Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55436
Automatic Translation
1, 2, 3, 2,4
1Biomedical Engineering Graduate Program, The University of Western Ontario, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, The University of Western Ontario, 3Department of Chemical Engineering, Queen's University, 4Department of Chemical & Biochemical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Western Ontario

Summary

المصفوفة خارج الخلية الأنسجة محددة (ECM) هو الوسيط الرئيسي من وظيفة الخلية. توضح هذه المقالة طرق توليف الرغاوي وناقل دقيق التي هي مستقرة بالثقافة بدون حاجة إلى يشابك الكيميائي لتقديم الطلبات في 3D متقدم في نماذج زراعة الخلايا المختبر أو bioscaffolds الموالية لالتجديدي المستمدة ECM الخالص.

Abstract

وتوسطت وظيفة الخلية عن طريق التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (ECM)، التي لديها تركيبة معقدة الأنسجة محددة والهندسة المعمارية. وتركز هذه المقالة على طرق تصنيع المواد الرغوية وناقل دقيق مسامية المستمدة ECM لاستخدامها بوصفها ركائز البيولوجية ذات الصلة في 3D المتقدمة في نماذج زراعة الخلايا في المختبر أو السقالات الموالية للالتجدد وأنظمة تسليم خلية للهندسة الأنسجة والطب التجديدي. باستخدام الأنسجة decellularized أو الكولاجين غير قابلة للذوبان المنقى كمادة البداية، يمكن تطبيق تقنيات لتجميع مجموعة واسعة من bioscaffolds الأنسجة محددة مع هندستها للتخصيص. ينطوي على نهج المعالجة الميكانيكية والأنزيمية الهضم خفيفة الى تسفر عن تعليق ECM التي تستخدم لتصنيع الرغاوي ثلاثية الأبعاد أو ناقل دقيق من خلال إجراءات تجميد وبالتجفيد التي تسيطر عليها. هذه السقالات المستمدة ECM النقية هي التي يسهل اختراقها للغاية، ولكن مستقرة دون الحاجة إلى كيميائيآل يشابك وكلاء أو غيرها من المواد المضافة التي قد تؤثر سلبا على وظيفة الخلية. خصائص سقالة يمكن ضبطها إلى حد ما بفعل عوامل مختلفة مثل تركيز ECM تعليق، وأساليب المعالجة الميكانيكية، أو الظروف التوليف. بشكل عام، السقالات هي قوية وسهلة للتعامل، ويمكن معالجتها كما أنسجة لمعظم المقايسات البيولوجية القياسية، وتوفير منصة الثقافة 3D خلية تنوعا وسهلة الاستعمال الذي يحاكي تكوين ECM الأصلي. وعموما، قد تكون هذه الأساليب واضحة لافتعال الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM مخصصة التي تهم كلا البيولوجيين والمهندسين الطبية الحيوية كمنصات خلايا مفيدة الأنسجة محددة لفي المختبر وفي التطبيقات الجسم الحي.

Introduction

وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من شبكة معقدة 3D من البروتينات وبروتينات سكرية، والسكريات 1. مرة واحدة تعتبر إطارا في الغالب الهيكلي، ومن المسلم به الآن جيدا أن ECM يتضمن مجموعة متنوعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا مع أدوار وظيفية هامة 2. التفاعلات خلية ECM يمكن توجيه بقاء الخلية، التصاق، والهجرة، والانتشار، والتمايز 3. في حين أن فئات رئيسية من الجزيئات ECM عموما المحفوظة بشكل جيد عبر الأنسجة والأنواع، كل الأنسجة لديها تكوين مصفوفة فريدة من نوعها والهندسة المعمارية (4). وعموما، يوفر ECM الأنسجة محددة لالمكروية مفيدة التي تتوسط ظيفة من دوين الخلوي لحجم الأنسجة / الجهاز 5.

نظرا للدور الحاسم من ECM في التوسط وظيفة الخلوية، كان هناك اهتمام متزايد في ديvelopment من bioscaffolds المستمدة ECM للتطبيقات في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. على وجه الخصوص، وقد تم اكتشاف طريقة decellularization على نطاق واسع كوسيلة للحصول على ECM من مجموعة واسعة من الأنسجة لاستخدامها كمادة سقالات للتجديد الأنسجة والخلايا تسليم 5 و 6 و 7. Decellularization عادة ما ينطوي على سلسلة من والكيميائية وأو مراحل المعالجة الميكانيكية / البيولوجية التي تستهدف إزالة الخلايا والمكونات الخلوية، بينما تسبب مثالي الحد الأدنى من تعديلات على هيكل 3D وتكوين ECM 8. من خلال مسح الأدب، ويمكن التعرف على بروتوكولات decellularization مختلف عن كل الأنسجة تقريبا في الجسم 7.

بينما الأنسجة decellularized يمكن استخدامها مباشرة كما السقالات زرع أو 3D ركائز ثقافة الخلية، قد تسلل الخلويةتكون محدودة في الأنسجة مع هيكل ECM كثيفة 9. وعلاوة على ذلك، فإن عدم التجانس الطبيعي في ECM قد يسبب تقلبات في مرفق الخلية والتوزيع ضمن مصفوفات decellularized، والتي من المحتمل أن تؤثر على الاستجابة الخلوية 10. وبشكل عام، في حين واعدة بالنسبة لبعض التطبيقات، تطبيق الأنسجة decellularized في شكلها سليمة توفر التنوع المحدود من حيث الخصائص ضبط سقالة بما في ذلك الشكل، المسامية، وصلابة، فضلا عن طريقة التسليم للتطبيقات في الجسم الحي.

وللتغلب على هذه القيود، مجموعات بحثية عديدة تطبق أساليب معالجة أخرى لتوليد صيغ سقالة مخصصة باستخدام الأنسجة decellularized كمادة قاعدة. في أبسط صوره، وهذا قد تنطوي على cryomilling الأنسجة decellularized لتوليد حقن جزيئات ECM الأنسجة محددة 11. يمكن إدراج هذه الجزيئات ECM بمثابة خلية instruعنصر التفاعلية الذي نظمه في السقالات المركبة مع المواد الحيوية الأخرى، مثل في الموقع يشابك الهلاميات 12 و 13 و 14. بالإضافة إلى المعالجة الميكانيكية، ويمكن أيضا الأنسجة decellularized أن تخضع لعملية الهضم الأنزيمي مع بروتين و / أو الانزيمات حال السكر لصنع الهلاميات المائية المستمدة ECM والمواد الرغوية، ناقل دقيق، والطلاء 15 و 16 و 17، وكذلك لتجميع bioinks للطباعة 3D 18.

