Summary
Вирусные производные пептиды, в сочетании с антител конъюгатов (ACs) — это подход, набирает обороты из-за возможности доставлять молекулярной аппаратуру с накоплением рост опухолевых клеток. Используя общие методы для оценки пептид спряжение, переменного тока и полезной нагрузки внутриклеточного накопления и опухоли таргетинга, этот протокол помогает исследователям на этапах первоначального развития.
Abstract
Антитела конъюгатов (АКГ) изменен с пептидами, вирус производные являются потенциально мощный класс опухолевых клеток агентов доставки для молекулярной нагрузок используется в лечении рака и изображений из-за увеличения сотовой накопления над текущей ACs. Во время ранних переменного тока в vitro развития, методы флуоресценции и Радиоиммуноанализы достаточно для определения внутриклеточной локализации, накопление эффективность и специфики целевой ячейки. В настоящее время нет консенсуса на стандартизированные методы подготовки клетки для оценки AC внутриклеточного накопления и локализации. Первоначальное тестирование ACs с вирусом производные пептиды имеет решающее значение, особенно если были построены несколько кандидатов. Определение внутриклеточного накопления флуоресценции могут быть затронуты фонового сигнала от ACs на поверхности клеток и усложнить толкование накопления. Для Радиоиммуноанализы фракционированный обычно обработанные клетки и измерения радиоактивности в различных клеточных компартментов. Однако лизис клеток зависит от ячейки к ячейке и часто ядерные и цитоплазматические отсеков не адекватно изолированы. Это может производить вводящие в заблуждение данные о свойствах доставки полезной нагрузки. Внутривенные инъекции radiolabeled вирус производные пептид модифицированные ACs в опухоли, принимая мышей, следуют радионуклидной визуализации-это мощный метод для определения свойства доставки опухоли ориентации и полезной нагрузки в в естественных условиях этапа развития. Однако это относительно недавнее улучшение и несколько групп оценивается вирус производные пептид модифицированные ACs таким образом. Мы описываем обработки обработанные клетки более точно оценить вирус производные пептид модифицированные накопление переменного тока при использовании confocal микроскопии и Радиоиммуноанализы. В частности метод trypsinizing клетки, чтобы удалить поверхности клетки связаны ACs. Мы также предоставляют метод для улучшения клеточной фракционирования. Наконец этот протокол предоставляет метод в естественных условиях с использованием позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) для оценки первоначальной опухоли, ориентация свойства опухоли подшипник мышей. Мы используем радиоизотопные 64Cu (t1/2 = 12,7 ч) как полезные данные примера в настоящем Протоколе.
Introduction
Антитела конъюгатов (АКГ) являются биофармацевтических препаратов, которые созревают в класс трансформативных эффективных препаратов для улучшения лечения рака и для обнаружения опухолей. Состоит из моноклональных антител (МАБ), конъюгированных с молекулярной полезных радиоизотопов, малые молекулы и биологических токсинов, ACs способны доставить этих полезных для раковых клеток с изысканной целевой антигена сродства и специфичностью. Таким образом ACs могут значительно сократить неспецифических токсичности и увеличения полезной деятельности на объекте опухоли. Терапевтически ACs, транспортировки цитотоксических малых молекул (обычно упоминается как антитела наркотиков конъюгатов) были одобрены для лечения пациентов с раком молочной железы и лимфомы Ходжкина, которые потерпели неудачу традиционные методы лечения 1, 2. Кроме того, перевозящих радиоизотопов ACs (обычно называют radioimmunoconjugates) также находятся в стадии разработки. Переменного тока транспортировки радиоизотопов для визуализации предназначено для выявления метастазов рака простаты 3. С многие терапевтический ACs, представленный для утверждения 4оптимизм является высоким для будущего ACs для улучшения рака уход 5.
Тем не менее при доставке химиотерапевтические или радиоизотопов, ACs испытывают трудности, эффективно накапливать эти полезных нагрузок внутри клеток-мишеней. Этот аспект значительно способствует во многих случаях в неспособности ACs предоставлять долгосрочные безвирусного выживания или опухоль высококонтрастных изображений 6,7. В общем после того, как ACs привязать их целевой антиген они являются внутренним через процесс, известный как рецептор опосредованный эндоцитоз. ACs затем ловушке внутри endosomes и торговли для лизосомы деградации и грузоподъемность выпуска 8. Процесс внутриклеточного торговли создает проблемы для ACs для достижения высокой полезной специфика и эффективность против раковых клеток-мишеней. Например, многие антигены например Her2 (целевой показатель для терапевтического AC трастузумаб emtansine) можно перерабатывать до 85% связанного антител в первые 30 мин 9. Кроме того после того, как происходит деградация, выпущенный химиотерапевтические и радиоизотопов могут активно экспортироваться увеличение выражение или активность мембранных связанные транспортных белков 10,11. Лизосома деградации также препятствует оказанию полезных новых биологических такие терапевтические ферментов и олигонуклеотиды, которые могут быть отключены 12,13. По существу раковые клетки очень эффективен при отмены необходимые внутриклеточное накопление полезных предоставляемых ACs.
Этот протокол описывает способы реализации концепции ACs связаны с вирусом производные пептиды, специально для побега endosome изобличения и локализации клеточное ядро. С такой сложности манипулировать принимающей ячейки системы это не удивительно, что развитие вируса производных белков и пептидов как потенциальных биофармацевтики давно были укоренившиеся в терапевтических исследованиях 14. За миллионы лет вирусы эволюционировали, чтобы приобрести исключительную коллекцию белки способны использовать нормальное физиологическое mammalian клетки систем для того, чтобы эффективно ввести клеток хозяина. Для вирусов, которые являются внутренним через рецептор опосредованный эндоцитоз они также сталкиваются с побега людьми Лизосома где натиском локализованных концентрации протеаз может быть проблематичным для выживания. Хорошо характеризуется вирусный производные пептид, используемых в доставки лекарств для экранирования endosome захвата является transactivator вирусом иммунодефицита человека транскрипции (ТАТ) белок 15. ТАТ состоянии избежать захвата endosome путем зондирования низкий рН в какой-то момент белка конформационные изменения происходят благоприятные ТАТ вставить себя в и сорвать от англ мембраны 16. Это приводит к Tat грузоподъемность конъюгатов возможность доступа к цитоплазме. Второй элемент вирусный манипуляции, связанные с этот протокол является подход, используемый для доставки терапевтических генов и наркотики ядро 17. Вирусы эволюционировали, чтобы успешно управлять принимающей ячейки машины для прогрессирует в прошлом ядерной мембраны, проходя через ядерные поры комплекс (NPC). Сотовый макромолекул содержат (или связываться с белками, которые содержат) ядерной локализации сигналов (ОУЖН), необходимые для привязки к ядерной транспорт белков (например karyopherins α и β), которые обеспечивают необходимые движения через NPC. Вирусы были разработаны протеины содержат последовательности NLS, которые предоставляют им возможность использовать принимающей ячейки транспортных белков для попеременно в ядро 18.
Многочисленные ACs ранее были функционализированных с ТАТ - и NLS-производные пептидами и испытаны для их способность накапливаться внутри раковых клеток и для ориентации опухоли 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Таблица 1). Исследования, обеспечивая цитотоксических полезных показали, что ACs с вирусом производные пептиды способны значительно увеличить сотовой накопления, цитотоксичность и опухоли, убив над неизмененной ACs 22,26. Общей чертой для этого романа класса переменного тока является их строительства. Как правило пептиды содержат терминала цистеина, обеспечивая свободный сульфгидрильных групп. MAbs сначала отреагировали с noncleavable бифункциональных сшивателя, содержащей N- оксисукцинимидного (ГСЗ) и maleimide групп на противоположных концах. NHS эфиры реагируют с первичных аминов МАБ сформировать амидных связей. МАБ отреагировал с бесплатным maleimide группами затем реагирует с сульфгидрильных групп на пептиды, сформировать тиоэфиром Бонд и таким образом увязка пептида и МАБ. Хотя homobifunctional сшиватели используется 28, heterobifunctional сшивателя более широко используются в строительстве вирус производные пептид ACs 22,23,26, 31,32. Этот протокол использует специально сшивателя sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу ККАП) за его простоту использования и потому, что он используется в утвержденных антитела наркотиков конъюгата трастузумаб emtansine и во многих вирус производные пептид ACs 8,22,23,26,,3132. Электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE) является основным методом для первоначально определения эффективности спряжение и полу количественного определения количество пептидов в МАБ. Конфокальная микроскопия помощью дневно меченых вторичное антитело для mAb обычно является метод первоначально оценки свойства внутриклеточного распространения вируса производные пептид модифицированные АКГ. До настоящего времени радиоизотопов являются основной полезной нагрузки, выступил вирус производные пептид модифицированные ACs. Радиоизотопов, выгодно, потому что радиоактивности в клетках легко количественно подсчитывая гамма. Кроме того служба управления доступом, которые переводятся на мыши модели человеческого рака обеспечивают исследователей с возможностью оценить опухоли ориентации с использованием молекулярной визуализации формы, такие, как одиночных фотонов выбросов компьютерная томография и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) 23 , 32 , 33. В целом, строительство и тестирование методов, в основном используется исследователями проверки обеспечивают очень хорошую оценку АКГ изменен с пептидами, вирус, полученных на этапе первоначальной разработки эффективно войти и доставить Полезная нагрузка, внутри клетки-мишени и целевой опухоли.
Tat-NLS-изменены и ACs есть Подсветка ключевых областей для дальнейшего улучшения доставки полезной нагрузки внутри клетки рака и опухолей. Отношении NLS-модифицированные ACs эффективность в внутриклеточного накопления может быть скромным 23,,3134. Неэффективные внутриклеточного накопления вызвана захвата продолжение от англ. В естественных условиях ориентации опухоли также может быть ослаблена с обеих ТАТ - и NLS-изменение ACs. Несколько положительных заряженных остатков содержат активные последовательности ТАТ и NLS. При подключении к mAbs, Общая катионного заряда может быть значительно увеличили 35. Как следствие ТАТ-NLS-изменены и ACs увеличили поглощения в здоровых тканях и увеличенный просвет быстрой крови.
Наша группа разработала композитные смеси состоящей из Холевая кислота связана с NLS (ChAcNLS; Рисунок 1). ChAcNLS изменение ACs способны увеличить внутриклеточного накопления поставленный радиоизотопов и улучшить опухоль ориентации, по сравнению с NLS-модифицированные и традиционных ACs 33,34. Механизм позади Холевая кислота вдохновлен способности выбора nonenveloped вирусы, которые не могут полагаться на мембраны Фьюжн использовать Холевая кислота для инициирования endosome бежать через формирование Церамид. К примеру свиного кишечного вируса новобранцев Холевая кислота, которая активирует sphingomyelinase, который катализирует гидролиз сфингомиелин в Церамид 36,,3738. Это дестабилизирует от англ мембраны и позволяет вирус побег. Таким образом Холевая кислота является другой вирус производный компонент, который дополняет NLS.
Как это поле движется вперед и будущих достижений происходят в полезных данных доставки службой ACs с вирусом производные пептиды, это подходящее время для обеспечения визуального демонстрации их биохимических и функциональных характеристик во время начальной разработки. Здесь мы описываем наш протокол для первоначальной оценки вирус производные пептид модифицированные ACs для определения эффективности еще простой внутриклеточного накопления и опухоли ориентации во время ранней стадии развития. Мы используем имеющиеся mAbs 7G 3 и A14 как пример модели системы. 1 процедура описывает использование SDS-PAGE как метод, который позволяет для «go/no go» решений для сконструированного ACs. Процедура 2 описывает метод, с помощью trypsinization, позволяя для улучшения визуализации AC внутриклеточного распределения и накопления. Процедура 3 описывает метод для повышения внутриклеточного фракционирование точно определить ядерной локализации. В этой процедуре мы используем грузоподъёмность 64Cu (t1/2 = 12,7 ч) потому что он уязвим для сотовых измеряем и позитрон излучателя 10. Таким образом процедура 4 описывает в vivo опухоли ориентации характеристика ПЭТ изображения для визуализации опухоли поглощения относительно фона (т.е. здоровых тканей nontarget) и определить, может ли пример переменного тока непосредственно и эффективно Целевой опухоли. Эти методы являются достаточно для следователей развивающихся ACs с вирусом производные пептиды для выявления кандидатов для дальнейшего продвижения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В естественных условиях животных описал были проведены эксперименты согласно утвержденным протоколом и этические руководящие принципы Комитета по этике при университетский центр де Шербрук для экспериментов животных.
1. антитела пептида спряжение
Примечание: ChAcNLS может быть синтезирован в любой коммерческой пептид производителя или университет аффилированным пептидный синтез службы платформы. Синтез ChAcNLS можно найти в справочных 34. Для процедуры 1 и 2 Используйте МАБ 7G 3, которая является специфической для лейкемии антигена Ил 3Rα 39.
- В пробки microcentrifuge 1,7 мл Подготовьте 10 мг/мл раствора (~ 1 мг всего антитела) 7G 3 в фосфатный буфер (PBS), рН 7,6.
- Растворите сульфогруппу ККАП в диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 5-10 мм. Vortexing решение тщательно лучше всего работает для достижения полного растворения.
