Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rekombinant α-β - og γ-Synucleins stimulerer Protein fosfatase 2A katalytisk Subunit aktivitet i celle gratis Assays

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne publikation præsenterer en protokol, der viser hvordan man måler aktiviteten af rekombinante protein fosfatase 2A katalytisk subunit (PP2Ac) som reaktion på rekombinant α-synuclein, β-synuclein eller γ-synuclein proteiner ved hjælp af en simpel kolorimetriske assay. Vi viser undersøgelsesresultater vedrørende α-synuclein specificitet mod PP2Ac i mus hjerne.

Abstract

Α-Synuclein (eddike), β-Synuclein (bSyn) og γ-Synuclein (gSyn) er en bevaret familiemedlemmer af anstandsdame-lignende proteiner, der er stærkt udtrykt i hvirveldyr neuronal væv. Af de tre synucleins, har kun eddike været stærkt involveret i neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom, demens med Lewy organer, og flere System atrofi. I at studere normal eddike funktion, viser data, at eddike stimulerer aktiviteten af den katalytiske underenhed af en overflod udtrykt dephosphorylating enzym, PP2Ac in vitro og i vivo. Forudgående data viser, at eddike sammenlægning i menneskelige hjerne reducerer PP2Ac aktivitet i regioner med Lewy body patologi, hvor opløselige eddike er blevet uopløselige. Men, fordi alle tre synucleins er betydelig homologi i aminosyre-sekvenser, eksperimenter var designet til at teste, hvis alle kan modulere PP2Ac aktivitet. Ved hjælp af rekombinante synucleins og rekombinante PP2Ac protein, blev aktivitet vurderet af Malakit grønt kolorimetriske assay. Data viste, at alle tre rekombinante synucleins stimuleret PP2Ac aktivitet i celle-fri assays, at øge muligheden for, at de bevarede homologi mellem synucleins kan udstyrer alle tre homologs med evnen til at binde sig til og aktivere PP2Ac. Co-immunoprecipitation data, dog, tyder på at PP2Ac graduering sandsynligt opstår gennem endogene interaktioner mellem eddike og PP2Ac i vivo.

Introduction

Undersøgelser fastlægge fordelingen af synucleins i hjernen og rygmarven vis at alle tre synucleins er beriget med neurale væv, selv om varierende mønstre af lokalisering har været rapporteret1. For eksempel eddike er mest rigelige på præsynaptiske websteder i hjernebarken og basale ganglier2,3, bSyn har en mere ensartet fordeling i hjernen og rygmarven4,5, og gSyn er mere rigelige i rygmarven og perifere ganglier6. Selv om nogle embryonale udtryk for alle synucleins kan forekomme, blive de tre homologs mere rigelige i det neonatale periode4,5,6,7,8. Bemærkelsesværdigt, data fra synuclein tredobbelt knockout mus, tyder på, at tabet af alle tre synucleins forårsager alder debut neuronal dysfunktion9, støtte vigtige synuclein funktioner i centralnervesystemet (CNS)10, 11. det er endnu ikke kendt hvis synuclein tredobbelt knockout mus Vis ændringer i PP2Ac distribution eller aktivitet. Data fra enkelt synuclein knockout mus afslører, at tab af eddike alene er i stand til at reducere PP2Ac aktivitet i hjernen12. Ud over CNS lokalisere alle synucleins til andre væv overalt i kroppen13,14,15.

