Summary
यहाँ, हम एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पर एक अर्द्ध उच्च throughput सेल प्रवास परख प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल एक सेल monolayer पर लगातार खरोंच घावों को बनाने के लिए एक तेज, सरल और किफायती तरीका है।
Abstract
सेल प्रवास / लोग घायल हो गए परख सेल प्रवास और इस तरह के angiogenesis और ट्यूमर मेटास्टेसिस के रूप में अन्य जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है। इस परख में, कोशिकाओं को एक मिला हुआ monolayer फार्म के लिए बड़े हो रहे हैं और एक यांत्रिक घाव एक डिवाइस के साथ scratching द्वारा बनाई गई है। तब denuded क्षेत्र की ओर कोशिकाओं के प्रवास दर इमेजिंग द्वारा नजर रखी जा सकती है। हमारे 8 चैनल यांत्रिक wounder सेल प्रवास परख के साथ जुड़ी समस्याओं के सबसे निपटने के लिए बनाया गया है। सबसे पहले, हमारे wounder आसानी से autoclaving द्वारा या आम कीटाणुनाशक के साथ निष्फल किया जा सकता है। दूसरे, व्यक्तिगत समायोज्य पिन भी सेल संस्कृति की थाली इतना है कि तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घाव बनाया जा सकता है के साथ संपर्क की अनुमति। तीसरा, wounder के दोनों किनारों पर मार्गदर्शक सलाखों अच्छी तरह से प्रत्येक में लगातार लोग घायल हो गए स्थिति जाता है। घायल आगे wounder की बेहतर हैंडलिंग प्रदान कर सकते हैं के रूप में अच्छी तरह से पार contaminat कम से कम करने के लिए डिस्पोजेबल प्लास्टिक पिपेट सुझावों का उपयोगआयन। अंत में, अपने सेल wounder मानक 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट का उपयोग सेल प्रवास परख प्रदर्शन के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डिवाइस के साथ शोधकर्ताओं प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
सेल प्रवास ऐसी embryogenesis, न्यूरोजेनेसिस, angiogenesis, घाव भरने, श्लैष्मिक मरम्मत, सामान्य विकास और रोग की स्थिति 1 के तहत उपकला-mesenchymal-संक्रमण के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह एक जटिल प्रक्रिया है जो संकेत अणु बातचीत, सेल ध्रुवीकरण, cytoskeletal पुनर्गठन, मैट्रिक्स remodeling, झिल्ली फलाव और गतिशील सेल सेल आसंजन मॉडुलन 2 सहित कई अंतर और अंतर सेलुलर घटनाओं के समन्वय शामिल है। सेल प्रवास का अध्ययन करके, डिस्कवरी और रसायन या biomolecules सेल आंदोलन और इससे संबंधित जैव रासायनिक रास्ते के लिए अग्रणी के सत्यापन निर्धारित किया जा सकता है। यह मौलिक प्रक्रिया ऐसी बीमारी के इलाज और दवा को निशाना बनाने के रूप में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में लाभदायक इस्तेमाल किया जा सकता है।
लोग घायल हो गए परख सेल प्रवास assays के 3 में से एक है। इधर, एककोशिकाओं के अलग-अलग नमूना आंशिक रूप से यांत्रिक तरीकों से हटा दिया जाएगा एक ऐसा क्षेत्र है जहां denuded कोशिकाओं क्षेत्र को कवर की ओर पलायन होगा उत्पादन करने के लिए। एक विशेष समय बिंदु पर वसूली का प्रतिशत नजर रखी जाएगी। जब नमूनों की बड़ी संख्या को संभालने, इस तरह की प्रयोगात्मक लागत और नमूने के भीतर पार संदूषण के रूप में मुद्दों समस्याग्रस्त किया जा सकता है। हालांकि कई वाणिज्यिक उपकरण और assays सेल प्रवास 4, 5, 6 का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं, उनमें से कई के लिए आवश्यक महंगा और अत्याधुनिक उपकरणों और सुधार अब भी जरूरत है। इन कारणों के लिए, एक 8 चैनल यांत्रिक सेल wounder (चित्रा 1) विकसित की है।
हमारे 8 चैनल यांत्रिक सेल wounder उपर्युक्त समस्याओं को सुलझाने में कई अनूठी विशेषताएं शामिल किया गया है। यह लचीलापन सेल प्रवास / 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली प्रारूप में assays लोग घायल हो गए प्रदर्शन करने के लिए प्रदान करता है। समायोज्य गुजरातiding बार डिजाइन सुनिश्चित करता है कि खरोंच क्षेत्र में अच्छी तरह से प्रत्येक के केंद्रीय स्थिति में है। इसके अलावा, मार्गदर्शक बारों की ऊंचाई समायोजित किया जा सकता है ताकि wounder संस्कृति प्लेटों के विभिन्न ब्रांडों के लिए लागू है। अंत में, समायोज्य लोग घायल हो गए पिन डिजाइन एक भी संस्कृति की थाली सतह एक साथ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लोग घायल हो गए 7, 8 को प्राप्त करने के साथ पिपेट सुझावों के संपर्क में सक्षम बनाता है।
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Protocol
1. wounder के कुछ हिस्सों को परिचय (चित्रा 1)
- समान दूरी पर लोग घायल हो गए पिन फिक्सिंग से पिन धारक तैयार करें। विंदुक युक्तियाँ पकड़ो और समायोज्य लोग घायल हो गए पिन ऊपर और नीचे ले जाकर टिप ऊंचाई समायोजित करें।
- 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के विभिन्न ब्रांडों पर समायोज्य मार्गदर्शक-बार फिट हैं और यह सुनिश्चित करें कि लोग घायल हो गए क्षेत्र एक निश्चित स्थिति में है।
- हेक्स पेंच कस द्वारा समायोज्य लोग घायल हो गए पिन को ठीक करें। दोनों सिरों पर हेक्स सॉकेट सिर टोपियां कस द्वारा स्थिति में मार्गदर्शक-बार ठीक करें।
2. पिन धारक की चौड़ाई निर्धारित (चित्रा 2)
- M5 हेक्स रिंच के साथ हेक्स सॉकेट सिर टोपियां ढीला।
- पिन धारक के दोनों पक्षों के छल्ले को एडजस्ट करने का एक उपयुक्त संख्या डालें तो यह है कि मार्गदर्शक सलाखों के 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली की चौड़ाई के साथ पूरी तरह से फिट है।
नोट: Corning और Iwaki प्लेटों बड़े छल्ले की 1 जोड़ी और छोटे छल्ले की 1 जोड़ी की आवश्यकता है। फाल्कन और Nunc पीएलAtes बड़े छल्ले की 1 जोड़ी की जरूरत है। - हेक्स सॉकेट सिर कस मार्गदर्शक बार ठीक करने के लिए टोपियां।
3. गाइडिंग बार्स समायोजन (चित्रा 3)
- बाँझ 10 μL प्लास्टिक पिपेट सुझावों के साथ लोग घायल हो गए पिन फिट बैठते हैं।
- M5 हेक्स रिंच के साथ हेक्स सॉकेट सिर टोपियां ढीला।
- wounder पकड़ो और एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में से एक स्तंभ में लोग घायल हो गए पिन डुबकी।
- मुश्किल से कुओं के नीचे छू सुझावों में से सभी तक मार्गदर्शक बारों की ऊंचाई को समायोजित करें।
- हेक्स सॉकेट सिर टोपी कसो। सुनिश्चित करें कि wounder अब पूरी तरह से संस्कृति की थाली पर और पिन कुओं के बीच में अच्छी तरह से तैनात कर रहे हैं कि फिट बैठता है।
4. पिंस कैलिब्रेशन
- एक फ्लैट बाँझ सतह (यानी पेट्री डिश) के लिए सीधा wounder पकड़ो और एम 3 हेक्स रिंच के साथ सभी हेक्स शिकंजा ढीला।
- समान रूप से फ्लैट बाँझ सतह को छूने सुझावों में से सभी तक wounder टैप करें। </ Li>
- फिर स्थिति में पिन बंद करने के लिए हेक्स शिकंजा कस।
- फ्लैट बाँझ सतह पर धीरे wounder दोहन से एक टिप की समता की जाँच करें।
5. Scratching सेल monolayer (चित्रा 4)
- एक 0.1% जिलेटिन लेपित 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पर बीज मानव नाल संवहनी endothelial कोशिकाओं। मीडियम 199 में संस्कृति कोशिकाओं 20% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.09 छ / एल हेपरिन के साथ पूरक। रात भर में इस्तेमाल किया जा रहा से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें। प्रकोष्ठों लोग घायल हो गए पहले 100% confluency तक पहुंच जाना चाहिए।
- सबसे बाएँ (या दाएँ) संस्कृति की थाली का एक ही स्तंभ के भीतर प्रत्येक कुएं के पक्ष में लोग घायल हो गए सुझावों का रखें। अच्छी तरह के दूसरे पक्ष को पार wounder स्लाइड; यकीन है कि लोग घायल हो गए सुझावों का अच्छी तरह से नीचे छू रहे हैं।
- scratching सभी स्तंभों के लिए (चरण 5.2) दोहराएँ।
- लोग घायल हो गए करने के बाद, त्यागने टीवह मध्यम प्रत्येक कुएं में और नए सिरे से परीक्षण यौगिकों से युक्त मध्यम के साथ बदलें।
6. डाटा अधिग्रहण और छवि विश्लेषण
- छवि डिजिटल कैमरा (जैसे 10X उद्देश्य) के साथ एक कम शक्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग सेल monolayer पर यांत्रिक घाव के साथ पूरे अच्छी तरह से घायल हो गए तुरंत (टी = 0 एच) के बाद।
- परीक्षण यौगिकों अगर वांछित जोड़ें और समय के वांछित लंबाई के लिए सेते हैं। छवि घाव क्षेत्र फिर वांछित ऊष्मायन समय (टी = Δh) के बाद से पूरे अच्छी तरह से।
- ImageJ जैसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (का प्रयोग https://imagej.nih.gov/ij/ ), मुक्तहस्त उपकरण का उपयोग कर छवि पर घायल क्षेत्र को मापने।
- घाव बंद के प्रतिशत की गणना:
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Representative Results
यह 8 चैनल यांत्रिक wounder आदेश सेल प्रवास परख प्रदर्शन करने के लिए एक सेल monolayer खरोंच करने के लिए निर्माण किया है। यह एक उपयोगकर्ता के अनुकूल डिवाइस है कि विशेष प्रशिक्षण के बिना एक मिनट से भी कम समय में 96 अच्छी तरह प्लेटें में सेल scratching assays के बाहर ले जा सकता है। इस wounder लगभग 600 माइक्रोन के एक समान चौड़ाई के साथ और तेज किनारों के साथ सेल monolayers पर घाव क्षेत्रों लागू कर सकते हैं (आंकड़े 5 और 6)। घाव की चौड़ाई पिपेट सुझावों की ब्रांड और उपयोगकर्ता के प्रदर्शन पर निर्भर करता है। घाव चौड़ाई की यह रेंज आम छवि कम शक्ति बढ़ाई के तहत कब्जा (चित्रा 7) के लिए उपयुक्त है। छवि पर कब्जा करने के बाद, घाव बंद का प्रतिशत गणना की जा सकती है। यह सेल wounder सेल प्रवास परख के साथ सामना करना पड़ा समस्याओं को सुलझाने में विभिन्न रणनीतियों शामिल किया गया है। इसके अलावा, यह विभिन्न 96 अच्छी तरह से संस्कृति पी एल में सेल प्रवास assays के प्रदर्शन में लचीलापन प्रदान करता हैस्वरूपों खा लिया।
चित्रा 1: आठ चैनल यांत्रिक सेल wounder। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पिन धारक की चौड़ाई को समायोजित करें। आदेश में 96 कुओं की थाली में फिट करने के लिए समायोजित करने के छल्ले डालें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. विभिन्न स्वरूपों प्लेट फिट करने के लिए मार्गदर्शक सलाखों समायोजित करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: टिप की दिशा scratching। अच्छी तरह से नीचे के दूसरी ओर करने के लिए अच्छी तरह से नीचे के एक तरफ से wounder फिसलने से कोशिकाओं स्क्रैच।
चित्रा 5: लोग घायल हो गए के बाद 96 अच्छी तरह से थाली का अवलोकन। सेल monolayer के बारे में 600 माइक्रोन की वर्दी चौड़ाई के साथ तेज किनारों के उत्पादन wounder से घायल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। < / P>
चित्रा 6: एक पंक्ति के प्रतिनिधि छवियों और तुरंत scratching के बाद कुओं का एक स्तंभ। प्रत्येक घाव की चौड़ाई के मात्रात्मक विश्लेषण। छवियाँ एक 10X उद्देश्य के तहत कब्जा कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: कब्जा कर लिया घाव छवियों (10X उद्देश्य) पर = 0 टी एच और टी = Δh। बिंदीदार रेखा घाव क्षेत्र इंगित करता है और ठोस लाइन सेल प्रवास क्षेत्र इंगित करता है। ए) मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं। बी) मानव त्वचीय fibroblast।मिल = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हमारे सेल wounder पारंपरिक सेल प्रवास assays की समस्याओं को सुलझाने में कई अनूठी विशेषताएं है। 8 चैनल यांत्रिक सेल wounder एक लंबी उम्र कि autoclaving द्वारा निष्फल किया जा सकता है के साथ उच्च ग्रेड स्टेनलेस स्टील (स्टील 304) से बना है। लगभग सभी 96 अच्छी तरह से संस्कृति के बाजार पर उपलब्ध प्लेटों के व्यावसायिक ब्रांड समायोज्य मार्गदर्शक बार की वजह से इस यांत्रिक सेल wounder के साथ प्रयोग किया जा सकता है। समायोज्य मार्गदर्शक बार की डिजाइन भी सुनिश्चित करता है कि scratching क्षेत्र प्रत्येक के केंद्र में भी है। अच्छी तरह से एक केंद्रीय स्थान में घाव एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि पर कब्जा करने की सुविधा कर सकते हैं। छवियों कुछ बदलाव करते हुए अलग-अलग समय बिंदुओं पर लिया अधिकारी, लेकिन वे डेटा विश्लेषण को प्रभावित नहीं करते, क्योंकि अच्छी तरह से क्षेत्र के लगभग 90% एक कम बढ़ाई उद्देश्य (यानी 10X) के साथ माइक्रोस्कोप से देखा जा सकता है। इस प्रकार, एक अर्द्ध उच्च throughput विश्लेषण 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों 7, <पर किया जा सकता हैसमर्थन वर्ग = "xref"> 8। हालांकि, इस पद्धति अभी भी चित्र है, जो लंबा डेटा विश्लेषण की आवश्यकता की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है। यह अगर एक स्वचालित छवि प्राप्त करने प्रणाली उपलब्ध है हल किया जा सकता है।
wounder के व्यक्तिगत समायोज्य पिनों की डिजाइन भी सेल monolayer पर समान चिकनी और तेज घावों को प्राप्त करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली की सतह के साथ संपर्क की अनुमति देता। scratching पिन वाणिज्यिक प्लास्टिक पिपेट टिप्स, जो निष्फल किया जा सकता है और हर एक scratching के बाद निपटाया, और महान लोच यांत्रिक क्षति के बिना अच्छी तरह से सतह से संपर्क करने के लिए प्रदान कर सकते हैं। ये लाभ आगे प्रयोग और denuded क्षेत्र भर में सेल आंदोलन पर प्रभाव के दौरान नमूने के पार संक्रमण को कम कर सकते हैं। भविष्य में, हम एक स्प्रिंग नियंत्रित पिन जो पिन ऊंचाई समायोजन कदम को समाप्त कर सकते हैं विकसित करना होगा। इस उपकरण का उपयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम बल scratching के दौरान सेल monolayer पर लागू होता है। wounder चाहिए, संस्कृति की थाली के खिलाफ सीधा आयोजित किया है, ताकि आठ पिपेट सुझावों का अच्छी तरह से नीचे छू रहे हैं। दरअसल, wounder महंगे और जटिल उपकरणों के उपयोग के बिना सेल प्रवास परख प्रदर्शन करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। इस wounder के लिए प्रोटोकॉल सरल और सीधा है।
अंत में, हमारे 8 चैनल यांत्रिक wounder है कि कोई विशेष कौशल की आवश्यकता सेल प्रवास assays के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण है। उपयोगकर्ताओं को एक तेज और सरल तरीके से 9, 10, 11 में नमूने की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें में सेल प्रवास परख प्रदर्शन कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।
Acknowledgments
लेखक इस wounder के प्रोटोटाइप बनाने में श्री टैम पो Leung, श्री वाँग ची परिजनों और विज्ञान संकाय कार्यशाला के तकनीकी स्टाफ, हांगकांग बैपटिस्ट विश्वविद्यालय, अपने तकनीकी कौशल के लिए और सलाह का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
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