Summary
두 이미지 분석 알고리즘, "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.
Abstract
시냅틱 형태는 시냅스 효능에 밀접하게 관련되어, 많은 경우에 형태 학적 시냅스 결함은 궁극적으로 시냅스 오작동을 초래할. 초파리 애벌레 신경 근육 접합부 (NMJ), 글루타메이트 시냅스에 대한 잘 확립 된 모델은 광범위하게 수십 년 동안 연구되어왔다. NMJ 형태 학적 결함을 일으키는 돌연변이의 식별 시냅스 개발 및 기능을 조절하는 유전자의 레퍼토리를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들의 대부분은 초파리 NMJ의 형태 학적 이상을 감지하는 질적 접근 방식에 초점을 맞춘 대규모 연구에서 확인되었다. 질적 분석의 단점은 NMJ 형태에 기여 미묘한 플레이어 가능성이 주목 남아 있다는 것입니다. 정량 분석은 형태 학적 미묘한 차이를 검출하는 데 필요한 반면, 수고가 있기 때문에, 이러한 분석은 일반적으로 아직 수행되지 않는다. 이 프로토콜은 두 상세 이미지 분석 알고리즘의 설명 "초파리 초파리 NMJ의 정량적 정확하고 객관적인 형태 학적 분석을 위해 피지 대응 매크로로서 사용할> NMJ Morphometrics "및"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics "이.이 방법은 일반적으로 사용되는 마커 immunolabeled NMJ 단자를 분석하기 위해 개발 굴림-1 . BRP는 또한, 같은 HRP CSP의 및 SYT를 다른 마커의 폭 넓은 응용 프로그램이 프로토콜에 표시되는 매크로는 구 개 형태 NMJ 기능을 평가할 수 있습니다. NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ 길이를 NMJ 긴 지점 길이, 섬의 수, 지점의 수 및 분기점 NMJ 단말의 활성 영역의 수의 수.
Introduction
이러한 지적 장애, 자폐증 스펙트럼 장애와 같은인지 장애, 정신 분열증은 종종 비정상적인 시냅스 기능 1, 2, 3을 특징으로한다. 시냅스의 형태와 기능은 밀접하게 얽혀있다; 형태 적 결함이 시냅스 오작동을 일으킬 수 있고, 역으로, 비정상적인 시냅스 전달은 시냅스 성숙 및 형태 4, 5, 6에 영향을 미칠 것이다.
모델 생물의 수는 더 나은 시냅스 생물학을 이해하고 시냅스 변화가 건강과 질병 7, 8, 9의 뇌 기능에 미치는 영향을 밝혀하기 위해 사용되어왔다. 초파리 NMJ은 광범위하게 연구하고 글루타메이트 SY에 대한 생체 내 모델에서 잘 확립napse 생물학 10, 11. 지난 수십 년 동안,이 모델은 NMJs 사이의 형태 학적 차이를 감지 할 목적으로,뿐만 아니라 대규모 유전 화면에 대한 생리 학적 유전자에 초점을 맞춘 연구에 사용되어왔다. 특히, 순방향 유전자 스크린 시냅스 개발 기초 많은 중요한 레귤레이터 및 메커니즘을 식별하여 12, 13, 14, 15, 16를 작동 하였다. 그러나, 이러한 화면의 대부분 NMJ 단말기 형태의 시각적 평가 및 정성 시냅스 이상 검출 또는 몇몇 형태 적 특징의 반 정량적 점수에 의존. 결과적으로, 인간의 눈에 비 명백하다 오히려 미묘한 시냅스 형태 학적 이상이 간과하기 쉬운. 위해서하는 것은 포괄적으로 양적 차이는 감지 할 수 있어야합니다NMJ 정확하게 관심의 형태 학적 매개 변수의 체계적인 정량화에 의해 평가되어야한다. 수동으로 NMJ 기능을 측정하는 것은 여러 NMJ 관심의 기능 및 / 또는 대규모 유전 검사를 수행 할 때이있다, 특히 힘든입니다. multiparametric 높은 처리량 형태소 해석을 지원하기 위해 객관적 정량을 달성하기 위해, 두 매크로 "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics는"17 개발되었다. 두 매크로는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 피지 (18)에서 실행, 모두 공 초점 및 nonconfocal 이미지를 정량화 할 수 있습니다.
"초파리 NMJ Morphometrics"방안은 큰 1 시냅스 마커 디스크 (굴림-1) 또는 연접 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)로 면역 염색 NMJ 단자는 활성 영역 마커 bruchpilot (BRP)와 CO는 표지. 그것은 구 형태 parame을 정량화TERS (이하에서 설명) NMJ 영역 NMJ 경계, 튼스 수, NMJ 길이 NMJ 긴 분기 길이, 섬의 수, 지점의 수, 분기점 및 시냅스 말단 활성 영역 번호의 수 (도 1) . 튼스의 수를 결정하는 알고리즘이 매크로에 존재하지만, 정확성 (17)에 대한 기준을 충족하지 않았다. 적절 튼스의 수를 평가하기 위해, 특별히 반대 Synaptotagmin (SYT를) 또는 항 시스테인 문자열 단백질 (CSP)으로 면역 염색 NMJ 제제를 사용 튼스 정량화하도록 설계된 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"매크로를 사용할 필요가있다, 및 BRP와 공동 immunolabeled. 은 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"매크로는 다음과 같은 매개 변수를 정량화 : 활성 ZO의 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 섬의 수, 지점 수, 분기 지점의 수와 수를NES (도 2).
매크로 3 서브 매크로 구성 : (I)는 "스택 변환"모든 가능한 이미지 파일을 식별하고, Z-hyperstacks 두 채널의 최대 강도 예측을 생성한다. 출력으로,이 매크로는 "stack_image_name"와 "flatstack_image_name"라고 시냅스 당 두 개의 새로운 파일을 생성합니다. II) "ROI 정의"를 연속하여 모두 최대 투영 화상 "flatstack_image_name을"수동으로 열어 관심의 특정 시냅스 단말이 존재하는 관심 (ROI)의 영역을 정의하는 요청들을 제공한다. 이것은 이미지 (11)에 존재할 수있는 인접한 근육 및 / 또는 (예를 들면 1 초 등) 시냅스 말단 다른 유형의 시냅스 연결의 배제를 허용하도록 구현 하였다. (III) "분석"완전히 ROI의 경계 내에서 이미지의 모든 지역에 분석을 자동으로 적용합니다. 같이모든 측정 수치가 주석 될 "RESULTS.TXT"및 매크로에 의해 생성 된 원본 영상 분할이 설명 될 것이다 "res_image_name.tif"이 단계의 결과, 사용자는 두 개의 새로운 파일을 구하는 것이다. NMJ 윤곽은 NMJ 골격과 BRP-양극 활성 영역의 수 : 화상 분석 중에 세 구조는 각각의 시냅스 말단으로부터 유도된다. NMJ 개요는 NMJ 영역과 경계를 결정하기 위해 사용되며, 후속 유역 분리 튼스의 수를 제공한다. 골격에서 다섯 개 NMJ 기능이 도출된다 : 총 NMJ 길이, 두 끝점을 연결하는 가장 긴 연속 경로의 길이의 합 (긴 가지 길이), NMJ 당 연결되지 않은 구획의 수를 ( "섬"이라 ), 브랜치 수 및 분기점 (하나 개의 분기점이 세 개 이상의 분기 접속)의 수. 활성 영역의 수를 카운트하여 BRP 채널의 판단BRP 양성 명소. (주석 NMJ 윤곽 (황색 선)은 NMJ 골격 (청색 라인) 및 (백색 병소로 표시) BRP-양극 활성 영역의 개수는 결과 영상에 표시되는 상기 파라미터의 측정은로 처리된다. TXT) 출력 파일 (도 3).
초파리 NMJ Morphometrics "및"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics 초파리 NMJ Morphometrics "및"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics ""제 설명 광범위 Nijhof 외. (17)에 의해 확인되었다.이 논문은 매크로를 사용 NMJ 형태를 분석하는 방법에 초점을 맞추고있다. " 그럼에도 불구하고, 매크로를 이용한 분석에 앞서, NMJ 해부 및 immunostainings은 이러한 중요한 단계이다. 수행해야하고, 면역 조직 화학에 사용되는 마커의 조합은 매크로 분석에 적합 할 필요가있다. 이러한 단계를 간략하게 언급되어있는 SE이 프로토콜 ction 1, 이러한 절차를 실행하도록 상세히 설명 프로토콜을 참조로 사용자를 안내.
Protocol
이전 이미지 처리 1. 요구 사항
- 이전 19 바와 같이, 제 방황 령 유충 (L3)의 초파리 책 준비를 수행한다.
- 공동 immunolabel 개의 마커의 조합을 사용하여 초파리 NMJ 단자 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"20 분석 BRP 함께 "초파리 NMJ Morphometrics"으로 분석 BRP 및 SYT를 또는 값 (Csp)와 함께 굴림-1 또는 HRP를.
참고 : 동일한 종으로부터의 항체는 예컨대 제논 렉 라벨링 키트 (17)와 같은 항체 결합 키트 미리 라벨링 의해 결합 될 수있다. - (또는 ApoTome없이) 예를 들어, 선택, 형광 또는 공 초점 현미경의 현미경을 사용하여 이미지 NMJ 터미널.
- NMJ 단말의 2 채널 영상 스택을 획득.
- 방식으로 현미경 설정을 조정 채널 1BRP와 immunolabeled NMJ 단말기 (2) 굴림-1 (또는 HRP, SYT를 CSP의) 및 채널 immunolabeled NMJ 단자를 취득한다.
- 선택적으로, 매크로 (단일 항체 immunolabeled 시냅스) 한 채널의 이미지를 분석한다. 이미지 NMJs는 "초파리 NMJ Morphometrics"또는 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"에 대한 SYT를 또는 값 (Csp)와 분석을 위해 굴림-1 또는 HRP와 고유 immunolabeled.
참고 : 그것은 단지 안티 - BRP와 면역 염색 시냅스를 분석 할 수 없습니다.
- 개인의 티파니 파일로 얻어진 이미지를 내 보냅니다. 표시된 인수하지 않을 경우 매크로를 실행하기 전에 채널 순서를 반전.
- NMJ 단말의 2 채널 영상 스택을 획득.
2. 소프트웨어 요구 사항 및 설치
- 매크로 다운로드 : "초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"을 다음 웹 사이트에서 : https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a
- 폴더 "매크로 업데이트 1"로 커서를 이동하고 나타나는 옵션 "보기"를 클릭합니다. 이 폴더의 내용 목록이 나타납니다. 폴더는 매크로 "초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"를 포함하고 있습니다.
참고 : 두 매크로 같은 폴더에 제공되는 피지 버전 1.4과 호환됩니다. 매크로는 최근 버전에서 실행되지 않을 수 있습니다. 제공된 버전 1.4을 이용하시기 바랍니다. 사용할 수있는 최신 피지 버전도 컴퓨터에이 버전을 시작하는 것이 문제가없는 것입니다.- "모두 다운로드"를 클릭합니다. 폴더의 콘텐츠는 .zip 파일로 컴퓨터에 다운로드됩니다. 다운로드 한 파일의 압축을 풉니 다.
- Fiji.app/plugins/ 디렉토리에 초파리 _NMJ_Morphometrics.ijm 초파리 _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm 파일을 복사합니다. 프로그램을 다시 시작하면, 매크로는 플러그인의 하단에 나타납니다드롭 다운 메뉴.
- 폴더 "매크로 업데이트 1"로 커서를 이동하고 나타나는 옵션 "보기"를 클릭합니다. 이 폴더의 내용 목록이 나타납니다. 폴더는 매크로 "초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"를 포함하고 있습니다.
3. 실행 하위 매크로는 NMJ 이미지의 Z-계획과 Hyperstacks 만들기 "스택으로 변환"
- 드롭 다운 메뉴에서 "초파리 NMJ Morphometrics를"도구 모음에서 플러그인을 선택하여 그래픽 인터페이스를 시작하고 선택합니다.
- 매크로의 그래픽 인터페이스에서 "고유 파일 문자열"설정을 정의합니다.
참고 : 현미경 소프트웨어는 개인의 .TIFF 파일로 스택을 저장할 때 비행기와 채널을 구성 할 수 식별 서명을 사용합니다. 입력 된 고유 한 파일 문자열 설정은 첫 번째 채널의 첫 번째 평면에 소프트웨어에 의해 할당 된 서명을 지정해야합니다 (중요 : 평면과 채널 번호가 필요로 가장 낮은 표시한다). - 단지 서브 매크로 "확인"을 클릭하고 이미지가있는 폴더를 선택 "스택 변환"을 선택합니다. 여러 하위 폴더 메인 디렉토리를 선택하면, '모든 개인은 티파니가 내 파일고유 파일 문자열 기준과 일치하는 주요 디렉토리 및 하위 폴더 처리됩니다.
- 의 z 스택은 하나 개의 채널을 포함하는 경우, 박스 "채널 1 단지"를 선택합니다.
- 기본적으로 NMJ 이미지 당 두 개의 새로운 파일이 stack_image_name 되나 및 flatstack_image_name이 나타납니다 것을 알 수 있습니다. 추가 분석 만이 스택과 flatstack를 저장합니다. .TIFF 파일 시리즈는 필요한 저장 용량을 최소화하고 잠재적 인 오류 소스를 피하고,이 시점에서 삭제할 수 있습니다.
