellert etter metoden for Fathi et al. 29. denne metoden og romanen funnene er beskrevet heri.

Protocol

1. forberedelse av buffere og reagenser

  1. Utarbeidelse av p-nitrophenyl-fosfatbuffer (pNPP)
    1. Forberede 50 mL av pNPP buffer som følger.
    2. Veie ut 0.30285 g Tris base (se Tabell for materiale) og oppløse den i 25 mL ultrapure deionisert vann.
      1. Legg 41.6 µL av 120 mM CaCl2. Justere pH 7.0 med 1 M HCl og få det endelige løsningen volumet til 50 mL med ultrapure deionisert vann.
      2. Kontroller at den siste konsentrasjonen er 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7.0.
      3. Lagre pNPP buffer ved 4 oC.
  2. Klargjør følgende malakitt grønne løsninger.
    1. Forberede løsning A ved å legge 32.8 mL konsentrert HCl 67.2 mL ultrapure deionisert vann for å lage en 4 M HCl løsning.
      Merk: Malakitt løsning er utarbeidet i avtrekksvifte engangshansker, ansikt-maske og vernebriller.
    2. Klargjør løsning B ved veiing ut 4,2 g ammonium molybdate og legge det til 95.8 mL løsning A.
    3. Klargjør løsning C ved veiing ut 0.045 g malakitt grønne oksalat salt og legge ultrapure deionisert vann for å få det endelige totalt volumet 100 mL.
    4. Forberede løsning D av miksing løsninger B og C på 1:3 (v/v) forholdet, rør 1t ved romtemperatur.
    5. Filtrere Løsning D gjennom en 0.22 µm pore størrelse nitrocellulose membran filter enhet med en 50 mL sprøyte.
    6. Lagre forberedt malakitt løsning på 4 oC beskyttet mot lyset.
  3. Utarbeidelse av aktivator
    1. For å forberede en 1% vaskebuffer mellom 20 løsning, pipette 10 µL av mellom 20 til 990 µL av ultrapure vann (v/v) så vortex til mellom 20 oppløsning helt.
  4. Utarbeidelse av malakitt grønne mellom 20 (MGT) fungerende løsning.
    1. Bland aktivatoren (trinn 1.3) med malakitt grønne løsningen (løsning D, trinn 1.2.5) i forholdet 1: 100 (f.eks 1 µL aktivator til 99 µL malakitt grønne løsning).
  5. Utarbeidelse av threonin phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) substrat.
    1. For å forberede et 2 mM lager, sted 1 mg phosphopeptide ampuller på is, legger du til 550 µL ultrapure deionisert vann og vortex forsiktig å oppløse.
      1. Gjøre ~ 10 dele og lagre pT på-20oC.
  6. Synuclein forberedelse
    1. Forberede synucleins i avtrekksvifte engangshansker, ansikt-maske og vernebriller.
    2. Resuspend 1 mg av rekombinant synuclein i 1 mL ultrapure deionisert vann i en siste konsentrasjon av 1 mg/mL.
    3. Vortex forsiktig å oppløse og plassere på is.
    4. Forberede 50 µL dele og lagre på-80 oC.
  7. Utarbeidelse av fosfat standarder
    1. Forberede 0,1 mM fosfat lager løsningen som følger.
      1. Veie ut 0.1361 g KH2PO4 og plasseres i et beaker med 80 mL ultrapure deionisert vann. Legge rør bar og blandingen til å oppløse. Overføre alle løsningen til en uteksaminert sylinder og bringe det endelige totalt volumet 100 mL med ultrapure deionisert vann.
      2. Filtrere hele løsningen gjennom en 0.22 µm pore størrelse nitrocellulose membran filter enhet med en 50 mL sprøyte; siste konsentrasjonen er 10 mM.
      3. Fortynne den løsning (10 mM) 1: 100; siste konsentrasjonen blir 0,1 mM fosfat (PO4) som skal brukes for analysen standarder.
      4. Lagre fosfat lager løsningen ved 4 oC.
    2. Se tabell 1 for å begrense fortynninger brukes til å lage PO4 standarder med et siste totalvolum på 1250 µL hver. Legge til riktig mengde fosfat og ultrapure deionisert vann 1,5 mL rør som tabell 1.
      1. Store forberedt PO4 standarder på-20 oC.
Fosfat standarder
0,1 mM PO4 løsning (mL) 0 75 150 300 600 1200
Ultrapure deionisert vann (mL) 1250 1175 1100 950 650 50
Siste konsentrasjon av PO4 [pmol] 0 150 300 600 1200 2400

Tabell 1: Fosfat standarder.

2. PP2A analysen svar rekombinant Synucleins

Merk: Siste totalvolumet for hver reaksjon vil være 60 µL, så eksperimentator må justere innledende mengden pNPP buffer riktig til volumet av synucleins som brukes for hvert utvalg. I de fleste tilfeller blir volumet av pNPP buffer mellom 40 og 44 µL.

  1. Forberede hver PP2Ac reaksjon som følger.
    1. Legg 39 µL pNPP buffer og sted i en 1,5 mL tube, på is.
    2. Legge 1 µL (105 ng/µL eller 0.0007 U/µL) av menneskelig rekombinant PP2Ac (rPP2Ac).
    3. Legg 4 µL av 0, 1.5, 7.5, 15 eller 30 µM synucleins til rPP2Ac i pNPP buffer for siste konsentrasjoner av 0, 0.1, 0.5, 1.0, og 2.0 µM og Inkuber på 4 ° C i 30 min på en roterende enhet; det siste bindet blir 60 µL.
    4. Etter 30 min, flytte prøver is og legge 16 µL av 2 mM pT substrat.
    5. Inkuber hver PP2A analysen blandingen for 10 min på 30 ° C i et vannbad med periodisk risting.
    6. En flat bunn 96-brønns plate, legge til 25 µL av hver PO-4 standard (0, 150, 300, 600, 1200 og 2400 pmol) i like brønner fra lav til høy.
    7. Neste legge 25 µL av hver eksperimentelle prøve (PP2A analysen ± synuclein), utarbeidet i trinn 2.1.1 til 2.1.6, duplisere brønner på samme 96-brønns plate.
    8. Deretter legger til 75 µL av MGT fungerende løsning til hver godt med standarder og eksempler.
    9. La platen ved romtemperatur for 10 min.
    10. Observere en farge endring i prøver å ha målbare nivåforskjellene fosfat.

3. fotometriske analyse

  1. Analysere 96-brønns platen inneholder standarder og prøver en Spektrofotometri plate leser med bølgelengde satt til 630 nm29.
  2. Plot absorbansen kurven produsert (prøver lese på 630 nm) og noter at det fortsatt er lineær opptil 2400 pmol konsentrasjon av PO4.

Representative Results

Protein-funksjonen og aktivitet kan endres ved innlegg translasjonsforskning endringer, for eksempel fosforylering. Mange proteiner kan fosforylert av en kinase, eller dephosphorylated av en fosfatase. Ved protein fosfatase 2A (PP2A), denne multisubunit fosfatase muliggjør dephosphorylation av serine og threonin rester på en bred rekke av fosfoproteiner. Unormal PP2A aktivitet kan føre til feilregulering protein-funksjonen som finnes i mange sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom der aSyn kan bli hyperphosphorylated, og i Alzheimers sykdom der tau protein kan bli hyperphosphorylated. Dette gitt begrunnelse for å optimalisere en egen prosedyre for å raskt vurdere PP2Ac aktivitet og se hvis unormal PP2Ac aktivitet føre til mobilnettet dysfunction.

Bruker denne cellen-fri kolorimetrisk analysen, PP2Ac aktivitet ble målt ved kvantifisere mengden ledig PO4 kløyvde fra pT underlaget (figur 1A) og sammenlignet med kjente picomolar mengder PO4 i standardkurven (figur 1B ). PP2Ac aktivitet ble også målt svar 0,0, 0.1, 0.5, 1.0, og 2.0 µM synucleins (figur 1A), i forhold til grunnlinjen PP2Ac aktivitet i fravær av lagt synuclein (på den store pilen i figur 1A).

Figure 1
Figur 1 : PP2A aktivisering av rekombinant synucleins, målt i forhold til kjente nivåer av fosfat i standarder. I (A) aSyn bSyn og gSyn ble evaluert i området fra 0 - 2 µM protein konsentrasjoner, sammenligne 0 - 2400 pmol PO4 standarder. (B) en standardkurven for malakitt grønne PP2Ac analysen ble generert for å gi kjent mengder fosfat som verdier hentet i eksperimentelle forhold kan beregnes. I alle tilfeller når PP2Ac aktivitet øker, mengden ledig PO4 kløyvde fra pT underlaget øker og produserer en mørkere grønn farge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Resultatene viser at tillegg av synucleins til PP2Ac i første inkubasjon trinn kan øke mengden ledig PO4 målt, og dermed demonstrere økt PP2Ac aktivitet. Den statistiske analysen etter mange repetisjoner viser at alle tre rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) vesentlig øke PP2Ac aktivitet (figur 2). Disse resultatene tyder på at endringer i løselig mobilnettet synucleins kan endre PP2Ac aktivitet. og dermed kan påvirke mobilnettet homeostase. Det er ikke kjent, men hvis alle tre synucleins bidra til aktivering av PP2Ac i vivo, selv om dataene i Figur 3 foreslår at aSyn sannsynlig bidrar til PP2Ac aktivitet i vivo.

Figure 2
Figur 2 : PP2Ac aktivitet blir stimulert av alle tre synucleins. Grafisk fremstilling av PP2Ac aktivisering svar på ulike konsentrasjoner av rekombinant aSyn, bSyn eller gSyn vises. Alle tre rekombinant synucleins stimulert PP2Ac aktivitet. aSyn mest eksperimenter syntes å være litt mer potent, om ANOVAs utføres med statistisk programvare var bemerkelsesverdig lik samlet. Dataene representerer den gjennomsnittlig ± SEM 4-9 uavhengig eksperimenter. ns, ikke signifikant; p < 0,05; p < 0.01; p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å vurdere hvilke synuclein(s) kan samhandle med PP2Ac i hjernen, ble co-immunoprecipitation (Co-IP) analyser utført med wild type mus hjernen og PP2Ac-spesifikke-antistoffer, 1 d 6. Proteiner ble deretter atskilt med SDS side og blots ble analysert for PP2Ac, aSyn, bSyn og gSyn med etablerte metoder19. Rekombinant synuclein kontroller viser aSyn, bSyn og gSyn antistoff spesifisitet (figur 3A). Co-IP data viser at den store synuclein tilknyttet PP2Ac i hjernen var aSyn, mye mindre bSyn kom ned i co-IP (figur 3B), og ingen gSyn kom ned i Co-IP (data ikke vist). Dette antyder en særegen rolle for endogene aSyn i regulering av PP2Ac i hjernen. Det også øker muligheten for at PP2Ac modulering med bSyn-basert-terapi kan ha potensial til å gjenopprette PP2A aktivitet i de med synucleinopathy, som bSyn er kjent for å være nonamyloidogenic ennå som vist her kan stimulere PP2Ac30, 31.

Figure 3
Figur 3: Samhandling i PP2Ac med endogene synucleins i musen hjernen. (A) rekombinant aSyn, bSyn og gSyn ble analysert med synuclein spesifikke antistoffer som beskrevet nedenfor. (B) bruke musen hjernen homogenate Co-IP ble utført med antistoff 1 d 6, og deretter prøver ble analysert på immunoblots. Data vises for PP2Ac og aSyn bSyn, men ikke for gSyn som gjorde ikke Co-IP med PP2Ac. Start eksempler viser relativ nivåer av PP2Ac (lane 1), aSyn (lane 4), og bSyn (lane 7) i den første homogenates. Slutten eksempler viser de gjenstående nivåene av PP2Ac (lane 2), aSyn (lane 5), og bSyn (lane 8) i homogenates etter 1 d 6 PP2Ac Co-IP. Betydelige nivåer av PP2Ac var immunoprecipitated bruker 1 d 6 antistoff (lane 3), som også brakt ned rikelig mengder aSyn (lane 6, pilen) men svært lite bSyn (lane 9, sterkt overeksponert for å vise svak bSyn signal, pilen). * Stjernene og braketter merke ikke-spesifikk signaler på blots. Se Tabellen for materiale for detaljer på antistoffer brukes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne malakitt grønne analysen med pT ble brukt til å måle PP2Ac aktivitet fordi det er enklere å utføre den klassiske metoden som bruker 32P-merket underlag. En annen fordel med denne analysen over radioaktivt analyser er at radioisotopes utgjør noen risiko og kan være kostbart, spesielt 32P-merket molekyler som har kort, som begrenser antall analyser en kan utføre før reagenser utløper. Bruke malakitt grønne snarere enn radioaktivitet eliminerer behovet av 32avfall P. Malakitt grønne analyser er også ganske følsom når måle aktiviteten til serine/threonin phosphatases sammenlignet med en annen kolorimetrisk analysen som bruker substrat p-nitrophenylphosphate (pNPP), som er ikke-selektive som det kan være dephosphorylated av en bred rekke enzymer32.

Kommersielle malakitt grønne kits å måle PP2A aktivitet har vært tilgjengelig i noen tid, og ble tidligere brukt i laboratoriet. Men når du gjør mange malakitt grønne analyser, ble slik kits uoverkommelig dyrt. I tillegg kommersielle kits for PP2A aktivitet er stabile bare for ett år, mens har reagenser i pulverisert form og med riktig lagring, gir lett tilgjengelig analysen komponenter som er strukturelt stabile over lengre tid.

Før testing bSyn og gSyn, ble aSyn brukt som en positiv å stimulere PP2Ac aktivitet og til å bestemme mengden av PP2Ac som kreves for analyser samt bekrefte at resultatdataene fortsatt på skala med standardkurven (150-2400 pmol PO4 ). Det er bemerkelsesverdig at hvis aSyn stimulerer PP2Ac for sterkt om reaksjonen er vanligvis lineær, data som kommer av skalaen og kjemikalier i MGT løsningen bunnfall, gjør det umulig å måle nøyaktig mengder sluppet gratis-PO4 med en plate leseren.

Gitt at aSyn bidrar til PP2Ac aktivitet i vivo og i vitro12,19,21,23,25, og at alle synucleins har betydelig homologi, det hadde vært hypotese at alle synuclein familiemedlemmer kan klare å stimulere PP2Ac i cellen gratis analyser. Bruker kolorimetrisk analysen beskrevet her, ble det funnet at faktisk alle tre rekombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) stimulert PP2Ac aktivitet, øke muligheten at alle tre synucleins kan utføre lignende funksjoner i nervesystemet. Imidlertid hjernen av Parkinson eller demens med Lewy Body tilfeller har mindre PP2Ac aktivitet i vev som inneholder svært samlet aSyn23. Musen vev skjuler Lewy body-lignende patologi også utstillingen redusert PP2Ac aktivitet25. Dette, og nye data i Figur 3 og tidligere data fra aSyn knockout mus12, sterkt foreslår at verken bSyn eller gSyn kan vanligvis kompensere for tap av løselige aSyn i hjernen, eller at de synuclein homologs kan ikke knytte PP2Ac sterkt som aSyn som vises (Figur 3). Allen hjernen Atlas viser colocalization av alle tre synuclein mRNAs i mange hjernen områder, og selv trippel synuclein knockout mus har vært generert9,33, PP2Ac aktivitet ikke er vurdert i den modellen. Interessant aSyn som er fosforylert på Ser129 av Polo-lignende kinase 2, er mindre i stand til å aktivere PP2Ac12, men bevis vises her for bSyn foreslår at bSyn fosforylering er usannsynlig å påvirke PP2Ac aktivitet, som lite bSyn kom ned med PP2Ac i musen hjernen (Figur 3). Sammen tyder dataene på at endogene PP2Ac aktivitet modulatorer, som aSyn, sannsynligvis bidra til velvære og sykdom.

Protokollen skissert her er en enkel ennå kraftfull teknikk å avgjøre kapasiteten til PP2Ac å dephosphorylate et phosphopeptide substrat svar på ulike behandlinger. Denne samme metode kan for eksempel brukes til å teste andre PP2Ac aktivator, som ceramides så vel som potensielle romanen therapeutics34, eller vurdere virkningen av PP2Ac hemmere i vitro. Det er også viktig å påpeke at lignende analyser kan måle aktiviteten til PP2Ac som har vært av 1 d 6 immunoprecipitation fra cellen ekstrakter eller kroppens vev, som tidligere beskrevet av forfatterne12,19, 25. fremtiden programmer for malakitt grønne analysen eksistere utenfor måle PP2Ac aktivitet, som ATP aktivitet kan også bestemmes ved hjelp av slike analysen.

Merk en standardkurve må genereres hver gang for hver uavhengige PP2Ac analysen. Det er obligatorisk å sikre at alle de anvendte reagensene er fosfat gratis, gratis fosfater kunstig øke bakgrunn signal og gir feil resultater. På dagen for analysen er det viktig å forberede nok frisk MGT løsning for alle prøver å være assayed. Også er MGT bare bra at det er gjort og tendens til å føre til etter noen timer. PP2Ac kjøpt fra en leverandør må være aliquotted og lagret frosset snart etter det mottas for å hindre fryse tine sykluser som reduserer sin virksomhet. Som andre phosphatases kan dephosphorylate pT underlaget (f.eks PP1 og PP535), når du analyserer celle eller vev ekstrakter som PP2Ac ikke har blitt isolere av immunoprecipitation, prøver må sendes over kolonner fjerne gratis fosfater og spesifikke hemmere av phosphatases må brukes til å bekrefte fosfatase spesifisitet, som beskrevet tidligere18.

Disclosures

Dr. Perez var medlem av fakultetet i ved Institutt for Nevrologi ved Universitetet i Pittsburgh School of Medicine fra 1999-2011.

Acknowledgments

Forfatterne takker innsats av tidligere laboratorium Kendra Mackett, Sandra Slusher og Jie Chen som jobbet for å optimalisere metoden. Forfatterne også takke National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso vitenskapelige aktivitet forskning Project (SARP), Lizanell og Colbert Coldwell Foundation, flere System atrofi Coalition, Hoy familie forskning og Anna Mae Doyle gave midler til økonomisk støtte av denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

Nevrovitenskap problemet 126 kolorimetrisk analysen dephosphorylation malakitt fosfat fosfatase aktivitet PP2A katalytisk delenhet rekombinante proteiner synucleins threonin phosphopeptide

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Rekombinant α-β og den ble Synucleins stimulere Protein fosfatase 2A katalytisk delenhet aktivitet i cellen gratis analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter