Summary
שני אלגוריתמים לניתוח תמונה, "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" נוצרו, לכמת באופן אוטומטי תשע תכונות מורפולוגיות של צומת דרוזופילה שרירית (NMJ).
Abstract
מורפולוגיה Synaptic היא בחוזקה הקשורים ליעילות סינפטית, ובמקרים רבים פגמי סינפסה מורפולוגיים בסופו של דבר להוביל לתקלה הסינפטי. צומת העצב-שריר הזחל תסיסנית (NMJ), מודל ומבוסס על סינפסות glutamatergic, נחקר בהרחבה במשך עשרות שנים. זיהוי של מוטציות גרימת פגמים מורפולוגיים NMJ חשף רפרטואר של גנים מווסתים פיתוח סינפסה ולתפקד. רבים מאלה שזוהו במחקרים רחב היקף אשר התמקדו גישות איכותיות כדי לזהות חריגויות מורפולוגי של תסיסנית NMJ. חסרון של ניתוחים איכותיים הוא ששחקנים עדינים רבים התורמים מורפולוגיה NMJ יבחינו סביר. בעוד ניתוחים כמותיים נדרשים לזהות את ההבדלים המורפולוגיים המעודנים, שניתוח כזה הוא עדיין לא בצע פקודות כי הם מייגעים. פרוטוקול זה מתאר באלגוריתמים לניתוח פרט לשני תמונה "דרוזופילה 'דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics', זמין כמו פקודות מאקרו פיג'י תואם, עבור ניתוח morphometric כמותית, מדויק ואובייקטיבי של דרוזופילה NMJ. מתודולוגיה זו פותחה כדי לנתח מסופי NMJ immunolabeled עם סמנים נפוצים DLG-1 ו . BRP בנוסף, היישום הרחב יותר שלה סמנים אחרים כגון Hrp, CSP ו Syt מוצג פרוטוקול זה המקרו מסוגל להעריך תשעה סרטים עלילתיים NMJ מורפולוגיים:. אזור NMJ, היקף NMJ, מספר boutons, אורך NMJ, סניף ארוך NMJ אורך, מספר האי, מספר הסניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר האזורים פעילים מסוף NMJ.
Introduction
הפרעות קוגניטיביות כגון נכות אינטלקטואלית, הפרעת ספקטרום האוטיזם וסכיזופרניה מאופיינות לעתים קרובות פונקצית 1 הסינפטי נורמלי, 2, 3. מורפולוגיה פונקצית סינפסה היא בחוזקה סבוכים זה בזה: פגמים מורפולוגיים יכולים לגרום לתקלה הסינפטי, reversely, העברה סינפטית סוטה תשפיע התבגרות הסינפטי ומורפולוגיה 4, 5, 6.
מספר אורגניזמים מודל הועסק על מנת להבין טוב יותר את הביולוגיה הסינפסה לשפוך אור על כמה שינויים סינפטיים להשפיע תפקוד המוח בריאות ומחלות 7, 8, 9. NMJ תסיסנית הוא למד בהרחבה ומבוססת במודל vivo עבור glutamatergic סאיםnapse ביולוגיה 10, 11. בעשורים האחרונים, מודל זה שימש במשך מחקרים פיזיולוגיים הגן ממוקד, כמו גם עבור מסכי גנטית בקנה מידה גדול, במטרה לזהות הבדלים מורפולוגיים בין NMJs. בפרט, מסך גנטי קדימה זיהה רבי רגולטורי מנגנונים חיוניים שבבסיס התפתחות הסינפסה לתפקד 12, 13, 14, 15, 16. עם זאת, רוב המסכים הללו הסתמכו על הערכה חזותית של מורפולוגיה מסוף NMJ ועל גילוי איכותני של הפרעות הסינפטי או הבקיע חצי כמותית של כמה תכונות מורפולוגיות. כתוצאה מכך, דווקא עדין הפרעות מורפולוגיים הסינפטי שאינם ברורים לעין האנושית הם החמיצו בקלות. על מנת להיות מסוגל לזהות הבדלים כמותיים באופן מקיף, אתיש NMJ להיבדק במדויק על ידי כימות שיטתי של פרמטרים מורפולוגיים של עניין. מדידת תכונות NMJ ידנית מייגעת, במיוחד כאשר ישנם מספר תכונות NMJ של ריבית ו / או בעת ביצוע הקרנות גנטיות בקנה מידה גדולה. על מנת לתמוך multiparametric, ניתוח מורפולוגי תפוקה גבוהה וכדי להשיג כימות אובייקטיבי, שתי פקודות מאקרו "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון" פותחו 17. מאקרו שניהם לרוץ תוכנה לניתוח תמונה קוד פתוח פיג'י 18, והוא יכול לכמת את שתי התמונות confocal ו nonconfocal.
אמצעים "דרוזופילה NMJ Morphometrics" מסופי NMJ immunostained עם דיסק סמן postsynaptic גדול 1 (DLG-1) או peroxidase חזרת presynaptic (HRP), שיתוף שכותרתו עם bruchpilot סמן אזור פעיל (BRP). זה מכמת תשעה parame מורפולוגייםters (המתוארת בהמשך): אזור NMJ, ההיקף NMJ, מספר boutons, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איים, מספר סניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר אזורי פעיל המסוף הסינפטי (איור 1) . למרות אלגוריתם לקביעת מספר boutons שוהה המאקרו הזה, זה לא עומד בקריטריונים של דיוק 17. כדי להעריך את המספר כראוי של boutons, יש צורך להשתמש במאקרו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics", אשר תוכנן במיוחד כדי לכמת boutons באמצעות הכנות NMJ immunostained ידי אנטי-Synaptotagmin (Syt) או חלבון מחרוזת אנטי-ציסטאין (CSP), ושיתוף immunolabeled עם BRP. המאקרו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" מכמת את הפרמטרים הבאים: מספר boutons, אזור בוטון NMJ, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איים, מספר סניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר zo פעילנס (איור 2).
המקרו מורכב 3 תת-מאקרו: (I) "המר לערום" מזהה את כל קבצי התמונה הזמינים ויוצר-hyperstacks Z ו- תחזיות בעצמה מקסימלית של שני הערוצים. כפלט, מאקרו זה יפיק שני קבצים חדשים בכל סינפסה שנקרא "stack_image_name" ו "flatstack_image_name". II) "גדר ROI" יפתח את כל תמונות הקרנת מקסימלית "flatstack_image_name" ברציפות ולהציגם עם הבקשה ידנית להגדיר את האזור של עניין (ROI) שבה המסוף הסינפטי הספציפי של העניין קיים. זו יושמה כדי לאפשר הרחקה של סינפסות חיבור השרירים הסמוכים ו / או סוגים אחרים של מסופי הסינפטי (כגון 1s) שיכול להיות נוכח התמונות 11. (III) "לנתח" חל אוטומטי ניתוח מלא לכל האזורים של התמונות בתוך הגבולות של ROI. כפי שבעקבות צעד זה, המשתמש יקבל שני קבצים חדשים: "results.txt" שבו כל המדידה המספרית תהיה מבוארת ו "res_image_name.tif" שבו סגמנטציה הבסיסית המיוצרת על ידי מאקרו שתודגם. במהלך ניתוח תמונה שלושה מבנים נגזרים כל מסוף סינפטי: מתווית NMJ, שלד NMJ, ומספר BRP חיובי האזורים פעילים. מתווית NMJ משמשת כדי לקבוע את אזור NMJ וההיקף שלה פרדת פרשה מים עוקבת מספקת מספר boutons. מן השלד, חמש תכונות NMJ מוסקות: אורך NMJ הכולל, הסכום של אורך הנתיב הארוך הרציף חיבור כל שתי נקודות קצה (אורך סניף ארוך), מספר תאים שאינם קשורים לכל NMJ (המכונה "אי" ), מספר הסניפים, ואת מספר נקודות הסתעפות (בהתפצלות אחד מתחברת סניפים שלושה או יותר). מספר האזורים הפעילים נקבע על-ערוץ BRP ידי ספירהכתמי BRP חיוביים. מתווית NMJ המבוארת (הקו צהוב), שלד NMJ (הקו כחול), ומספר BRP חיובי האזורים פעילים (מסומן מוקדים לבנים) מוצגות תמונת תוצאות המדידות של הפרמטרים מעובדות ל (. txt) קובץ הפלט (איור 3).