4. 실행 하위 매크로는 관심의 NMJ 터미널을 윤곽을 그리다 "투자 수익 (ROI)을 정의"
- "초파리 NMJ Morphometrics"의 그래픽 인터페이스를 시작합니다.
- "투자 수익 (ROI)을 정의합니다"하고 "확인"flatstack_name를 제목의 영상이 저장하고 "선택"하는 주요 디렉토리를 선택한 경우에만 확인란을 선택합니다. 하위 매크로 "투자 수익 (ROI)을 정의"가 자동으로 모든 하위 폴더를 검색선택한 주요 디렉토리 내.
- 제 1 돌출부가 열립니다 도구 모음에서 "자유형 선택"도구를 선택합니다. 마우스가 독점적으로 관심의 전체 NMJ 터미널을 포함하는 선택을 그리고 창 "터미널 정의"의 "확인"을 클릭하여. 매크로는 다음 돌기가 진행됩니다.
- 다음 ROI의 윤곽을 모든 로아가 정의 될 때까지 반복합니다. "roi_image_name"라는 ROI의 이미지 파일은, 상기 처리 화상의 각각에 대해 이전에 생성 된 스택과 투영 화상과 동일한 디렉토리에 저장된다. 이 서브 매크로의 출력은 검은 색 바탕에 흰색의 ROI의 이진 이미지이다.
"분석"5. 실행 하위 매크로 NMJ 터미널의 특징을 정량화하기
- "플러그인"사용을 선택하고 도구 모음으로 이동
"초파리 _NMJ_Morphometrics"반 굴림-1 또는 항 HRP (채널 1)과 immunolabeled 시냅스를 분석 할 때 서로안티 BRP (채널 2), 또는 "초파리 _NMJ_Bouton_Morphometrics"BRP로 (채널 1) 함께 항 또는 SYT를 방지-CSP와 immunolabeled 시냅스를 분석하는 (채널 2).- 하나의 채널 이미지 스택 분석 할 때 ( "Drosophila_ NMJ_Morphometrics"또는 SYT를 또는 "초파리 _NMJ__Bouton_Morphometrics"의 값 (Csp)에 대한 채널 구조 굴림 HRP-1)는, 박스 "채널 1 단"을 선택한다.
- 이미지에 대응하는 스케일을 조정하는 분석한다. 화상의 1 개 화소에 대응 2.5 μm의 경우, 2.5 ㎛의 규모 = 화소 = 1, 스케일의 거리를 나타낸다. 경우 모두 설정은 NMJ 영역 둘레 길이가 가장 긴 분기 길이는 픽셀 수로 표현되고, 0으로 남겨진다.
- 필요한 경우, 매크로의 기본 분석 설정을 조정합니다. 하위 매크로 "분석"경우에만 조정 (만족스럽지 못한 결과이 섹션 및 DETE를 수행섹션 6 rmined 더 나은 설정) 실행하고있다.
- 확인란을 선택 "분석"과 "대기"하고 "확인"을 누릅니다.
- 2 개 채널 이미지에 서브 매크로 "분석"을 실행하면 "대기"확인란을 선택합니다. 그렇지 않으면 활성 영역 계산의 오류로 인해 제한 컴퓨터 용량에 발생할 수 있습니다.
- 새 창으로 열립니다 "디렉토리가 선택"이미지가 "선택"위치를 눌러 디렉토리를 선택합니다. 적용 이후의 폴더 (: stack_image_name, flatstack_image_name 및 roi_image_name 이전의 서브 매크로를 실행에서 세 개의 파일을 사용하는) 경우 매크로는 메인 디렉토리에 저장된 모든 이미지를 분석하고 있습니다. 매크로 프로세스 개별적 연속적으로 각 이미지. 이것은 (컴퓨터 용량에 따라) 이미지 스택 당 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 매크로를 실행 한 후, 각각에 대해 새 이미지 파일 이름 res_image_name 분석 참고 시냅스 CREA 될 것입니다 저장부모 폴더에 테드. 정량적 측정은 "RESULTS.TXT"파일로 저장됩니다.
- 감지하고 세분화 오류가있는 사진을 제외 할 모든 결과 이미지를 검사합니다. 가능한 분할 오류는 다음을 우회하기 위해 설정을 조정하는 방법을 조언과 함께, 표 3에 설명되어 있습니다. 이러한 분할 오류와 결과 이미지는도 4의 실시 예로서 제공된다.
참고 : 사용자 인터페이스에서 관찰 된 기본 설정을 사용하여 매크로를 실행하는 경우, 매크로 평가 수동 평가 (17)와 비교했을 때 약 95 %의 정확도를 있었다.
6. 이미지에 매크로 설정 조정
- 이미지의 5 % 이상이 분할 오류를 표시하는 경우, / 정의 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 선택하기 위해 다른 알고리즘을 탐구한다.
- 롤링 볼 반경 값을 조정
참고 : 롤링 볼 반경함수는 이미지의 배경을 감산한다. 형광 현미경에 획득 된 영상 작업을 할 때이 기능은 매우 중요하다 및 / 또는 이미지가 높은 배경 잡음이있을 때. 배경의 감산은 NMJ 터미널의 적절한 분할을 생성하는 매크로의 자동 임계 단계를 도움이 될 것입니다.- 세 NMJ Z-돌기 이미지 데이터 집합의 대표 (서브 매크로 "스택 변환"에 의해 생성 flatstack_image_name 화상)을 선택한다.
- 도구 모음에서 [이미지 | 컬러 | 분할 채널. 두 이미지는 하나의 채널 1과 다른 채널 2를 차지 생성됩니다.
- 굴림-1, HRP, 또는 SYT를 CSP는 immunolabeling에 대응 한 개방 채널 및 이미지를 닫아 BRP 채널 영상을 폐기 속하는 영상만을 유지.
- 드롭 다운 메뉴에서 다음 도구 모음에서 "프로세스" "빼기 배경을 ..."를 선택하여 필터 "빼기 배경"을 실행합니다.
- 팝업 창에서 미리보기 체크 박스를 클릭하고 패널 (그림 5A ')에서와 시냅스와 배경 사이의 대비를 증가 값으로 롤링 볼 반경을 조정합니다.
참고 : 예를 들어 그림 5를 참조하십시오. 도 5a에 '500로 설정 "롤링 볼 반경"은 시냅스와 배경 사이의 강력한 콘트라스트를 생성하는 반면 Figure5A에서 시냅스 부분은 배경과 동일한 계조를 표시한다. - 롤링 볼 반경에 해당하는 값이 정의되면, 동일한 롤링 볼 반경 값을 선택한 Z-전망에서 "빼기 배경"알고리즘을 실행하고 (디렉토리)에 저장합니다.
주 : 8 비트 또는 RGB 이미지에 대한 롤링 볼 반경 값은 배경의 일부가 이미지의 가장 물체의 반경 이상이어야한다. 16 비트 및 32 비트 이미지의 반경이 반전되어야화소 값 범위 22 ersely 비례한다.
- 사용되는 다른 자동 임계 값을 결정
- 이전 단계 (6.2.6)에 저장된 Z-전망을 열고 이미지를 선택 | 조정 | AutoThreshold | 모두를보십시오.
- 이진 역치 결과 이미지가 모두 다른 자동 임계 값 알고리즘을 나타 바와 같이, 이미지에 가장 적합한 알고리즘을 결정합니다.
- 나중에 매크로를 실행하는 경우, 그에 따라 매크로 설정에서 임계 값을 변경합니다.
- 활성 영역을 결정하기 위해 예컨대 "RenyiEntrophy"또는 NMJ 골격을 결정하기 NMJ 개요 액 및 "리튬"로 더 허용 임계 값으로서 "순간"와 "황"로 더 엄격한 임계치를 사용한다. 이미지가없는 배경에 작은 매우 날카로운 경우, 그렇지 않으면 시냅스의 부분 영상 분할 후 누락 될 수 있습니다. NMJ 개요 임계 값 "으로"황 "을 사용합니다.
- 예제는 그림 5B를 참조하십시오. 시냅스의 적절한 분할 녹색 상자로 강조 자동 임계 값으로 얻을 수있다. 비 적절한 임계 값의 예로는 빨간색 상자 (고배율에서 시냅스를 확인)에 의해 강조 표시됩니다. 후자에서, 시냅스의 어느 부분이 누락 또는 배경의 일부가 포함된다. 자세한 내용은 23를 참조하십시오.
- 작은 입자의 최대 크기를 결정
참고 :이 기능은 분석에서 "작은 입자 설정"에 정의 된 값보다 작은있는 NMJ 개요 임계 값과 해골 임계 값에 의해 탐지 된 모든 입자를 제외됩니다. 이 값은 픽셀 단위로 정의된다. 이 함수는, 노이즈 필터로서 작용하고 (예컨대 결정 / 먼지 등) 불균일 한 배경의 높은 비율이 얻어진 화상에 존재하는 경우에 매우 유용하다.- 단계 6.2.6에 저장된 Z-전망을 엽니 다. 및 설정규모가 분석을 통해 픽셀 수를 감지하는 | 설정 규모. 다음 설정을 적용 거리 (픽셀 단위) = 1 인 경우, 공지 된 거리 = 1 픽셀 종횡비 = 1, 길이 = 화소 및 "OK"를 누르면 단위. 도구 모음에서 "타원형 선택"도구를 클릭합니다.
- 마우스를 사용하면 더욱 밀접하게 면역 염색에 존재하지만 NMJ에 속하지 않는 하나의 입자를 둘러싸고있는 선택을 그립니다. Mac 사용자를위한 Windows 사용자 또는 cmd를 + m에 대한 Ctrl 키 +의 m. 따라서 윈도우의 픽셀 수에서 선택된 입자의 면적을 나타내는 열 것.
- 가장 큰 오염 입자 / 유물의 영역을 결정하기 위해 이미지에 존재하는 여러 유물과 이전 단계를 여러 번 반복합니다. 이것은 나중에 매크로를 실행할 때 설정에서 설정 값이됩니다. 가장 작은 입자 크기 관찰 고름과 "작은 입자 크기"25 %의 마진을 설정 매크로를 실행하는 경우.
- 예제는 그림 5D를 참조하십시오. 가장 큰 결정 감지ED (112 개)의 화소 영역을 갖는다. 150 - 매크로와,이 화상을 처리 할 때 "작은 입자 크기"설정, to125 설정되어야한다.
- 최소 부통의 크기를 결정
참고 :이 기능은 분석에서 정의 된 값보다 작은있는 NMJ 개요 임계 값에 의해 탐지 된 모든 튼스 제외됩니다. 이 값은 픽셀 단위로 정의된다.- 6.4 절에 설명 된 것과 동일한 단계를 수행하지만,이 경우 NMJ 단말에 존재하는 작은 주변 튼스 선택을 그린다. 측정 된 것들 중 가장 작은 부통에 해당하는 작은 영역을 선택합니다. 이것은 나중에 매크로를 실행하는 경우 최소 부통 크기 설정에서 설정 한 값입니다.
- 정의 값 "최대 노이즈 내성을 찾기"
- 섹션 6.2.1에서 선택한 Z-hyperstacks를 사용합니다.
- 도구 모음에서 [이미지 | 컬러 | CREA에 분할 채널TE 2 스택 (채널 1, 채널 2)를 열어 BRP 채널에 대응하는 이미지를 유지한다. 이를 폐쇄함으로써 다른 채널 영상을 버린다.
- 프로세스를 선택하고 팝업 메뉴에서 플러그인 탭으로 이동 | 최대 (3D) 및 maximum_image_name가 (몇 분 정도 걸릴 수) 나타날 때, 원본 이미지 스택을 닫습니다.
- | 최대 ... 여기서 image_name (얻어진 이미지 스택)을 선택하고 플러그인을 선택 프로세스 | 최소 (3D)는 최대 ... 여기서 image_name 스택을 닫습니다.
- 도구 모음에서 처리를 선택 | 최대 찾기 .... 새 창이 "찾기 최대 ..."이 열립니다. "... 미리보기 포인트 선택"체크 박스를 클릭하고 작은 십자가 이미지에 표시됩니다 (50) 최대 포인트를 기본 설정 매크로와 함께 "소음 허용"상자를 입력합니다.
- 에있는 활성 영역의 상단에없는 주석 활성 영역, 즉 십자가의 과잉을 관찰하면 "소음 허용"값을 증가배경에서 검출 된 선택된 스택면 또는 거짓 활성 영역에 초점을 맞춘다.
- 불완전 활성 영역을 주석 지켜보고 다른 한편, 만약의 "소음 허용"값을 감소 레이블 인식하지 초점 활성 영역을 즉. 십자가가 적절하게 초점 활성 영역에 레이블을하는 때까지이 절차에 따라 다른 값을 계속 시도. 이 값을 "찾기 최대 소음 허용"을 입력합니다.
- 예제는 그림 5C를 참조하십시오. 너무 많은 활성 영역이 검출된다. 도 5c에서 "단 초점의 활성 영역이 검출된다.
- 에있는 활성 영역의 상단에없는 주석 활성 영역, 즉 십자가의 과잉을 관찰하면 "소음 허용"값을 증가배경에서 검출 된 선택된 스택면 또는 거짓 활성 영역에 초점을 맞춘다.
- 하위 매크로는 이전의 모든 단계에서 정의 된 설정 단계 5.1에서 선택한 대표 이미지에 대해 "분석"실행합니다.
- 하위 및 상위 임계 BRP-puncta의 조정을
- 새 파일이 m을 실행 한 후 나타나는 될 것으로 주목아크로있어서 6.6라는 2_active_zone_stack_image_name로 진행한다. 이 이미지의 각면에 백색 도트로 표시되는 "최대 값 찾기"기능에 의해 검출 된 상기 활성 영역을 스택.
- 드래그하고 도구 모음을 선택 이미지에 놓아이 파일을 엽니 다 | 스택 | Zproject | 프로젝션 타입 = 합계 조각. 2_active_zone_stack_image_name의 투영을 수득한다.
- 선택 이미지 | 조정 | 문지방. 새 창이 "임계 값"이 열립니다. 원하는 모든 초점 / BRP 양성 반점이 빨간색으로 시각화되어, 임계 값을 선택할 수있는 상단 바를 밀어 넣습니다.
참고 : 임계 값이 너무 낮게 설정되어있는 경우, 활성 영역의 과잉이 계산됩니다. 너무 높게 설정하면, 활성 영역의 일부가 누락됩니다.- 예제는 그림 5E를 참조하십시오. 임계 값이 400으로 설정되면 이들은 적색 (도 5에서 강조되어 있지 않기 때문에, (1 개 화소의 초점으로 상징)는 활성 영역의 대부분은, 세그먼트에 포함되지E). 임계 값은 50의 값으로 설정되면 모든 활성 영역은 적색 (도 5E ')으로 표시된다.
- 최소 임계 값으로이 값을 정의합니다. 최대 값의 "상단 puncta의 임계 값"을 둡니다.
- 하위 매크로는이 섹션의 모든 이전 단계에서 정의 된 설정으로 대표 이미지 "분석"다시 실행하십시오. 비판적 결과 이미지 파일을 평가하고 분할이 제대로되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 분할 오류의 성질 (도 4, 표 3)에 따라서 설정을 재조정.
Representative Results
텍스트 결과 파일은 주 디렉토리에 표시됩니다. 그것은 이미지 당 측정 된 모든 매개 변수를 요약 한 것입니다. 결과를 파일명에 연결되어 상기 파라미터이어서 표 1 및 표 2에 나타낸 순서로 요약된다.
Res_image_name는 세 화상 스택이다. 첫번째 이미지 (굴림-1, HRP, SYT를, 또는 값 (Csp) immunolabeling) 윤곽과 채널 1에 기초하여 상기 매크로 결정된 NMJ 단말의 골격을 강조한다. 두번째 이미지의 첫 번째 이미지의 사본이며, 별도로 도식화 초점으로서 채널 2에서 검출 된 식별 BRP 양성 스폿을 나타낸다. 세번째 이미지 식별 BRP 양성 병소와 함께 상기 제 2 채널의 최대 투영을 제공한다.
NMJ 개요 임계치 매크로 출력 결과 화상에 노란색으로 표시된다. NMJ 지역, 페림eter와 튼스의 수는이 임계 값에서 추론된다.
NMJ 골격 임계치 매크로 출력 결과 이미지에서 청색으로 표시된다. 포인트와 섬 분기 NMJ 길이, 긴 가지 길이, 지점의 수는이 임계 값에서 추론된다.
NMJ 활성 영역 임계 값은 매크로 출력 결과 화상에 표시되지 않는다. 이 임계 값은 BRP 양성 병소 잠재적 매크로에 의해 발생 될 수있는 영역을 결정한다. NMJ 개요 임계 값에 의해 정의 된 하나보다 약간 더 큰 인 NMJ 영역을 작성하기위한 것입니다. 너무 제한적인 임계 값을 선택하면 시냅스의 여백에있는 BRP 양성 초점이 제외 될 수 있습니다. 임계 값이 너무 허용되면, 배경 잡음이 스폿 (- 2,도 1) BRP 양성으로 간주 될 수있다.
valida으로테 "초파리 NMJ Morphometrics"매크로의 성능이 이미 다른 시냅스 NMJ 파라미터 결함을 제시하는 설명 된 세 돌연변이 조건을 시험 하였다. 각각의 결함은 매크로 (NMJ 개요 각각 17 골격 또는 활성 영역)에 의해 수행되는 다양한 이미지 분할 방법에 의해 검출되었다. 유도 RNAi에 의한 관심과 수행 해부 및 L3 유충의 NMJ의 면역 염색의 세 가지 유전자를 대상으로 한 매크로가 실행되었습니다. 얻어진 NMJ 형태 측정 후 t-test를 이용하여 비교 (대 그 제어의 RNAi)을 쌍으로 하였다. 세 가지 경우 모두 통계적 차이가 돌연변이와 이전에보고 된 형태의 결함과 일치한다 매개 변수에 영향을 미치는 컨트롤 사이에서 발견되었다. 이 매크로는 참으로 적절 초파리 NMJ에서 이전에 설명 된 결함을 식별 할 수있는 것을 확인합니다.
Ankyrin 2 (Ank2, CG42734) 변이체는 융합 튼스 작은 NMJs 포함 시냅스 형태의 결함을 표시하는 것으로 알려져있다. 이 결함은 Ank2 돌연변이 체 (24), (25)에 대한 관찰과 Ank2의 최저 26 날아간다. 팬 신경 Ank2-의 RNAi 녹다운 파리 NMJ 단자 t 테스트 p = 2.18 (w; UAS-Dicer에-2 / UAS-Ank2 RNAi의 KK107238는, elav-GAL4는 / +)이 상당히 작은 NMJ 영역을 보였다 (= 339.25 μm의 2 의미 X 10-8)와 경계 (평균 = 238.24 μm의; t 테스트 p = 1.82 × 10 -3), w 유전 배경 제어 데이터 세트 (비교; UAS-Dicer에-2 / UAS-KK60100; elav - GAL4 / + () = 451.95 μm의 2를 의미하고 "초파리 NMJ Morphometrics"(도 6a 및도 4b)를 실행 한 후 = 288.62 μm의 각각)을 의미한다.
는 GTPase Rab3 (CG7576) bruchpilot 적절한 분포가 필요하고, RUP 돌연변이 활성 영역 (27)의 상당히 감소 된 숫자로 나타낸다. 활성 영역의 수의 상당한 감소가 관찰 한 팬 신경 Rab3 최저 파리 (w의 NMJ 단자에서 "초파리 NMJ Morphometrics"매크로 의해 BRP 양성 병소를 측정하는 단계; UAS-Dicer에-2 / UAS-RNAi의 KK100787; elav -Gal4). Rab3 -RNAi에 NMJ 단말기 당 활성 영역의 평균 수는 제어 데이터 세트 (/ +) t 테스트 (P)의 검출 (290) = 4.43 × 10 -29) (도 6a 및도 4c)에 대조적으로 138이었다.
의 HighWire (HIW, CG32592)는 NMJ 성장의 중요한 레귤레이터; HIW 유전자 리드 돌연변이 자라다 및 NMJ 단자 (28)의 분기를 확장한다. 범 신경 HIW -RNAi의 최저 선 (w의 NMJ 단자를 측정하는 단계; U를AS-Dicer에-2 / UAS-의 RNAi-GD36085; elav-GAL4는 / +) "초파리 NMJ Morphometrics"로, 유의 한 차이가 골격 유래 파라미터 관찰되었다 : 길이 (= 147.36 μm의 평균, t, 제어 = 122.07 μm의 의미 제어 평균 = 105.65 μm의; -test p = 7.31 × 10-7), 긴 분기 길이 (= 122.19 μm의 평균 X t 테스트 p = 4.62 × 10 -4) 분기 (= 7.69 평균 개수, 평균 제어 = 5.74; t 테스트 p = 2.52 × 10 -2)와 분기점 (평균 = 2.73의 수, 평균 제어 = 1.79, t 테스트 p = 3.31 × 10 -2). 모든 이들 파라미터는 현저하게 증가되었다 (120~180%) 유전 적 배경 대조군과 비교 (w; UAS-Dicer에-2 / UAS-GD60000; elav - GAL4 / +) (도 6a 및도 4d).
그림 1 : 초파리 _NMJ_Morphometrics는 Drosophi 9 개 매개 변수를 측정라 NMJ. 왼쪽에 굴림-1, BRP는 ApoTome과 형광 현미경에 이미징 NMJ 단자를 immunolabeled이다. 오른쪽은 "초파리 NMJ Morphometrics"를 실행 한 후 결과 영상이다. 파라미터 영역 경계와 튼스을 나타내는 매크로 - 주석 노란색 윤곽선으로 표시된다. 매개 변수의 길이는 가장 긴 지점 길이 (LBL), 지점, 분기 포인트와 섬은 매크로 주석 파란색 1 {에 의해 제공됩니다. BRP-immunolabeled 병소 (활성 영역)은 결과 이미지에서 백색 반점으로서 매크로에 의해 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics은 초파리 NMJ 8 개 매개 변수를 측정합니다. 왼쪽에SYT를-1, BRP는 ApoTome과 형광 현미경에 결상 NMJ 단말기 immunolabeled이다. 오른쪽은 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"를 실행 한 후 결과 영상이다. 매개 변수 튼스과 부통 영역은 매크로 주석 노란색 테두리로 표시됩니다. 매개 변수의 길이는 가장 긴 지점 길이 (LBL), 지점, 분기 포인트와 섬은 매크로 주석 파란색 1 {에 의해 제공됩니다. BRP-immunolabeled 병소 (활성 영역)은 결과 이미지에서 백색 반점으로서 매크로에 의해 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 초파리 NMJ Morphometrics 초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics 매크로를 대표하는 흐름도. 첫 번째 서브 매크로 "t 변환스택 O "이미지화 NMJs의 돌기와 hyperstacks을 생성한다. 제 2 서브 매크로", "관심 NMJ 단말의 위치를 정의하는 수동 입력이 필요하다. 세 개의 서브 매크로"ROI 정의 분석 "대책 모두 NMJ 파라미터. 텍스트를 정량적 인 값과 매개 변수 묘사를 묘사 결과 이미지 파일이 들어있는 파일이 매크로 성능에 대한 사용자의 평가를 지원하기 위해 만들어집니다. 이미지가 서로 다른 조건에 따라 취득한 경우, 매크로 설정을 테스트하고 정확한 분석을 보장하기 위해 조정해야합니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 4 : 부적절한 매크로 분할 결과의 예. "초파리 NMJ Morphometr를 실행 한 후 결과 이미지ICS "또는"초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics는 ". 시냅스 말단의 일부가 황색 윤곽 (A)에 포함되지 않는다. 배경의 부분이 황색 윤곽 (B)에 의해 시냅스 말단에 포함되어있다. 블루 골격 선이 넘어 연장 시냅스 단말기. (C - D)가 너무 많은 활성 영역이 검출된다 (E - E ') (. 일부 활성 영역이 분석 G - G)가 미결 상태를 유지 ".. 활성 영역은 시냅스 (F) 잘못된 부통 분할 밖에 검출 (초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics를 실행하는 경우 만 해당)은, 튼스가 (H)을 누락하거나 너무 많은 튼스는 세그멘테이션 (I)에 의해 검출된다. 세그먼트에 포함 된 배경 부분 입자 등의 결정 또는 분진 (J) . 이러한 오류를 방지하기 위해 설정을 변경하는 방법에 대한 정보는 표 3에 제공 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 매크로 설정 조정 및 이미지 분할에 대한 그 영향의 예. "롤링 볼 반경은"20 (A) 또는 (500) (A ')로 설정되어있는 경우 (A)와 ApoTome 형광 현미경에 결상 굴림 -1- immunolabeled 시냅스의 배경 미리 뺀다. (B) 출력 이미지를 실행 한 후 얻은 이미지 | 조정 | 자동 임계 값 | 16 다른 자동 임계 값 알고리즘에 의해 얻어진 영상 분할을 도시 한 모든 화상을보십시오. 50 (C) 500 (C ')에서 "노이즈 내성을"설정시 (C) 미리보기 "맥시마 찾기"; 행분할하여 검출적인 영역이 작은 단면으로 분류된다. 공 초점 현미경에 이미징 항 HRP와 immunolabeled 시냅스의 이미지 배경에 나타나는 "작은 입자"의 (D) 측정. (E) "합 슬라이스"투영은 2_active_zone_stack_ima-ge_name로부터 획득. 임계 값은 400 (E)에서 50 (E ')로 설정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 : 굴림 BRP-1의 "초파리 NMJ Morphometrics"매크로를 실행 한 후 근육 (4) (A) 결과 이미지에서의 매크로 NMJs 평가 및 정량화 NMJ 단자 immunolabeled. 매개 변수 영역, 경계 및 부통들 매크로 주석 노란색 테두리로 표시됩니다. 매개 변수의 길이는 가장 긴 지점 길이 (LBL), 지점, 분기 포인트와 섬은 매크로 주석 파란색 1 {에 의해 제공됩니다. BRP-immunolabeled 병소 (활성 영역)은 결과 이미지에서 백색 반점으로서 매크로에 의해 표현된다. 스케일 바는 20 μm의 나타낸다. (B)는 RNAi를 나타낸다 Ankyrin2에게 작은 NMJ 영역과 경계 유전자 녹다운 배경 대조군과 비교 하였다. (C) Rab3 최저 유전 배경 대조군과 비교 BRP-양극 활성 영역의 하부 번호 NMJs 결과. (D)의 HighWire 최저 더 분지 유전 배경 제어 NMJs 비교 NMJ 단자 당 분기 포인트보다 긴 브랜치 길이가 긴 결과. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다 ** p <0.01, 두 개의 꼬리 T 테스트. 그는를 클릭하십시오이 도면의 확대보기 재.
| 매개 변수 | NMJ 구조 | 설명 |
| 지역 (μm2) | NMJ 개요 | 전체 분류 NMJ의 영역 |
| 경계 (μm의) | NMJ 개요 | 면적에 속하는 주변 |
| #Boutons | NMJ 개요 | NMJ의 시냅스 부 튼스 ( '문자열 진주')의 수 |
| 길이 (μm의) | 해골 | 완전한 NMJ 단말기의 전체 길이 |
| 가장 긴 지점 길이 (μm의) | 해골 | NMJ의 두 끝점을 연결하는 연속적인 긴 경로의 길이의 합 |
| #분기ES | 해골 | 지점의 총 수 |
| #Branching 점 | 해골 | 포인트 분기의 수는 (여러 가지가 하나 개의 분기점에서 파생 할 수 있습니다) |
| #Islands | 해골 | 비 접속 Dlg1 양성 시냅스 구획의 번호 (또는 다른 염색) |
| #Active 영역 | BRP 양성 명소 | BRP 염색에 기초하여 활성 영역의 수, |
표 1 : "초파리 NMJ Morphometrics"에 의해 측정 NMJ 매개 변수. 은 "초파리 NMJ Morphometrics"매크로 의해 측정 NMJ 파라미터는 표에 기재된 순서에 따라, 수득 된 텍스트 파일 목록으로 표시된다. 이 테이블은 Nijhof 등의 알에서 다시 인쇄됩니다. (17)
| 매개 변수 | NMJ 구조 | 설명 |
| 튼스 | NMJ 개요 | NMJ의 시냅스 부 튼스 ( '문자열 진주')의 수 |
| 부통 지역 | NMJ 개요 | 모든 튼스의 총 면적 |
| 길이 (μm의) | 해골 | 완전한 NMJ 단말기의 전체 길이 |
| 가장 긴 지점 길이 (μm의) | 해골 | NMJ의 두 끝점을 연결하는 연속적인 긴 경로의 길이의 합 |
| #Branches | 해골 | 지점의 총 수 |
| #Branching 점 | 해골 | 목포인트 분기의 전자 수는 (여러 가지가 하나 개의 분기점에서 파생 할 수 있습니다) |
| #Islands | 해골 | 비 접속 Dlg1 양성 시냅스 구획의 번호 (또는 다른 염색) |
| #Active 영역 | BRP 양성 명소 | BRP 염색에 기초하여 활성 영역의 수, |
표 2 : "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"에 의해 측정 NMJ 매개 변수. 은 "초파리 _Bouton_NMJ_Morphometrics"매크로 의해 측정 NMJ 파라미터는 표에 기재된 순서에 따라, 수득 된 텍스트 파일 목록으로 표시된다. 이 테이블은 Nijhof 등의 알에서 다시 인쇄됩니다. (17)
| 분할 | 예 | 필요한 조정 | ||
| NMJ 영역 및 (결과 화상의 윤곽 노란색으로 표시) 둘레 | 시냅스 말단의 어느 부분이 황색 윤곽 또는 배경 부에 포함되지 않는 황색에서 설명한 시냅스 말단에 포함되어있다. | 도 5A-B | '롤링 볼 반경'값을 조정합니다. 6.1 절을 참조하십시오. | 'NMJ 개요 임계 값을'조정합니다. 6.2 절을 참조하십시오. |
| NMJ 길이 관련 파라미터 (결과 이미지에서 청색 골격 선으로 표시) | 블루 골격 선을 넘어 연장 또는 전 시냅스 말단 함께 존재하지 않는 하나. | 그림 5C-D | '롤링 볼 반경'값을 조정합니다. 6.1 절을 참조하십시오. | 'NMJ 개요 임계 값을'조정합니다. 6.2 절을 참조하십시오. | </ TR>
| (결과 이미지에서 점으로 표시 함) BRP 양성 puncta의 | 너무 많은 활성 영역이 검출된다. | 그림 5E-E ' | '최대 노이즈 내성을 찾기'값을 줄입니다. 6.5 절을 참조하십시오. | |
| (결과 이미지에서 점으로 표시 함) BRP 양성 puncta의 | 활동 영역은 분석에 의해 놓친된다. | 그림 5G-G ' | '최대 노이즈 내성을 찾기'값을 늘립니다. 6.5 절을 참조하십시오. | 'BRP-puncta의 낮은 임계 값'을 줄입니다. 6.6 절을 참조하십시오. |
| (결과 이미지에서 점으로 표시 함) BRP 양성 puncta의 | 활성 존 아티팩트는 시냅스 말단 밖에서 검출된다. | 그림 5 층 | '활성 영역 임계 값'6.2 절을 조정합니다. | 'BRP-puncta의 낮은 임계 값을'늘립니다. 6.6 절을 참조하십시오. |
| 작은 입자 | 배경의 일부가되는 결정 또는 먼지와 같은 입자는 세그먼트에 포함되는 것으로 보인다. | 그림 5J | '작은 입자를 제거'확인란을 선택합니다. 6.3 절을 참조하십시오. | 작은 입자에게 최대 크기를 결정합니다. 6.3 절을 참조하십시오. |
| 부통 분할 | (초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics에만 적용, 부통 분할을 위해 초파리 NMJ Morphometrics를 사용하지 않는) 잘못된 부통 분할. | 그림 5H-I | 'NMJ 개요 임계 값을'조정합니다. 6.1 절을 참조하십시오. | '최소 부통 크기'를 결정합니다. 6.4 절을 참조하십시오. |
표 3 : 매크로에 의해 제조 할 수있다 이미지 분할의 오류의 다른 종류에 대한 가이드 문제 해결. 이 테이블은 다른 종류의 설명매크로에 의해 생성 된 영상 분할 오류. 이들은 쉽게 결과 이미지에서 검출 될 수있다. 각 오류 유형의 예는도 4에 도시된다. 테이블의 "조정 섹션"에서 조정해야 설정이 강조되며, 사용자는 이러한 설정을 조정하는 방법에 대해 설명 제 6의 중요한 하위 단계라고합니다.