بالإضافة إلى التطبيقات الأنسجة والهندسة، وعقد bioscaffolds المستمدة ECM إمكانات كبيرة لتوليد أعلى الإخلاص نماذج في المختبر للبحث البيولوجي. وهناك حاجة كبيرة لتطوير أنظمة زراعة الخلايا 3D أن ألخص أفضل المكروية الخلوية المحلية 19. الأكثر في المختبر جوتجرى دراسات ثقافة الذراع حتى الآن على زراعة الأنسجة البوليسترين (برنامج التعاون الفني)، الذي لديه علاقة تذكر مع الوسط الخلوي معقد من الناحية البيولوجية والحيوية وجدت داخل الأنسجة الحية 20. بينما ملائمة لدراسة التفاعلات الخلوية في بيئة تسيطر عليها، وزراعة الخلايا على هذه ركائز 2D جامدة مبسطة يغير مرفق الخلية والتشكل، وكذلك كل خلية خلية وخلية ECM التفاعلات 21 و 22. التعديلات الخلوية لوحظ على 2D برامج التعاون الفني يمكن أن تؤثر على مسارات الإشارات بين الخلايا التي تنظم وظائف الخلية المتنوعة بما في ذلك البقاء على قيد الحياة، وانتشار، والهجرة، والتمايز، مما يثير تساؤلات من أهمية الدراسات 2D في النمذجة في أنظمة الجسم الحي 23. وكان هناك اعتراف متزايد بأن السلوك الخلوي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في 2D مقابل النظم 3D 24، والتي البيوكيميائية ونصفيشير omechanical مع ECM هي الوسطاء الرئيسيين من وظيفة الخلية 25. وقد حاول العديد من الجماعات للتغلب على القيود المفروضة على أنظمة 2D التي وضعتها طلاء برامج التعاون الفني مع مكونات ECM مثل الكولاجين، laminin وفبرونيكتين. في حين أن هذه الاستراتيجيات يمكن أن تحسن مرفق الخلية وقد تغير الاستجابات الخلوية، وهذه النماذج لا تزال محدودة بسبب التكوين 2D على أن لا تحاكي التنظيم المكاني معقدة أو الكيمياء الحيوية من ECM الأصلي 26 و 27.

لقد كان لدينا مختبر الهندسة الحيوية مهتمة في تطوير bioscaffolds المستمدة ECM بمثابة ركائز لتطبيقات زراعة الخلايا والأنسجة الهندسة 3-D. على وجه الخصوص، ونحن كان لها السبق في استخدام الأنسجة الدهنية decellularized (DAT) كمنصة سقالات للالدهنية تجديد 28. وعلاوة على ذلك، أنشأنا طرق تجميع ناقل دقيق 3D والرغاوي التي يسهل اختراقها باستخدام DAT هضمها مع البيبسين انزيم بروتين أو أنزيم الأميليز حال السكر α-29 و 30 و 31. وتجدر الإشارة إلى أننا أثبتنا في كل من هذه الأشكال سقالة أن يوفر ECM الدهنية المشتقة من المكروية الاستقرائي للتمايز مكون الشحم من الخلايا البشرية الدهنية المشتقة الجذعية / اللحمية (مخولا لصيانة طائرات) في الثقافة. وفي الآونة الأخيرة، وسعنا أساليب التصنيع لدينا لتوليد 3D الرغاوي التي يسهل اختراقها من الخنازير هضمها α الأميليز-decellularized البطين الأيسر (DLV) (طرق decellularization مقتبس من ينرايت وآخرون. 32)، وأظهرت أنها توفر منصة داعمة لإحداث cardiomyogenic في وقت مبكر التعبير علامة في التامور مخولا لصيانة طائرات المشتقة من الدهون الإنسان 31.

توضح هذه المقالة بالتفصيل الطرق لتوليف غير كيميائيا عبر ربط 3D الرغاوي وناقل دقيق مسامية المستمدة بحتةمن ECM α الأميليز هضم لاستخدامها 3D معقدة بيولوجيا في ركائز الثقافة خلية المختبر وكما الحيوية لتجديد الأنسجة. من الناحية النظرية، أي مصدر ECM التي تحتوي على ارتفاع الوزن الجزيئي الكولاجين يمكن أن تستخدم كمادة انطلاق لهذه التقنيات. إلى إبداء المرونة لهذا النهج، وقد تم تطبيق أساليب لتوليد bioscaffolds الأنسجة محددة باستخدام DAT البشري، الخنزير decellularized الجلد الأنسجة (DDT) 8، والخنازير DLV كأمثلة التمثيلية. ويقدم الشكل 1 لمحة بصرية من عملية تصنيع لرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM.

شكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على طريقة لإنتاج الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM-الأنسجة محددة. decel 1. الأنسجة Decellularized، أعدت في أعقاب تأسيسبروتوكولات lularization، ويمكن استخدامها لأنسجة محددة المستمدة ECM bioscaffold تلفيق. وتظهر الصور العيانية من DAT البشري رطب (أعد كما هو موضح في فلين 2010 28)، DDT الخنازير (أعد كما هو موضح في Reing، JE، وآخرون. 2010 8)، والخنازير DLV (أعد كما هو موضح في ينرايت وآخرون. 2010 32 )، والأمثلة النموذجية على مصادر ECM التي يمكن استخدامها كمواد البداية. تمثل القضبان نطاق 3 سم. 2. يتم مجفف بالتجميد أنسجة decellularized، ثم 3. مفروم ميكانيكيا. تمثل الحانات مقياس 1 سم. 4. ويمكن بعد ذلك cryomilled وECM المفروم، الذي هو اختياري للرغوة تلفيق، ولكن المطلوب لتخليق ناقل دقيق. يمثل مقياس شريط 3 مم. 5. ثم يتم هضمها وECM مفروم أو cryomilled مع α الأميليز والمتجانس لإنشاء تعليق ECM متجانسة. يمثل مقياس شريط 1 سم. 6B) لتصنيع ناقل دقيق، وelectrosprayed تعليق ECM cryomilled لتوليد ناقل دقيق كروية منفصلة. يمثل مقياس شريط 2 مم. 7. الرغاوي وناقل دقيق ومن ثم يمكن ممهى تدريجيا والمصنف مع الخلايا. وتظهر الصور التمثيلية للمخولا لصيانة طائرات الإنسان (خلايا قابلة للحياة = الأخضر) المصنف على رغوة DAT (يسار) وDAT ناقل دقيق (يمين). تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. معالجة الأنسجة Decellularized