- Добавьте в пробирку, содержащую 7G 3 растворенного сульфогруппу ККАП решения (обычно между 5-20 мкл в зависимости от молярное соотношение сульфогруппу ККАП к - 7G 3 желаемого). Рекомендуется тестирование соотношения сульфогруппу ККАП к - 7G 3 10 - 25-и 50-к-1. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч.
-
Очищают и сконцентрировать дериватные maleimide 7G 3 с помощью ультрафильтрации устройство и буфер обмена в PBS, pH 7.0. Центрифуга на 8000 x g примерно 5 мин отклонения потока через и заполнить с PBS, pH 7.0 и центрифуги снова.
- Выполнить это в 7 - 8 раз полностью обменяться буфера. Восстановить в концентрированных 7G 3 белка, поместив фильтр устройства вверх ногами в чистой microcentrifuge трубки. Центрифуги для 2 мин на 1000 x g. тома для восстановления должно быть примерно 0,3 мл
- В пробирку, содержащую активированный maleimide 7G 3 добавить 2 раза Молярная избыток ChAcNLS относительно соотношение сульфогруппу ККАП к - 7G 3, используемых в предыдущем шаге и инкубировать на ночь при 4 ° C. Например если было использовано соотношение сульфогруппу ККАП к - 7G 3 10-в-1, затем используйте коэффициент ChAcNLS к - 7G 3 20-к-1. Общий объем должен быть существенно не изменилась.
Примечание: Хотя ChAcNLS не вызывает осадков во время процесса конъюгации это вероятность того, что может произойти с другими пептиды. Наблюдать за трубу во время реакции на наличие признаков осадков, который скорее всего вызвана пептиды гидрофобны. В таких случаях он может быть стоит пересмотр пептид интерес с целью разработки изменения для обеспечения повышенной гидрофильность. - Концентрат 7G 3-ChAcNLS с помощью ультрафильтрации устройство к желаемой концентрации и буфер обмена в PBS рН 7,4 (см. шаг 1.4). Доходность восстановления общего белка должно быть ≥ 75% первоначального исходного материала.
- Выполните SDS-PAGE для оценки построенных 7G 3-ChAcNLS кандидатов с помощью геля полиакриламида 12% (обеспечивает достаточное разделение ChAcNLS конъюгированных тяжелых и легких цепей от несопряженных цепи). Микс 10 мкг 7G 3-ChAcNLS в загрузки страницы буфера содержащий 2 мкл β-меркаптоэтанол и загрузить в колодец.
- Установите соответствующие напряжения (120 V на 1 ч для 12% гель) и запустите электрофореза. Остановите электрофореза, когда краситель фронт Кумасси достигает нижней части геля.
Примечание: Не позволяйте Кумасси краситель передней бежать гель. - Удалить из аппарат для электрофореза геля и сполосните минигелей решения, содержащие 10% v/v Ледниковая укусная кислота и 20% v/v метанола.
- Сделайте фотографию геля и с правителем и мера расстояния (cm) мигрировали для стандартов и 7G 3 конъюгатов. Вычислить значение удержания фактор (РФ), который представляет собой расстояние мигрировали делится на гель длиной (от где белок загружается на фронт Кумасси миграции). Участок молекулярный вес (МВт) в журнале против РФ значения из каждого стандарта белка и экстраполировать размер 7G 3 конъюгатов.
- Рассчитайте количество пептидов на антитела путем деления различие в МВт между 7G 3 конъюгатов и немодифицированные 7G 3, 1768.5 г/моль (МВт ChAcNLS).
- Цифровые изображения Кумасси окрашенных геля и выполнять анализ денситометрии. На данный момент выбор кандидата свинца может основываться на переменного тока с максимальным числом молекул ChAcNLS, не содержат значительные совокупные видов.
2. confocal микроскопии для внутриклеточного накопления оценки
Примечание: Важно протестировать клетки избирательность внутриклеточного накопления пептид модифицированные mAbs до разработки рецептуры с полезной интерес. Потому что ТАТ также было показано, имеют склонность для проникновения неспецифических клеток, стоит первый анализ внутриклеточного накопления и клеток избирательности до дорогостоящих развития предпринимает шаги с дорогим полезных. По этой причине процедура 1 следует также изменить mAbs изотипа определенного не значения элемента управления. Для остальной части протокола мы будем работать с ACs изменен с 10 ChAcNLS молекул на антитела. Схема, включая ключевые шаги процедуры 2 и 3 описана на рисунке 2.
Предупреждение: Этот шаг протокола включает обработки и манипуляции параформальдегида. Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя при обработке.
- Относитесь к клеткам-мишеням TF-1a с 200 Нм 7G 3-ChAcNLS включая изменение управления mAbs. Инкубировать 5 х 106 антигена положительных клеток с конъюгатов за 1 ч при 37 ° C.
- Через 1 ч удалить супернатант и мыть с 1 мл раствора 3 x в ледяной PBS. Добавить свежие СМИ и проинкубируйте дополнительного часа при 37 ° C.
-
После дополнительных часа удалить супернатант и мыть 3 x в 1 мл ледяной PBS. Добавьте 0,5 мл PBS, содержащий 0,25% трипсина и Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) при 37 ° C для 3 до 30 мин.
Примечание: Во время первоначального пилотного тестирования рекомендуется не trypsinize клетки для того чтобы определить различия в AC внутриклеточного накопления. Настоящий Протокол поощряет использование трипсина и мы показываем, как это повышает оценку эффективности внутриклеточного накопления различных кандидатов переменного тока.- Протестируйте различное время для инкубации, визуально проверка для отсоединения всех ячеек. Кроме того инкубации клеток аликвоты с жизнеспособностью, окрашивание решения и выполнять анализ потока гранулярных как описано 40.
- Нейтрализовать трипсина с 1,5 мл культуры клеток плода бычьим сывороточным RPMI 1640 media/10%. Центрифуга клетки на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и мыть 3 x в 0,5 мл ледяной PBS.
- Исправить клетки в PBS 0,5 мл, содержащих параформальдегида 1% и 1% сахарозы на льду для стирки 30 мин клетки 3 x 0.5 мл ледяной PBS и центрифуги на 250 x g для 5 минут Permeabilize клеток в 0,5 мл PBS, содержащих 0,15% Тритон X-100 5 минут на льду. Вымыть клетки в ледяной PBS и повторите центрифугирования.
-
Приостановить клетки в PBS 0,1 мл, содержащих 2 мкг/мл (или производителя, рекомендуется концентрации) в борьбе с мышиным (изотипа конкретных) ФК вторичного Поликлональные антитела спрягаются в AlexaFluor 647 за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Центрифуга на 250 x g для 5 минут и смыть клетки 3 x 0.5 мл ледяной PBS. Приостановите клетки в 0,5 мл PBS.
Пауза: Клетки могут храниться в холодильнике.