Discussion
"초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ 부통 Morphometrics은"시냅스 형태의 평가에 관심이 연구자를위한 강력한 도구입니다. NMJ 매개 변수의 수동 평가는 힘든 것입니다; 이 매크로는 15 분에 숙련 된 연구원을 절약 할 것으로 추정된다 / NMJ 수동 영상 분할에 보냈다. 조건 또는 유전자형에 따라 평가 시냅스 1 ~ 2 수십, 이것은 신속하게 아주 작은 규모의 연구에서, 저장 시간의 상당한 양을 요약한다. 대형 화면을 수행 할 때, 수동 평가 및 정량화에 비해 높은 처리량 분석을 사용할 때의 이득은 엄청난 수있다. 증가 된 처리량에 더하여, 매크로 용이 객관적인 분석을 제공한다; 그들은 그렇지 않으면 눈을 멀게 실험뿐만 아니라 여러 연구자가 분석에 관여 할 때 발생하는 대인 관계의 차이를 필요로 개인 편견을 제외 할 수 있습니다. 마지막으로, 매크로는 민감하고 정확한을 제공극적인 NMJ 결함보다는 미묘한 원인이 지금까지 연구자의 눈에 의해 진가를 인정받지 못한 남아있는 시냅스 규제의 식별을 허용 NMJ 기능 alysis. 검증 절차 및 매크로에 사용되는 알고리즘에 대한 자세한 정보는 게시 Nijhof 등의 알에서 발견된다. (17).
매크로의 기능을 적절하게 근육이어서 4에 초파리 melanogaster의 NMJs의 형태 적 특징을 측정하기 위해 확인 된, 상기 매크로이 유기체의 다른 근육에 시냅스를 분석하기에 적합 있다고 입증되었다. 이 매크로는 다른 초파리 종과 더 곤충을 포함한 다른 종의 유사한 구조와 NMJ의 형태 학적 매개 변수를 측정 할 수있는 가능성이 높습니다. 진화에 매우 먼 심지어 NMJs는, 예를 들면, 마우스의 NMJs는 매우 유사한 구조 형태를 보여 (29). 매크로는 다른 종에서 NMJ 준비에 테스트하지 않은 있지만, 잠재적 인 사용자는 이러한 목적으로 매크로를 테스트하는 것이 좋습니다.
사용자가 / 정의 이미지에 가장 적합한 매크로 설정을 선택할 수있는 다양한 자동 임계 값 및 알고리즘을 탐구하는 것이 매우 중요합니다. 매크로 평가는 수동 평가 비교할 때 이러한 설정으로, 약 95 %의 정확도가 얻어진다. 매크로 설정을 조정하면 제대로 세그먼트는 이미지의 100 %가 매우 힘든 또는 불가능 절차가 될 수 있습니다. 그들의 수는 5 % 이하 경우에 따라서 적절하게 분할되지 이미지를 배제하는 것이 좋습니다. 이미지의 품질이 낮 으면 분명히, 매크로는 만족스럽지 못한 영상 분할의 높은 비율을 생성합니다. 낮은 품질의 이미지는 유사하게 수동 평가에 영향을 미칠 것이다, 따라서 매크로의 성능에 링크 할 수 없습니다. 그들은 이미지 설계된대로 그럼에도 불구하고 매크로 오히려 견고높은 함량 현미경 (17) (샘플의 다수의 이미지를 허용하는 자동 형광 현미경) s의 생성.
중요한 점은 사용자가 시각적으로 매크로에 의해 생성 된 모든 결과의 이미지를 검사한다는 것이다. 이것은 감지하고 만족스럽지 분할로 사진을 제외 할 수 있습니다. 이 프로토콜 (6)에서, 사용자는 "분석"서브 매크로 실행시 정확한 이미지 분할의 설정을 조정하는 방법에 대해 안내된다. 빠르게 매크로의 요구 사항 및 방법 매크로 설정 "매크로 설정을 Examples_adjusting"라는 폴더를 조정하는 방법에 익숙해 매크로 저장소 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a에 포함되어 있습니다. 예제 (고 함량 / 촛점 / 형광 현미경) 다른 현미경 플랫폼에서 얻어진 화상과 다른 immunostainings 열세 하위 각각이 제공된다. PDF 파일 권리 "예 가이드는"동일한에 포함되어 있습니다각 예제에 필요한 설정이 예상 결과와 결과 이미지를 제공하는 텍스트 문서와 함께 제공되는 폴더.
매크로는 티파니 파일을 분리로 저장된 이미지를 처리하도록 설계되었습니다, 그럼에도 불구하고 일부 사용자는 다른 형식으로 자신의 이미지를 저장 한 수 있습니다. 상세한 지침 문서 "예 안내서"어떻게 매크로로 이미지를 가져 - 다음 웹 사이트 https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a (21)는 세 개의 예제 파일 (3 예 1) "초파리 NMJ"라는 이름의 폴더가 티파니 분리 된 파일로 저장되지 않은 경우도 같은 폴더에서 찾을 수 있습니다.
NMJ 지역, NMJ 주변, 튼스의 수, NMJ의 부통 지역, NMJ 길이, NMJ 긴 지점의 길이, 이슬라 번호 : 함께 "초파리 NMJ Morphometrics"와 "초파리 NMJ 부통 Morphometrics"매크로는 10 개 개의 다른 NMJ 기능을 정량화NDS, 지점의 수, 분기점의 수 및 활성 영역의 수. 이것은 단지 하나 또는 몇 시냅스 기능 (30), (31)을 평가할 수 있습니다 지금까지 사용 가능한 도구를 통해 큰 장점을 제공한다. Multiparametric 정량 분석은 시냅스 생물학의 여러 측면까지를 제어하는 새로운 규제를 식별하기 위해 새로운 발견, 예를 들어,에 대한 큰 잠재력을 맺는다. 또한 동일 또는 중복 NMJ 기능을 coregulate 따라서 일반적인 분자 경로에서 작동 할 가능성이 유전자를 결정하는 데 필요한 해상도를 제공합니다. 마지막으로, 유전자 시냅스 파라미터는 조정 된 형태 학적 상관 관계를 확인 교란 조건 (17)으로 서로 상호 얼마나 다른지 조사 할 수있는 가능성을 연다.
함께 찍은,이 프로토콜은 "초파리 NMJ Morphometrics"두 매크로를 사용하는 방법을 보여줍니다 및고 처리량 방법으로 열 개 형태 NMJ 기능 대물 민감한 정량화를 수행 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics".
Disclosures
저자는 공개 관심의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 초파리 균주를 제공하기 위해 비엔나 초파리 리소스 센터 및 블루밍턴 초파리 재고 센터 (NIH P40OD018537)을 인정합니다. 우리는 영상 전문가 지원을 위해 대한 현미경 이미징 센터에서 잭 프랜슨합니다. 이 연구는 독일의 정신 지체 네트워크에 의해, 두 DCN / Radboud 대학 의료 센터의 박사 장학금으로, VIDI 및 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 TOP 보조금 (917-96-346, 912-12-109)에 의해 지원되었다 교육 및 연구 (BMBF)의 독일 연방 정부의 NGFN + 프로그램 및 AS에 대한 유럽 연합의 FP7 대규모 통합 네트워크 Gencodys (건강-241995)에 의해 투자. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining | Dilution | ||
| Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
| Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
| Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
| Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
| Zeiss Axio imager | |||
| Computer | Mac or Pc | ||
| Material | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| FIJI |
References
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