  1. Decellularization وتجفيد
    1. الأنسجة Decellularize (ق) من الفائدة بعد بروتوكول المعمول بها.
      تم إعداد السقالات في الدراسة الحالية التالية بروتوكولات decellularization نشرت للإنسان DAT 28، DDT الخنازير 8، والخنازير DLV 32: ملاحظة. ويمكن أيضا المتاحة تجاريا، والكولاجين غير قابلة للذوبان يمكن استخدامها لصنع الرغاوي وناقل دقيق، مثل الكولاجين مصدرها وتر البقري، والتي استخدمت بنجاح على نطاق تركيز 10-50 ملغ / مل. قد تكون استخدمت مصادر الكولاجين غير قابلة للذوبان أخرى، ولكنها قد تتطلب الأمثل لتحديد مدى التركيز من شأنها أن تسفر السقالات مستقرة.
    2. نقل الأنسجة decellularized المائية أو الكولاجين المنقاة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع ملقط وإضافة ما يكفي من الماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O) لغمر الأنسجة، رالزراعة العضوية حجم الحد الأقصى لمجموع 35 مل.
    3. تجميد العينة بين عشية وضحاها في -80 ° C، مع أنبوب الطرد المركزي وضعه أفقيا أثناء التجميد لتحقيق أقصى قدر من المساحة السطحية للتسامي خلال تجفيد لاحق.
    4. إزالة الغطاء من أنبوب الطرد المركزي ونقل العينة المجمدة في وعاء بالتجفيد.
    5. يجفد العينة باستخدام مجفف تجميد المختبر ل48-72 ساعة أو حتى يجف تماما.
      ملاحظة: تجفيف الوقت قد تختلف عن lyophilizers المختلفة والأنسجة decellularized.
    6. يفرم ناعما ECM مجفف بالتجميد إلى قطع صغيرة (~ 1-2 ملم 3) باستخدام مقص جراحي حادة.
    7. تخزين ECM المفروم في مجفف حتى جاهزة لمزيد من المعالجة.
      ملاحظة: من المستحسن أن ECM مفروم استخدامها على الفور لمنع امتصاص الرطوبة من البيئة.
  2. Cryomilling (اختياري للرغوة تلفيق)
    1. ملء 25 مل الفولاذ المقاوم للصدأ غرفة الطحن لlaboratoري بال طاحونة النظام مع ECM مجفف بالتجميد المفروم وإضافة كل منهما 10 ملم الفولاذ المقاوم للصدأ كرات الطحن.
    2. إغلاق ويغرق تماما غرفة الطحن المحملة في النيتروجين السائل لمدة 3 دقائق.
    3. طاحونة العينة المجمدة لمدة 3 دقائق في 30 هرتز (1800 دورة في الدقيقة).
    4. كرر الخطوات من 1.2.2 و1.2.3 حتى يتم المضروب على ECM الى مسحوق ناعم.
      ملاحظة: عدد المرات التي يجب تكرار هذه الخطوات قد تختلف بين مصادر ECM. على سبيل المثال، DAT عادة ما يتطلب 3 دورات الطحن لتوليد مسحوق ناعم.
    5. نقل مسحوق باستخدام سكوبولا في قارورة زجاجية، وختم بإحكام، وتخزينها في مجفف.
  3. إعداد ECM تعليق
    1. تزن من 250 ملغ من أي مفروم (للرغاوي) أو cryomilled (للرغاوي أو ناقل دقيق) ECM وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. الرجوع إلى الخطوة 1.1.6 والقسم 1.2 لإعداد ECM المفروم وECM cryomilled، على التوالي.
      ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لإعداد 50 ملغ / مل ECM السقوفسيون، التي يستحب للDAT البشري، DDT الخنازير، والخنازير DLV. اعتمادا على مصدر ECM محددة، قد يتم إنشاء تعليق موحدة بتركيزات أعلى أو أقل البداية.
    2. إضافة 5 مل من 0.22 M ناه 2 PO 4 (الرقم الهيدروجيني 5.4) عازلة للأنبوب الطرد المركزي وبمناسبة مستوى السائل في الأنبوب.
    3. إعداد محلول المخزون-α اميلاز بإضافة 7.5 ملغ من α الأميليز إلى مل 0.22 M ناه 2 PO 4 (الرقم الهيدروجيني 5.4) عازلة 1. إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون-α اميلاز (0.75 ملغ من α الأميليز؛ 0.3٪ وزن / وزن الأنسجة الجافة) للعينة. إضافة 0.22 M ناه 2 PO 4 للحصول على الحجم النهائي من 10 مل.
    4. تستنهض الهمم تعليق مستمر في 300 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    5. الطرد المركزي تعليق في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة. بعناية جمع والتخلص من طاف دون الإخلال بيليه ECM هضمها. إعادة تعليق المواد مكعبات في 10 مل من 5٪ كلوريد الصوديوم المخفف في ده 2 O.
    6. كرر الخطوة 1.3.5 لمجموعه اثنين يشطف مع 5٪ كلوريد الصوديوم في [ده 2 O.
    7. تجاهل طاف وإعادة تعليق المواد مكعبات في 10 مل من ده 2 O.
    8. تستنهض الهمم تعليق مستمر في 300 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في RT.
    9. الطرد المركزي تعليق في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة. بعناية جمع والتخلص من طاف دون الإخلال بيليه ECM هضمها.
    10. إضافة 0.2 M حمض الخليك إلى علامة 5 مل في الخطوة 1.3.2.
    11. تستنهض الهمم تعليق مستمر في 120 دورة في الدقيقة O / N عند 37 درجة مئوية.
    12. التجانس تعليق ECM في درجة حرارة الغرفة في فترات عشرة ثانية باستخدام الخالط باليد مجهزة رأى الأسنان 10 ملم التحقيق واسعة حتى لا تبقى شظايا مرئية. ضع تعليق في كوب من الماء البارد بين فترات التجانس لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
      ملاحظة: اعتمادا على مصدر ECM، قد تكون هناك حاجة مزيد من التخفيف في 0.2 حامض الخليك M للحصول على تعليق متجانسة. Eتبريد xcessive لتعليق ECM قد يؤدي إلى زيادة في اللزوجة التي يمكن أن تتداخل مع تجانس كفاءة. إذا لاحظت زيادة في اللزوجة، يمكن rewarmed العينة إلى 37 درجة مئوية، وتتعرض لمزيد من المعالجة.
    13. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد قبل رغوة أو تلفيق ناقل دقيق.

2. المستمدة ECM رغوة تلفيق

  1. احتضان تعليق ECM من الخطوة 1.3.13 (مفروم أو cryomilled) عند 37 درجة مئوية مع الإثارة مستمرة في 120 دورة في الدقيقة حتى تعليق دافئة.
  2. تمييع تعليق ECM في 0.2 M الخليك الحمضية إلى التركيز المطلوب.
    ملاحظة: اعتمادا على مصدر ECM والمواد الرغوية مستقرة قد تكون مستعدة في حدود 10-100 ملغ / مل، مع 15-50 ملغ / مل كما النطاق الموصى به لDAT، DDT وDLV. عادة، سوف الرغاوي ملفقة في تركيزات أعلى يكون أقل قليلا يسهل اختراقها ولكن أكثر استقرارا في الثقافة وأسهل في التعامل معها.
  3. باستخدام حقنة 3 مل ثإيث إبرة 18 G لمنع تشكيل فقاعة في تعليق ECM، وملء القالب المطلوب مع تعليق ECM. لافتعال DAT، DDT، والرغاوي DLV، الاستغناء عن 400 ميكرولتر من 35 ملغ / مل تعليق ECM في لوحة المعالجة خلية ثقافة 48-جيدا.
    ملاحظة: شكل القالب المحدد وحجم تعليق ECM تحديد هندسة الرغوة الناتجة.
  4. تغطية وتجميد القوالب بين عشية وضحاها عن طريق وضعها في -20 ° C أو الفريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: درجة حرارة التجميد قد تؤثر على المسامية من الرغاوي. ومن المتوقع المسام أكبر عندما يتم تجميد العينات في -20 ° C مقارنة -80 ° C نظرا لتكوين بلورات الجليد أكبر 33. لافتعال الرغاوي مع بنية مسامية موحد، تأكد من أن العفن ليست على اتصال مع سطح موصل لمنع التبريد الاتجاه.
  5. ضع القوالب التي تحتوي على العينات المجمدة في قارورة مجفاد. ربط قارورة مجفاد إلى laboratأوري نظام مجفف تجميد وجافة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: من المهم أن العينة لا تزال المجمدة قبل تجفيد.
  6. تخزين المواد الرغوية مجفف بالتجميد في مجفف حتى المطلوبة.

3. المستمدة ECM ناقل دقيق تلفيق عبر Electrospraying

وأظهرت لمحة عامة عن electrospraying التي أنشئت في الشكل 2: ملاحظة.

  1. احتضان تعليق ECM cryomilled من الخطوة 1.3.13 عند 37 درجة مئوية مع الإثارة مستمرة في 100 دورة في الدقيقة O / N.
    ملاحظة: يتم استخدام Cryomilled ECM لافتعال ناقل دقيق المستمدة ECM لضمان قدر أكبر من الاتساق في التعليق ومنع انسداد خلال electrospraying.
  2. تحميل 3 مل من ECM تعليق في قفل مل لور حقنة 3 وإرفاق ضخ المجنح وضع على تحمل الحقنة.
    ملاحظة: هناك مجموعة من مقاييس إبرة يمكن استخدامها، مع الاعتراف بأن الاختيار قد تؤثر على حجم وشكل ناقل دقيق الناتجة. لfabricatه وناقل دقيق DAT، DDT، وDLV، واستخدام إبرة G 25.
  3. تأمين حقنة داخل ضخ حقنة. ربط الإبرة إلى موقف معوجة ووضع طرف الإبرة عموديا على مسافة 4-6 سم من الجزء العلوي من شكل منخفض ديوار قارورة (250-500 مل نطاق حجم مستحسن).
  4. إرفاق القطب مقطع التمساح إلى رأس الإبرة وتوصيله إلى الطرف الموجب من إمدادات الطاقة عالية الجهد.
  5. أضعاف شريط من رقائق الألومنيوم (12 × 5 سم) على حافة قارورة فراغ.
  6. إرفاق الثاني التمساح كليب القطب إلى الحافة الخارجية للاحباط وذلك لربط محطة مصدر الأرضي من امدادات الطاقة.
  7. ملء قارورة ديوار مع النيتروجين السائل لحوالي 1 سم من أعلى، بحيث ¾ من وغمرت المياه احباط.
    ملاحظة: من المهم للحفاظ على قارورة ديوار مليئة النيتروجين السائل. يجب أن يكون السطح من النيتروجين السائل لا يقل عن 2 سم من أعلى القارورة خلال بروسس electrosprayingالصورة. مطلوب إعادة تعبئة مستمرة من النيتروجين السائل للحفاظ على مستوى ثابت خلال electrospraying.
  8. تعيين ضخ حقنة إلى معدل ضخ 30 مل / ساعة.
    ملاحظة: يمكن متفاوتة معدل ضخ تغيير شكل ناقل دقيق وقطر، ولكن مجموعة الموصى بها هي 25 - 35 مل / ساعة. في حين أنها تعتمد بشكل كبير على لزوجة تعليق، معدلات تدفق أقل من 25 مل / ساعة قد يؤدي إلى توليد ناقل دقيق أكبر. في معدلات تدفق منخفضة جدا، وحجم وشكل ناقل دقيق قد تصبح أقل تجانسا. في معدلات ضخ فوق 35 مل / ساعة، قد تتعطل توحيد قطرات المولدة عبر electrospraying، مما أدى إلى ناقل دقيق غير كروية مع توزيع حجم أوسع 34.
  9. تطبيق الجهد 20 كيلو فولت وبدوره على ضخ حقنة لبدء electrospraying.
    ملاحظة: يجوز تغيير الجهد لضبط حجم ناقل دقيق ويميل إلى أن يكون لها تأثير أكبر على قطر من infusioمعدل ن. مدى الجهد الموصى بها هي 15-25 كيلو فولت. ومن المتوقع حدوث انخفاض في قطر ناقل دقيق مع زيادة في الجهد 35.
  10. مرة واحدة ضخ كاملة، صب بعناية من النيتروجين السائل الزائد من ديوار، وترك ناقل دقيق معلقة في ~ 25 مل من النيتروجين السائل لضمان أن تبقى مجمدة.
  11. على الفور نقل ناقل دقيق مع النيتروجين السائل في أنبوب الطرد المركزي 50 مل بصب في اقتراح واحد على نحو سلس. جمع أي ناقل دقيق المجمدة المتبقية في ديوار مع سكوبولا وإضافتها إلى أنبوب الطرد المركزي.
    ملاحظة: اعتمادا على حجم ديوار، وناقل دقيق في النيتروجين السائل يمكن أن يكون سكب في البداية في وعاء متوسط ​​الحجم، ثم نقل على الفور إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
  12. تغطية أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على ناقل دقيق في النيتروجين السائل مع رقائق الألومنيوم مثقب مع ثقوب صغيرة استعدادا لبالتجفيد.
  13. وضع الطرد المركزي المغطاةأنابيب في قارورة مجفاد. على الفور الاتصال القارورة إلى مجفاد وتجفيف العينات O / N.
    ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على ناقل دقيق معلقة في النيتروجين السائل لضمان عدم ذوبان الجليد قبل هذه الخطوة، وذوبان الجليد قد يؤدي إلى انهيار و / أو التجميع. سوف DAT، DDT وDLV ناقل دقيق ملفقة بتركيز 35 ملغ / مل باستخدام الظروف electrospraying المذكورة أعلاه وعادة ما يكون قطرها رطب تتراوح بين 350-500 ميكرون في الحجم. قد تختلف توزيع حجم اعتمادا على مصدر ECM.
  14. تخزين ناقل دقيق مجفف بالتجميد في مجفف حتى المطلوبة.

الشكل 2
الشكل 2. نظرة عامة على جهاز Electrospraying المستخدمة في تصنيع ناقل دقيق. A: صورة تبين ترتيب المعدات electrospraying الرئيسية بما في ذلك ضخ حقنةوعالية الجهد إمدادات الطاقة، وكذلك تحديد المواقع من الإبرة المتعلقة ديوار النيتروجين السائل. B: Electrospraying التخطيطي، بما في ذلك النطاقات الموصى بها للجهد، ومعدل التسريب، والمسافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. كسوات وناقل دقيق التحضير لزراعة الخلايا

  1. الإماهة
    1. نقل الرغاوي مجفف بالتجميد مع ملقط في أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على الايثانول الزائد المطلق (~ 99.9٪) (~ 5: 1 نسبة الإيثانول برغاوي). وبالمثل، إعادة تعليق ناقل دقيق مجفف بالتجميد في الايثانول المطلق الزائد داخل أنبوب الطرد المركزي الأصلية المستخدمة لجمع. باستخدام ماصة المصلية، تصفية ناقل دقيق من خلال غربال المقاوم للصدأ مع حجم شبكة المعرفة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي الجديدة لإزالة أي وحدات العمل وتحديد نطاقات الحجم المطلوب.
      ملاحظة: إذا هي ملفقة الرغاوي داخل لوحات برامج التعاون الفني، ويمكن ممهى مباشرة داخل هذه السفن.
    2. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو حتى الرغاوي أو ناقل دقيق استقروا الجاذبية إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في غطاء تدفق الصفحي باستخدام الكواشف معقمة وتقنية معقمة المناسبة.
    3. إزالة الايثانول المطلق باستخدام ماصة المصلية وإضافة الزيادة (5: 1 نسبة) 95٪ من الإيثانول المخفف بمحلول ملحي معقم الفوسفات مخزنة (PBS) إلى السقالات. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو حتى غرقت السقالات المستمدة ECM إلى الجزء السفلي من السفينة الإماهة.
    4. تدريجيا ترطيب السقالات من خلال سلسلة الايثانول (90، 85، 80، 75، 70، 50، 25 و 0٪، مخففة مع معقم PBS). في كل خطوة، واحتضان عند 4 درجات مئوية حتى غرقت السقالات في الجزء السفلي من السفينة قبل تغيير الحل. ديغا السقالات تحت فراغ ضوء إذا تشكيل فقاعة داخل السقالات هو OBServed.
    5. استبدال PBS العقيمة لاثنين يشطف إضافية لإزالة الإيثانول المتبقية.
    6. مخزن في 100٪ العقيمة PBS في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للزراعة الخلايا. استخدام السقالات ضمن 1-2 أسابيع بعد معالجة الجفاف.
  2. استعدادا لبذر خلية
    1. في اليوم قبل البذر، ونقل الرغاوي باستخدام ملقط في الثقافة خلية معاملة حسنة لوحات أو إدراج transwell وإضافة ما يكفي من مستنبت الخلية (اختيارهم بناء على نوع من الخلايا في المصالح) لغمر تماما السقالات (على سبيل المثال، 2.5 مل / سقالة في لوحة 12 أيضا). وبالمثل، والسماح للناقل دقيق لخطورة تسوية داخل أنبوب الطرد المركزي، بعناية إزالة PBS باستخدام ماصة المصلية دون إزعاج ناقل دقيق، وإضافة مستنبت الخلية لتحقيق 5: 1 نسبة متوسطة إلى ناقل دقيق.
      ملاحظة: للحصول على بذر مخولا لصيانة طائرات الإنسان، والاستفادة من Dulbecco والتعديل المتوسطة النسر (DMEM): خليط F12 المغذيات هام تستكمل مع10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين.
    2. استبدال مستنبت خلايا لمجموعة من شطف واحد.
    3. يوازن بين عشية وضحاها السقالات في مستنبت الخلايا عند 37 درجة مئوية. والسقالات يكون جاهزا للخلية البذر في اليوم التالي.
      ملاحظة: الرغاوي يمكن المصنف ثابت في إدراج خلية ثقافة أو زراعة الأنسجة لوحات جيدا 29، أو المصنف حيوي باستخدام شاكر مختبر 36. اعتمادا على مصدر ECM، وأساليب المعالجة والتركيز تعليق، بذر الحيوي قد يؤدي إلى تعزيز مرفق الخلية الأولي والانتشار والتسلل. وناقل دقيق يمكن المصنف حيوي باستخدام نظام الثقافة الدوار 11.

Representative Results

في الدراسة الحالية، قمنا ملفقة الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM باستخدام DAT البشري، DDT الخنازير، والخنازير DLV كأمثلة التمثيلية مما يدل على أن تقنيات يمكن تطبيقها لتوليد bioscaffolds الأنسجة محددة باستخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة decellularized كمصادر ECM ( الشكل 1). لكل من الرغوة وناقل دقيق تلفيق، وقد تم تكييف هذه التقنية Nishihara من الإذابة الكولاجين مع انزيم حال السكر α الأميليز 37 لتوليد تعليق ECM لزج من المواد الأنسجة بدءا decellularized، والذي يستخدم لتجميع bioscaffolds من خلال إجراءات تجميد وبالتجفيد التي تسيطر عليها.

لافتعال الرغاوي، والأنسجة decellularized يمكن معالجتها من خلال إما تنميق الميكانيكية أو cryomilling لزيادة مساحة السطح قبل الهضم الأنزيمي. التالية45؛ -amylase العلاج والتجانس، والاستغناء عن تعليق ECM الناتجة في قالب المعرفة من قبل المستخدم، والذي هو ثم المجمدة والمجففة بالتبريد. السقالات ويمكن تخزين مستقر في الحالة الجافة لفترة طويلة من الزمن. قبل استخدامها في دراسات زراعة الخلايا، يجب أن تخضع السقالات مجفف بالتجميد لعملية الإماهة تسيطر عليها أن ينتج الرغاوي متجانسة مسامية عالية والمائية المستمدة من ECM النقي (الشكل 3A). إذا ممهى الرغاوي بسرعة كبيرة جدا، وتورم سريع قد يضر السمات الهيكلية الدقيقة، مما أدى إلى فقدان النزاهة وانهيار الهيكلية. بشكل عام، فإن المواد الرغوية الإبقاء على شكل محدد من قبل القالب الأصلي الإماهة التالية ومستقرة دون الحاجة إلى يشابك الكيميائية. الشكل 3B يظهر ممثل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وصور للDAT، DDT، وDLV الرغاوى ملفقة مع ECM cryomilled بتركيز 35 ملغ / مل ودرجة حرارة تجميد -80 & #176، C.

الشكل (3)
الشكل 3. الصور التمثيلية للDAT، DDT، وDLV كسوات مصنعة مع Cryomilled ECM معلقات في تركيز 35 ملغ / مل والمجمدة في -80 ° C. A: عرض العيانية للDAT، DDT، وDLV المضروب الرغاوي توليفها في 48 جيدا زراعة الأنسجة لوحة العفن التالية الإماهة. تمثل الحانات مقياس 1 سم. B: الصور SEM من الرغاوي DAT، DDT، وDLV يظهر التركيب الدقيق التي يسهل اختراقها متجانسة. تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويمكن أيضا أن تعليق ECM cryomilled استخدامها لتوليد ناقل دقيق المستمدة ECM نقية عبر تقنيات electrospraying (الشكل 2 (الشكل 4A). في حين أن ناقل دقيق يمكن تخزينها في حالة مجفف بالتجميد، فمن المستحسن لسهولة التعامل مع التي يتم الاستغناء هم أو منخول لمجموعة الحجم المطلوب بعد إعادة تعليق في الإيثانول. وتشير SEM التصوير أن التركيب الدقيق ناقل دقيق يمكن أن يختلف وفقا لمصدر الأنسجة decellularized (الشكل 4B).

الشكل (4)
الشكل 4. الصور التمثيلية للDAT، DDT، وDLV ناقل دقيق مصنعة مع Cryomilled ECM معلقات في تركيز 35 ملغ / مل، وهو معدل ضخ 0.5 مل / دقيقة، والجهد التطبيقية من 20 كيلو فولت. A: العيانية عرض سو رطب على ناقل دقيق DAT، DDT، وDLV. تمثل القضبان نطاق 4 مم. B: الصور SEM من ناقل دقيق DAT، DDT، وDLV تبين أن التركيب الدقيق والحجم يمكن أن تختلف تبعا لمصدر ECM. تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخواص الميكانيكية للالسقالات تعتمد على مصدر ECM، وطريقة معالجة تطبيق (أي تنميق مقابل cryomilling)، وتركيز تعليق ECM، ودرجة حرارة التجمد. بشكل عام، السقالات هي لينة والمتوافقة مع الرجوعية الشباب في مجموعة من 1-5 كيلو باسكال ذكرت لDAT (50 و 100 ملغ / مل) 29 والرغاوي DLV (20-50 ملغ / مل) 31، و<1 باسكال لناقل دقيق. الرغاوي cryomilled وعادة ما تكون أكثر ليونة عشروالرغاوي مفروم بسبب طبيعتها أكثر تعطلت. هناك حاجة إلى أنظمة الاختبار الميكانيكية المتخصصة مجهزة خلايا الحمل عالية الحساسية لتوصيف دقيق لخصائص الضغط. عادة، فإن المواد الرغوية وناقل دقيق يكون الرجوعية أقل من الأنسجة decellularized الأم نظرا لخطوات المعالجة الإضافية تشارك في تصنيع بما في ذلك عملية الهضم الأنزيمي والتجانس، فضلا عن الطبيعة غير تساهمي عبر ربط من السقالات. ومع ذلك، وهذا يمكن أن تختلف تبعا الأنسجة من الاهتمام. على سبيل المثال، في الأعمال السابقة، وجدنا أن مفروم DAT الرغاوى ملفقة بتركيزات عالية ECM زيارتها (100 ملغ / مل) الرجوعية مماثلة إلى الأنسجة الدهنية الأم 29.

الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM ممهى يمكن المصنف مع الخلايا تحت ظروف التربية ساكنا أو متحركا لتوفير منصة خلية داعمة لفي الدراسات المختبرية ثقافة خلية و/ س(ص) في تسليم خلية الجسم الحي. في حين السقالات دعم عموما مرفق الخلية، فإن كفاءة البذر تعتمد على مصدر ECM، هندسة سقالة والمسامية، ونوع من الخلايا في المصالح. على هذا النحو، فإن أساليب البذر وكثافة تتطلب التحسين تبعا للظروف التي يحددها المستخدم. لرغاوي المذكورة أعلاه، فإننا نوصي تركيز خلية البداية في مجموعة من ،25-1 × 10 6 خلية / سقالة، مع بذر الديناميكي على شاكر المداري لتعزيز تسلل خلية. لناقل دقيق، نقترح كثافة البذر الأولية في حدود 25000 - 50000 خلية / ملغ من ناقل دقيق، مع بذر تتم تحت الظروف الديناميكية في الثقافة قارورة الدوار 11. الصور المبينة في الجزء السفلي من الشكل 1 تمثل مخولا لصيانة طائرات الإنسان المصنفة على رغوة DAT (يسار) أو DAT ناقل دقيق (يمين، prelabeled مع صبغ الأمينات رد الفعل والظهور الزرقاء 13)، كما تصور من قبل الصغرى متحد البؤرSCOPY باستخدام الفلورسنت وصمة عار بقاء الخلية (الحية خلايا = الخضراء، ميتة خلايا = الحمراء، أشرطة النطاق تمثل 100 ميكرون). المجهر متحد البؤر يمكن استخدامها لتصور خلايا المصنف على سطح الرغاوي لتصل إلى 2 مم في السمك، ولكن التصور في المناطق الوسطى من السقالات محدودة بطبيعتها مبهمة. ومع ذلك، فإن المواد الرغوية وناقل دقيق يمكن أن تعامل على أنها الأنسجة والبارافين جزءا لا يتجزأ أو النسيجية والمناعى مقطوع البرد تحليلات لتصور توزيع الخلايا والتعبير علامة.

Discussion

بشكل عام، يمكن bioscaffolds المستمدة من الأنسجة decellularized تقارب أوثق تكوين معقدة 3D وهيكل ECM في المكروية الخلوية المحلية بالمقارنة مع السقالات الاصطناعية أو نماذج الثقافة القياسية على أساس 2D برامج التعاون الفني. كما نوقش سابقا، التفاعلات خلية ECM هي ذات أهمية حاسمة في التوسط السلوك الخلوية على حد سواء في الثقافة وفي الجسم 1. وإذ تدرك أن الخصائص الكيميائية الحيوية، الفيزيائية الحيوية، والنشاط الحيوي للECM هي فريدة من نوعها في كل الأنسجة، وهناك أدلة متزايدة على أن دعم المنطقي لتطبيق نهج الأنسجة محددة في تصميم المواد الحيوية لهندسة الأنسجة، وكذلك في تطوير أكثر من الناحية الفسيولوجية نماذج الثقافة ذات الصلة ب في التجارب المختبرية 20. استخدام الأنسجة decellularized كمادة أولية، يمكن أن طرقنا تتضمن تركيبة معقدة من ECM الأنسجة محددة ضمن أكثر الزبونصيغ سقالة omizable. في حين أن خطوات المعالجة الميكانيكية والأنزيمية سوف يؤدي إلى فقدان التركيب الدقيق ECM الأصلي، وقد أظهرت دراسات سابقة مع DAT التي يتم حفظها آثار مفيدة للECM الدهنية المشتقة في هذه الأشكال سقالة، مما يشير إلى أن تكوين bioscaffold هو الوسيط الرئيسي وظيفة الخلايا 11، 29. وهناك ميزة كبيرة لاستخدام الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM بمثابة ركائز ثقافة الخلية بالمقارنة مع الأنسجة decellularized سليمة هي أنها أكثر تجانسا، التي يمكن أن تحسن التوحيد في توزيع الخلايا والتفاعلات خلية خلية / خلية ECM.

الأساليب المذكورة هنا يمكن استخدامها لتوليد مجموعة واسعة من bioscaffolds الأنسجة محددة لاستخدامها في زراعة الخلايا والأنسجة تطبيقات الهندسة. على سبيل المثال، بالإضافة إلى DAT، DDT، وDLV، وقد طبقت مختبرنا بنجاح هذه التقنيات لتوليد 3D بورالرغاوي الأوس باستخدام العظام decellularized والغضاريف والنواة اللبية، والتليف الحلقة، وكذلك المتاحة تجاريا، والكولاجين غير قابلة للذوبان المستمدة من وتر البقري. من وجهة نظر في المختبر، ويمكن استخدام هذه bioscaffolds كأساس لالإخلاص أعلى نماذج الثقافة 3D للتحقيق في الخلوي وعلم الأحياء، علم وظائف الأعضاء أو علم الأمراض 38، بمثابة ركائز النشطة بيولوجيا في الإنتاجية العالية منصات فحص المخدرات 39، أو المصفوفات كما مفيدة لالجذعية التمايز 40 و 41 خلية. DAT، DDT وDLV الرغاوي ملفقة بتركيزات من 25 - 50 ملغ / مل مستقرة في المدى الطويل في الثقافة المختبر (اختبار تصل إلى 28 يوما). وعلاوة على ذلك، يمكن لجميع الأنواع الثلاثة من ناقل دقيق دعم مرفق الخلية وانتشارها في ظل ظروف دينامية في نظام الثقافة الدوار القص منخفضة (10-15 دورة في الدقيقة) لمدة 2 أسابيع على الأقل. لتقديم الطلبات في الجسم الحي، وحيويا وbiodegradaبلي الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM تبشر كمنتجات قبالة الجاهزة للاستخدام لتحفيز إعادة تشكيل الأنسجة بناء وتجديد 11، 29. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام السقالات خلايا لاصقة كما نظم تسليم العلاج بالخلايا 42 و 43. وكمثال على ذلك، عرضت الرغاوي DAT لتعزيز الأوعية الدموية وتكون الشحم عند المصنف مع مخولا لصيانة طائرات خيفي وزرعها تحت الجلد في نموذج الفئران مناعيا 29. بالنسبة إلى DAT سليمة والمواد الرغوية وDAT معالجة أكثر شدة تتحلل بسرعة أكثر من ذلك بكثير، مع تخفيض 50٪ في حجم لوحظ في 3 أسابيع لأنها أصبحت متكاملة مع الأنسجة المضيف، وشبه كامل ارتشاف بنسبة 12 أسابيع. ومع ذلك، كما يتسبب الرغاوي استجابة عائية أكثر فعالية، مما يدل على أن ECM-هضم انزيم زيارتها آثار فريدة من نوعها المؤيدة للالتجدد. وبالمثل، يمكن استخدام ناقل دقيق المستمدة ECM كما هو الحال في المختبر </ م> ركائز ثقافة الخلية داخل النظم ثقافة ديناميكية وكما حقن المركبات تسليم خلية 11، 30، 44. وبشكل أكثر تحديدا، يمكن أن قطر وسطح كبير مساحة صغيرة من ناقل دقيق تمكين إيصال كمية كبيرة من الخلايا في حجم صغير، مع توفير المصفوفة التي قد تساعد على دعم بقاء الخلية وزيادة الاحتفاظ الخلية في موقع الحقن 30. قبل استخدامها في أي نظام المعيشة، فمن الأهمية بمكان لضمان أن ECM مصدر يخلو كبير من المكونات الخلوية مولدة و / أو الكواشف decellularization يحتمل أن تكون سامة للخلايا التي يمكن أن تثير رد فعل المضيف السلبية 7.

يستخدم البيبسين انزيم بروتين عادة في إعداد الهلاميات المائية المستمدة ECM 15. البيبسين هو الأنزيم البروتيني غير محددة من شأنها أن هضم الكولاجين وغيرها من ECM البروتينات كثافة العملياتس 45 أجزاء صغيرة. في حين تم الإبلاغ عن الهلاميات المائية ملفقة من ECM-هضم الببسين أن يكون لها آثار خلايا مفيدة، والحد هو أن هذه المواد تميل إلى أن تكون غاية ضعيفة ميكانيكيا 46. لدينا في التطوير الأولي للناقل دقيق DAT، نحن تستخدم نهج المركب الذي كان الجمع بين البيبسين هضم DAT مع الجينات، وأضاف قطرة قطرة إلى CaCl 2 لتشكيل حبات كروية (30). كانت حبات في وقت لاحق الصور عبر ربط وتم استخراج الجينات باستخدام سيترات الصوديوم. بالإضافة إلى متطلبات يشابك الكيميائية، وكان قيود مفتاح أن ناقل دقيق ملفقة مع هذا النهج كان الاستقرار الفقراء أقل من حجم مجموعة من 900-950 ميكرون 30. في مكان البيبسين، والأساليب المقدمة هنا الاستفادة من عملية الهضم أكثر معتدل من ECM مع انزيم حال السكر α الأميليز، والذي يفترض أن يلتصق مجموعة الكربوهيدرات من telopeالمناطق ptide الكولاجين، وبالتالي زيادة القابلية للذوبان في حمض الخليك 37. هذا النهج يمكن عزل الكولاجين بلمرة للغاية التي يمكن استخدامها لتوليد الرغاوي وناقل دقيق المستمدة ECM نقية دون الحاجة إلى يشابك الكيميائية أو غيرها من المواد المضافة. واستقرت هذه bioscaffolds من خلال التفاعلات الفيزيائية والرابطة الهيدروجينية بين الألياف الكولاجين المحفوظة جيدا، على غرار الكولاجين في المكروية ECM الأم.

الرغاوي هي منصة مرنة للغاية والتي يمكن أن تكون ملفقة في مجموعة واسعة من هندستها اعتمادا على قالب معين المحدد. لدراسات ثقافة الخلية، يمكن التصويت الرغاوي مباشرة في لوحات جيدا برامج التعاون الفني، لتشكيل الطلاء أو السقالات 3D متفاوتة سمك. لافتعال الرغاوي 3D مع الأسطح موحدة جدا، فمن المستحسن أن قالب مخصص تم تصميمه التي يمكن أن تكون مختومة على كلا الجانبين من البلاستيك أو الزجاج الشرائح. إما ECM مفروم أو cryomilled يمكن استخدامها لتجميعالرغاوي. بشكل عام، وجدنا أن الرغاوي cryomilled تميل إلى أن تكون أكثر ليونة ظاهريا ولها التركيب الدقيق أكثر تعطلت بتركيزات أقل 31 و 36. اعتمادا على مصدر الأنسجة، قد يسبب خطوات المعالجة الميكانيكية إضافية تغييرات في تكوين ECM التي يمكن أن تؤثر وظيفة الخلية. على سبيل المثال، في عملنا السابق، تم الكشف عن laminin في الرغاوي DLV المفروم، ولكن ليس cryomilled DLV الرغاوي 31. في المقابل، تم الكشف عن الكولاجين I، الكولاجين الرابع، laminin وفبرونيكتين في كل المفروم وcryomilled DAT الرغاوي 36. بالإضافة إلى خطوات المعالجة الميكانيكية، وحجم المسامية والمسام من الرغاوي يمكن ضبطها إلى حد ما من خلال تغيير تركيز تعليق ECM ودرجة حرارة التجمد 47. بشكل عام، وانخفاض تركيز المواد الرغوية (~ 10-15 ملغ / مل) هي نوعيا أكثر مسامية، ولكن قد يصاب بسرعة ولها الفقيرةالاستقرار في الثقافة على المدى الطويل 31 و 36. وبالمثل، فإن معدل تجميد أبطأ، حقق عادة من قبل أعلى درجة حرارة التجمد، يمكن أن يؤدي إلى مسام أكبر في الرغاوى نظرا لحجم بلورات الجليد تشكلت خلال تلفيق 29. كل من هذه المعايير قد تؤثر على التفاعلات الخلية التي تحتوي على المواد، بما في ذلك المرفق، تسلل، وإعادة عرض. على سبيل المثال، نمو الخلايا على الرغاوي التي هي ملفقة مع تركيزات أعلى ECM قد تكون محدودة للمناطق السطح، لا سيما مع مصادر ECM المفروم وفي ظل ظروف ثقافة ثابتة 36.

لناقل دقيق، والمعايير الأساسية التي يمكن ضبطها هي تركيز تعليق ECM، إبرة قياس، والجهد التطبيقية، مع تركيزات أعلى عادة يحقق ناقل دقيق التي هي أكثر استقرارا في ظل ثقافة ديناميكية على المدى الطويل. بعد بدء electrospraying، وsuspens ECMيجب قطرات أيون تسقط بسرعة في وسط قارورة، نحو اتجاه جامع رقائق الألومنيوم. لمنع التجميع، فمن المهم أن حبات الاتصال النيتروجين السائل قبل احباط. المسافة بين الإبرة وسطح النيتروجين السائل يمكن تعديلها لتلبية هذه الاحتياجات. ومن المهم أن نلاحظ أن الأمثل قد يكون مطلوبا تبعا لخصائص كل مصدر ECM محددة، ولا سيما في تحديد النطاق تركيز من شأنها أن تولد bioscaffolds مستقرة. عامل رئيسي آخر هو بروتوكول decellularization التي يتم استخدامها لتوليد المواد الأولية، وطرق decellularization التي تحط من ECM أو وجود الكواشف المتبقية (على سبيل المثال، السطحي) قد تؤثر سلبا على استقرار الرغاوي الناتجة وناقل دقيق. إذا واجهت تحديات مع استقرار bioscaffold، والخيارات التي يمكن أن يتم التحقيق تشمل باستخدام عملية الإماهة أكثر تدرجا، وزيادة المعل ECMتركيز ension، واستكشاف مفروم مقابل ECM cryomilled. ينبغي لجميع هذه الخيارات تفشل في حل المشكلة، قد يكون من الضروري لاستكشاف بروتوكولات decellularization أو مصادر ECM بديل.

لضمان استنساخ أثناء الإنتاج سقالة، يجب توخي الحذر خاصة في خطوات معينة في البروتوكول. عندما cryomilling الأنسجة decellularized، فمن المستحسن أن طحن أن تتم مباشرة بعد بالتجفيد في بيئة جافة للحد من احتمال تجميع الجسيمات نظرا لامتصاص الرطوبة من البيئة. خلال تلفيق ناقل دقيق، يقترح أن تعليق وelectrosprayed في دفعات صغيرة، مع حجم الحد الأقصى من 3 مل، لتجنب المشاكل مع عينة التبريد التي يمكن أن تؤدي إلى انسداد الإبرة. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري أن ناقل دقيق لا يسمح لذوبان الجليد بعد عملية electrospraying. للحفاظ على الهندسة الكروية والاستقرار الميكانيكي، وmicrocarriالمتطلبات البيئية ينبغي جمع من النيتروجين السائل، وتنقل في حاوية مملوءة النيتروجين السائل، ومجفف بالتجميد على الفور. وأخيرا، بالنسبة لكل من الرغاوي وناقل دقيق، فمن الأهمية بمكان أن الخطوات الإماهة تتم ببطء على مدى فترة من عدة أيام. الإماهة السريع يمكن أن يؤدي إلى انهيار الهيكلي على المستويين الكلي و / أو الصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، يجب أن يحدث الإماهة ببطء لمنع تشكيل فقاعات الهواء الصغيرة داخل سقالة، التي يمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من الوقت لديغا في ظل فراغ خفيفة.

وفي الختام، والأساليب المقدمة في هذه الورقة يمكن استخدامها لتصنيع مجموعة متنوعة من المواد الرغوية الأنسجة محددة وناقل دقيق يتكون من الذهب الخالص، ECM غير كيميائيا عبر ربط. ميزة للباحثين البيولوجي هي أن bioscaffolds من السهل التعامل معها ويمكن معالجتها على نحو مماثل لالأنسجة عند إجراء التحليلات مع تقنيات مثل الأنسجة، المناعية، أو الجينات والبروتينات المقايسات.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للالسقالات المستمدة ECM يكون تدهور إنزيمي لاستخراج السكان الخلية المصنف أو يمكن استخدامها مباشرة بوصفها وسائل إيصال الخلايا القابلة للتحلل وحيويا. عموما، هذه التكنولوجيا منصة مرنة يحمل فائدة كبيرة للعديد من التطبيقات بما في ذلك دراسات ثقافة الخلية 3D التحقيق وظيفة الخلية، بمثابة ركائز توسيع الخلية، وbioscaffolds موالية للالتجديدي.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid, glacial BioShop ACE222.500
Alligator clip leads VWR 470149-728
Aluminium foil Fisher Scientific 01-213-101
α-amylase Sigma 101074694 from Aspergillus aryzae
Analytical balance Sartorius CPA225D
Centrifuge Thermo Scientific 75004251 With swinging bucket rotor for 15 & 50 mL centrifuge tubes
Centrifuge tubes (15 mL) Sarstedt 62.554.205
Centrifuge tubes (50 mL) Sarstedt 62.547.205
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) Sigma C9879  Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers
Cryomilling system Retsch 20.745.0001 MM 400
Dessicator Fisher Scientific 8624426 For lyophilized ECM and bioscaffold storage
DMEM: F12 Hams Sigma D6421 Used for proliferation media
Dewar flask Fisher Scientific 10-196-6 Low form; volume range of 250 - 500 mL
Double distilled water (ddH2O) From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System
D-PBS (Phosphate-buffered Saline) Wisent 311425125
ECM (Extracellular Matrix) Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ethanol Greenfield Specialty Alcohols Inc. P016EAAN Absolute
Fetal bovine serum (FBS) Wisent 80150 Used for proliferation media
Forceps VWR 37-501-32 For transferring the foams
Freezer (-20 °C) VWR 97043-346
Freezer ( -80 °C) Thermo Scientific EXF40086A
Glass vials Fisher Scientific 03-339-26D To store lyophilized cryomilled ECM
Hand held homogenizer Fisher Scientific 14-359-251 Speed: 8,000 - 30,000 rpm
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes Fisher Scientific 14-261-17 10 x 95 mm
Liquid nitrogen For electrospraying
Lyophilizer Labconco 7750021 FreeZone4.5
Milling chamber Retsch 02.462.0213 25 mL volume recommended
Milling balls VWR 16003-606 10 mm diameter, stainless steel recommended
18 G needle VWR C ABD305185 For dispensing ECM suspension into moulds
Orbital incubator shaker SciLogex 832010089999 Temperature controlled (37 °C)
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140-122 Used for proliferation media
Pipet-Aid XP Mandel Scientific DRU-4-000-101
Retort stand VWR 470019-526
Retort stand clamp VWR 21573-606
Safety-Lok Syringe BD 309606 3 mL Luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension
Serological pipettes (10 mL) Sarstedt 86.1254.001
Serological pipettes (25 mL) Sarstedt 86.1685.001
Sodium chloride BioShop 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic BioShop 10049-21-5
Scoopula VWR 89259-968 For collecting microcarriers
Surgical scissors VWR 82027-590
Syringe pump VWR 10117-490 Microprocessor controlled
High voltage power supply Gamma High Voltage Research ES30P-5W/DDPM Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range
12-well plates Fisher Scientific 12565321 For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected
Winged infusion set Terumo 22258092 30 cm tubing length, 25 G 3/4" recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells? Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  3. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
  4. Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
  5. Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
  6. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  7. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  8. Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
  9. Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
  10. Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
  11. Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
  12. Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
  13. Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
  14. Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O'Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
  15. Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
  16. Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
  17. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  18. Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935 (2014).
  19. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems - Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
  20. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  21. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  22. Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
  23. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro - A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
  24. Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
  25. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
  26. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122 (2014).
  27. McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
  28. Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  29. Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
  30. Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
  31. Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
  32. Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
  33. Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
  34. Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
  35. Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
  36. Turco, B. Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , Queen's University. Kingston, Ontario, Canada. (2014).
  37. Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
  38. Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
  39. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  40. Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
  41. Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
  42. Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
  43. Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
  44. Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
  45. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
  46. Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
  47. Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 122، المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والكولاجين، سقالة، رغوة، ناقل دقيق، decellularization، الهندسة الحيوية، الأنسجة محددة، المكروية، مفيدة، زراعة الخلايا، هندسة الأنسجة
تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kornmuller, A., Brown, C. F. C., Yu, … More

Kornmuller, A., Brown, C. F. C., Yu, C., Flynn, L. E. Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55436, doi:10.3791/55436 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter