Abstract
Identifiseringen av en antigen epitop av immunsystemet åpner for forståelsen av den beskyttende mekanisme av nøytraliserende antistoffer som kan fremme utvikling av vaksiner og peptid narkotika. Peptid-skanning er en enkel og effektiv metode som oversiktlig kartlegger lineær epitop som gjenkjennes av et monoklonalt antistoff (mAb). Her forfatterne presenterer en epitop besluttsomhet metodikk som involverer serielt avkortede rekombinante proteiner, syntetisk peptid design, og dot-blot hybridisering for antigen anerkjennelse av nervøs nekrose virus kappeproteinet ved hjelp av en nøytraliserende mAb. Denne teknikk er avhengig av dot-blot-hybridisering av syntetiske peptider og mAb'er på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Den minimale antigene region av et viralt kappeprotein som gjenkjennes av RG-M56 mAb kan begrenses ved steg-for-steg trimmet peptidkartlegging på en 6-mer peptid-epitop. I tillegg, alanin mutagenese og residuet ble underGrunnloven kan bli utført for å karakterisere bindingen betydningen av hver aminosyrerest som utgjør epitopen. Restene flankerer epitop nettstedet ble funnet å spille viktige roller i peptid konformasjon regulering. Den identifiserte epitop peptidet kan bli anvendt for å danne krystaller av epitop peptid-antistoff-komplekser for en røntgendiffraksjon studium og funksjonell konkurranse, eller for terapeutiske midler.
Introduction
I immunsystemet, det rekombinasjon av V, D og J segmentene gjør det mulig for antistoffer til å skape store variasjoner av komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) for binding til forskjellige antigener for å beskytte verten fra sykdomsfremkallende infeksjon. Den nøytraliserende forsvar av antistoffer mot antigener som er avhengig av den romlige komplementaritet mellom CDR'ene fra antistoffene og epitoper av antigenene. Derfor vil en forståelse av denne molekylær interaksjon hjelpe profylaktisk vaksine utforming og terapeutiske peptidlegemiddel-utvikling. Dette kan imidlertid nøytralisering interaksjonen bli påvirket både av flere antigene domener fra ett enkelt antigen, og av flere CDR fra antistoffer, som dermed gjør det epitop bestemmelse prosessen mer kompleks. Heldigvis utvikling av hybridoma-teknologi, som sikringer individuelle antistoffproduserende celler med myelomceller, gjør det mulig for en kontinuerlig delende gruppe med celler for å sekrete en spesifikt antistoff, kjent som et monoklonalt antistoff (mAb) 1. Hybridomceller som produserer slike ren, høy-affinitets mAb til å bindes til en enkelt antigenisk område av et spesifikt antigen. Med forholdet mellom antigen-antistoff-etablert, flere fremgangsmåter, inkludert peptid skanning, kan brukes til å bestemme den epitop av et antigen ved hjelp av tilsvarende mAb. Den siste utviklingen i syntetisk peptid teknologi har gjort peptid skanning teknikk mer tilgjengelig og mer praktisk å utføre. I korthet er et sett av overlappende syntetiske peptider fremstilt i henhold til et mål-antigen sekvens og er forbundet til en fast støttede membran for mAb hybridisering. Peptid skanning ikke bare gir en enkel måte for å kartlegge antistoffbindingsregion, men letter også aminosyre (aa) mutagenese gjennom rest skanning eller substitusjon for å evaluere bindingsinteraksjonen mellom hver aa rest av epitopen peptidet og CDR'ene i antistoffet.
to, tre, fire. Protokollen omfatter mAb forberedelse, konstruksjon og ekspresjon av serielt trunkerte rekombinante proteiner, syntetiske overlappende peptid utforming, dot-blot-hybridisering, alanin-skanning, og substitusjon mutagenese. Tatt i betraktning den høye kostnaden for peptid-syntese, ble det trinn å serielt å avkorte de rekombinante proteiner fra et ønsket mål-protein modifiseres, og det antigeniske region ble redusert til rundt 100 til 200 aa rester før det syntetiske peptid matrisen dot-blot-analyse ble utført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av monoklonalt antistoff
- Kultur RG-M56 musmonoklonale hybridomceller 2 i serumfritt medium i 175T kolber ved 37 ºC med 5% CO 2 supplement. Samle supernatanten når fargen av mediet blir gul etter fem dagers inkubasjon.
MERK: Hybridomceller ble dyrket i serumfritt medium for å unngå forurensning antistoff fra føtalt bovint serum. - Sentrifuger supernatanten ved 4500 xg i 30 min ved 4 ° C og kast celleavfall pellet.
- Tilsett 2 ml protein G-agarose (levert som en 50% oppslemming) til en 5 ml kolonne og i likevekt med 10 harpiks volumer (10 ml) av iskald PBS.
- Load 200 ml av antistoffet supernatanten (trinn 1.2) i kolonnen og kast pass-through.
- Tilsett 10 ml iskald PBS til kolonnen for å vaske den. Gjenta to ganger.
- Tilsett 10 ml 50 mM glycin, pH 2,7 til kolonnen for å eluere proteinet G-assosierte antistoff. Collect 900 ul fraksjoner i et mikro-sentrifugerør inneholdende 100 pl 10x nøytralisering buffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl, og 1 mM EDTA, pH 8,0).
- Oppbevar det rensede antistoff i 50% glycerol med 0,03% NaN3 ved -20 ° C.
2. Konstruksjon og ekspresjon av serielt avkortet rekombinante proteiner
- Forbered en PCR reaksjonsblanding: 5 pl 10x PFU buffer, 0,2 mM av hver dNTP, 0,2 mikrometer fremover primer 3, 0,2 mikrometer revers primer 3, 2 mM MgSO4, 1 ng pET20b-1A59 3 plasmid DNA, og 2,5 U ( enhet) av PFU DNA polymerase; legg DDH 2 O til et sluttvolum på 50 ul.
- Kjør prøver i en automatisk termosykler ved hjelp av følgende parametere: Cycle 1 (94 ºC i 5 min); 2-36 sykluser (94 ° C i 30 s, 63 ° C i 30 s, og 72 ° C i 60 s); og sykle 37 (72 ºC for 7 min).
- Ekstraher polymerase kjedereaksjon (PCR) produkt til anvendelse av en PCR-rensesett 5 for å lette den følgende restriksjonsenzymnedbrytning.
- Fordøye PCR-amplifiserte DNA-fragmenter med NdeI og XhoI restriksjonsenzymer og ligere hver av disse DNA-fragmenter i Ndel og XhoI enzym-spaltet Dyre 20b (+) vektor. Transform konstruksjonene i Escherichia coli DH-5a-kompetente celler 6.
- Fremstille fordøyelse blandingen i fordøyelse buffer (20 mM Tris-acetat, 10 mM Mg (CH3 COO) 2, 50 mM KCH 3 COO, og 1 mM DTT, pH 7,9) med 1 ug av PCR-amplifisert DNA eller pET-20b (+) vektor-DNA, og 2 U av Ndel og Xhol restriksjonsenzymer i et sluttvolum på 20 mL.
- Bland fordøyelse blandingen forsiktig og raskt å spinne ned. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer i en tørr bad for å sikre en fullstendig kutting av restriksjonen sittees.
- Ekstraher restriksjonsenzym-spaltet DNA-fragmenter ved hjelp av en PCR-rensesett 5 for å lette den følgende plasmidkonstruksjon.
- Fremstille ringsblandingen i ligeringsbuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP og 5 mM DTT, pH 7,5) med 100 ng av predigested, PCR-amplifisert DNA, 10 ng av predigested pET-20b (+) vektor-DNA, og 5 U av T4 DNA-ligase i et endelig volum på 10 ul.
- Bland ringsblandingen forsiktig og raskt å spinne ned. Inkuber ved 16 ° C i 18 timer i et vannbad.
- Satt 10 ul av ligerings prøvene i 100 ul av DH-5α-kompetente celler og bland forsiktig før plassering av mikrosentrifugerør på is i 30 min. Sett mikrosentrifugerør i en tørr bad ved 42 ºC i 90 s for å indusere varmesjokk 7. overfører straks røret på is i 2 min.
- Legg 900 mL av Luria-Bertani (LB) kjøttkraft (1% Bacto trypton, 0,5% Bacto gjær extract, og 0,5% NaCl, pH 7,0) til røret. Inkuber ved 37 ° C med 150 rpm risting i 45 min. Pellet cellene ved sentrifugering ved 4000 x g i 10 minutter og supernatanten kastes.
- Resuspender pelleten med 50 pl LB-medium og spredd hver transformasjon til pre-oppvarmet LB-plater inneholdende 100 ug / ml ampicillin. Inkuber platene ved 37 ° C i 16 timer.
- Plukk opp en enkelt koloni ved hjelp av en 200 mL tips og plassere den i 3 ml LB buljong inneholder 100 mikrogram / ml ampicillin i en løst avkortet 15 ml tube. Inkuber ved 37 ° C med 150 rpm risting i 12 timer.
- Ekstraher plasmid DNA 8 fra hver kultur og sekvensere den ved hjelp av T7-promoter og terminator-T7-primere for å bekrefte sekvensen 9.
- Etter sekvens bekreftelse, forvandle 10 ng av DNA fra disse Dyre 20b (+) plasmider med varierende lengder av YGNNV kappeprotein gen inn i BL-21 (DE3) stamme av E. coli hos ossing varmesjokkmetoden 7. Følg trinn 2.3.6-2.3.8 å utføre transformasjonen.
- Overføre en enkelt koloni fra hver transformert E. coli BL-21 celle inn i 3 ml LB-næringsløsning inneholdende 100 ug / ml ampicillin i en løst avkortet 15 ml tube. Inkuber kultur ved 37 ºC med 150 rpm risting.
- Avkjøl kulturen til 25 ° C når OD 600 av kulturen er omtrent 0,6 og tilsett IPTG til en sluttkonsentrasjon på 0,4 mM for å indusere ekspresjon av det rekombinante protein. Inkuber kultur for en ekstra 4 timer ved 25 ºC med 200 rpm risting.
- Overføre 1 ml av kulturen til et mikrosentrifugerør. Pellet cellene ved sentrifugering ved 12.000 x g i 1 min og kast supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 100 ul av denaturering buffer (8 M urea, 20 mM natriumfosfat, og 0,5 M NaCl, pH 7,4) ved å pipettere opp og ned med en mikropipette. Bland ved kraftig risting.
MERK: Utvalget solutions bør nå være semi-transparent, litt klebrig, og klar for dot-blot hybridiserings-analyse.
3. Design og syntese av overlapp Peptider
- Design og syntetisere 3 serie 20-mer peptider som hver lapper med sin etterfølger av 10 aa rester fra 195-338 aa region av YGNNV kappeproteinet å innskrenke epitop regionen RG-M56 mAb av dot blotting.
- Design og syntetisere tre tre 8-mer peptider (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 og 199 VLCRWSVR 206) med en overlapping på 6 AA rester til neste syntetisk peptid å innskrenke epitop regionen 195-206 aa av dot blotting.
- Design og syntetisere tre 7-mer (196 NVSVLCR 202 og 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, og en97 VSVLCR 202), og 5-mer peptider (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, og 198 SVLCR 202) med en overlapping på 6, 5 og 4 aa rester, henholdsvis på sine nabo peptider for å minimere epitop regionen med dot blotting.
4. Dot-blot hybridisering
- Oppløs hver syntetiserte peptidet i dimetylsulfoksid (DMSO) til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml.
NB: For å overvinne den varierte oppløseligheten av syntetiske peptider bør alle syntetiske peptider bli oppløst i DMSO. DMSO er et godt løsemiddel for å løse opp hydrofobe eller hydrofile peptider. - Bløt polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med metanol i 2 min.
MERK: PVDF membran er opp til 100% motstandsdyktig mot DMSO; andre kanskje ikke være så. - Ekvilibrere PVDF-membran med modifisert Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, og 0,1% SDS, pH 8,3) for2 min.
MERK: 10-20% (v / v) metanol kan tilsettes til modifiseres Towbin buffer for å forbedre overførings resultater. - Skyll et stykke papir-kromatografi med det modifiserte Towbin buffer. Plasser PVDF membran på kromatografi papiret. Vent til den modifiserte Towbin buffer har forsvunnet fra PVDF membran overflaten før du fortsetter til neste trinn.
- Tilsett 2 ul av hver prøve peptid til membranen med en 10 mL spiss. Luft-tørke PVDF-membran på kromatografipapir i 10 min. Legg hvert peptid prøve sakte og gradvis på membranen for å unngå for mye diffusjon.
- Blokkere membranen i TBST-buffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris, og 150 mM NaCl, pH 7,4) med 5% fettfri melk i 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Legg RG-M56 mAb ved en endelig fortynning på 1: 1000 i TBST-buffer med 5% fettfri melk til membranen. Inkuber membranen ved 37 ° C i 1 time med forsiktig risting.
- Fjern antistoffet såoppløsning. Vask membranen i TBST-buffer i 5 min med forsiktig risting. Gjenta to ganger.
- Tilsett sekundært antistoff (geite-anti-mus IgG, Fc, konjugert alkalisk fosfatase) ved en endelig fortynning på 1: 5000 i TBST-buffer med 5% fettfri melk til membranen. Inkuber membranen ved 37 ° C i 1 time med forsiktig risting.
- Kast antistoffoppløsning. Vask membranen i TBST-buffer i 5 min med forsiktig risting. Gjenta vasketrinn to ganger.
- Utvikle membranen med BCIP / NBT substrat oppløsningen ved værelsestemperatur i 15 min i mørket. Stopp utviklingen ved å vaske membranen med DDH 2 O når signalet vises.
- Air-tørke membranen og fange dot-blot bildet ved hjelp av et bilde system.
- Måle intensiteten av hver dot blot bruker bildeanalyse programvare tre.
5. alaninskanning og Bytte
- Design og syntetisere tre alanin og Methionine substitusjons peptider. Bytt hver aa rester med alanin for 8-mer peptid 195 VNVSVLCR 202 og syntetisere peptider 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 og 195 VNVSVLCA 202 . Bytt aa rest leucin 200 til metionin å skape den SJNNV genotype epitop peptid 195 VNVSVMCR 202.
- Følg § 4 til å utføre alaninskanning og substitusjon mutagenese dot blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med dette forsøket var å identifisere en epitop gjennom dot blotting ved hjelp av mAb. Til hurtig og effektivt begrense det antigene området gjenkjent av mAb, ble full-lengde og avkortede serielt YGNNV rekombinante kappeproteiner med en 6xHis fusjon kode ved C-terminus uttrykt fra en E. coli-ekspresjonssystem PET 10 (figur 1A). De resulterende rekombinante proteiner ble flekket ut på PVDF-membran ved hjelp av RG-M56 mAb og anti-6xHis-antistoff for dot-blot-hybridisering. Prikken blotting viste positive signaler mot 1-338 aa (full-lengde), 51-338 aa, og 195-338 aa, men ikke 1-100 aa eller 1-200 aa rekombinante proteiner (Figur 1b). Punktmatrisen hybridisert mot anti-6xHis-antistoff og bekreftet ekspresjon av alle rekombinante proteiner. Disse data indikerer at epitopen av RG-M56 mAb erkjennelse ligger i en 144-aa rekombinant protein near den C-terminale ende av YGNNV kappeprotein (195-338 aa).
Deretter serie 20-mer peptider med 10 Aa-rester lange lapper på sin nabo ble utformet og syntetisert fra sekvensen av 144-aa rekombinant protein for peptid skanning for å innskrenke epitop regionen. Disse syntetiske peptider ble oppdaget på en PVDF membran og utsatt for dot-blot hybridisering ved hjelp av RG-M56 mAb. Resultatet viste positive signaler bare på peptidet 195-214 aa og den positive kontrollen, 195-338 aa rekombinant protein (figur 2A). Som epitopen er plassert inne i peptidet 195-214 aa region, men ikke peptidet 205-224 aa region, tre serielle 8-mer peptider med 6-aa rester fra overlapper aa rest 195-206 (peptider 195-202 aa, 197- 204 aa, og 199-206 aa) ble designet og syntetisert. Dot-blot hybridisering Resultatene viste positive signaler på peptid 195-202 aa og positiv-kontroll peptid 195-214 aa hjelpRG-M56 mAb (figur 2B).
Alaninskanning og substitusjon mutagenese ble utført for å evaluere spesifisiteten til hvert aa rest av 8-mer epitop, 195 VNVSVLCR 202. Hver aa rester av 8-mer peptid ble individuelt erstattet med alanin. Den alaninmutasjon peptidet matrise ble deretter plassert på en PVDF-membran ved bruk av peptidet 195-202 aa som en positiv kontroll. Dot-blot-analyse viste at de tre erstatte mutasjonene, V197A, V199A, og C201A, avskaffet bindingsaffiniteten RG-M56-mAb (figur 3A). Selv om aa rest 200 i den SJNNV genotype epitopen er metionin, i motsetning til et leucin i de andre fire Betanodavirus genotypen epitoper, den SJNNV genotype-sekvensen, 195 VNVSVMCR 202, viste positiv bindingsaffinitet mot RG-M56-mAb, som det av den positive kontrollen (Figur 3A). Dette resultatet indikerer at epitopene of alle Betanodavirus genotyper kan bli gjenkjent av RG-M56 mAb. Bindingsaffiniteten til hver aa rest som deltar til epitopen området ble videre kvantifisert ved å måle signalstyrken for dot blot av hvert alanin-substitusjon ved hjelp av programvare for bildeanalyse (figur 3B). Intensitetene for V197A, V199A, og C201A erstatninger ble redusert til 10,2%, 18,6% og 8,5%, respektivt, når sammenlignet med de til den positive kontrollen (100%), mens den V195A, S198A, L200A, R202A, og L200M substitusjoner viste høyere eller tilsvarende intensiteter som den av den positive kontroll. Det er verdt å merke seg at det å påvirke styrken på N196A substitusjon er tvetydig, med en 37,4% reduksjon i positiv kontroll. Disse resultater indikerer at V197, V199, og C201 er essensielle rester for binding av RG-M56 mAb.
De alaninskanning mutagenese Resultatene viser at aa rester V195, N196, og R202 kanbli erstattet med alanin, noe som innebærer at epitopen regionen kan bli ytterligere innsnevret i begge ender. Derfor steg-for-steg trimmet peptid kartlegging gjennom 7-mer, 6-mer, og 5-mer syntetiske peptider trinnet er designet for å minimere antigen regionen. Det positive signal var tilstede på den 6-mer syntetisk peptid 196 NVSVLC 201, men ikke på 7-mere og 5-mer syntetiske peptider (figur 4). Disse data indikerer at den minimale epitop av NNV kappeprotein gjenkjent av RG-M56 mAb er den 6-mer peptid, 196 NVSVLC 201.
Figur 1: Reduksjon av epitopen region ved hjelp av i serie avkortede rekombinante proteiner og monoklonale antistoffer. (A) Kart over serielt avkortede rekombinante NNVCPs. NNVCP 1-338 aa er den full-lengde frakk protein. (B) Dot-blot analyse av rekombinante NNVCPs. Venstre: Kart over de serielt avkortede YGNNV rekombinant kappeproteiner på PVDF membran. I midten: Den dot-blot analyse ble utført ved anvendelse av anti-6xHis-antistoff. Høyre: Den dot-blot analyse ble utført ved hjelp av RG-M56 mAb. NNVCP: nervøs nekrose virus kappeprotein; aa: aminosyre; PVDF: polyvinylidenfluorid; N: N-terminal; C: C-terminale ende; mAb: monoklonalt antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fine kartlegging av epitopen region ved hjelp av syntetiske peptider. (A) Venstre: Aminosyresekvenser av 20-mere syntetiske peptider ble justert til NNVCP 195-338 aa; hver foregående peptid hadde en 10 Aa-rester-lang overlapping med følgende peptid. Høyre: Kart av synthetic peptider på PVDF membran. Rekombinant NNVCP 195-338 aa ble brukt som en positiv kontroll. Dot-blot analyse ble utført ved anvendelse av RG-M56 mAb. (B) Venstre: aminosyresekvenser av 8-mer syntetiske peptider, 195-202 aa, aa 197-204, og 199-206 aa; hver foregående peptid hadde en 6 AA-rester-lang overlapping med følgende peptid. Syntetisk peptid 195-214 aa ble anvendt som en positiv kontroll. Høyre: Den dot-blot analyse ble utført ved hjelp av RG-M56 mAb. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: alaninskanning og substitusjon mutagenese av 195 VNVSVLCR 202 epitop. (A) Aminosyresekvenser av substitusjon mutagenese og dot-blot-analyse. Hver aa residue av epitop regionen, 195-202 aa ble erstattet individuelt med alanin. L200M substitusjon er SJNNV genotype sekvensen ved Betanodavirus kappeproteinet epitop regionen. Syntetisk peptid 195-202 aa ble anvendt som en positiv kontroll. De erstattet aa rester er understreket. (B) Kvantifisering av dot-blot-signalet bindingsaffinitet. Signalintensiteten av den positive kontroll (195-202 aa) ble bestemt som 100%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Minimum epitop besluttsomhet. Den 7-mer (A), 6-mer (B), og 5-mer (C) syntetiske peptider 195-202 aa ble brukt til å identifisere den minimale epitop som gjenkjennes av RG-M56 mAb. syntetisk peptide 195-202 aa ble anvendt som en positiv kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en hurtig og enkel teknikk for å identifisere en mAb-gjenkjent lineær epitop. Tatt i betraktning kostnadene for peptidsyntese og produksjonseffektivitet til å syntetisere peptider, ble den antigene region av viruskappeproteinet redusert ved å uttrykke i serie trunkerte rekombinante proteiner før peptidet scanning-analyse. Som sådan, er en pålitelig og effektiv E. coli pET-ekspresjonssystemet anvendt for å fremstille disse serielt trunkerte rekombinante proteiner som rekombinante proteiner med molekylvekter mellom 10 til 50 kDa kan være lett uttrykkes gjennom dette system. På denne måten, kan epitopen bli lett begrenses til en mer håndterlig 100 til 200 aa region. PET-20b (+) vektor ble spesielt valgt, da den inneholder en sekvens som koder for uttrykket av 6xHis-koder, slik at de produserte 6xHis-tag fusjonsproteiner som skal immunpåvist hjelp av en anti-6xHis antistoff for å bekrefte uttrykk for rekombinant proteins. De produserte rekombinante kappeproteiner ble deretter analysert ved anvendelse av RG-M56 mAb via en dot-blot-hybridiseringsanalyse. En alternativ fremgangsmåte for rekombinant protein epitop bestemmelse er å rense de uttrykte rekombinante proteiner via immobilisert metallion-affinitetskromatografi 10, separere de rekombinante proteiner med SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese, og utføre Western blot-analyse 3.
For å ytterligere og mer fint kartlegge epitopen plassering bestemmes av resultatene av dot-blot-hybridisering analyse ved hjelp av serie-trunkerte rekombinante proteiner, ble overlappende syntetiske peptider med forskjellige størrelser utformet. Blant de forskjellige mulige lengder av syntetisk peptid for å syntetisere, 20-mer med 10 aa-rester lange overlappende peptider ble valgt først i peptidet skanning, både for høy syntese renhet (på rundt 90%) og for deres peptid lengde, nok for jakten på den kontinuerlige epitope anerkjent av B-celle antistoff 11. Merk at nøyaktigheten og renhet av syntetiserte peptider forringes som syntetiserte peptid er lengre. På denne måte ble epitopen region raskt redusert til rundt 10 aa rester i lengde. Etter serie 8-mer overlappende peptider ble kartlagt, var den lineære epitop regionen definert til peptid 195-202 aa. Deretter alanin-scanning av denne 8-mer peptid epitop viser den kritiske bindingsaffinitet styrken av hver aa rest, slik at søket etter den minimale epitop. De essensielle roller V197, V199 og C201 aa rester innebærer at den lineære epitop regionen dekker minst 5 aa rester, fra 197 til 201. Videre kan aa rester V195, N196, og R202 bli erstattet med alanin uten helt å miste binding affinitet, noe som indikerer at epitopen område kan reduseres til 7, 6, 5 eller til og med en et-rester i lengde. Små peptidsekvenser kan lett og økonomisk syntetisert for søke av lineær (kontinuous) epitoper. Imidlertid er dette syntetiske peptid skanning teknikk ikke egnet for bestemmelse av en diskontinuerlig epitop av et antistoff, med mindre den er kombinert med epitop eksisjon og massespektrometrisk analyse 12.
I denne protokollen, ble en dot-blot hybridisering teknikk som brukes for å søke den lineære epitop av en mAb. Dot-blot-hybridisering er en enkel, men effektiv metode. I begynnelsen av søket, når epitopen region er innsnevret fra en stor-skala landskapet, er den største bekymringen for å observere enten et positivt eller negativt signal etter at hybridiseringen av antistoffet til et mål membranbundet protein, som de fleste mAbs bare binder seg til en spesifikk epitop av et antigent protein (figur 1 og 2). Imidlertid, ved bruk av dot-blot-hybridisering for å utforske bindingen tilgjengelighet for hvert aa rest innenfor epitopen region mot antistoffet, slik som ved å alanin substitusjon mutagenesesignalstyrken for hver byttet aa resten ble bestemt ved dot blotting bør være priset inn i den generelle bindende betydning. At signalintensitet kan kvantifiseres enkelt ved hjelp av bildeanalyse programvare (figur 3B) eller et densitometer. Alternativt kan en enzymbundet immuno-sorbent assay (ELISA) kan utføres for å kvantifisere graden av bindingsaffiniteten og den resulterende signalstyrken 3.
I forrige undersøkelse, den eneste kappeproteinet av ikke-konvolutt nervøs nekrose virus var immun-anerkjent av 10 mAbs med høy nøytralisering indeksverdi mellom 06.05 til 04.05 (log 10 NI) 2. Den svært innpassing evne til mAb ble videre brukt for utvikling av den ett-trinns, hurtig Immunokromatografisk diagnostisk sett for påvisning av NNV-infisert fisk 13. Den antigenepitop nervøs nekrose virus kappeprotein ble anerkjent av RG-M18mAb som en 8-mer peptid, 195 VNVSVLCR 202 3, gjennom hvilken en ny NNV reseptor har blitt identifisert (upubliserte data). I denne studien ble epitop nervøs nekrose virus kappeproteinet ytterligere snevret ned til en 6-mer peptid, 196 NVSVLC 201, ved den andre mAb, RG-M56.
Det er uventet at to 7-mer peptider (196 NVSVLCR 202 og 195 VNVSVLC 201) som inneholder 6-mer peptid 196 NVSVLC 201 ikke er anerkjent av RG-M56 mAb (figur 4A). En rimelig tolkning er at, selv om den omkringliggende rester V195 og R202 kan ikke direkte bidrar til bindingsinteraksjonen mellom epitopen og antistoff, de flankerende residier påvirke dannelsen av den korrekte konformasjon peptidet for antistoffgjenkjenning. Utseendet til V195 eller R202 på sine flankerer endestasjonen alene kan forvrenge den syntetiske peptidkonformasjon for antistoff anerkjennelse og bindende. Epitopen konformasjon er drevet av styrken i begge termini, V195 og R202, som er balansert mot hverandre i den 8-mer syntetisk peptid, 195 VNVSVLCR 202, og motvirkes i den 6-mer syntetisk peptid, 196 NVSVLC 201. AA rester, V195, N196, og R202, kan være individuelt erstattes med alanin uten helt å miste bindende evne, og dermed er alaninskanning mutagenese Resultatene tyder på at disse tre aa rester ikke kan spille en betydelig rolle i anerkjennelse og binding av RG -M56 mAb. Men etter trimming en mer rest fra den 6-mer syntetisk peptid, 196 NVSVLC 201, den 5-mer peptid, 197 VSVLC 201, uten at N196 i den N-terminale flankerende region, mister evnen til å bli gjenkjent og bundet av RG -M56 mAb (Figur 4C). Dette resultatet tyder på at N196 rest kan også slå en viktig rolle i den flankerende område av epitopen for å stabilisere den korrekte konformasjon epitopen for å lette gjenkjenning og binding av RG-M56 mAb. Betydningen av flankerende residier som omgir epitopen regionen hadde også blitt undersøkt av andre antigen-antistoff-bindingsstudier. Betydningen av flanke aa rester rundt α-bungarotoxin epitop regionen for binding av antistoffer ble undersøkt ved hjelp av ulike aa erstatninger innenfor samme kolinerge sekundært område. De ble deretter vurdert som enten viktig, innflytelsesrike, eller ikke innflytelsesrik 14. Det ble også funnet at spesifisiteten til antistoffet anerkjente epitop av karsinom-assosiert epiteliale muciner kan bli ytterligere påvirket av de flankerende aa rester. Disse effektene kan presentere konformasjonelle hindringer som kan hindre binding av et antistoff mot en epitop 15.
Den 6-mer epitop, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, har ekstremt hydrofobe egenskaper, med fire hydrofobe rester, hvorav to Valines (197 og 199), en leucine (200), og en cystein (201) (redusert form). Rester V197, V199 og C201 er avgjørende for RG-M56 mAb anerkjennelse og bindende, som bestemmes av alaninskanning mutagenese. Epitopen region ble plassert på en av åtte antiparallelle P-tråder av skallet domene (S-domenet) av den NNV kappeproteinet 16. Interessant, epitopen ikke vises på utsiden fremspring domene, men skjuler i den gelé-rull struktur av S-domenet under de andre antiparallelle P-tråder. Epitopen, med sitt høye hydrofobisitet, kan oppnå en mer stabil mikromiljøet i denne depresjon. Videre ble 195 VNVSVLCR 202 3 peptid av denne epitopen funnet å hindre forplantning av den gigantiske havabbor nervøs nekrose virus i havabbor hjerneceller. Derfor ble denne epitopen peptidet foreslått å være en competitor involvert i den reseptor-bindende domene som er nødvendig for viral inngang 3. Det ble antatt at peptidet inntrengningsinhibitorer omfattende hydrofobe og / eller amfipatiske rester kan forandre den fysiske konformasjon og kjemi av cellulære membran grensesnitt og kan hindre sammensmelting av cellulære og virale membraner 17. Videre har mange syntetisk peptid oppføring hemmere demonstrert sterke inhibitoriske egenskaper mot ulike virusinfeksjoner 17, 18. Dermed kan identifiseres epitop peptid med hydrofobe rester og sterk oppføring hemming mot NNV infeksjon rette for utvikling av terapeutiske peptid narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