Примечание: Важно, чтобы выбрать вторичное антитело, которое признает правильной изотипа МАБ интерес. AF647 выбирается из-за его дальнего инфракрасного выбросов, которые не мешают пропидий йодидом (PI) окрашивания ядра.
- Центрифуга на 250 x g для 5 минут и смыть клетки 3 x 0.5 мл ледяной PBS. Приостановите клетки в 0,5 мл PBS.
- Добавьте PI в концентрации 10 мкг/мл в контейнер с ячейками. Далее Подключите 1 х 105 клеток на стеклянных вставках, используя монтажные средства массовой информации и крышка с coverslip стекла.
- Изучите клетки с целью погружения Apo план 60 X нефти NA 1,42 на Перевернутый лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп. Обнаружения PI флуоресценции, используя 488 нм Аргонового лазера и спектрального сканирования Призма для 600-650 Нм. Для AF647 флуоресценции используют 633 нм гелий неонового лазера и спектрального сканирования Призма для 650-700 Нм. Соберите флуоресценции выбросов от PI и AF647 последовательно.
Примечание: Используйте те же настройки на протяжении оценки и сравнения клеток. Однако вам придется изменить настройки для trypsinized клеток, по сравнению с не trypsinized клеток. - Используйте программное обеспечение микроскоп для получения изображений. Собирайте изображения с помощью серийный горизонтальных оптических разделы 1 024 x 1 024 пикселей с 2 X линии в среднем на 0,5 мкм интервалы сквозь толщу всей ячейки. Представить как сложены z прогнозы от четырех последовательных фрагментов изображения на максимум флюоресценции интенсивности.
- Анализ клеток с Микроскоп программного обеспечения. Запись сотовой распределение конъюгатов. Частности оценивают ли сгруппированных внутриклеточных флуоресценции в цитоплазме и возле клеток поверхности или диффузных и однородной. Также оцените интенсивность относительной флуоресценции в клетку.
3. radiolabeled AC строительство и клеточных фракционирование для оценки эффективности Cu внутриклеточных доставки 64
Предупреждение: Процедуры 3 и 4 включают обработки и манипуляции радиоактивности. Перед выполнением этих шагов, исследователи должны иметь утвердил обучение технике безопасности и протоколы, утвержденных от их дома институт радиационной безопасности.
Примечание: Для процедуры 3 и 4 мы используем МАБ A14, который специфичен для инвазивных мочевого пузыря рак антигена Ил 5Rα41. Кроме того все эксперименты являются время чувствительной за короткий период полураспада 64Cu. В общем это лучше не ждать 1 неделя для выполнения в vitro эксперименты и не более чем 72 h в vivo исследований.
- В 1,7 мл приостановить 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic кислоты (NOTA-NHS) в ДМСО до концентрации 10 мм.
- Реагировать производится Молярная избыток NOTA-NHS с A14 (2 мг исходного материала) в бикарбонат натрия 0,1 М при pH 8.6 за 1 ч при комнатной температуре в объем ≤ 0,5 мл (окончательный объем NOTA-NHS не должен превышать 2% v/v общего объема).
- Очищают и буфера обмена NOTA-A14 с помощью ультрафильтрации устройство в PBS, рН 7,6 (см. шаг 1.4).
- Для последующего крепления ChAcNLS выполните шаги 1.2-1.6.
- Реагировать NOTA-A14-ChAcNLS (250 мкг пакетов) с 100 мегабеккерель (МБК) 64CuCl2 в бикарбонат натрия 0,1 М, pH 5.5 для 1 ч при 37 ° C ≤ 0,1 мл. 64 Cu производится на TR-PET циклотрон CIMS 42.
- Концентрат 64Cu-A14-ChAcNLS в PBS рН 7,4, используя ультрафильтрации устройство к желаемой концентрации (см. шаг 1.4).
-
Определите radiolabeling эффективность полосы 64Cu-A14-ChAcNLS путем мгновенного тонкослойной хроматографии (освоения) с использованием хроматографии и 0,1 М, рН 5,5 цитрат натрия (налогам элюента) как растворитель. Применить 0.5 мкл Алиготе реакции раствора к налогам газа. Выполните авторадиография полосы и получить цифровое изображение.
- Выполняют денситометрия для получения доли граница и бесплатно 64Cu. Если бесплатно 64Cu содержание > 5%, вернуться к предыдущему шагу и выполнения дополнительной очистки.
- Кроме того выполняйте SDS-PAGE с Кумасси, пятнать для оценки агрегатов. Выполните второй SDS-PAGE следуют авторадиография геля для определения, если есть radiolabeled совокупных видов.
-
Сродство привязки качества КПП: инкубировать 64Cu-A14 конъюгатов на повышение концентрации (0-100 Нм) в двух экземплярах с 1 x 106 клеток-мишеней на мл. Для определения неспецифического связывания, смешать дубликатов образцов 64Cu-A14 конъюгатов с клетками в присутствии 100-кратного Молярная избыток немеченого A14.
- После инкубации 1 h на льду вымыть клетки и рассчитывать общее связанного антителами проб и всего неспецифических привязанных антитела в гамма счетчике. Граф конкретной привязки (всего связанного антитела - неспецифические связан антитела) против реактивной бесплатно 64Cu-A14 (Нм) используется в assay. Определите константу диссоциации (Kd), нелинейной регрессии с использованием графического программного обеспечения.
- Для исследования Cu сотовой накопления 64: лечить клетки с 100 Нм 64Cu меченых A14 конъюгатов за 1 ч, 6 и 24 ч при 37 ° C, как описано33. Включить дополнительные параметры, такие как лечение при наличии неизмененном A14 блока IL-5Rα сайтов и при 4 ° C для блокирования рецептор опосредованный интернализации.
- В назначенное время точки, как описано в шаге 2.3 - 2.3.2, добавить 0,5 мл PBS, содержащий 0,25% трипсина и ЭДТА при 37 ° C следуют нейтрализации и стирки.
- Инкубировать ячейки в буфер lysis плазматической мембраны, содержащей 1% NP-40, 10 мм трис рН 7,5, 10 мм NaCl, 3 мм MgCl2 буфера на льду на 10 мин центрифуга лизированы плазматической мембраны клетки на 90 x g за 5 мин.
- Место в свежих пробки и удалить супернатант. Это представляет собой цитоплазматических дроби. Вымойте ядра 3 x в ледяной PBS и добавить моет цитоплазматических дроби.
- Убедитесь, что флаконов, содержащих ядерные и цитоплазматические фракции являются запечатанными. Затем поместите их в счетчик калиброванные для 64Cu для того, чтобы преобразовать необработанные счетчики MBq гамма.
-
Определить качество изоляции ядер, выполняя Западный анализ помаркой для Ламин A/C, ограниченных ядерных белков и Rab7 телефоны, обильные цитоплазматического белка на целом lysate, ядерные и цитоплазматические фракций.
- Лечить 5 х 106 клеток с 500 мкл буфера пробирного (RIPA) Радио иммунопреципитации и буфера lysis плазматической мембраны в шаг 3.12 содержащие 1%, 2% и 4% NP-40. Кроме того лечения отдельных ядер в 500 мкл Буфер RIPA для получения изолированных ядерных белков.
- Осадок белков изолированных ядерных, цитоплазмы и всей ячейки с помощью 4 x объем образца холодной ацетона для 60 мин при-20 ° C. Центрифуга на 13 000 x g 10 мин и сцеживаться супернатанта, стараясь не выбить Пелле белка. Добавьте 100 мкл PBS для растворения белков.
- Загрузка 10 мкг белка в каждой скважине геля SDS-PAGE 10%. Выполните электрофореза, как описано в 1,7-1,9. Переноса западной помарке как описано в refeference 43.
- Определите по лестнице, которую маркеры, которые лучше всего соответствуют МВт ~ 40 кДа. Пополам мембраны на этот маркер. Зонд помаркой, содержащие высокий белки МВт с Ламином A/C-специфические антитела. Зонд мембраны с нижней МВт белки с раб 7-специфические антитела. Западная помарка хорошо известный метод и не указанных в настоящем Протоколе.
4. PET изображений оценки ориентации опухоли
Примечание: Методы имплантации опухолевые клетки мышей для создания heterotopic ксенотрасплантатов хорошо известны и большинство лабораторий имеют собственные протоколы, специально для их системы опухоли. Таким образом это не рассматривается в протоколе. Гранулы ксенотрансплантата модель будет nonobese Диабетическая/тяжелой комбинированной иммунодефицитных (NOD/ТКИД) мышей подшипников IL-5Rα-позитивные опухоли инвазивных мочевого пузыря HT-1376 и HT-B9. Ил 5Rα-положительных инвазивных мочевого пузыря опухолевые клетки составляют > 66% от общего числа клеток в гранулы ксенотрансплантата. Напротив только ~ 11% HT-B9 Ил 5Rα-положительных клеток содержатся в развитых ксенотрасплантатов41. Таким образом эта модель обеспечивает отличный пример для оценки AC опухоли ориентации в две опухоли, которые представляют обозримом пациента тумора неоднородности.
- В группах, содержащие ≥ 4 (NOD/ТКИД) мышах, придать 20-30 мкг (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS и 64Cu-A14 в Вену хвост.
- В тот же день место цилиндрических Фантом (24.8 мл), содержащие 5 MBq 64Cu для преобразования радиоактивных графов в секунду в вводили дозу в грамм ткани (%ID/g).
- Подождите 48 часов и затем анестезировать мышей, поместив их в камеру всасывание с 1,5 Л/мин потока кислорода с 2% изофлюрановая. Стерильные глазные мази можно обратиться мыши глаза после индукции и перед размещением в PET сканер.
- Быстро перенесите мыши таблицу PET сканер в лежачем положении вниз головой с носовой конус для изофлюрановая. Дыхание и Ректальные зонды и частоту монитора дыхания и температуры для поддержания физиологических условиях во время эксперимента, ранее описанные 44.
- Начните PET сбора данных, используя параметр режим регулярных выборочных и энергии окно 250-650 кэВ. Как правило достаточно для обеспечения достаточной совпадающих событий для производства ПЭТ изображений высокого качества и реконструкции 45-минутный статические проверки на мышь.
- После сканирования 64Cu-AC удалите мышь от сканера и поместить его обратно в клетке. Разрешить для мыши достаточно восстановить до возвращения в объекте животных.
- Получения восстановленных изображений с помощью 20 итераций алгоритм трехмерной максимальная вероятность максимизации ожидания.
-
Выполняют региона интерес (ROI) анализа опухоли и визуально оценимый органов с использованием программного обеспечения Амида.
- Нарисуйте трансформирования для получения количественных %ID/g данных вручную с помощью параметра 3D карандаша и тщательно разграничить опухоли или прилегающих бедра мышцы. Отсчеты пиксел в ROI будут преобразованы в %ID/g от предыдущего шага 4.2.
- Сравнение 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS изображений для опухоли контраст и количественные ROI % ID/g и опухоли на фоне соотношения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 процедура строительство 7G 3 изменена с ChAcNLS с помощью сульфогруппу ККАП как сшивателя является очень надежным. Как правило при загрузке на 12% гель и проанализированы SDS-PAGE, это приводит к различимых поэтапное увеличение МВт пропорционального увеличения соотношения сульфогруппу ККАП к - 7G 3 используется и позволяет для тяжелых и легких цепей оцениваться индивидуально для ChAcNLS Спряжение (рис. 3). 7G 3 отреагировали на 10-, 20-, 25- и 50-к-1 сульфогруппу ККАП к - 7G 3 соотношения следуют РФ измерения и результаты экстраполяции МВт в 3, 7, 10 и 20 ChAcNLS молекул в 7G 3. При денситометрии процент мономера вид является > 90% для 7G 3 с 3-10 ChAcNLS. Для 7G 3-ChAcNLS20 совокупных видов составляет 45%. Это демонстрирует, что SDS-PAGE является простой, но эффективный для выбора 7 G 3-ChAcNLS конъюгат для дальнейшего развития. Хотя небольшое размытие с цепей антител может произойти за антитела гликозилирования это не мешает с определения совокупного видов.
Для 2 процедуры репрезентативных данных демонстрирует различия между использованием трипсина и не трипсина при оценке вирус производные пептид модифицированные ACs для внутриклеточного эффективности накопления. В этом примере 7G 3-ChAcNLS способность увеличить внутриклеточного накопления может быть оценен в клетках, обработанных с и без трипсина (рис. 4). Однако значение trypsinization очевидно, при интерпретации накопление конъюгатов, используемая для сравнения для определения AC эффективности и избирательности. Trypsinization позволяет для базового уровня внутриклеточного флуоресценции устанавливается как заметил с неизмененной 7G 3. Можно подробно, что 7G 3 ограничена в цитоплазме в небольших очагов. В отличие от клетки, которые не являются trypsinized, 7G 3-конкретных флуоресценции ограничивается клеточной поверхности вследствие гиперэкспрессия Ил 3Rα на поверхности клеток. Это делает его трудно расследовать внутриклеточного накопления и распространения, потому что флуоресцирования на клеточной поверхности доминирует и таким образом блокирует флуоресценции внутриклеточных от визуализируемый. Trypsinizing клетки также имеет важное значение при оценке специфику как доказательства с IgG-ChAcNLS. Мы видим, что есть некоторые неспецифические флуоресценции от поверхности клетки, но не сможет определить уровень внутриклеточного накопления, вызванных пептида если клетки не были trypsinized. Наконец без trypsinization одно может ложно интерпретировать, что недавно разработанных переменного тока не накапливаются внутри клетки-мишени. Как видно с 7G 3-NLS, клетки, которые не являются trypsinized большинство флуоресценции снова от поверхности клетки. После trypsinization можно наблюдать что 7G 3-NLS накапливаются, хотя и ограниченные, внутри клеток-мишеней.
Для 3 процедуры репрезентативных данных демонстрирует контроль качества строительства, близость и в пробирке эффективность доставки полезной нагрузки и специфичности для радиоизотопных 64Cu с A14-ChAcNLS. Денситометрия выполнена на радиографические изображения, взятые из 12% геля полиакриламида содержащий 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, или 64Cu-A14-ChAcNLS показывают, что radiolabeled конъюгатов 100% видов мономеров (Рисунок 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS показывает наномолярных сродство для Ил 5Rα. A14-ChAcNLS как функция увеличения концентрации 64Cu-A14-ChAcNLS показало конкретной привязки подошел насыщения при концентрации 3-5 Нм в HT-1376 и HT-B9 клетки (Рисунок 5B). Kd для 64Cu-A14-ChAcNLS на HT-1376 и HT-B9 клетки был 6.4 Нм ± 1,7 и 3,1 ± 0,8 Нм, соответственно. ChAcNLS спряжение снижена близость A14 примерно 2,5 для Ил 5Rα на HT-1376 и HT-B9 клетки. Гамма, подсчет показывает, что увеличение радиоактивности в ядре и цитоплазме выступил 64Cu-A14-ChAcNLS конкретные и увеличивается с течением времени (рис. 6). Гамма подсчета обычно демонстрирует приблизительно > кратные увеличение обладающие и внутриклеточного накопления в клетках лечение с 64Cu-A14-ChAcNLS по сравнению с лечения с 64Cu-A14-ChAcNLS в присутствии избытка неизмененное A14 или когда лечение исследования выполняются на 4 ° C (рис. 6A). Существует также ≥ 3 раза увеличить в ядерной и внутриклеточное накопление 64Cu относительно клетках, обработанных с 64Cu-A14 и 64Cu-IgG-ChAcNLS во всех точках время испытания (Рисунок 6B).
Рисунок 7 демонстрирует важность протокола фракционировки клетки. HT-1376 и HT-B9 клетки инкубировали с буфера lysis плазматической мембраны, содержащей 1%, 2% или 4% NP-40. Изолированные ядер исключительно должен содержать Ламин A/C. соответственно цитоплазматических фракции должны быть исключительно для Rab7. Как элемент управления всей клетки лизированы с Буфер RIPA должны быть положительным для Ламин A/C в обеих фракций. Этот протокол показывает, что при оценке ядерной фракция лизированных клетках HT-1376, существует нет настоящего Rab7. Кроме того существует не Ламин кондиционера в цитоплазматических дроби. Однако, есть уменьшение количества Rab7 в цитоплазме, взяты из клетки лизированы с 4% NP-40 (рис. 7A). Это скорее свидетельствует о том, что что буфера lysis NP-40 4% является причиной срыва ядерной мембраны в дополнение к плазматической мембраны. Это приводит к смешивания ядерных белков с цитоплазматических белков и таким образом уменьшает концентрацию 7 раб. Это объясняет уменьшение количества раб 7 настоящего. HT-B9 клетки более чувствительны, чем HT-1376 клетки. Когда лечение с плазматической мембраны литического буфера содержит 4% NP-40, Ламин A/C ясно видно в цитоплазматических фракции (рис. 7B). Существует соответствующее сокращение Ламин A/C в ядерной фракции. HT-B9 клетки также чувствительны на 2% NP-40 литического буфера как количество Rab7 в фракции цитоплазматических заметно уменьшается по сравнению с 1% NP-40. Таким образом один следует оптимизировать сотовой фракционирование интерес с конкретной клетки так, что количественные результаты полезной нагрузки накопления в ядро и внутриклеточного пространства являются точными. Это имеет важное значение для оценки эффективности ядерной локализации Роман переменного тока.
Для 4 процедуры PET изображений на 48 ч впрыск 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, либо 64Cu-A14-ChAcNLS в мышах, принимая HT-1376 и HT-B9 heterotopic ксенотрасплантатов на противоположной задних лапах позволяет для визуализации опухоли ориентация свойства (Рисунок 8). В нашем примере визуальный осмотр PET изображений показывает HT-1376 и HT-B9 опухоли таргетинга возможности 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 и 64Cu-A14-NLS (рис. 8A). Однако в тех случаях, когда визуальный осмотр трудно как с HT-B9 опухоли, анализ ROI может использоваться для определения соотношения опухоли к мышцы (Рисунок 8B).
Рисунок 1: ChAcNLS модифицированные mAbs. NLS остатки от больших SV-40 Т-антиген (KKKRKV) прослоены между распорку остатков, увенчанные N-терминальный цистеина. Холевая кислота (Зеленый кронштейн) сочетается с цистеином как описано 34. После очистки ChAcNLS и строительство, хвоща сульфгидрильных групп используется для сопряжения через сульфогруппу ККАП (красным скобка; показано уже привязан к МАБ). Примечание: МАБ (150 кДа) и ChAcNLS (1.8 кДа) являются не в масштабе. Адаптированы и Перепечатано с разрешения Пакетт, M. et al. NLS-Холевая кислота спряжение Ил 5Rαspecific антитела к улучшает сотовой накопления и в естественных условиях опухоль таргетинг свойства в модели рака мочевого пузыря. Химии биоконъюгатов. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-
Рисунок 2: схема AC ячейки подход к лечению и последующей обработкой для анализа Confocal микроскопии и для анализа качества фракционировки клетки. Красные стрелки соответствуют основные шаги, 2.2, 2.3, 3.15 и 3.15.4. Адаптированы и Перепечатано с разрешение от Бодуан, S. et al. ChAcNLS, Роман модификации сбежать антитела-конъюгаты разрешительные целевой ячейки-конкретных от англ, локализации для ядра и повышение общей внутриклеточного накопления. Молекулярная Фармацевтика. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Рисунок 3: анализ ChAcNLS модифицированные mAbs. Сокращение SDS-PAGE показывая идущий лестница (L) с молекулярной массой, соответствующего в kilodalton (кДа) и неизмененном 7G 3 тяжелых и легких цепей как ссылки. Следующие полосы являются миграции полос тяжелых и легких цепей 7G 3 изменена с 3, 7, 10 и 20 ChAcNLS.
Рисунок 4: анализ МАБ внутриклеточного распределения и накопления. Confocal микроскопии изображений, иллюстрирующих внутриклеточного 7G 3 распределения и накопления относительной флуоресценции в ил 3Rα-положительных клеток лейкемии, относились с 7G 3, 3-ChAcNLS 7 G, IgG и IgG-ChAcNLS. Клетки были trypsinized или не trypsinized до фиксации. Ядер запятнаны с пропидий йодидом (PI; красный), краситель murine-Fc-AF647 (МАБ; зеленый), и PI/МАБ объединены. Масштаб — 50 мкм. В рамках трипсина и группы не трипсина изображения были приобретены с идентичными инструмент настройки между различными ACs показано. Трипсин часть рисунка 4 заимствован из 34 refefence с разрешения. Адаптированы и Перепечатано с разрешения Бодуан, S. et al. ChAcNLS, Роман изменения антител конъюгаты разрешительные целевых конкретных клеток от англ побега, локализации для ядра и более всего внутриклеточного накопления. Молекулярная Фармацевтика. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Рисунок 5: 64Cu-A14-ChAcNLS чистоту и сходства. (A) радиохимической чистоту 64Cu меченых A14, А14-NLS, А14-ChAcNLS были проверены SDS-PAGE следуют авторадиографии. (B) конкретные привязки кривые для 64Cu-A14 и 64Cu-A14-ChAcNLS на HT-1376 и HT-B9 клетки. Планки погрешностей указать стандартное отклонение эксперимента в репликацию. Адаптированы и Перепечатано с разрешения Пакетт, м. и др. NLS-Холевая кислота спряжение Ил 5Rα-специфические антитела к улучшает сотовой накопления и в естественных условиях опухоль таргетинг свойства в модели рака мочевого пузыря. Химии биоконъюгатов. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Рисунок 6: 64Cu обладающие и внутриклеточного накопления. Пример лечения клетки выполнена в трех экземплярах (планки погрешностей обозначают стандартное отклонение) для демонстрации специфичность (A) и (B) повышение накопления 64Cu-A14-ChAcNLS. Накопление % представлена в ядро (левой панели) и внутриклеточных площадь (правой панели) относительно общего количества радиоактивности, используемые во время лечения раковых клеток ИЛ 5Rα-позитивных инвазивных мочевого пузыря. Планки погрешностей указать стандартное отклонение эксперимента в репликацию. * Указывает p ≤0.05.
Рисунок 7: анализ процедуры фракционировки клетки. Западная помарка ядерного (A) и (B) Эндоплазматический фракций Ламин кондиционера (Топ помарки; красные стрелки) и раб 7 (нижний помарки; черные стрелки), полученные от лечения HT-1376 и HT-B9 клетки плазматической мембраны литического буфера, содержащий 1%, 2% или 4 % NP-40. Все клетки лизированы с Буфер RIPA использовался как положительный контроль Ламин кондиционирования и Rab7 в обеих фракций. Выполнение стандартов (L) изображены только в топ помарки. Из-за нескольких изоформ для Ламин A/C указаны три стрелы. Адаптированы и Перепечатано с разрешения от Пакетт, м. и др. NLS-Холевая кислота спряжение Ил 5Rα-специфические антитела к улучшает сотовой накопления и в естественных условиях опухоль таргетинг свойства в модели рака мочевого пузыря. Химии биоконъюгатов. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Рисунок 8: В естественных условиях анализ опухоли ориентации PET изображений и анализа ROI. (A) PET изображений на 48 ч впрыск Нод/SCID мышей, принимая HT-1376 (красные стрелки) и HT-B9 (синие стрелки) опухоли, внутривенно вводят с 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS и 64Cu-A14-ChAcNLS. Зеленая стрелка-печени поглощения. Мышцы ROI рисунок показано с малиновым круг. (B) ROI HT-1376 и HT-B9 опухоли к мышцы соотношения ACs на 48 ч после инъекции. Планки погрешностей указать стандартное отклонение эксперимента в n = 10 ROIs на мышь (n = 5). * Указывает p 0,05.
| Tat |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Холевая кислота CGYGPKKKRKVGG 34 |
Таблица 1: Перечень ТАТ и SV-40 крупных T-антиген производные пептиды в AC изменения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основными задачами системного доставки анти-рак агентов являются увеличить накопления на опухоли и поглощение в раковые клетки и уменьшить нежелательные побочные эффекты в здоровых тканях. AC целевой доставки молекулярных полезных для опухолевых клеток является весьма перспективным подходом к лечения и выявления опухолей. Однако отсутствие эффективности вызванные endosome изобличения и вниз лизосомальных деградации поток остается важной задачей. Хотя этот протокол использует ChAcNLS пептид как пример для строительства нового поколения ACs, описанные процедуры могут быть адаптированы к любой пептид модифицированные AC, разрабатывается с целью увеличения количества внутриклеточного поставки полезной нагрузки чтобы целевой раковые клетки.
Наиболее важные шаги в этом протоколе являются: 1) выявления и ограничения высокого МВт совокупности видов; 2 trypsinization клеток до анализа для определения внутриклеточного накопления; 3) выполнение качества сотовой фракционирование процедур; и 4) выполнение PET изображений для оценки опухоли, ориентация в естественных условиях.
Важно, что сопряжения вирус производные пептиды для mAbs не приводит к высокой МВт совокупных видов, которые скорее всего вызвано внутримолекулярной сшивки между mAbs. Это первоначальный интерес и должны решаться до прогрессирует дальше. Двигаться вперед с пептида модифицированные ACs, которые содержат нежелательные агрегатов может дать результаты, которые обеспечивают ложных доказательств по таким аспектам, как профили доставки полезной нагрузки внутриклеточные и в естественных условиях . Реактивные малеинимидов на mAbs является то, что скорее отвечает за ковалентных агрегации. Одно из решений заключается в том, чтобы уменьшить коэффициент сульфогруппу ККАП МАБ. Другой альтернативой является использование N-ацетил-Производные аминокислот например Cys, Lys, его, Ser и чет во время спряжение пептида в maleimide активированный МАБ 45. Реакции нуклеофильного боковой цепи способны реагировать с maleimide общие ККАП и уменьшить интра антитела сшивки. Кроме того разделение хромотографией размер исключение после сопряжения может использоваться для изолировать мономера видов 45. Может также выполняться участкам спряжение пептида антитела к. Например антитела углеводы могут быть изменены для сопряжения с пептидами, который показал эффективно производить мономера видов 24.
SDS-PAGE с 12% полиакриламидных гелей-это недорогой и эффективный способ получить широкие перспективы большого размера различий в AC видов. Если используется увеличение % полиакриламида, разделение тяжелых цепей и внутримолекулярная видов будет трудно отличить. И наоборот Если используется сокращение % полиакриламида, легкие цепи могут убежать геля. Градиент гели, содержащие 4-20% полиакриламида также обеспечивают хорошее удержание сдвиги для тяжелых и легких цепей на одном гель. Среди различных аналитических методов, доступных для анализа биомолекулярных высокая производительность жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза SDS превосходят SDS-PAGE для разделения и характеристика кондиционеров 46. Тем не менее SDS-PAGE является ранней и недорогой метод для анализа начальное строительство этих новых агентов и затем принять решение о следующих курс действий.
Инкубации клеток в растворе, содержащем трипсин 0.25% (шаг 2.3), который удаляет максимальное количество белков клетк поверхности и связанные ACs имеет важное значение, потому что она позволяет для улучшения визуализации и относительное увеличение внутриклеточного накопления между Ссылка антител. Задаются параметры камеры для захвата изображения на максимум флюоресценции интенсивности. Это из-за изменения от ячейки к ячейке размере переменного тока, который накапливается. Таким образом захват изображений при максимальной интенсивности позволяет для ячеек с накоплением меньше переменного тока также оцениваться. Однако рак антигены высоко обычно выражаются на опухолевые клетки. Если клетки не были подвергнуты переваривания трипсином, флюоресценция, вытекающих из ACs на поверхности клеток будет доминировать изображения. Кроме того без trypsinization развития могут быть ограничены с помощью ACs с тонкие, но значительные внутриклеточного накопления свойствами.
Обеспечение высокого качества сотовой фракционирование имеет важное значение для точной оценки накопления 64Cu в ядре и цитоплазме. ChAcNLS способность увеличить внутриклеточного накопления переменного тока и полезной нагрузки объясняется активной локализации ядра 34. Как разрабатываются будущих вирус пептиды, эти пептиды могут также локализовать в ядро как часть их механизма для повышения эффективности внутриклеточных полезной нагрузки. Таким образом важно, что что сотовой фракционирование высокого качества точно подробно этот процесс. Этот протокол подчеркивает важное значение оценки ядер цитоплазматических маркеров, а также цитоплазмы дроби для ядерных маркеров. К примеру, Ху et al., разработали переменного тока с ТАТ пептид и изучить ядерных накопления радиоизотопа грузоподъемность 24. Западный анализ помаркой для calpain, обильные цитоплазматического белка, присутствовал в ядерной фракции. Это, скорее, потому что коммерческих ядерных изоляции комплекты были использованы. Этот протокол продемонстрировал, что HT-1376 и HT-B9 клетки требуемые разные концентрации NP-40 для того, чтобы изолировать обогащенного ядер при интактном плодном пузыре. Когда HT-B9 клетки были лизированы с буфером содержит 4% NP-40, Ламин A/C присутствовал в цитоплазматических дроби, указывающее лечения нарушается ядерной мембраны и позволило Ламин A/C вступить в цитоплазму. Если тщательно не изолированы ядерные и цитоплазматические фракций, это может быть трудно определить вклад ядерной локализации всего внутриклеточного накопления. Есть сообщения о биологической и искусственно производный пептиды, которые специально направлены другие внутриклеточные отсеков эндоплазматического ретикулума, аппарат Гольджи и митохондрии 47,,4849. Таким образом изоляция внутриклеточных отсеков становится все более актуальной.
Этот протокол заканчивается с ее описанием 64Cu-A14-ChAcNLS ориентации на HT-1376 и HT-B9 опухоли. От визуального осмотра PET изображений на рисунке 8, очевидно, увеличение опухоли PET сигнал относительно смежных уменьшена окружающий фон 64Cu-A14-ChAcNLS имеет улучшенный ориентации HT-1376 и HT-B9 опухолей (рис. 8А ). Анализ ROI также демонстрирует свою способность оценивать опухоли ориентации. В нашем примере мы используем ROI опухоли к мышцы коэффициенты для количественного определения ориентации опухоли и продемонстрировать, что 64Cu-A14-ChAcNLS является улучшенный AC (Рисунок 8B). PET изображений также позволяет для оценки AC поглощения в здоровых органов. Печень является основным органом, который усваивает антител. Рис. 8А демонстрирует, что поглощения в печени сопоставимых в мышей, вводится с 64Cu-A14-ChAcNLS и 64Cu-A14. На этой ранней стадии развития эти данные свидетельствует о том, что ChAcNLS не вызывает нежелательных поглощения. 64 Cu имеет период полураспада 12,7 ч, который не является идеальным для кондиционеров, половина-жизнь нескольких дней. Как описано в протоколе визуального Zeglis и Льюис использование долгоживущих радиоизотопов циркония-89 (89Zr) является полезной, чьи физические half-life является идеальным для mAbs и может отражаться на PET 50. Таким образом для оценки опухоли доставки в течение нескольких дней, 89Zr является предпочтительным выбором. Это особенно важно, если терапия — это цель, где высокая опухоли поглощения является благоприятным и увеличивается с течением времени с антитела 7. Накопление должны также выполняться для определения отдельных органа поглощения для дальнейшего изучения нападения или поглощения свойства недавно разработанных ACs. Кроме того можно predosed мышей с неизмененной специфическое антитело для блока рецепторов на опухолевые клетки для оценки ориентации специфичности. Тем не менее, 64Cu с PET изображений и анализа ROI достаточно предоставить первоначальную оценку опухоли свойства доставки развитых АКГ, представленные в настоящем Протоколе.
До настоящего времени ACs с вирусом производные пептиды были ограничены для доставки радиоизотопов. Отчасти это объясняется историческими причинами, а также потому что радиоизотопов легко количественно в пробирке и в vivo тестирование и могут быть визуализированы с помощью неинвазивной визуализации формы всего тела. Естественно как это поле расширяется для транспортировки и доставки полезной нагрузки за исключением радиоизотопов, например химиотерапевтические, ферменты и олигонуклеотиды, изменения методов, описанных в настоящем протоколе должны разрабатываться. Например новые методы для оценки внутриклеточное накопление альтернативных полезных придется быть разработаны. Кроме того изменения в естественных условиях оценки будет пчела, необходимых как нельзя легко воспроизведен образ этих полезных и поэтому будет трудно оценить эффективность поглощения накопление, специфика и опухоли. По этим причинам радионуклидных полезной нагрузки должен оставаться суррогатной полезных для будущего развития с альтернативными грузов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Эта работа финансировалась обществом исследований рака (Канада) и кису. Авторы благодарят д -р Самиа МТА-Моханд и Жан-Франсуа Beaudoin за помощь. Д-р Анхель Лопес (Университет Южной Австралии) для mAb A14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
- Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
- Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
- Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
- Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
- Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
- Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
- Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
- Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
- Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
- Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
- Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
- Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
- Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
- Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
- Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
- Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
- Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
- Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
- Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
- Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
- Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
- Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
- Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
- Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
- Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
- Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
- Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
- Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
- Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
- Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
- Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
- Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
- Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
- Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
- Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
- Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
- Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
- Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
- Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