På grund af sin veletablerede genetiske links til neurodegeneration16,17, er eddike blandt bedste undersøgt af de tre synucleins. Perez laboratorium har længe arbejdet på at definere normal funktionel aktiviteter af eddike, især i CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 og mere for nylig i perifere væv24,25. Blandt disse var opdagelsen at eddike spiller en vigtig lovgivningsmæssig rolle i stimulerende PP2Ac aktivitet19. PP2A aktivitet bidrager meget til normal hjernefunktion, herunder til regulering af dopamin produktion26. PP2A holoenzym består af tre uafhængige underenheder, katalytisk C subunit, PP2Ac, et stillads A subunit og én af flere forskellige lovgivningsmæssige/målretning B underenheder, der hjælpe med at lokalisere PP2A til specifikke subcellulært microdomains, hvorved PP2A funktionel diversitet27. Beviser viser, at eddike interaktioner med PP2Ac bidrage betydeligt til sin fosfatase aktivitet in vitro- og i vivo12,19,21,23, 25. Når eddike ophobes i protein aggregater, som når Lewy organer form inde neuroner for Parkinsons og demens med Lewy organer (DLB), væv med aggregerede eddike har formindsket PP2Ac aktivitet23,25, når niveauer af opløselige eddike mindskes. Eftersom at alle tre synucleins er betydelig homologi28 (eddike deler 66% identitet med bSyn og 56% med gSyn) og at eddike bidrager til aktivering af PP2Ac, det var den hypotese, at alle medlemmer af familien synuclein protein kan være i stand til at øge PP2Ac aktivitet, i det mindste i vitro. For at vurdere dette, blev PP2Ac aktivitet målt i svar til rekombinant eddike, bSyn og gSyn ved hjælp af en simpel kolorimetriske assay, modelleret efter metoden af Fathi et al. 29. denne metode og de nye resultater er beskrevet heri.

Protocol

1. fremstilling af buffere og reagenser

  1. Forberedelse af p-nitrophenylfosfat fosfat (pNPP) buffer
    1. Forberede 50 mL af pNPP buffer som følger.
    2. Afvejes 0.30285 g Tris base (Se Tabel af materialer) og opløse den i 25 mL i ultrarent deioniseret vand.
      1. Tilføje 41.6 µL af 120 mM CaCl2. Justeres til pH 7,0 med 1 M HCl og bringe den endelige løsning lydstyrken til 50 mL med laves deioniseret vand.
      2. Sikre at den endelige koncentration er 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0.
      3. Gemme pNPP buffer på 4 oC.
  2. Malakit grønne løsninger, forberede følgende.
    1. Forbered opløsning A ved at tilføje 32,8 mL koncentreret HCL til 67,2 mL i ultrarent deioniseret vand til at oprette en 4 M HCl løsning.
      Bemærk: Malakit løsning er udarbejdet i et stinkskab, bruger engangshandsker, -ansigtsmaske, og beskyttelsesbriller.
    2. Forberede løsning B vejning ud 4,2 g ammoniummolybdat og føje det til 95.8 mL af opløsning A.
    3. Forberede løsning C ved vejning ud 0,045 g Malakit grønt oxalat salt og tilføje ultrarent deioniseret vand for at bringe den endelige samlede rumfang på 100 mL.
    4. Forberede løsning D ved at blande løsninger B og C i forholdet 1:3 (v/v), rør i 1 time ved stuetemperatur.
    5. Filtrer Løsning D gennem et 0,22 µm pore størrelse nitrocellulose membran filterenhed ved hjælp af en 50 mL sprøjte.
    6. Gemme rede Malakit løsning på 4 oC beskyttet mod lys.
  3. Forberedelse af aktivator
    1. For at forberede en 1% deioniseret tween 20 løsning, pipette 10 µL af tween 20 til 990 µL af ultrarent vand (v/v) så vortex indtil tween 20 opløses fuldstændigt.
  4. Forberedelse af Malakit grønt Tween 20 (MGT) brugsopløsning.
    1. Bland aktivator (trin 1.3) med Malakit grønt opklaring (løsning D, trin 1.2.5) i et forhold på 1: 100 (f.eks. 1 µL aktivator til 99 µL Malakit grønt løsning).
  5. Forberedelse af Threonin phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) substrat.
    1. For at forberede en 2 mM stock, sted en 1 mg phosphopeptide hætteglas på is, tilføje 550 µL af ultrarent deioniseret vand og vortex forsigtigt at opløse.
      1. Gøre ~ 10 delprøver og gemme pT på-20oC.
  6. Synuclein forberedelse
    1. Forberede synucleins i et stinkskab, bruger engangshandsker, -ansigtsmaske, og beskyttelsesbriller.
    2. Resuspend 1 mg af rekombinant synuclein i 1 mL ultrarent ionbyttet vand til en endelig koncentration på 1 mg/mL.
    3. Vortex forsigtigt at opløse og Anbring på is.
    4. Forberede 50 µL delprøver og opbevar ved-80 oC.
  7. Forberedelse af fosfat standarder
    1. Forberede 0.1 mM fosfat stamopløsningen som følger.
      1. 0.1361 g KH2PO4 der afvejes og anbringes i et baegerglas sammen med 80 mL i ultrarent deioniseret vand. Tilføje en røre bar og bland til at opløse. Overføre alle af løsningen til et måleglas og bringe den endelige samlede volumen med laves ionbyttet vand til 100 mL.
      2. Filtrere hele løsningen gennem et 0,22 µm pore størrelse nitrocellulose membran filterenhed ved hjælp af en 50 mL sprøjte; den endelige koncentration er 10 mM.
      3. Fortynd løsning (10 mM) 1: 100; den endelige koncentration vil være 0,1 mM fosfat (PO4) skal anvendes til assay standarder.
      4. Gemme fosfat stamopløsning på 4 oC.
    2. Se tabel 1 for at begrænse fortyndinger bruges til at lave PO4 standarder med en endelige samlede volumen af 1250 µL hver. Tilføje den passende mængde fosfat og laves deioniseret vand til 1,5 mL rør pr. tabel 1.
      1. Butik forberedt PO4 standarder på-20 oC.
Fosfat standarder
0.1 mM PO4 løsning (mL) 0 75 150 300 600 1.200
Laves deioniseret vand (mL) 1.250 1,175 1.100 950 650 50
Endelig koncentration af PO4 [pmol] 0 150 300 600 1.200 2.400

Tabel 1: Fosfat standarder.

2. PP2A Assay svar på rekombinante Synucleins

Bemærk: Den samlede endelige rumfang for hver reaktion vil være 60 µL, så eksperimentatoren skal regulere den oprindelige mængde af pNPP buffer behov for at rumme mængden af synucleins til hver prøve. I de fleste tilfælde bliver omfanget af pNPP buffer mellem 40 og 44 µL.

  1. Forbered hvert PP2Ac reaktion som følger.
    1. I en 1,5 mL tube, tilføje 39 µL af pNPP buffer og sted på is.
    2. Tilføj 1 µL (105 ng/µL eller 0.0007 U/µL) af humane rekombinante PP2Ac (rPP2Ac).
    3. Tilføj 4 µL af 0, 1.5, 7.5, 15 eller 30 µM synucleins til rPP2Ac i pNPP buffer for endelige koncentrationer af 0, 0,1, 0,5, 1,0 og 2,0 µM og inkuberes ved 4 ° C i 30 min på en roterende enhed; den endelige mængden bliver 60 µL.
    4. Efter 30 min, flytte prøver til is og tilføje 16 µL af 2 mM pT substrat.
    5. Inkuber hver PP2A assay blandingen i 10 min ved 30 ° C i et vandbad med intermitterende rysten.
    6. En flad bund 96-brønd plade, tilføje 25 µL af hver PO4 standard (0, 150, 300, 600, 1.200 og 2.400 pmol) i dublerede wells fra lav til høj.
    7. Næste tilføje 25 µL af hver eksperimentel prøve (PP2A assay ± synuclein), forberedt i trin 2.1.1 til 2.1.6, duplikere brønde på samme 96-brønd pladen.
    8. Næste, Tilføj 75 µL af MGT brugsopløsning til hver godt indeholder standarder og prøver.
    9. Forlade plade ved stuetemperatur i 10 min.
    10. Observere en farveændring i prøver at have målbare forskelle i fosfat niveauer.

3. fotometriske analyse

  1. Analysere den 96-brønd plade der indeholder standarder og prøver ved hjælp af en spektrofotometrisk Pladelæser med bølgelængden indstillet til 630 nm29.
  2. Plot absorbans kurven produceret (prøver læse på 630 nm) og Bemærk, at det fortsat er lineær op til 2.400 pmol koncentration af PO4.

Representative Results

Protein funktion og aktivitet kan ændres af indlæg translationel ændringer, såsom fosforylering. Mange proteiner kan fosforyleret af en kinase eller defosforyleret af en fosfatase. I tilfælde af protein fosfatase 2A (PP2A), denne multisubunit fosfatase letter dephosphorylation af Serin og Threonin rester på en lang række fosfoproteiner. Unormal PP2A aktivitet kan føre til dysregulering af protein funktion, som forekommer i mange sygdomme, herunder Parkinsons sygdom hvor eddike kan blive hyperphosphorylated, og i Alzheimers sygdom hvor tau protein kan blive hyperphosphorylated. Dette gav begrundelse for at optimere en in-house procedure hurtigt evaluere PP2Ac aktivitet og bestemme hvis unormal PP2Ac aktivitet kan føre til cellulært dysfunktion.

Ved hjælp af denne celle-fri kolorimetriske assay, PP2Ac aktivitet blev målt af kvantificere mængden af gratis PO4 kløvet fra pT substrat (figur 1A) og i forhold til kendte picomolar mængder af PO4 i standardkurven (figur 1B ). PP2Ac aktivitet var også målt som svar på 0,0 0,1, 0,5, 1,0 og 2,0 µM synucleins (figur 1A), i forhold til baseline PP2Ac aktivitet i mangel af tilsat synuclein (på den store pil i figur 1A).

Figure 1
Figur 1 : PP2A aktivering af rekombinante synucleins, måles i forhold til kendte niveauer af fosfat i standarderne. I()eddike, bSyn og gSyn blev evalueret i et område fra 0 - 2 µM protein koncentrationer, at sammenligne med 0 - 2400 pmol PO4 standarder. (B) en standardkurve for Malakit grønt PP2Ac analysen blev genereret for at give kendte mængder af fosfat mod som opnåede i forsøgsbetingelser værdier kan beregnes. I alle tilfælde, når PP2Ac aktivitet stiger, mængden af gratis PO4 kløvet fra pT substrat øger og producerer en mørkere grøn farve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Resultaterne viser, at tilsætning af synucleins til PP2Ac i det oprindelige inkubation skridt kunne øge mængden af gratis PO4 målt, hvilket viser øget PP2Ac aktivitet. Den statistiske analyse efter mange gentagelser viser, at alle tre rekombinante synucleins (eddike, bSyn, gSyn) betydeligt øge PP2Ac aktivitet (figur 2). Disse resultater tyder på, at ændringer i mængden af opløselige cellulære synucleins kan ændre PP2Ac aktivitet; og således kan påvirke cellulære homøostase. Det vides ikke, men hvis alle tre synucleins bidrage til aktivering af PP2Ac i vivo, selv om data i figur 3 viser, at eddike sandsynligvis bidrager til PP2Ac aktivitet i vivo.

Figure 2
Figur 2 : PP2Ac aktivitet stimuleres af alle tre synucleins. Grafisk repræsentation af PP2Ac aktivering som reaktion på varierende koncentrationer af rekombinant eddike, bSyn eller gSyn er vist. Alle tre rekombinante synucleins stimuleret PP2Ac aktivitet. Eddike i de fleste eksperimenter viste sig at være lidt mere potent, selvom ANOVAs udføres ved hjælp af statistisk software samlet set var bemærkelsesværdigt ens. Data repræsenterer den gennemsnit ± SEM 4-9 uafhængige forsøg. ns, ikke betydelig; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at vurdere, hvilke synuclein(s) kan interagere med PP2Ac i hjernen, blev co-immunoprecipitation (Co-IP) assays udført ved hjælp af vildtype mus hjernen og PP2Ac-specifikke-antistof, 1 d 6. Proteiner blev derefter adskilt af SDS-PAGE og blots var probed for PP2Ac, eddike, bSyn og gSyn ved hjælp af etablerede metoder19. Rekombinant synuclein kontrol demonstrere eddike, bSyn og gSyn antistof specificitet (figur 3A). Co-IP data afslører, at den store synuclein forbundet med PP2Ac i hjernen var eddike, som meget mindre bSyn kom i co-IP (figur 3B), og ingen gSyn kom i Co-IP (data ikke vist). Dette tyder på en karakteristisk rolle for endogene eddike i reguleringen af PP2Ac i hjernen. Det rejser også den mulighed at PP2Ac graduering med bSyn-baserede-behandlinger kan have potentiale til at genoprette PP2A aktivitet hos patienter med synucleinopathy, som bSyn er kendt for at være nonamyloidogenic endnu som vist her kan stimulere PP2Ac30, 31.

Figure 3
Figur 3: Interaktion af PP2Ac med endogene synucleins i mus hjernen. (A) rekombinant eddike, bSyn og gSyn var probed med synuclein specifikke antistoffer, som beskrevet nedenfor. (B) bruge musen hjernen homogenatet Co-IP blev udført med antistof 1 d 6, så prøver blev analyseret på immunoblots. Data er vist for PP2Ac, eddike og bSyn, men ikke for gSyn, som gjorde ikke Co-IP med PP2Ac. Start prøver viser relative niveauer af PP2Ac (lane 1), eddike (lane 4), og bSyn (lane 7) i den indledende homogenater. Ende prøver viser de resterende niveauer af PP2Ac (lane 2), eddike (lane 5), og bSyn (lane 8) i homogenater efter 1 d 6 PP2Ac Co-IP. Betydelige niveauer af PP2Ac blev immunoprecipitated ved hjælp af 1 d 6 antistof (lane 3), som også bragte rigelig mængder af eddike (lane 6, på pil) men meget lidt bSyn (lane 9, stærkt overeksponeret for at vise svage bSyn signal, på pil). * Stjerner og beslag mark den ikke-specifikke signaler på blots. Se Tabel af materialer for detaljer om antistoffer bruges. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne Malakit grønt assay med pT blev brugt til at måle PP2Ac aktiviteten, fordi det er lettere at udføre end den klassiske metode, der bruger 32P-mærket substrater. En anden fordel ved denne analyse over radioaktive assays er at radioisotoper udgøre nogle risiko og kan være dyrt, især 32P-mærkede molekyler, der har korte halveringstider, som begrænser antallet af assays man kan udføre før reagenser udløber. Bruge Malakit grønt i stedet for radioaktivitet også eliminerer behovet for at bortskaffe 32affald P. Malakit grønt assays er også ganske følsomme, når du måler aktiviteten af Serin/Threonin fosfataser sammenlignet med en anden kolorimetriske assay, der bruger substrat p-nitrophenylphosphate (pNPP), hvilket er non-selektive, da det kan være defosforyleret af en bred række enzymer32.

Kommercielle Malakit grønt kits til at måle PP2A aktiviteten har været tilgængelige i nogen tid, og blev tidligere anvendt i laboratoriet. Men når du laver mange Malakit grønt assays, sådanne kits blev uoverkommeligt dyre. Derudover kommercielle kits for PP2A aktivitet er stabile kun for ét år, mens at have reagenser findes i pulveriseret form og med korrekt opbevaring, give let tilgængelige assay komponenter, der er strukturelt stabil i lange perioder.

Før testning bSyn og gSyn, blev eddike anvendt som positiv kontrol at stimulere PP2Ac aktivitet og til at bestemme mængden af PP2Ac kræves for assays og også bekræfte, at resulterende data forbliver på skalaen med standardkurven (150-2400 pmol PO4 ). Det er bemærkelsesværdigt, at hvis eddike stimulerer PP2Ac kraftigt, selv om reaktionen er typisk lineær, data vil gå off skala og kemikalier i MGT løsning bundfald, hvilket gør det umuligt at måle præcise mængder af frigivet gratis PO4 med en plade læser.