דרוזופילה NMJ Morphometrics" ו 'דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics' תוארו הראשון ומאומתים בהרחבה על ידי Nijhof et al. 17. כתב יד זה מתמקד המתודולוגיה לנתח מורפולוגיה NMJ באמצעות פקודות מאקרו 'Morphometrics NMJ תסיסנית' ו 'Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון'. עם זאת, לפני ניתוחים מאקרו בסיוע, NMJ וניתוחים ו immunostainings צריכות להתבצע. אלה הם צעדים מכריעים, והשילוב של סמנים המשמש אימונוהיסטוכימיה צריך להיות מתאים ניתוחי מאקרו. צעדים אלה מוזכרים בקצרה section 1 של פרוטוקול זה לכוון את משתמש אזכור המתאר בפירוט את הפרוטוקולים לבצע הליכים אלה.
Protocol
1. דרישות לפני עיבוד תמונה
- בצע הכנות ספר דרוזופילה פתוח של זחלים נודדים instar השלישיים (L3), כפי שתוארו לעיל 19.
- Co-immunolabel מסופי תסיסנית NMJ באמצעות שילוב של שני סמנים: DLG-1 או Hrp יחד עם BRP לניתוח עם "דרוזופילה NMJ Morphometrics", ו Syt או CSP יחד עם BRP לניתוח עם "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון" 20.
הערה: נוגדנים מאותו המין ניתן לשלב על ידי תיוג מראש אחד עם ערכת נוגדן-נטיה כגון ערכות זנון אלקסה תיוג 17. - מסופי NMJ תמונה באמצעות מיקרוסקופ של בחירה, למשל, קרינה (עם או בלי ApoTome) או confocal.
- רוכש ערימת תמונה 2 ערוצים של הטרמינל NMJ.
- התאם את הגדרות מיקרוסקופ באופן ערוץ 1רוכש מסוף NMJ immunolabeled עם DLG-1 (או Hrp, Syt, CSP) וערוץ 2 בטרמינל NMJ immunolabeled עם BRP.
- לחלופין, לנתח תמונות חד ערוץ (של סינפסות immunolabeled עם נוגדן בודד) עם פקודות מאקרו. NMJs תמונה immunolabeled ייחודי עם DLG-1 או Hrp לניתוח עם "דרוזופילה NMJ Morphometrics", או Syt או CSP עבור "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון".
הערה: לא ניתן לנתח סינפסות immunostained עם אנטי BRP בלבד.
- לייצא את התמונות שהתקבלו כקבצים בודדים" .tiff. הופך את סדר הערוץ לפני הפעלת פקודות מאקרו אם לא רכש כמצוין.
- רוכש ערימת תמונה 2 ערוצים של הטרמינל NMJ.
2. דרישות תוכנת התקנה
- הורד את פקודות מאקרו: "דרוזופילה NMJ Morphometrics" ו "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון" מאתר האינטרנט הבא: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- הזיזו את הסמן אל התיקייה "מאקרו עדכון 1", ולחץ על הקישור "הצג" אפשרות להופיע. רשימה עם תוכן התיקייה הזו תופיע. התיקייה מכילה רכיבי המאקרו "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון".
הערה: שתי פקודות מאקרו תואמים לגרסאות פיג'י 1.4, הניתן גם באותה תיקייה. המקרו לא יכול לרוץ על הגירסאות האחרונות. אנא לנצל את הגרסה סיפק 1.4. זה לא בעייתי להתחיל בגרסה זו, גם במחשבים עם גרסה עדכנית יותר פיג'י זמינה.- לחץ על "הורד הכל". התוכן בתיקייה יורד למחשב כקובץ zip. לפתוח את הקובץ שהורד.
- העתק את הקבצים דרוזופילה _NMJ_Morphometrics.ijm ו דרוזופילה _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm לספרייה Fiji.app/plugins/. בעת הפעלה מחדש של התוכנית, פקודות מאקרו יופיע בחלק התחתון של Pluginsתפריט נפתח.
- הזיזו את הסמן אל התיקייה "מאקרו עדכון 1", ולחץ על הקישור "הצג" אפשרות להופיע. רשימה עם תוכן התיקייה הזו תופיע. התיקייה מכילה רכיבי המאקרו "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון".
3. הפעלה תת-מאקרו "המר לערום" כדי ליצור Z-תחזיות Hyperstacks של תמונות NMJ
- הפעל את הממשק הגרפי על ידי בחירת תוספים בסרגל הכלים ובחר "דרוזופילה NMJ Morphometrics" בתפריט הנפתח.
- הגדר את ההגדרה "בודדת קובץ מחרוזת" בממשק הגרפי של המאקרו.
הערה: תוכנת מיקרוסקופ משתמשת חתימת זיהוי לארגן מטוסים וערוצים כאשר לאחסון ערימות כקבצים בודדים" .tiff. הגדרת מחרוזת קובץ הייחודית נכנסה צריכה לציין את החתימה מוקצה על ידי התוכנה למטוס הראשון של הערוץ הראשון (חשוב: הנמוך ביותר מטוס ומספר ערוץ צריך לציין). - בחר רק את המאקרו משנה "המר לערום" ולחץ על "אישור" ובחר את התיקייה שבה התמונות נמצאות. אם ספרייה עיקרית עם כמה תת-תיקיות נבחרה, כל הפרט" .tiff קבצים בתוךהספרייה ותיקיות המשנה העיקרית התאמת קריטריוני מחרוזת הקובץ הייחודי תעובד.
- אם Z- המחסנית מכילה רק ערוץ אחד, בחר את התיבה "בערוץ 1 בלבד".
- שימו לב כי שני קבצים חדשים לכל תמונה NMJ, כברירת מחדל כפי שכונו stack_image_name ו flatstack_image_name יופיע. אחסן ניתוח אלה מחסנית ו flatstack להמשך בלבד. הסדרה קובץ .tiff ניתן למחוק בשלב זה, מזעור קיבולות אחסון נדרש והימנעות מקורות שגיאה פוטנציאל.
4. הפעלה תת-מאקרו "הגדר ROI" להתוות את טרמינל NMJ של ריבית
- הפעל את הממשק הגרפי של "Morphometrics תסיסנית NMJ".
- בחר רק את תיבת הסימון "גדר ROI" ולחץ על "אישור" ובחר את המדריך הראשי שבו התמונות הזכאיות flatstack_name מאוחסנות ולחץ על "בוחרים". The-מאקרו תת "הגדר ROI" חיפושים אוטומטית את כל תיקיות המשנהבתוך הספרייה הראשית שנבחרה.
- כמו ההקרנה הראשונה נפתחה, בחר באפשרות "בחירות Freehand" בסרגל הכלים. באמצעות העכבר לצייר מבחר כי בלעדי מכיל הטרמינל NMJ המלא של עניין ולוחץ על "אישור" בחלון "גדר הטרמינל". המאקרו ימשיך עם ההקרנה הבאה.
- להתוות את ההחזר על ההשקעה הבאה וחזור עד שכל ROIs מוגדר. קובץ התמונה ROI, בשם "roi_image_name", יישמר באותה הספרייה כמו תמונות הערימה והקרנה שנוצרו בעבר עבור כל אחת מתמונות המעובד. הפלט של תת-מאקרו זו היא תמונה בינארית של ROI בלבן על רקע שחור.
5. Run Sub-מאקרו "לנתח" לכמת תכונות טרמינל NMJ
- לכו לסרגל הכלים, ובחר "תוספים" ושימוש:
"דרוזופילה _NMJ_Morphometrics" בעת ניתוח סינפסות immunolabeled עם האנטי-DLG-1 או אנטי-HRP (ערוץ 1) ביחדעם האנטי-BRP (ערוץ 2), או "דרוזופילה _NMJ_Bouton_Morphometrics" בעת ניתוח סינפסות immunolabeled עם-Syt אנטי או-CSP אנטי (ערוץ 1) יחד עם BRP (ערוץ 2).- כאשר ערימות תמונת ערוץ אחד הן להיות מנותחות (הערוץ המבני DLG-1 או HRP עבור "Drosophila_ NMJ_Morphometrics", או Syt או CSP עבור "דרוזופילה _NMJ__Bouton_Morphometrics"), בחר בתיבה "בערוץ 1 בלבד".
- התאם את ההיקף מתאים התמונות כדי להיות מנותח. אם פיקסל אחד בתמונה מתאים 2.5 מיקרומטר, מצביעים Scale-פיקסלים = 1, סולם-מרחק ב מיקרומטר = 2.5. במקרה שני ההגדרות נותרות בבית 0, באזור NMJ, ההיקף, האורך ואורך סניף הארוך יתבטאו מספר הפיקסלים.
- אם נדרש, לכוונן את הגדרות ברירת המחדל ניתוח של מאקרו. בצעו התאמות רק אם-מאקרו תת "לנתח" (סעיף זה עם תוצאות לא מספקות, ו Deteההגדרות טובות rmined בסעיף 6) הופעלו.
- בחר בתיבות הסימון "נתח" "חכי" ולחץ על "אישור".
- בחר "חכה" את תיבת הסימון בעת הפעלת מאקרו תת "לנתח" על התמונות בערוץ 2. אחרת טעויות בספירת אזור פעילה יכולות להתרחש עקב יכולות מחשב מוגבלות.
- כתוצאת חלון חדש "בחר תיקייה" נפתחה, בחר את הספרייה שבה התמונות נמצאות ולחץ "לבחור". המאקרו ינתח את כל התמונות נשמרות בספרייה הראשית, אם תיקיות ישימות, שלאחר מכן (באמצעות השלושה קבצים מלבצע את פקודות מאקרו תת הקודמות: stack_image_name, flatstack_image_name ו roi_image_name). התהליכים המאקרו כל תמונה בנפרד ברציפות. זה יכול לקחת כמה דקות לכל מחסנית תמונה (בהתאם לקיבולת המחשב).
- לאחר הפעלת המאקרו, לציין כי res_image_name בשם קובץ תמונה חדש עבור כל מנותח מאוחסן סינפסה יהיה Creaטד בתיקייה ההורית. המדידות הכמותיות תאוחסנה כקובץ "results.txt".
- בדוק את כל תמונות התוצאה לאיתור לכלול תמונות עם שגיאות פילוח. שגיאות פילוח אפשריות מתוארות בטבלה 3, יחד עם ייעוץ כיצד להתאים הגדרות לעקוף אלה. תמונות התוצאה עם שגיאות פילוח כזה ניתנים כדוגמאות באיור 4.
הערה: בעת הפעלת המאקרו עם הגדרות ברירת המחדל שנצפו ממשק המשתמש, חל דיוק של כ 95% כאשר הערכת מאקרו הושוותה הערכה ידנית 17.
6. התאם את הגדרות מאקרו אל תמונות
- כאשר יותר מ 5% של תמונות להראות שגיאות פילוח, לחקור את האלגוריתמים השונים להגדרה / לבחור את גדרות המאקרו המתאימות ביותר עבור התמונות.
- התאם ערך רדיוס כדור מתגלגל
הערה: רדיוס הכדור מתגלגלפונקציה מחסירה את הרקע של התמונה. פונקציה זו היא בעלת חשיבות מכרעת כאשר עובדים עם תמונות שנרכשו על מיקרוסקופי פלואורסצנטי ו / או כאשר יש תמונות רעש רקע גבוה. החיסור של הרקע יעזור הצעדים האוטומטיים thresholding של מאקרו לייצר פילוח נאות של מסופי NMJ.- בחר שלוש תחזיות-Z NMJ (תמונות flatstack_image_name שנוצרו על ידי תת-מאקרו "המר לערום") כי הם מייצגים את הנתונים לתמונה.
- בסרגל הכלים, בחר תמונה | צבע | ערוצי פיצול. שתי תמונות תיווצר, אחד המייצג ערוץ 1 וערוץ 2 אחרים.
- שמור רק את התמונה של ערוץ 1 פתוח, מתאים DLG-1, Hrp, Syt או CSP immunolabeling, וזורק את תמונת ערוץ BRP ידי סגירת התמונה.
- הפעל את המסנן "רקע הפחת" על ידי בחירת "תהליך" בסרגל הכלים ואחריו "רקע הפחת ..." בתפריט הנפתח.
- לחץ על תיבת הסימון המקדימה בחלון הקופץ ולהתאים את רדיוס הכדור מתגלגל לערך המגביר את הניגוד בין הסינפסה רקע כמו בלוח (איור 5 א").
הערה: ראה איור 5 עבור דוגמה. בשנת Figure5A, חלקים של הסינפסה מראים אותן הרמות האפורות כרקע, ואילו איור 5 א" את 'רדיוס הכדור המתגלגל' מוגדר 500 מייצר ניגוד חזק בין הסינפסה ברקע. - כאשר הערך המתאים עבור רדיוס הכדור מתגלגל מוגדר, ולהפעיל את האלגוריתם "רקע פחת" על Z-התחזיות שנבחרו עם ערך הרדיוס אותו מתגלגל כדור ולשמור אותם (בכל ספרייה).
הערה: ערך רדיוס הכדור מתגלגל עבור תמונות 8 סיבי או RGB צריכה להיות לפחות גדולה כמו הרדיוס של האובייקט הגדול בתמונה שאינה חלק מהרקע. במשך 16 סיביות ו 32 סיביות תמונות רדיוס יש INVersely פרופורציונאלי טווח הערכים פיקסל 22.
- קביעת אוטומטי ספים שונים אשר ישמשו
- פתח את התחזיות-Z הצילו בשלב הקודם (6.2.6) ו בחר תמונה | התאם | AutoThreshold | נסה כל.
- כתמונת תוצאה בינארית thresholded תופיע עם כל האלגוריתמים אוטומטי הסף השונים, לקבוע את האלגוריתם המתאים ביותר עבור התמונות.
- בעת הפעלת המאקרו בהמשך, לשנות את הסף בהגדרות המאקרו בהתאם.
- השתמש יותר ספי מגבילים כגון "RenyiEntrophy" או "רגעים" כמו הסף המתווה NMJ ו ספי מתירנית יותר כגון "לי" כדי לקבוע את שלד NMJ, ו "הואנג" כדי לקבוע אזורים פעילים. כאשר תמונות הן מאוד חדות עם מעט רקע, להשתמש "הואנג" כמו" סף המתווה NMJ. אחרת חלקים של הסינפסה עלולים להיות חסרים לאחר פילוח תמונה.
- ראה איור 5 עבור דוגמה. פילוח מתאים של סינפסה מתקבל עם-ספים אוטומטיים המודגשים על ידי תיבות ירוקות. כמה דוגמאות של ספים שאינם מתאימים מודגשות על ידי קופסות אדומות (לבדוק סינפסות בהגדלה גבוהה). בחודש האחרון, או חלקים של הסינפסה חסרים או חלקי הרקע כלולים. ראה התייחסות 23 למידע נוסף.
- לקבוע את הגודל המרבי של חלקיקים הקטנים
הערה: פונקציה זו לא תכלול את כל החלקיקים זוהו על ידי הסף המתווה NMJ ושלד הסף כי הם קטנים יותר מהערך שהוגדר "הגדרת החלקיקים קטנים" מהניתוח. ערך זה מוגדר בפיקסלים. פונקציה זו משמשת מסנן רעשים מאוד שימושי כאשר שיעור גבוה של הרקע הלא אחיד (כגון גבישים / אבק) נמצאים התמונות המתקבלות.- פתח את התחזיות-Z ששמרת בשלב 6.2.6. ולהגדירהסולם כדי לזהות מספר הפיקסלים באמצעות ניתוח | סולם סט. החל את ההגדרות הבאות: המרחק בפיקסלים = 1, הידוע מרחק = 1, יחס הממדים פיקסל = 1, יחידה של אורך = פיקסל ולחץ על "אישור". לחץ על הכלי "הבחירה אובל" בסרגל הכלים.
- באמצעות העכבר לצייר מבחר מקרוב שמסביב חלקיקים בודדים שנמצאים בתוך immunostaining אבל לא שייכים NMJ. מ 'לחצו על Ctrl + עבור משתמש Windows או Cmd + m עבור משתמשי מקינטוש. חלון תוצאת יפתח, המציין את השטח של החלקיקים הנבחרים מספר הפיקסלים.
- חזור על מספר פעמים בשלב הקודם עם כמה חפצי נוכח התמונות כדי לקבוע את אזור חלקיק המזהם הגדול / חפץ. זה יהיה הערך להגדיר בסביבה בעת הפעלת מאקרו בהמשך. בעת הפעלת המאקרו להגדיר את "גודל חלקיקים קטנים" כמו מוגלה ציין גודל החלקיקים הקטנים ביותר בהפרש של 25%.
- ראה איור 5D עבור דוגמה. הגביש הגדול לזהותיש ed שטח של 112 פיקסלים. ההגדרה "קטנים חלקיקים בגודל", בעת עיבוד התמונה עם המאקרו, יש להגדיר to125 - 150.
- קביעת גודל בוטון מינימום
הערה: פונקציה זו לא תכלול את כל boutons זוהה על ידי הסף המתווה NMJ כי הם קטנים יותר מאשר הערך המוגדר מהניתוח. ערך זה מוגדר בפיקסלים.- בצעו את אותם שלבים כמתואר בסעיף 6.4, אבל במקרה הזה לצייר מבחר סביב boutons הקטן הנוכחי במסוף NMJ. בחר את האזור הקטן ביותר המתאים בוטון הקטן של אלה שנמדדו. זהו הערך להגדיר בהגדרת הגודל המינימאלי בוטון בעת הפעלת מאקרו בהמשך.
- גדר "מצא סובלנות רעש מקסים" ערך
- השתמש Z-hyperstacks שנבחרו בקטע 6.2.1.
- בסרגל הכלים, בחר תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים ל- Creaטה 2 ערימות (עבור ערוץ 1 וערוץ 2) ולשמור את התמונה מתאימה לערוץ BRP הפתוח. מחק את תמונת הערוץ השני על ידי סגירתו.
- עבור אל כרטיסיית תוספים בתפריט הקופץ, בחר Process | (3D) מקסימאלי, וכאשר maximum_image_name מופיע (אשר יכול להימשך עד כמה דקות), לסגור את ערימת תמונה המקורית.
- בחר את המקסימום ... IMAGE_NAME (ערימת התמונה המתקבלת) ובחר תוספים | תהליך | מינימום (3D), לסגור את הערימה המרבית ... IMAGE_NAME.
- בסרגל הכלים, תהליך בחר | מצא מקסימה .... חלון חדש "מצא מקסימה ..." יפתח. לחץ על תיבת סימון "בחירת הנקודה מקדים ..." ומלא את התיבה "רעש סובלנות" עם מאקרו ברירת מחדל 50. נקודות המקסימום יהיה המופיע בתמונה כמו צלבים קטנים.
- הגדל את הערך "רעש סובלנות" אם התבוננות עודפת של אזורים פעילים מבוארים, צלבים כלומר שאינם על גבי אזורים פעילים הנמצאיםלהתמקד במישור הערימה שנבחר, או אזורים פעילים שווא כי מזוהה ברקע.
- מצד השני, אם התבוננות מבוארת חלקי אזורים פעילים, כלומר אזורים פעילים בפוקוס לא יסומן בתווית המוכרת, להקטין את הערך "רעש סובלנות". תמשיך לנסות ערכים שונים ביצוע הליך זה עד הצלבים הם תיוג אזורים פעילים כראוי בפוקוס. מלא את "סובלנות הרעש המקסים מצא" עם הערך הזה.
- ראה איור 5C עבור דוגמה. מדי אזורים פעילים מזוהים. באיור 5C" בלבד האזורים הפעילים בפוקוס מזוהה.
- הגדל את הערך "רעש סובלנות" אם התבוננות עודפת של אזורים פעילים מבוארים, צלבים כלומר שאינם על גבי אזורים פעילים הנמצאיםלהתמקד במישור הערימה שנבחר, או אזורים פעילים שווא כי מזוהה ברקע.
- הפעל את "נתח"-מאקרו תת לתמונות הנציג שנבחרו בשלב 5.1, עם ההגדרות שהוגדרו כל השלבים הקודמים.
- התאם BRP-puncta התחתון רף עליון
- שימו לב כי קובץ חדש יופיע לאחר ההפעלה מלדברי אקרו לשלב 2_active_zone_stack_image_name 6.6, המכונה. בתמונה זו מחסנית האזורים הפעילים זוהו על ידי פונקציית "מצא מקסים" מסומנים על ידי נקודות לבנות בכל מטוס.
- פתח את הקובץ הזה על ידי גרירה ושחרור אותו לתוך התמונה שבסרגל הכלים ובחר | סטאק | Zproject | סוג הקרנה = פרוסות סאם. הקרנה של 2_active_zone_stack_image_name תושג.
- בחר תמונה | התאם | סף. חלון חדש "Threshold" יפתח. חלק את הבר העליון כדי לבחור ערך סף שבו, כל מוקדי רצוי / BRP חיובי הכתמים הם דמיינו באדום.
הערה: אם הסף מוגדר נמוך מדי, עודף של אזורים פעילים ייספר. אם להגדיר גבוה מדי, שבריר של האזורים הפעילים יחסר.- ראה איור 5E עבור דוגמה. כאשר סף מוגדר 400, לרוב האזורים הפעילים (סמלו כמו מוקדי 1 פיקסל) אינם נכללים הפילוח, שכן הם אינם מודגשים באדום (איור 5E). כאשר סף מוגדר שווי של 50 כל האזורים הפעילים מודגשים באדום (האיור 5E").
- הגדר ערך זה בתור סף מינימום. עזוב "Upper puncta סף" על הערך המקסימאלי.
- רץ שוב את-מאקרו תת "לנתח" את התמונות נציג עם ההגדרות מוגדרות בכל השלבים הקודמים של סעיף זה. האנושות להעריך את קבצי תמונה המתקבלים ולוודא כי הפילוח נעשה כראוי. אם זה אינו המקרה מחדש את ההגדרות בהתאם לאופי שגיאות פילוח (איור 4, טבלה 3).
Representative Results
קובץ תוצאות הטקסט יופיע בספרייה הראשית. זה מסכם את כל הפרמטרים שנמדדו לכל תמונה. התוצאות צמודות שם הקובץ ואת הפרמטרים מכן מסוכמים לפי הסדר המצוין בלוחות 1 ו 2.
Res_image_name הוא בערימה תלת-תמונה. הדימוי הראשון מדגיש את קווי המתאר ואת השלד של הטרמינל NMJ שקבעה מאקרו מבוסס על ערוץ 1 (immunolabeling DLG-1, Hrp, Syt, או CSP). הדימוי השני הוא העתק של התמונה הראשונה ובנוסף מציג את המקומות המזוהים BRP החיובי כי מזוהה בערוץ 2 כמו מוקדי schematized. התמונה השלישית מספקת את ההקרנה המרבית של הערוץ השני ביחד עם מוקדי BRP חיוביים מזוהים.
סף המתווה NMJ מיוצג בצהוב בתמונת תוצאת פלט מאקרו. אזור NMJ, perimeter ומספר boutons נגזרים מתנועת סף זה.
סף שלד NMJ מיוצג בכחול בתמונת תוצאת פלט מאקרו. אורך NMJ, אורך סניף ארוך, מספר הסניפים, הסתעפות נקודות ואיים נגזרים מתנועת סף זה.
סף אזורי פעילות NMJ אינו מיוצג בתמונת תוצאת פלט מאקרו. סף זה קובע את האזור שבו מוקדים חיוביים-BRP פוטנציאלי אפשר להיתקל בהם על ידי המאקרו. זה נועד כדי ליצור שטח NMJ כי הוא גדול במקצת מזה שהוגדר על ידי הסף המתווה NMJ. כאשר סף מגביל מדי נבחר, BRP חיוב מוקדים ממוקמים בשולים של הסינפסה עשויים להיות שליליים. כאשר הסף הוא גם מתירני, רעשי רקע ניתן לספור כמו BRP חיובי כתמים (איורים 1 - 2).
כדי valida טה את הביצועים של מאקרו "דרוזופילה NMJ Morphometrics", שלושה תנאים מוטציה כי תוארו כבר להציג פגמים הסינפטי בפרמטרים NMJ שונים נבדקו. כל פגם זוהה על ידי הליך פילוח תמונה שונה בביצוע מאקרו (מתווית NMJ, אזורי שלד או פעילים, בהתאמה 17). לאחר המיקוד בשלושת הגנים של עניין על ידי מושרת RNAi ו וניתוחים מבצעים ו immunostaining NMJ של זחלי L3, המאקרו הופעלה. מדידות מורפולוגיים שהושגו NMJ היו אז Pairwise (RNAi מול שליטתו) בהשוואה באמצעות מבחן t. בכל שלושת המקרים, הבדלים סטטיסטיים נמצאו בין מוטציות ובקרות משפיעי פרמטרים שנמצאים הסכם עם פגמי מורפולוגיים שדווחו בעבר. זו מאשרת כי פקודות מאקרו מסוגלים אכן לזהות כראוי תיאר בעבר ליקויים בבית NMJ תסיסנית.
"1"> 2 Ankyrin (Ank2, CG42734) מוטנטים ידועים להראות פגמים מורפולוגיה הסינפטי, כולל boutons התמזגו ו NMJs קטן. פגמים אלה נצפו עבור מוטציות Ank2 24, 25 ו מציאת Ank2 טסה 26. מסופי NMJ של הפאן העצבית זבובים מציאה RNAi Ank2- (w; כטב"מ דייסר-2 / כטב"מ Ank2 RNAi KK107238; elav-Gal4 / +) הראו באופן משמעותי באזור NMJ קטן (ממוצע = 339.25 מיקרומטר 2; מבחן t p = 2.18 x 10 -8) ו היקפי (ממוצע = 238.24 מיקרומטר; מבחן t p = 1.82 x 10 -3), לעומת הנתונים מלאי רקע הגנטי (w; כטב"מ דייסר-2 / כטב"מ KK60100; elav-Gal4 / + () אומר = 451.95 מיקרומטר 2 ולהתכוון = 288.62 מיקרומטר, בהתאמה) לאחר ריצה "דרוזופילה NMJ Morphometrics" (איורים 6 א & 4B).
GTPase Rab3 (CG7576) נדרשו לחלוקת bruchpilot נכונה מוטצית RUP מציגה עם מספר מופחת משמעותי של אזורים פעילים 27. ירידה משמעותית במספר האזורים הפעילים נצפתה כאשר מודדים מוקדים BRP חיוביים על ידי מאקרו "דרוזופילה NMJ Morphometrics" ב מסופי NMJ של הפאן עצבי Rab3 זבובי מציאה (w; כטב"מ דייסר-2 / כטב"מ RNAi KK100787; elav -Gal4). המספר הממוצע של אזורים פעילים לכל מסוף NMJ ב Rab3 -RNAi היה 138 לעומת 290 שהתגלו במערך הבקרה (/ +) מבחן t p = 4.43 x 10 -29) (איורי 6 א & 4C).
Highwire (HIW, CG32592) הוא וסת חשוב של צמיחה NMJ; מוטציות להוביל גן HIW כדי לגדול והרחיבה הסתעפות של מסופי NMJ 28. מדידה מסופי NMJ של קו מציאת הפאן העצבי HIW -RNAi (w; UAS-דייסר-2 / כטב"מ-RNAi-GD36085; elav-Gal4 / +) עם "דרוזופילה NMJ Morphometrics", הבדלים משמעותיים נצפו הפרמטרים הנגזרות השלד: אורך (ממוצע = 147.36 מיקרומטר; מלאה מתכוון = 122.07 מיקרומטר; t p -test = 7.31 x 10 -7), אורך הסניף הארוך (ממוצע = 122.19 מיקרומטר; מלאה מתכוון = 105.65 מיקרומטר; מבחן t p = 4.62 x 10 -4) מספר סניפים (ממוצע = 7.69; לשלוט ממוצע = 5.74; מבחן t p = 2.52 x 10 -2) ומספר נקודות הסתעפות (ממוצע = 2.73; לשלוט ממוצע = 1.79; מבחן t p = 3.31 x 10 -2). כל הפרמטרים הללו הוגדלו באופן משמעותי (120 - 180%) בהשוואה לקבוצת ביקורת הרקע הגנטית (w; כטב"מ דייסר-2 / כטב"מ GD60000; elav-Gal4 / +) (איורים 6 א & 4D).
איור 1: דרוזופילה _NMJ_Morphometrics מודד 9 פרמטרים של DrosophiLa NMJ. משמאל הם DLG-1 ו BRP immunolabeled מסופי NMJ, צילמו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ApoTome. מימין הם תוצאה תמונות לאחר הפעלת "דרוזופילה NMJ Morphometrics". פרמטרים באזור, היקפי boutons מיוצגים על ידי המתווה הצהוב-מבואר מאקרו הצביע. פרמטרים אורכים, אורך סניף ארוך (LBL), סניפים, נקודות הסתעפות, והאיים מוצגים על ידי המתווה הכחולה-מבואר מאקרו. BRP-immunolabeled מוקדים (אזורים פעילים) מיוצגים על ידי מאקרו כמו כתמים לבנים בתמונות התוצאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics מודד 8 פרמטרים של דרוזופילה NMJ. בצד שמאלהם Syt-1 ו BRP immunolabeled מסוף NMJ, צילמו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ApoTome. מימין הם תוצאה תמונות לאחר הפעלת "Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון". הפרמטרים boutons והאזור בוטון מיוצגים על ידי המתווה הצהוב-מבואר מאקרו. פרמטרים אורכים, אורך סניף ארוך (LBL), סניפים, נקודות הסתעפות, והאיים מוצגים על ידי המתווה הכחולה-מבואר מאקרו. BRP-immunolabeled מוקדים (אזורים פעילים) מיוצגים על ידי מאקרו כמו כתמים לבנים בתמונות התוצאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תרשים זרימה ייצוג תסיסנית NMJ Morphometrics ו תסיסנית NMJ בוטון Morphometrics מאקרו. The-מאקרו המשנה הראשון "מר to ערימה" יוצר תחזיות hyperstacks של NMJs צילמו. השני תת-מאקרו 'ROI הגדר' דורש הזנה ידנית בהגדרת המיקום של הטרמינל NMJ של עניין. תת-מאקרו שלוש, 'לנתח', אמצעים כל הפרמטרים NMJ. טקסט קובץ המכיל את הערכים הכמותיים קובץ תמונת תוצאה המתאר את תיחום הפרמטר נוצר כדי לסייע בהערכת ביצועים המאקרו של המשתמש. כאשר תמונות נרכשות בתנאים שונים, הגדרות מאקרו צריכות להיבדק והותאמו להבטיח ניתוח מדויק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: דוגמאות של תוצאות פילוח מאקרו לא ראויות. תמונות תוצאה לאחר הפעלת "דרוזופילה NMJ Morphometrics" או 'דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics'. חלקים של המסוף הסינפטי אינם נכללים למתווה הצהובה (א). חלקים מהרקע כלולים המסוף הסינפטי ידי למתווה הצהובה (B). קו שלד הכחול חורג מסוף הסינפטי. (C - D) מדי אזורים פעילים מזוהים (E - E "). אזורי פעילות חלקם יישארו לא מזוהה על ידי הניתוח (G - G"). אזורי פעילות מזוהים מחוץ לסינפסה (F) הפילוח בוטון שגוי. (ניתן לשימוש בעת הרצת תסיסנית NMJ בוטון Morphometrics), boutons הם החמיצו (H) או boutons רב מדי מזוהה על ידי הפילוח (I). חלקיקים כזה גבישים או אבק כי הם חלק מהרקע כלול בפילוח (J) . מידע כיצד לשנות הגדרות כדי למנוע שגיאות אלו ניתנים בטבלה 3 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: דוגמאות של התאמות מאקרו-הגדרה והשלכותיהם על פילוח תמונה. (א) הפחת המקדימה רקע של סינפסה immunolabeled DLG-1, צילמו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ApoTome, כאשר "רדיוס הכדור המתגלגל" מוגדר 20 (א) או 500 (א"). (ב) תמונות פלט שהושגו לאחר ריצת תמונה | התאם | Auto-סף | נסה את כל התמונה ממחישה סגמנטציה מתקבלת על ידי 16 האלגוריתמים אוטומטי הסף השונים. (ג) "מצא מקסימה" תצוגה מקדימה בעת ההגדרה "סובלנות רעש" ב 50 (ג) ו- 500 (ג"); Acאזורי מגני אוזניים כי מזוהים על ידי פילוח מסומנים על ידי צלב קטן. (ד) מדידת "חלקיקים קטנים" המופיע ברקע תמונה של סינפסה immunolabeled עם-HRP אנטי, צילמו על מיקרוסקופ confocal. (ה) "פרוסות Sum" הקרנה המתקבלת 2_active_zone_stack_ima-ge_name. סף מוגדר 400 (E) ב 50 (E"). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: הערכת מאקרו וכימות של NMJs על שריר 4. (א) תמונות תוצאה לאחר הפעלת "דרוזופילה NMJ Morphometrics" מאקרו על DLG-1 ו BRP immunolabeled מסופי NMJ. פרמטרים באזור, היקפי בוטוןהים מיוצג על ידי המתווה הצהוב מאקרו-מבואר. פרמטרים אורכים, אורך סניף ארוך (LBL), סניפים, נקודות הסתעפות, והאיים מוצגים על ידי המתווה הכחולה-מבואר מאקרו. BRP-immunolabeled מוקדים (אזורים פעילים) מיוצגים על ידי מאקרו כמו כתמים לבנים בתמונות התוצאה. סרגל הסולם עולה 20 מיקרומטר. (ב) Ankyrin2 RNAi מציאת תערוכת אזור NMJ קטן היקפי בהשוואה לקבוצת ביקורת רקע גנטית. (ג) Rab3 מציאה הביאה NMJs עם מספר נמוך של אזורים הפעילים BRP חיוביים בהשוואה לקבוצת ביקורת רקע גנטית. (ד) מציאת Highwire הביאה כבר, אורך סניף ארוך גבוה, מסועף יותר ועם נקודות הסתעפות יותר לכל מסופי NMJ לעומת NMJs מלא רקע הגנטי. ברי שגיאה מצביעים SEM, ** p <0.01, שני T-test זנב. אנא לחץ הואמחדש כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פָּרָמֶטֶר | מבנה NMJ | הֶסבֵּר |
| שטח (μm2) | מתווה NMJ | האזור של NMJ שכותרתו המלאה |
| היקפי (מיקרומטר) | מתווה NMJ | המיתחם השייכים לאזור |
| #Boutons | מתווה NMJ | מספר boutons הסינפטי ( "פנינים על חוט") של NMJ |
| אורך (מיקרומטר) | שֶׁלֶד | האורך הכולל של הטרמינל NMJ המלא |
| אורך הסניף הארוך ביותר (מיקרומטר) | שֶׁלֶד | סכום אורך הנתיב הארוך הרציף חיבור כל שתי נקודות קצה של NMJ |
| #ענף es | שֶׁלֶד | המספר הכולל של סניפים |
| נקודות #Branching | שֶׁלֶד | מספר הסתעפות נקודות (מספר סניפים יכולים לנבוע בהתפצלות אחד) |
| #איים | שֶׁלֶד | מספרם של העובדים הלא-מחוברים תאים הסינפטי Dlg1 חיובי (או כל מכתים אחרים) |
| אזורי #Active | כתמי BRP החיובי | מספר האזורים הפעילים, מבוסס על מכתים BRP |
טבלה 1: פרמטרים NMJ נמדד על ידי "דרוזופילה NMJ Morphometrics". פרמטרי NMJ נמדדים המאקרו "דרוזופילה NMJ Morphometrics" יופיעו כרשימה בקובץ הטקסט המתקבל, בעקבות הסדר המתואר בטבלה זו. טבלה זו נדפסה מ ואח Nijhof. 17
FO: keep-together.within-page = "1">
| פָּרָמֶטֶר | מבנה NMJ | הֶסבֵּר |
| boutons | מתווה NMJ | מספר boutons הסינפטי ( "פנינים על חוט") של NMJ |
| אזור בוטון | מתווה NMJ | השטח הכולל של כל boutons |
| אורך (מיקרומטר) | שֶׁלֶד | האורך הכולל של הטרמינל NMJ המלא |
| אורך הסניף הארוך ביותר (מיקרומטר) | שֶׁלֶד | סכום אורך הנתיב הארוך הרציף חיבור כל שתי נקודות קצה של NMJ |
| #ענפים | שֶׁלֶד | המספר הכולל של סניפים |
| נקודות #Branching | שֶׁלֶד | thמספר הדואר של הסתעפות נקודות (מספר סניפים יכול לנבוע בהתפצלות אחד) |
| #איים | שֶׁלֶד | מספרם של העובדים הלא-מחוברים תאים הסינפטי Dlg1 חיובי (או כל מכתים אחרים) |
| אזורי #Active | כתמי BRP החיובי | מספר האזורים הפעילים, מבוסס על מכתים BRP |
טבלה 2: פרמטרים NMJ נמדד על ידי "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics". פרמטרי NMJ נמדדים המאקרו "דרוזופילה _Bouton_NMJ_Morphometrics" יופיעו כרשימה בקובץ הטקסט המתקבל, בעקבות הסדר המתואר בטבלה זו. טבלה זו נדפסה מ ואח Nijhof. 17
| הִתפַּלְגוּת | דוגמא | התאמות הנדרשות | ||
| שטח והיקף NMJ (ע"י ב"כ מתווה צהוב בתמונת תוצאה) | חלקים של המסוף הסינפטי או אינם נכללים למתווה הצהובה או חלקי הרקע כלולים בטרמינל הסינפטי שהותווה צהוב. | איור 5 א-ב | התאם ערך "רולינג כדור רדיוס". ראה סעיף 6.1. | התאם "סף מתווה NMJ". ראה סעיף 6.2. |
| פרמטרי אורך הקשורים NMJ (ע"י ב"כ קו שלד בכחול בתמונת התוצאות) | קו שלד כחול או חורג או אינו נוכח לאורך הטרמינל הסינפטי כולו. | איור 5 ג-ד | התאם ערך "רולינג כדור רדיוס". ראה סעיף 6.1. | התאם "סף מתווה NMJ". ראה סעיף 6.2. | </ TR>
| BRP חיובי puncta (ע"י ב"כ נקודות בתמונת תוצאות) | מדי אזורים פעילים מזוהים. | איור 5E-E" | החלש את "סובלנות רעש מצא מקסימה" ערך. ראה סעיף 6.5. | |
| BRP חיובי puncta (ע"י ב"כ נקודות בתמונת תוצאות) | אזורי פעילות הם החמיצו ידי הניתוח. | איור 5G-G" | הגבר את "סובלנות מצא רעש מקסים" הערך. ראה סעיף 6.5. | הפחת 'סף נמוך BRP-puncta'. ראה סעיף 6.6. |
| BRP חיובי puncta (ע"י ב"כ נקודות בתמונת תוצאות) | חפצי אזור פעילות מזוהים מחוץ לטרמינל הסינפטי. | איור 5F | התאם "סף האזור פעיל" סעיף 6.2. | גדל 'BRP-puncta סף תחתון'. ראה סעיף 6.6. |
| חלקיקים קטנים | חלקיקים כזה גבישים או אבק כי הם חלק מהרקע להופיע להיכלל הפילוח. | איור 5J | בחר בתיבה "סר חלקיקים קטנים". ראה סעיף 6.3. | לקבוע קטנים חלקיקים בגודל מקסימאלי. ראה סעיף 6.3. |
| פילוח בוטון | פילוח בוטון שגוי (ישים רק כדי תסיסנית NMJ בוטון Morphometrics; לא להשתמש Morphometrics תסיסנית NMJ עבור פילוח בוטון). | איור 5H-לי | התאם "סף מתווה NMJ". ראה סעיף 6.1. | ברר "מינימום בוטון גודל". ראה סעיף 6.4. |
טבלה 3: מדריך לפתרון עבור סוגים שונים של טעויות פילוח תמונה שיכולה להיות מיוצר על ידי פקודות מאקרו. טבלה זו מתארת סוגים שונים שלשגיאות פילוח תמונה המיוצר על ידי פקודות מאקרו. אלה ניתן לאתר בקלות את תמונות תוצאות. דוגמאות לכל סוג שגיאה מוצגות באיור 4. בקטע "התאמות" של השולחן, את ההגדרות שצריכות להיות מותאמים מודגשות, והמשתמש נקרא הצעד תת הקריטי של סעיף 6, אשר מתאר כיצד לכוונן את ההגדרות האלה.
Discussion
"דרוזופילה NMJ Morphometrics" ו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" הם כלים רבי עוצמה עבור חוקרים מעוניינים בהערכה מורפולוגיה סינפסה. הערכה ידנית של פרמטרי NMJ היא מייגע; ההערכה היא כי פקודות מאקרו יצילו חוקר מנוסה עד 15 דקות / NMJ בילה על פילוח תמונה ידני. עם אחד עד שני עשרות סינפסות העריכו לכל תנאי או גנוטיפ, זה מהר מסכם לסכומים ניכרים של זמן נשמר, גם מחקרים בקנה מידה קטנים. בעת ביצוע מסכים גדולים, רווח השימוש באבחון תפוקה גבוהה, לעומת הערכה ידנית וכימות, יכול להיות עצום. בנוסף תפוקה מוגברת, פקודות מאקרו לספק ניתוח אובייקטיבי בקלות; הם פוסלים הטיות אישיות אחרים דורשות ניסויים עיוורים כמו גם הבדלים בין-אישיים המתרחשים כאשר חוקרים שונים מעורבים בניתוח. לבסוף, פקודות מאקרו לספק רגיש ומדויקalysis של תכונות NMJ, המאפשר זיהוי של רגולטורים הסינפטי שגורמים די מתוחכם ממה פגמי NMJ דרמטיים עד כה נותרו מערירים העין של החוקר. מידע מפורט על הליכי אימות האלגוריתמים מנוצלים מאקרו נמצא al הפרסום Nijhof et. 17.
הפונקציונליות של פקודות מאקרו אומת למדוד תכונות מורפולוגיות כראוי של תסיסנית NMJs על שריר 4. לאחר מכן, הודגם כי פקודות מאקרו היו גם מתאים לנתח סינפסות השרירים האחרים אורגניזם זה. סביר להניח כי פקודות מאקרו יכול לשמש גם כדי למדוד פרמטרים מורפולוגיים של NMJ עם מבנה דומה מינים אחרים, כולל מינים תסיסנית אחרים וחרקים נוספים. גם NMJs מאוד רחוק באבולוציה, למשל, NMJs של עכברים, להראות קונפורמציה מבנית דומה למדי 29. המקרו לא נבדק על הכנות NMJ ממינים אחרים אך משתמשים פוטנציאליים מוזמנים לבדוק את הפקודות מאקרו למטרות כאלה.
זה מאוד חשוב שהמשתמש בוחן את auto-הספים ואלגוריתמים השונים להגדרה / לבחור את גדרות המאקרו המתאימות ביותר עבור התמונות. עם ההגדרות האלה, ברמת דיוק של כ 95% מושגת כאשר הערכת מאקרו הושוותה הערכה ידנית. התאמת הגדרות מאקרו קטע שצריך 100% של תמונות יכול להיות תהליך מאוד מייגע או אפילו בלתי אפשרי. לכן, הדרה של תמונות לא מפולחות כראוי מומלצת אם המספרים שלהם מתחת 5%. ברור, אם האיכות של התמונות היא נמוכה, פקודות מאקרו יפיק יחס גבוה יותר של סגמנטציה מספקות. תמונות באיכות נמוכה תשפיע הערכה ידנית דומה ולכן לא ניתן לקשר את הביצועים של פקודות מאקרו. אף על פי כן מאקרו הם חזקים למדי כפי שהם תוכננו עבור התמונהs שנוצר על מיקרוסקופ התכול גבוה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי המאפשר הדמיה של מספר הגדול של דגימות) 17.
נקודה קריטית היא שהמשתמש חזותי בודק את כל תמונות התוצאה שנוצרו על ידי הפקודות מאקרו. זה יאפשר לזהות לכלול תמונות עם פילוח מאכזב. בסעיף 6 של פרוטוקול זה, המשתמש מודרך כיצד להתאים את ההגדרות עבור פילוח תמונה נכונה בעת הפעלת מאקרו תת "לנתח". כדי להכיר את דרישות במהירות של המקרו כיצד להתאים את הגדרות מאקרו תיקייה בשם "Examples_adjusting הגדרות המאקרו" נכלל https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a מאגר מאקרו. שלוש עשר תיקיות משנה, כל אחד עם דוגמאות תמונות המתקבלות על פלטפורמות מיקרוסקופ שונות (תכולה גבוהה / confocal / מיקרוסקופי פלואורסצנטי) ו immunostainings השונה, ניתנות. קובץ PDF תחת כותרת "מדריך דוגמאות" נכלל באותהתיקייה שבה ההגדרות הדרושות עבור כל דוגמא ניתנות, יחד עם מסמך טקסט מתן תמונות תוצאות ואת התוצאות הצפויות.
המקרו תוכננו לעבד תמונות שנשמרו כמו .tiff מופרד קבצים, בכל זאת חלק מהמשתמשים עשויים להציל את התמונות שלהם במתכונת שונה. Https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a האינטרנט הבא 21 מכיל תיקייה בשם "NMJ תסיסנית" שבו שלושה קבצים לדוגמה (דוגמה 1 - 3) ומסמך "מדריך דוגמאות" עם הוראות מפורטות כיצד לייבא תמונות לתוך מאקרו אם לא מאוחסן כמו .tiff קבצים מופרדים ניתן למצוא גם באותה תיקייה.
יחד, "דרוזופילה NMJ Morphometrics" ו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" פקודות מאקרו לכמת עשר תכונות NMJ שונים: אזור NMJ, ההיקף NMJ, מספר boutons, NMJ בוטון באזור, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איסלהNDS, מספר הסניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר האזורים פעילים. זה מספק יתרון גדול על פני כלים עד כה זמינים שיכול להעריך רק אחד או כמה תכונות הסינפטי 30, 31. ניתוח כמוני Multiparametric נושא פוטנציאל גדול עבור תגליות חדשות, למשל, לזהות רגולטורי רומן ששולטים אחד עד היבטים רבים של ביולוגית סינפסה. הוא גם מספק את הרזולוציה הנדרשת כדי לקבוע גני coregulate בדיוק תכונות NMJ הזהות או חופפים ולכן צפויים לפעול מסלולים מולקולריים משותפים. לבסוף, הוא פותח את האפשרות לחקור כיצד פרמטרים הסינפטי לתאם אחד עם השני בתנאים באין מפריעים 17 ואשר הודות לגנים מתאמים מורפומטריות מתואמים כזו.
יחדיו, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בשתי פקודות מאקרו "Morphometrics NMJ תסיסנית" ו"דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics", אשר לבצע כימות אובייקטיבי ורגיש של עשר תכונות מורפולוגיות NMJ באופן תפוקה גבוהה.
Disclosures
יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מכירים את מרכז המשאבים דרוזופילה וינה ובלומינגטון דרוזופילה מרכז המניות (NIH P40OD018537) למתן זני דרוזופילה. אנו מודים ג'ק פרנסן ממרכז הדמיה Microscopical לקבל תמיכה מקצועית בתחום ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי vidi ומענקים TOP (917-96-346, 912-12-109) מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO), על ידי שתי מלגות PhD DCN / Radboud המרכז הרפואי האוניברסיטאי, על ידי רשת פיגור שכלי גרמנית במימון התכנית + NGFN של משרד חינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) ועל ידי Gencodys הרשת המשולב המידה הגדולה FP7 של האיחוד האירופי (בריאותי 241,995) כדי AS. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
- Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
- van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
- Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
- Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
- Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
- Bosch, M., Hayashi, Y.
- Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
- Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
- Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
- Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
- Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
- Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
- Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
- Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
- Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
- Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
- Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
- Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
- Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902 (2013).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