Da eddike bidrager til PP2Ac aktivitet in vivo og in vitro-12,19,21,23,25, og at alle synucleins har betydelig homologi, det havde været den hypotese, at alle synuclein familiemedlemmer kan være i stand til at stimulere PP2Ac i celle gratis assays. Bruger de kolorimetriske assay beskrevet her, blev det konstateret, at faktisk alle tre rekombinante synucleins (eddike, bSyn, gSyn) stimuleret PP2Ac aktivitet, at øge muligheden for, at alle tre synucleins kan udføre lignende funktioner i nervesystemet. Men hjernen fra Parkinsons eller demens med Lewy Body tilfælde har mindre PP2Ac aktivitet i væv, som indeholder meget aggregerede eddike23. Musen væv husly Lewy body-lignende patologi også udviser reduceret PP2Ac aktivitet25. Dette, og nye data i figur 3 og forudgående data fra eddike knockout mus12, tyder stærkt på at hverken bSyn eller gSyn typisk kan kompensere for tabet af opløselige eddike i hjernen, eller alternativt at disse synuclein homologs kan ikke forbinde med PP2Ac så stærkt som eddike som vist (figur 3). Allen hjernen Atlas viser colocalization af alle tre synuclein mRNAs i mange områder i hjernen, og selv om tredobbelt synuclein knockout mus har været genererede9,33, PP2Ac aktivitet ikke er blevet vurderet i denne model. Interessant, eddike, det er fosforyleret på Ser129 af Polo-lignende kinase 2, er mindre i stand til at aktivere PP2Ac12, men beviser vist her for bSyn tyder på, at bSyn fosforylering er usandsynligt at påvirke PP2Ac aktivitet, som meget lidt bSyn kom ned med PP2Ac i mus hjernen (figur 3). Tilsammen, tyder dataene på, at endogene PP2Ac aktivitet modulatorer, som eddike, sandsynligt, bidrager til wellness og sygdom.

Den protokol, der er skitseret her er en simpel endnu kraftfulde teknik til bestemmelse af PP2Ac til dephosphorylate phosphopeptide substrat som svar på forskellige behandlinger. Eksempelvis kan denne samme metode bruges til at teste andre PP2Ac aktivatorer, såsom ceramider samt potentielle nye therapeutics34, eller at vurdere virkningen af PP2Ac hæmmere i vitro. Det er også vigtigt at påpege, at lignende assays kan måler aktiviteten af PP2Ac, der har været isoleret i 1 d 6 immunoprecipitation fra celle ekstrakter eller kroppens væv, som tidligere beskrevet af forfatterne12,19, 25. fremtidige ansøgninger om Malakit grønt analysen findes ud over måling PP2Ac aktivitet, som ATP aktivitet kan også bestemmes ved hjælp af sådan en analyse.

Bemærk, at en standardkurve skal genereres hver gang for hver uafhængig PP2Ac assay. Det er obligatorisk for at sikre, at alle reagenser er fosfat gratis, som gratis fosfater kunstigt øge baggrunden signal og give fejlagtige resultater. På dagen for analysen er det vigtigt at forberede nok friske MGT løsning for alle prøver der skal analyseres. MGT er også kun godt den dag, hvor det er lavet og tendens til at bundfald efter et par timer. PP2Ac købt fra en kreditor skal være aliquotted og opbevares frosset snart efter at den er modtaget for at forhindre fryse tø cykler, der reducerer dets aktivitet. Som andre fosfataser kan dephosphorylate pT substrat (fx PP1 og FP535), når du analyserer celle- eller vævsdel ekstrakter, hvor PP2Ac ikke er udskilt af immunoprecipitation, prøver skal være bestået over kolonner til at fjerne frie fosfater og specifikke hæmmere af fosfataser skal bruges til at bekræfte fosfatase specificitet, som tidligere beskrevet18.

Disclosures

Dr. Perez var medlem af fakultetet i Institut for neurologi ved University of Pittsburgh School of Medicine fra 1999-2011.

Acknowledgments

Forfatterne værdsætter indsats af forudgående laboratorium medlemmer Kendra Mackett, Sandra Slusher og Jie Chen, der arbejdede for at optimere metoden. Forfatterne også takke National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso videnskabelig aktivitet forskning projekt (SARP), Lizanell og Colbert Coldwell Foundation, flere System atrofi koalition, Hoy familie forskning, og Anna Mae Doyle gave midler til finansiel støtte af denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

Neurovidenskab sag 126 kolorimetrisk assay dephosphorylation Malakit fosfat fosfataseaktivitet PP2A katalytisk subunit rekombinante proteiner synucleins threonin phosphopeptide

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Rekombinant α-β - og γ-Synucleins stimulerer Protein fosfatase 2A katalytisk Subunit aktivitet i celle gratis Assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter