Summary
바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말 (ACs)에 결합 된 증가 된 종양 세포 축적과 분자 페이로드를 제공의 가능성으로 인해 기세를 얻고입니다. 펩 티 드 활용, AC 및 페이로드 세포내 축적, 및 종양을 대상으로 평가 하는 일반적인 방법을 활용 하 고,이 프로토콜 연구원 주요 초기 개발 단계에서 도움이 됩니다.
Abstract
항 체-어원이 같은 말 (ACs) 바이러스 파생 된 펩 티 드로 분자 페이로드 암 치료에 사용 되 고 현재 ACs에 증가 세포 축적 때문 이미징에 대 한 종양 세포 배달 에이전트의 잠재적으로 강력한 클래스는. 초기 AC에 체 외에서 동안 개발, 형광 기술 및 방사는 세포내 지역화, 축적, 효율과 대상 세포 특이성을 결정 하기 위한 충분 한. 현재, AC 세포내 축적 및 지역화에 대 한 셀을 준비 하기 위한 표준화 된 방법에 아무런 합의입니다. ACs를 바이러스 파생 된 펩 티 드로의 초기 테스트 하는 것이 여러 후보를 생성 하는 경우에 특히 중요 합니다. 세포내 축적 결정 형광 세포 표면에 ACs에서 배경 신호에 의해 영향을 받을 수와 축적의 해석을 복잡 하 게. 방사, 일반적으로 치료 세포는 분류 한 및 다른 세포 격실에 방사능 측정. 그러나, 세포 세포의 용 해 셀을 변화 하 고 종종 핵과 세포질 구획 적절 하 게 격리 됩니다. 이 페이로드 배달 속성에 잘못 된 데이터를 생성할 수 있습니다. 방사선된 바이러스 파생 된 펩 티 드 수정 ACs 종양 마우스 뒤에 방사성 핵 종 영상 베어링에서 정 맥 주입의 비보에 단계에서 종양 타겟팅 및 페이로드 배달 속성을 결정 하기 위한 강력한 방법 이다 개발입니다. 그러나, 이것은 비교적 최근의 발전 하 고 몇 그룹 펩 티 드 수정 ACs를 바이러스 파생이 방식으로 평가 했습니다. 우리는 더 정확 하 게 평가 하는 펩 티 드 수정 AC 축적 바이러스 파생 confocal 현미경 검사 법 및 방사를 사용 하는 경우에 치료 셀의 처리를 설명 합니다. 특히, trypsinizing 세포 세포 표면 제거 하는 방법 ACs 바인딩됩니다. 우리는 또한 세포 분별 법을 개선 하기 위한 방법을 제공 합니다. 마지막으로,이 프로토콜이 있습니다 vivo에서 양전자 방출 단층 촬영 (PET)를 사용 하 여 초기 종양 종양 방위 쥐에서 속성을 대상으로 평가. 우리가 사용 하는 방사성 64Cu (t1/2 = 12.7 h)이 프로토콜에서 예제 페이로드로.
Introduction
항 체 어원이 같은 말 (ACs)는 효과적인 약물 암 치료 향상을 위한과 종양의 transformative 클래스에 성숙 하는 바이오. 단일 클론 항 체 (mAb) radioisotopes, 작은 분자 및 생물 독 소 같은 분자 페이로드를 활용의 구성, ACs 절묘 한 대상 항 원 친화성 및 특이성 암 세포에 이러한 페이로드를 전달할 수 있습니다. 따라서 ACs을 크게 줄이고 특이 독성 종양 사이트에서 페이로드 활동 증가 가능성이 있다. 치료로, 세포 독성 작은 분자 (일반적으로 언급 항 체 약 변화)를 수송 하는 ACs 기존의 치료 1, 실패 한 유방암 및 Hodgkin의 림프 종 환자 치료에 대 한 승인 되었습니다. 2. 또한, ACs 수송 radioisotopes (일반적으로 radioimmunoconjugates 라고 함)는 또한 개발. 이미징에 대 한 방사성 동위 원소를 수송 하는 AC 전립선 암 전이 3식별을 위해 승인 된다. 많은 더 치료 acs 승인 4에 대 한, 암 치료 5개선에 ACs의 미래에 대 한 낙관론은 높다.
그럼에도 불구 하 고, chemotherapeutics 또는 radioisotopes 제공 때 ACs 대상 셀 안에 이러한 페이로드를 효과적으로 축적 하는 어려움이 있다. 이 부분 상당히 오랫동안 질병-무료 생존 또는 고대비 종양 6,7이미지를 제공 하는 ACs의 무 능력에서 많은 경우에 공헌 한다. 일반적으로, 일단 ACs 바인딩할 그들의 대상 항 원 수용 체 중재 된 endocytosis 이라는 프로세스를 통해 내는 그들은. ACs는 다음 endosomes 안에 갇힌 저하에 대 한 리소좀에 인신 매매 및 페이로드 발표 8. 세포내 밀매 과정 높은 페이로드 특이성 및 대상 암 세포에 대 한 효능을 ACs에 대 한 도전 포즈. 예를 들어 많은 항 Her2 등 (대상 치료 AC Trastuzumab-emtansine)는 첫 번째 30 분 9에 바인딩된 항 체의 85%를 재생할 수 있다. 또한, 저하 발생 하면 출시 된 chemotherapeutics와 radioisotopes 내보낼 수 있습니다 적극적으로 증가 식 및/또는 관련 된 막 수송 단백질 10,11의 활동. 리소좀 저하 또한 소설 생물 페이로드 치료 효소 등의 납품을 방해 하 고 수 있는 oligonucleotides 비활성화 12,13. 본질적으로, 암 세포 abrogating 페이로드 ACs에 의해 전달의 필요한 세포내 축적에 매우 효과적입니다.
이 프로토콜에서는 ACs-바이러스 파생 된 펩 티 드, 특히 endosome 함정을 탈출 하 고 세포 핵에 지역화에 대 한 결합의 개념을 구현 하는 방법을 설명 합니다. 호스트 셀 시스템 조작 같은 세련미와는 잠재적인 바이오로 바이러스 파생 단백질 및 펩 티 드의 개발은 오래 되었습니다에 배어 든 치료 연구 14놀라운 일이 아니다. 바이러스 단백질에 정상 생리 포유류 세포 시스템을 효과적으로 이용할 수 있는 뛰어난 컬렉션을 얻으려고 진화 하는 년의 수백만 대 한 호스트 셀을 입력 합니다. 바이러스 수용 체 중재 된 endocytosis를 통해 내 면, 그들은 또한 프로 테아의 지역화 된 농도의 공격 생존에 대 한 문제가 될 수 있는 매매는 리소좀에 이스케이프와 도전 됩니다. 특징이 잘 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 endosome 함정 탈출을 위한 약물 전달에 활용은 전사 (문신) 단백질 15의 인간 면역 결핍 바이러스 transactivator 이다. 문신은 낮은 pH 이때 단백질 구조적 변화가 활성화 문신 자체에 삽입 하 고 endosomal 막 16방해를 감지 하 여 endosome 함정을도 주 할 수 있습니다. 이 결과 세포질 액세스할 수 문신 페이로드 어원이 같은 말. 이 프로토콜에 관련 된 두 번째 바이러스 성 조작 요소 핵 17에 치료 유전자와 약물을 전달 하는 데 사용 하는 접근 이다. 바이러스는 성공적으로 복잡 한 핵 공 (NPC)를 통과 하 여 핵 막 과거 진행에 대 한 호스트 셀 기계 조작에 진화 했다. 세포질 고분자 포함 (또는 포함 하는 단백질을 바인딩할) 핵에 바인딩하는 데 필요한 핵 지 방화 신호 (NLSs) 수송 단백질 (예: karyopherins α와 β), NPC 통해 필요한 움직임을 제공 하는. 바이러스는 호스트 셀 전송 단백질 핵 18에 왕복에 대 한 활용 하는 기능 들을 제공 하는 NLS 시퀀스를 포함 하는 단백질을 개발 했습니다.
수많은 ACs 이전 문신 및 NLS 파생 된 펩 티 드와 공업화 되었고 암 세포 안에 축적 하는 그들의 능력에 대 한 고 종양 19,20,,2122 를 대상으로 테스트 23,,2425,26,27,28,29,30 (표 1). 세포 독성 페이로드를 제공 하는 연구 ACs 바이러스 파생 된 펩 티 드로 세포 축적, 세포 독성, 그리고 수정 되지 않은 ACs 22,26이상 죽이고 종양을 크게 증가 시킬 수 있습니다 설명 했다. AC의 소설이 클래스에 대 한 일반적인 특징은 그들의 건설 이다. 일반적으로, 펩 티 드 무료 sulfhydryl 그룹을 제공 하는 터미널 시스테인 포함. MAbs는 처음 N-hydroxysuccinimide (NHS)와 반대 끝에 maleimide 그룹을 포함 하는 noncleavable bifunctional crosslinker로 반작용 했다. NHS 에스테 르 아 미드 유대를 형성 하는 mAb에 1 차 아민으로 반작용 한다. 무료 maleimide 그룹으로 반작용된 mAb 다음 sulfhydryl 그룹 펩 티 드 thioester 유대와 이렇게 연결 하는 펩 티 드 및 mAb 형성에 반작용 했다. 비록 homobifunctional crosslinkers는 사용된 28, heterobifunctional crosslinker는 더 일반적으로 바이러스 파생 된 펩 티 드-ACs 22,,2326의 건설에 사용 되 31,32. 이 프로토콜은 특히 crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) 사용 하 여 cyclohexane-1-카복실산 (sulfo SMCC) 사용의 용이성에 대 한 승인 된 항 체 약물 어원이 Trastuzumab-emtansine에 많은 사용 되 고 바이러스 파생 된 펩 티 드-ACs 8,22,23,26,,3132. 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)가 처음 활용 효율성을 결정 하기 위한 기본 방법에 대 한 반 측정 mAb 당 펩 티 드의 수. Confocal 현미경 검사 법을 붙일 표시 된 이차 항 체는 mAb에를 사용 하 여 일반적으로 처음 바이러스 파생 된 펩 티 드 수정 ACs의 세포내 분포 속성을 평가 하기 위한 방법입니다. 지금까지, radioisotopes 기본 페이로드를 바이러스 파생 된 펩 티 드 수정 ACs에 의해 전달 되는. Radioisotopes 셀에 방사능은 쉽게 감마를 계산 하 여 정량 때문에 유리 하다. 또한, 인간의 암 마우스 모델으로 번역 하는 ACs 종양 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영과 양전자 방출 단층 촬영 (PET)와 같은 분자 이미징 modalities를 사용 하 여 대상으로 평가 하는 능력 연구원 제공 23 , 32 , 33. 건설 및 연구자에 의해 주로 사용 되는 메서드를 테스트 하는 유효성 검사 효과적으로 입력 하 고 제공 바이러스 파생 된 펩 티 드와 함께 초기 개발 단계에서 수정 하는 ACs의 매우 좋은 평가 제공 하는 일반적으로 페이로드 대상 셀 내부와 대상 종양입니다.
문신 및 NLS-수정 ACs 추가 페이로드 배달 암 세포 내부와 종양을 개선 하기 위한 조명된 핵심 지역이 있다. NLS 수정 ACs에 관하여 세포내 축적에 효율성 겸손 23,,3134수 있습니다. 비효율적인 세포내 축적은 지속적인된 endosomal 함정에 의해 발생 합니다. Vivo에서 종양을 대상으로 수 있습니다 또한 줄어들와 두 문신 및 NLS-수정 ACs. 문신 및 NLS의 활성 시퀀스 여러 긍정적인 충전된 잔류물을 포함합니다. MAbs에 연결 된, 전체 양이온 충전 크게 증가 35수 있습니다. 결과적으로 문신 및 NLS-수정 ACs 건강 한 조직에 통풍 관을 증가 있고 급속 한 혈액 클리어런스를 증가.
우리의 그룹 개발 복합 화합물 cholic acid NLS (ChAcNLS;에 연결 구성 그림 1)입니다. ChAcNLS 수정 ACs 배달된 radioisotopes의 세포내 축적을 증가 및 종양 NLS 수정 및 전통적인 ACs 33,34에 비해 대상으로 향상 시킬 수 있습니다. Cholic 산 뒤에 장치는 막 퓨전 세 라마 이드의 형성을 통해 endosome 탈출 하 cholic acid를 활용 하는 것에 의존할 수 없는 선택 nonenveloped 바이러스의 능력에 의해 영감 이다. 예를 들어 돼지 장 바이러스 sphingomyelinase, 세 라마 이드 36,,3738에 sphingomyelin의 가수분해를 catalyzes 활성화 cholic acid를 보충 한다. 이 endosomal 막 destabilizes 고 바이러스 탈출에 대 한 수 있습니다. 따라서, cholic acid NLS를 보완 하는 다른 바이러스 파생 된 구성 요소입니다.
이 필드 이동 앞으로 미래의 발전 그것은 초기 개발 하는 동안 그들의 생 화 학적 및 기능적 특성의 시각적 데모를 제공 하는 적시 페이로드 전달 바이러스 파생 된 펩 티 드로 ACs에 의해 발생 합니다. 여기, 우리는 세포내 축적 및 종양 초기 단계 개발 대상으로 효율적인 아직 간단한 결정에 대 한 펩 티 드 수정 ACs 바이러스 파생의 초기 평가 대 한 우리의 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 상용 mAbs 7G 3 및 A14 예제 모델 시스템으로 사용합니다. 절차 1 생성 된 ACs에 대 한 ' go/no가 ' 결정에 대 한 허용 하는 방법으로 SDS 페이지를 사용 하 여를 설명 합니다. 프로시저 2 trypsinization AC 세포내 분포와 축적의 향상 된 시각화에 대 한 허용을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 절차 3 핵 지역화가 정확 하 게 결정을 향상 된 세포내 분별 하는 방법을 설명 합니다. 이 절차에서는 우리가 활용 페이로드 64Cu (t1/2 = 12.7 h) 셀룰러 경과에 취약 하 고 양전자가 미터 10때문에. 따라서, 절차 4 종양 vivo에서 애완 동물 이미지 배경 (즉 nontarget 건강 한 조직) 기준으로 종양 글귀를 시각화 하 고 AC 예를 구체적으로 그리고 효과적으로 할 수 있는지 여부를 확인 하 여 특성화를 대상으로 설명 대상 종양입니다. 이 메서드는 추가 발전에 대 한 후보를 식별 하기 위해 바이러스 파생 된 펩 티 드로 ACs를 개발 하는 수 사관에 대 한 충분 한.
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Protocol
Vivo에서 동물 실험 설명 동물 실험 센터 Hospitalier 대학 드 룩 윤리 위원회의 윤리 지침에 따라 승인 된 프로토콜에 따라 수행 했다.
1. 항 체 펩 티 드 활용
참고: ChAcNLS 상업적인 펩 티 드 제조 업체 또는 대학 제휴 펩 티 드 종합 서비스 플랫폼에서 합성 될 수 있습니다. ChAcNLS의 합성 기준 34에서 찾을 수 있습니다. 절차 1과 2에 대 한 사용 하 여 7G 3, mAb는 백혈병 항 원 일 3Rα 39에 대 한 특정.
- 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 10 mg/mL를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.6에에서 7G 3의 (~ 1 mg 총 항 체) 솔루션 준비.
- 5-10 m m의 농도에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 sulfo SMCC 디졸브. Vortexing 솔루션은 철저 하 게 가장 완전 한 해체를 달성 하기 위해 작동 합니다.
- (일반적으로 어 금 니 비율의 sulfo SMCC-7G 3 원하는 따라 5-20 μ) 사이 녹아 sulfo SMCC 솔루션 7G 3 포함 된 튜브에 추가 합니다. 10, 25 및 50 대 1의 sulfo SMCC-7G 3 비율을 테스트 하는 것이 좋습니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
-
정화 하 고 PBS, pH 7.0에에서 적용 장치 및 버퍼 exchange를 사용 하 여 maleimide derivatized 7G 3 집중. 다시 약 5 분 삭제 통해 흐름과 PBS, pH 7.0, 원심 분리기와 채우기 위해 8000 x g에서 원심.
- 이 7-8 번을 수행 완전히 버퍼 교환 하. 거꾸로 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에서 필터 장치를 배치 하 여 복구 집중된 7G 3 단백질. 1000 x g. 복구 볼륨에서 2 분 동안 원심 분리기 약 0.3 mL 해야 합니다.
- Maleimide 활성화 7G 3를 포함 하는 관에서 이전 단계에서 사용한 sulfo SMCC-7G 3 비율 기준으로 ChAcNLS의 2-fold 어 금 니 과잉을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어 예를 들어 10-1 sulfo SMCC-7G 3 비율, 사용 하는 경우 다음 사용 하 여 20-1 ChAcNLS-7G 3 비율. 총 볼륨 크게 변경 되지 해야 합니다.
참고: ChAcNLS 강 수 활용 과정을 발생 하지 않습니다 있지만 이것은 다른 펩 티 드와 함께 발생할 수 있는 가능성입니다. 발생 소수 성 펩 티 드 때 강수량의 징후에 대 한 반응 동안 튜브를 관찰 합니다. 이러한 경우 설계 변경 증가 화란을 제공 하려면 관심의 펩 티 드 하는 걸로 가치가 있을 수 있습니다 그것. - 7 G 3-ChAcNLS PBS pH 7.4 (단계 1.4 참조)에서 원하는 농도 버퍼 교환 한 장치를 사용 하 여 집중 한다. 총 단백질의 복구 수확량은 ≥ 이어야 한다 원래 시작 물자의 75%.
- SDS-페이지 12 %polyacrylamide 젤 (충분 한 분리는 ChAcNLS의 무거운 활용 및 nonconjugated 체인에서 체인 빛 제공)를 사용 하 여 생성 된 7 G 3-ChAcNLS 후보자를 평가를 수행 합니다. 페이지 로딩에 7 G 3-ChAcNLS의 혼합 10 μ g 포함 2 μ β-mercaptoethanol을 버퍼링 하 고 잘으로 로드.
- 적절 한 전압 (120 V 1 h 12% 젤)를 설정 하 고 실행 하는 전기 이동 법. Coomassie 염료 앞에 도달 하면 젤 하단에 전기 이동 법을 중지 합니다.
참고: Coomassie 염료 전면 젤에서 실행 못하게 합니다. - 젤 전기 이동 법 기구에서 제거 하 고 빙 초 산, 20 %v / v 메탄올의 10 %v / v를 포함 하는 솔루션 destaining 린스.
- 젤의 사진 그리고 통치자와 측정 거리 (cm) 마이그레이션 표준과 7G 3 어원이 같은 말. 고정 비율 (Rf) 값을 계산 (Coomassie 마이그레이션 앞에 단백질 로드 되는 위치)에서 젤 길이 의해 분할 마이그레이션 거리입니다. 각 단백질 표준 Rf 값에 대 한 로그에 분자량 (MW)를 플롯 및 추정 7G 3의 크기 변화.
- 7G 3 MW에 차이 분할 하 여 항 체 당 펩 티 드의 수를 7G 3 1768.5 g/mol (ChAcNLS MW)에 의해 수정 되지 않은 계산 합니다.
- Coomassie 스테인드 젤의 디지털 이미지를가지고 고 densitometry 분석 수행. 이 시점에서, 리드 후보의 선택 ChAcNLS 분자의 중요 한 집계 종을 포함 하지 않는 최대 수와 AC 기반 될 수 있습니다.
2. 세포내 축적 평가 confocal 현미경 검사 법
참고: 테스트의 페이로드가 공식 개발 이전 펩 티 드 수정 mAbs의 세포내 축적의 셀 선택도 중요 하다. 문신도 일반적인 세포 침투에 대 한 성향을가지고 표시 되었습니다, 때문에 첫 번째 분석 세포내 축적 및 셀 선택도 비싼 페이로드가 있는 사업 비용이 개발 단계 전에 가치가 있다. 이런 이유로 절차 1 또한 isotype 특정 없는 제어 mAbs를 수정 해야 합니다. 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 항 체 당 10 ChAcNLS 분자와 수정 ACs를 사용 합니다. 절차 2와 3에 대 한 주요 단계를 포함 하 여 회로도 그림 2에 설명 되어 있습니다.
주의:이 단계는 프로토콜의 처리 및 조작의 paraformaldehyde 포함 됩니다. 처리 하는 경우 제조업체 지침을 따르시기 바랍니다.
- 200 nM 7 G 3-ChAcNLS 등의 수정 제어 mAbs와 대상 TF-1a 셀을 취급 합니다. 5 x 106 항 원 양성 세포 1 h 37 ° c.에 대 한 어원이 같은 말을 품 어
- 1 시간 후 상쾌한을 제거 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS에 3 x 1 mL로 씻어. 신선한 미디어를 추가 하 고 37 ° c.에 추가 시간에 대 한 품 어
-
추가 시간 후 상쾌한을 제거 하 고 1 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS에 3 배를 세척 합니다. 3 최대 37 ° C에서 30 분 0.25 %trypsin 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)을 포함 하는 PBS의 0.5 mL를 추가 합니다.
참고: 초기 파일럿 테스트 하는 동안 그것은 권장 하지 셀 AC 세포내 축적의 차이 결정 하기 위해 trypsinize를. 이 프로토콜 trypsin의 사용을 촉진 하 고이 다른 AC 후보자의 세포내 축적 효율의 평가 향상 시키는 방법을 보여 줍니다.- 분리 되는 모든 셀에 대 한 시각적으로 확인 하 여 부 화에 대 한 다른 시간을 테스트 합니다. 또한, 생존 솔루션 얼룩과 셀 aliquots를 품 어 고 앞에서 설명한 40흐름 cytometric 분석을 수행.
- 세포 배양 RPMI 1640 media/10% 태아 둔감 한 혈 청의 1.5 mL와 트립 신을 무력화. 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심, 상쾌한, 제거 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS 0.5 mL에에서 3 배를 씻어.
- 1% paraformaldehyde 30 분 세척을 위한 얼음에 1% 자당을 포함 된 0.5 mL PBS에 수정 세포 세포 얼음 처럼 차가운 PBS 0.5 mL에에서 3 배 그리고 5 분 Permeabilize 위한 250 x g에서 원심 분리기 0.5 ml PBS 0.15% 포함 된 얼음에 5 분에 대 한 Triton X-100 세포. 얼음 처럼 차가운 PBS에 세포를 세척 하 고 원심 분리를 반복.
-
0.1 mL PBS 2 μ g/mL (또는 제조업체에서 권장 하는 농도) 포함 된 셀 중단 방지 murine (특정 isotype)의 Fc 보조 polyclonal 항 체는 어둠 속에서 실 온에서 1 h AlexaFluor 647에 활용.
- 얼음 처럼 차가운 PBS 0.5 mL에에서 3 x 250 x g 5 분 및 세척 셀에서 원심. 0.5 mL PBS에에서 셀을 일시 중단 합니다.
일시 중지: 셀 냉장고에 저장할 수 있습니다.
참고: 인식의 mAb의 올바른 isotype 이차 항 체 선택 필수적 이다. AF647은 propidium 요오드 화물 (PI) 핵의 얼룩과 방해 하지 않는 그것의 먼 적외선 방출 때문에 선택 됩니다.
- 얼음 처럼 차가운 PBS 0.5 mL에에서 3 x 250 x g 5 분 및 세척 셀에서 원심. 0.5 mL PBS에에서 셀을 일시 중단 합니다.
- 셀과 컨테이너 10 μ g/mL의 농도에 PI를 추가 합니다. 다음, 유리 coverslip로 설치 미디어와 커버를 사용 하 여 유리 슬라이드에 1 x 105 셀을 탑재 합니다.
- 거꾸로 레이저 confocal 현미경 검사에 계획 Apo 60 X 기름 침수 목표 나 1.42 셀을 검사 합니다. 488 nm의 아르곤 레이저와 스펙트럼 스캐닝 프리즘 600-650 nm에 대 한 설정 사용 하 여 PI 형광을 감지 합니다. AF647 형광 633 nm 헬륨-네온 레이저와 스펙트럼 스캐닝 프리즘 650-700 nm에 대 한 설정를 사용 하 여. PI와 AF647에서 형광 방출을 순차적으로 수집 합니다.
참고: 셀의 비교 평가 걸쳐 동일한 설정을 사용 합니다. 그러나, 비 trypsinized 세포에 비해 trypsinized 세포에 대 한 설정을 조정 해야 합니다. - 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 이미지. 직렬 수평 광학 섹션 2 X 라인 평균 1024 x 1024 픽셀의 전체 셀 두께 통해 0.5 μ m 간격으로 사용 하 여 이미지를 수집 합니다. 최대 형광 강도에서 이미지로 누적된 z-4 연속 조각에서 예측을 제시.
- 셀 현미경 소프트웨어를 분석 합니다. 어원이 같은 말의 세포 분포 패턴을 기록 합니다. 특히, 세포질에 있는 세포내 형광 그룹화 여부 및 표면 또는 확산 및 균질 셀 근처를 평가 합니다. 또한 셀 당 상대 형광 강도 평가 합니다.
3. 방사선 AC 건설과 64 Cu 세포내 전달 효율의 평가 위한 세포 분별 법
주의: 절차 3 및 4 포함 처리 및 방사능의 조작. 이러한 단계를 수행 하기 전에 안전 교육 및 그들의 가정 기관 방사선 안전 기관에서 승인 하는 프로토콜 연구원 승인 해야 한다.
주: 절차 3 및 4에 대 한 우리가 사용 A14, mAb는 침 윤 성 방광 암 항 원 일 5Rα41에 대 한 특정. 또한, 모든 실험 시간에 민감한 64Cu의 짧은 반감기 때문입니다. 일반적으로, 이건 지난 1 주 생체 외에서 실험을 수행 하기 위해 기다리지 최고의 72 h 보다는 더 이상 vivo에서 학문에 대 한.
- 1.7 mL 튜브에 10 m m의 농도에 DMSO에 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic 산 (NOTA-보 건국)을 일시 중단.
- 볼륨 ≤ 0.5 mL (최종 NOTA NHS 볼륨 총 볼륨의 2 %v / v를 초과 하지 않아야 합니다)에 실 온에서 1 h에 대 한 pH 8.6에서 0.1 M 나트륨 중 탄산염에 A14 (2 mg 시작 물자)와 NOTA NHS의 50-fold 어 금 니 과잉 반응.
- 정화 및 버퍼 교환 NOTA-A14 PBS, pH 7.6 (단계 1.4 참조)에 한 장치를 사용 하 여.
- ChAcNLS의 후속 첨부 파일에 대 한 단계 1.2-1.6.
- 100 megabecquerel (MBq) 0.1 M 나트륨 중 탄산염, pH 5.5에서 37 ° C ≤ 1 h에서에서 64CuCl2 의 NOTA-A14-ChAcNLS (250 μ g 배치) 반응 0.1 mL. 64 Cu는 CIMS 42에서 TR-애완 동물의 싸이 클 로트 론에서 생산 됩니다.
- 집중 PBS ph 7.4 원하는 농도를 한 장치를 사용 하 여 64Cu-A14-ChAcNLS (1.4 단계 참조).
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용 매로 64Cu-A14-ChAcNLS 인스턴트 얇은 층 크로마토그래피 (ITLC) 하 여 크로마토그래피를 사용 하 여 스트립의 0.1 m M, pH 5.5 나트륨 시트르산 (ITLC eluent) radiolabeling 효율을 결정 합니다. ITLC 스트립에 반응 해결책의 0.5 μ 약 수를 적용 됩니다. 스트립의 autoradiograph를 수행 하 고 디지털 이미지를 얻을.
- 바운드의 비율 64Cu 무료 하 densitometry를 수행 합니다. 무료 64Cu 콘텐츠 > 5% 인 경우에, 이전 단계로 돌아가서 고 추가 정화를 수행 합니다.
- 또한 SDS-페이지 집계 평가 하 얼룩 Coomassie 수행 합니다. 두 번째 SDS 페이지 젤의 autoradiograph 뒤 방사선된 집계 종 확인을 수행 합니다.
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품질 체크 포인트에 바인딩 친 화력: 증가 농도에서 64Cu-A14 어원이 같은 말을 품 어 (0-100 nM) mL 당 1 x 106 대상 셀 중복에서. 일반적인 바인딩을 예상 하려면 레이블이 A14의 100 어 금 니 과잉 존재 셀 64Cu-A14 어원이 같은 말의 중복 샘플 혼합.
- 얼음에 1 h 인큐베이션, 후 셀 세척 하 고 총 바인딩된 항 체 샘플 및 감마 카운터에 총 일반적인 바운드 항 체 샘플을 계산 합니다. 특정 바인딩 (총 바인딩된 항 체-특이 항 체 바인딩) 반응 무료 64Cu-A14 (nM) 분석 결과에 사용에 대 한 그래프. 그래픽 소프트웨어를 사용 하 여 비선형 회귀에 의해 분리 상수 (Kd)를 결정 합니다.
- 64Cu 세포 축적 연구: 100 셀 치료 64Cu 표시 A14의 nM 1 h, 6 h을 37 ℃에서 24 h 앞33에서 설명한. 수용 체-중재 국제화를 차단 하도록 수정 되지 않은 A14 블록 IL 5Rα 사이트 및 4 ° C에서의 치료와 같은 추가 매개 변수를 포함 합니다.
- 정의 된 시간에 포인트에서 앞에서 설명한 단계 2.3-2.3.2, 0.5 mL PBS 포함 하 0.25 %trypsin 추가 하 고 37 ° C에서 EDTA 다음 중화와 세척.
- 원형질 막 세포의 용 해 버퍼 1% 포함 된 셀을 품 어 NP-40, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 버퍼 10 분에 대 한 얼음에 원심 5 분 동안 90 x g에서 원형질 막 lysed 세포.
- 상쾌한을 제거 하 고 신선한 튜브에. 이 세포질 분수를 나타냅니다. 핵 3 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS에 x 세포질 분수를 세척을 추가.
- 튜브는 핵과 세포질 분수를 포함 하는 봉인 하 고 있다 확인 하십시오. 다음 카운터 MBq 안됨 변환 하려면 64Cu에 대 한 보정 감마에 그들을 놓습니다.
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Lamin a/C, 제한 된 핵 단백질, 및 Rab7 서쪽 오 점 분석을 수행 하 여 핵 격리의 품질을 결정, 전체에 풍부한 세포질 단백질 세포 lysate, 핵 및 세포질 분수.
- 라디오 immunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼와 원형질 막 세포의 용 해 버퍼의 500 μ와 치료 5 x 106 세포 단계 3.12 포함 1%, 2%와 4 %NP-40. 또한, 고립 된 핵 단백질을 얻기 위해 RIPA 버퍼의 500 μ에 고립 된 핵을 취급 합니다.
- -20 ° c.에 60 분 찬 아세톤의 샘플 볼륨 x 4를 사용 하 여 격리 된 핵, 세포질과 전체 세포 단백질을 침전 10 분 13000 x g에서 centrifuge 고 단백질 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 되 고 상쾌한 가만히 따르다. 단백질을 분해 하는 PBS의 100 μ를 추가 합니다.
- 각 잘 10 %SDS-PAGE 젤에 단백질의 10 μ g를 로드 합니다. 1.7-1.9에 설명 된 대로 전기 이동 법을 수행 합니다. 서쪽 오 점 이전 이전 refeference 43에 설명 된 대로 수행 합니다.
- ~ 40 kDa의 MW에 해당 하는 마커를 최고의 사다리를 식별 합니다. 막이이 표식에 반으로 잘라. 프로브 Lamin A/C-특정 항 체와 높은 MW 단백질을 포함 하는 오 점. 랩 7 특정 항 체와 낮은 MW 단백질 막 프로브. 서쪽 오 점 잘 알려진 기술 이며이 프로토콜에서 설명 하지 않은.
4. 애완 동물의 종양을 대상으로 평가 이미징
참고: 생성할 heterotopic xenografts 쥐에 종양 세포를 이식 하는 기술을 잘 알려져 있으며 대부분 실험실 그들의 종양 시스템에 맞게 자체 프로토콜을가지고. 따라서,이 프로토콜에 적용 되지 않습니다. 이 종이 식 모델 nonobese 당뇨병/심한 결합 된 immunodeficient (끄 덕 임/SCID) 마우스 IL 5Rα 양성 침 윤 성 방광 종양 HT-1376 및 HT-B9 베어링 있을 것 이다. IL 5Rα 양성 침 윤 성 방광 종양 세포는이 종이 식에 총 셀의 > 66% 구성. 반면, IL 5Rα 양성 HT-B9 셀의 ~ 11%만 개발된 xenografts41에 포함 했다. 따라서이 모델 AC 예측 가능한 환자 종양이 나타내는 두 종양에서 종양 대상 평가 대 한 훌륭한 예를 제공 합니다.
- ≥를 포함 하는 그룹 4 (끄 덕 임/SCID) 쥐 꼬리 정 맥에 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS, 및 64Cu-A14의 20-30 μ g (6-9 MBq)을 주사.
- 같은 날 64초당 방사성 조사 조직 (%ID/g)의 그램 당 주입된 량으로 변환 하는 Cu의 5 MBq 포함 된 원통형 팬텀 (24.8 mL)를 배치 합니다.
- 48 h 고 1.5 L/min 2 %isoflurane 산소 흐름의 유도 챔버에 배치 하 여 마우스를 anesthetize. 유도 후 및 애완 동물 스캐너에 배치 하기 전에 마우스 눈에 메 마른 눈 연 고를 적용 합니다.
- 빠르게 isoflurane에 대 한 코 콘 headfirst 경향이 위치에 애완 동물 스캐너 테이블에 마우스를 전송. 위치는 호흡 및 직장 프로브 및 생리 적 상태는 이전 실험 기간 동안 유지 되도록 모니터 온도 호흡 속도 44를설명 합니다.
- 정기적인 샘플링 모드 설정 및 250-650 keV의 에너지 윈도우를 사용 하 여 애완 동물 데이터 수집을 시작 합니다. 일반적으로, 마우스 당 45 분 정적 스캔 재건 및 고품질 애완 동물 이미지의 생산을 위한 충분 한 일치 하는 이벤트를 제공 해도 됩니다.
- 64Cu-AC 스캔 후 스캐너에서 마우스를 제거 하 고 다시 감 금 소에. 마우스 충분히 동물 시설에 반환 하기 전에 복구를 허용 합니다.
- 3 차원 최대 가능성 기대 최대화 알고리즘의 20 번을 사용 하 여 복원된 이미지를 얻을.
-
종양 및 아 미드 소프트웨어를 사용 하 여 시각적으로 평가할 수 있는 장기의 관심 (ROI) 분석의 영역을 수행 합니다.
- 수동으로 3D 자유형 도구 설정을 사용 하 여 양적 %ID/g 데이터를 얻기 위해 ROIs 그리고 신중 하 게 종양 또는 인접 한 허벅지 근육을 나타냅니다. 투자 수익에서 픽셀 당 계산 이전 단계 4.2에서에서 %ID/g으로 변환 됩니다.
- 종양, 그리고 정량적 투자 수익 %ID / g, 명암과 종양-배경 비율에 대 한 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS 이미지를 비교 합니다.
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Representative Results
절차 1, 7G 3의 건설 한 crosslinker는 매우 안정적인 sulfo SMCC를 사용 하 여 ChAcNLS로 수정. 일반적으로, 12% 젤에 로드 하 고 의해 SDS 페이지 분석,이 결과 구별할 수 stepwise MW sulfo SMCC-7G 3 비율 증가에 비례 증가에 사용 및 개별적으로 ChAcNLS에 대 한 평가를 무 겁 고 가벼운 사슬에 대 한 허용 활용 (그림 3)입니다. 7 G 3는 10, 20, 25, 그리고 50 대 1 sulfo SMCC-7G 3 비율 Rf 측정, 3, 7, 10, MW 추정 결과 및 7G 3 당 20 ChAcNLS 분자에 반응. 의해 densitometry, 백분율 단위체 종 7G 3 3-10 ChAcNLS 수정 > 90%입니다. 7 G 3-ChAcNLS20 에 대 한 집계 종 45%입니다. 이 SDS 페이지는 아직 7 G 3-ChAcNLS를 선택 하기 위한 효과적인 켤레 추가 개발을 위한 간단한 방법을 보여 줍니다. 하지만, 항 체 glycosylation 인해 발생할 수 있습니다 항 체 사슬으로 약간의 번짐이 집계 종의 식별 하는 방해 하지 않습니다.
절차 2 대표적인 데이터 사용 하 여 트립 신 아무 trypsin 세포내 효율 축적에 대 한 펩 티 드 수정 ACs 바이러스 파생을 평가할 때의 차이점을 보여 줍니다. 이 예제에서는 세포내 축적을 증가 7 G 3-ChAcNLS 수 셀 trypsin (그림 4) 없이 치료에 평가할 수 있습니다. 그러나, AC 효율 및 선택도 결정 하는 비교에 사용 된 어원이 같은 말의 축적을 해석할 때 trypsinization의 중요성은 분명 하다. Trypsinization은 기준선 세포내 형광 수준 수정 되지 않은 7G 3 관찰로 설치 될 수 있습니다. 하나는 7G 3 작은 foci에서 세포질으로 제한 됩니다 자세히 수 있습니다. 반면, 셀 하지 trypsinized, 7 G 3 전용 형광 세포 표면에 IL 3Rα의 overexpression 인해 세포 표면으로 제한 됩니다. 이것은 세포 표면에 형광 고 따라서 시각화 되 고 있는에서 세포내 형광을 차단 하기 때문에 세포내 축적 및 유통 조사를 어려운 있습니다. IgG ChAcNLS와 증거로 특이성을 평가할 때에 trypsinizing 셀도 중요 하다. 우리는 거기 셀 표면에서 몇 가지 일반적인 형광 하지만 펩 티 드에 의해 발생 하는 경우 셀 trypsinized 하지은 세포내 축적의 레벨을 없을 것 이라고 볼 수 있습니다. 마지막으로, trypsinization 없이 한 수 잘못 해석 새로 개발된 된 AC 대상 셀 안에 축적 되지 않습니다. 7 G 3 NLS, 볼 수 있듯이 있지 않은 셀 trypsinized 형광의 대부분은 다시 세포 표면에서. Trypsinization, 후 한 관찰할 수 있다, 7 G 3 NLS 축적지 않습니다 제한 대상 셀 안에 이기는 하지만.
절차 3, 대표적인 데이터에서는 건설, 선호도, 그리고 생체 외에서 페이로드 배달 효율성에 대 한 품질 관리 및 방사성 64Cu A14-ChAcNLS와에 대 한 특이성을 보여 줍니다. Densitometry 12 %polyacrylamide 젤 포함 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS에서 촬영 한 방사선 이미지에 수행 하거나 64Cu-A14-ChAcNLS 방사선된 어원이 같은 말에는 100% 단위체 종 (그림 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS nanomolar IL 5Rα에 대 한 선호도를 보여줍니다. A14-ChAcNLS 64Cu-A14-ChAcNLS의 농도 증가의 기능으로 HT-1376에 HT-B9 셀 (그림 5B) 3-5 nM의 농도에서 특정 바인딩 접근 채도를 공개 했다. HT-1376에 HT-B9 셀 64Cu-A14-ChAcNLS에 대 한 Kd 6.4 ± 1.7 nM 및 3.1 ± 0.8 nM, 각각 이었다. ChAcNLS 활용 IL 5Rα HT-1376 및 HT-B9 셀에 대 한 A14 약 2.5-fold의 선호도 감소. 감마 방사능 핵 및 세포질의 증가 64Cu-A14-ChAcNLS에 의해 전달 밝혀 세 특정 이며 (그림 6) 시간이 지남에 따라 증가 합니다. 감마 계산 일반적으로 대략 보여 줍니다 > 셀에 핵 및 세포내 축적에 6-fold 증가 64Cu-A14-ChAcNLS 초과 존재 64Cu-A14-ChAcNLS 치료에 비해 치료 수정 되지 않은 A14 또는 때 치료 연구 4 ° C (그림 6A)에서 수행 됩니다. 또한는 ≥ 핵 3-fold 증가 이며 64Cu 64Cu-A14와 64Cu IgG ChAcNLS 모든 시간 지점에서 취급 하는 셀에 상대적의 세포내 축적 (그림 6B) 테스트.
그림 7 에서는 세포 분별 법 프로토콜의 중요성을 보여 줍니다. HT-1376 및 HT-B9 셀 1%, 2% 또는 4%를 포함 하는 원형질 막 세포의 용 해 버퍼와 incubated 했다 NP-40. 고립 된 핵 독점적으로 포함 해야 합니다 Lamin a/C. 따라 세포질 분수 Rab7에 대 한 배타적 이어야 한다. 컨트롤, 전체 셀 RIPA 버퍼 lysed 두 분수에 Lamin a/C에 대 한 긍정적인 되어야 합니다. 이 프로토콜 평가할 때 lysed HT-1376 셀의 핵 분수, 거기 아무 Rab7 존재는 보여 줍니다. 또한, 아무 Lamin 에어콘 세포질 부분에 존재입니다. 그러나, 4%로 lysed 세포에서 촬영 하는 세포질에서 Rab7의 감소 금액 있다 NP-40 (그림 7A). 이 대부분 4 %NP-40 세포의 용 해 버퍼 원형질 막 이외에 핵 막 방해는 나왔다. 이 세포질 단백질 핵 단백질의 혼합 귀착되 고 이렇게 랩 7의 농도 dilutes. 이 랩 7 존재의 감소 금액을 설명합니다. HT-B9 셀 HT-1376 셀 보다 훨씬 더 민감합니다. 원형질 막 세포의 용 해 버퍼로 치료 하면 4% 포함 된 NP-40, Lamin 에어콘 명확 하 게 볼 수 있다 세포질 분수 (그림 7B). 핵 분수에서 Lamin a/C 양을 해당 감소가입니다. HT-B9 셀은 또한 2 %NP-40 세포의 용 해 버퍼에서 중요 한 Rab7의 세포질 부분에는 눈에 띄게 줄어 1% 기준으로 NP-40. 따라서, 한 핵 및 세포내 공간에서 페이로드 축적의 양적 결과 정확한 관심의 특정 세포와 세포 분별을 최적화 해야 합니다. 이것이 소설 AC의 핵 지 방화의 효율성을 평가 하기 위한 중요 합니다.
프로시저 4, 애완 동물 영상 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, 또는 64Cu-A14-ChAcNLS 베어링 HT-1376 및 HT-B9 heterotopic xenografts 반대 뒷 다리에 쥐에서의 48 h 후 주사 종양의 시각화에 대 한 허용 타겟팅 속성 (그림 8). 우리의 예 애완 동물 이미지의 시각적 검사 HT-1376 및 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14, 및 64Cu-A14-NLS (그림 8A)의 HT-B9 종양 대상 기능을 보여준다. 그러나, 검사 HT-B9 종양으로 어려운 경우에 ROI 분석 종양 근육 비율 (그림 8B)를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
그림 1: ChAcNLS 수정 mAbs. NLS 잔류물 SV 40 큰 T 항 원 (KKKRKV)에서 N 맨끝 시스테인에 의해 덮인 스페이서 잔류물 사이 끼워 넣으면 됩니다. Cholic acid (녹색 브라켓)는 앞에서 설명한 34로 시스테인을 결합 이다. 건설 및 ChAcNLS의 정화, 후 시스테인 sulfhydryl 그룹 sulfo SMCC 통해 활용 사용 됩니다 (빨간색 대괄호는 mAb에 연결 된 이미 표시). 참고: mAb (150 kDa) 및 ChAcNLS (1.8 kDa)는 확장할 수 없습니다. 적응 하 고 Paquette에서 허가로 증 쇄, M. 그 외 여러분 NLS-cholic acid 활용 IL 5Rαspecific 항 체를 세포 축적 및 방광 암 모델에서 vivo에서 종양을 대상으로 속성을 향상 시킵니다. Bioconjugate 화학. doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077입니다. (2018)입니다.
-
그림 2: AC 셀 치료 접근 및 Confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 및 세포 분별 법 품질의 분석에 대 한 후속 처리의 도식. 빨간색 화살표는 2.2, 2.3, 3.15, 및 3.15.4 필수 단계에 해당합니다. 적응 하 고 함께 재발급 권한 Beaudoin, S. 그 외 여러분 ChAcNLS, 항 체 어원이 같은 말 허용 대상 셀 특정 Endosomal 탈출 소설 수정, 지역화에서 핵, 및 향상 된 총 세포내 축적. 분자 조제 학. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
그림 3: ChAcNLS 수정 mAbs의 분석. 감소 SDS-페이지 표시 실행 사다리 (L)와 해당 분자 무게 kilodalton (kDa)에 수정 되지 않은 7G 3 참조로 무 겁 고 가벼운 사슬. 다음 차선은 7G 3와 3, 7, 10, 20 ChAcNLS 수정에서 무 겁 고 가벼운 체인의 마이그레이션 밴드.
그림 4: mAb 세포내 분포의 분석 및 축적. 세포내 7G 3을 설명 하는 confocal 현미경 이미지 배포 및 7G 3 치료 IL 3Rα 양성 백혈병 세포에 상대 형광 축적 7 G 3-ChAcNLS, IgG 및 IgG-ChAcNLS. 셀 trypsinized 또는 고정 이전 하지 trypsinized. 핵은 propidium 요오드 화물 (PI; 레드)와 스테인드 안티 murine Fc AF647 염료 (mAb; 녹색), 및 PI/mAb 병합. 50 μ m입니다. 내에 트립 신, 트립 신 그룹이 없는 이미지 표시 다른 ACs 사이 동일한 악기 설정으로 인수 했다. 그림 4의 트립 신 부분 허가 refefence 34 에서 적응 이다. 적응 하 고 Beaudoin에서 허가로 증 쇄, S. 외. ChAcNLS, 항 체-어원이 같은 말 허용 소설 수정 대상 셀 특정 Endosomal 탈출, 핵, 그리고 향상 된 총 세포내 축적에 지역화. 분자 조제 학. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
그림 5: 64Cu-A14-ChAcNLS 순수성 및 선호도. (A) 64Cu 표시 A14, A14-NLS의 방사선 화학 순수성 A14-ChAcNLS SDS 페이지 다음 autoradiography에 의해 확인 되었다. (B) 특정 바인딩 곡선 64Cu-A14와 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 및 HT-B9 셀에 대 한. 오차 막대는 복제에서 수행 하는 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 적응 하 고 Paquette에서 허가로 증 쇄 M. 외. NLS cholic acid 활용 IL 5Rα 특정 항 체를 세포 축적 및 방광 암 모델에서 vivo에서 종양을 대상으로 속성을 향상 시킵니다. Bioconjugate 화학. doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077입니다. (2018)입니다.
그림 6: 64Cu 핵 및 세포내 축적. 세포 치료의 대표적인 예는 3 중에서 수행 (오차 막대를 나타내는 표준 편차) (A) 특이성 및 64Cu-A14-ChAcNLS의 (B) 축적 향상. % 누적 핵 (왼쪽된 패널)에 세포내 공간 (오른쪽 패널) 방사능 IL 5Rα 양성 침 윤 성 방광 암 세포의 치료 동안에 사용의 총 금액을 기준으로 제공 됩니다. 오차 막대는 복제에서 수행 하는 실험의 표준 편차를 나타냅니다. * p 0.05를 나타냅니다.
그림 7: 세포 분별 법 절차의 분석. Lamin a/C (최고 오 점, 빨간 화살표) 및 랩 7 (하단도 말, 검은 화살표) HT-1376, 1%, 2%, 또는 4를 포함 하는 원형질 막 세포의 용 해 버퍼에 HT-B9 셀의 치료에서 얻은 핵 (A)와 (B) Cytoplasmic 분수의 서쪽 오 점 %NP-40입니다. RIPA 버퍼 lysed 전체 셀 두 분수 Lamin a/C 및 Rab7에 대 한 긍정적인 제어로 사용 되었다. 실행 기준 (L)만 최고도 말에서 묘사 된다. 3 화살표의 여러 개의 isoforms 인해 Lamin a/C에 대 한 표시 됩니다. Paquette, M. 그 외 여러분 의 적응과 함께 재발급 허가 NLS cholic acid 활용 IL 5Rα 특정 항 체를 세포 축적 및 방광 암 모델에서 vivo에서 종양을 대상으로 속성을 향상 시킵니다. Bioconjugate 화학. doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077입니다. (2018)입니다.
그림 8: Vivo에서 분석 종양 애완 동물 화상 진 찰 및 ROI 분석에 의해 타겟팅. (A) 애완 동물 이미지 끄 덕/SCID 쥐 베어링 HT-1376 (빨간색 화살표) 및 정 맥 주사 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, 및 64Cu-A14-ChAcNLS HT-B9 (파란색 화살표) 종양의 48 h 후 주사. 녹색 화살표는 간 통풍 관. 근육 아 도면 마젠타 동그라미로 표시입니다. (B) ROI HT-1376 및 HT-B9 종양 근육의 48 h 후 사출에 ACs의 비율. 오차 막대는 실험의 표준 편차를 나타내는 n = 10 ROIs 마우스 당 (n = 5). * p 0.05를 나타냅니다.
| 문신 |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Cholic acid CGYGPKKKRKVGG 34 |
표 1: 문신과 SV 40 큰 T 항 원 파생 된 펩 티 드 AC 수정에 사용의 목록입니다.
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Discussion
항 암 제의 조직 배달의 주요 목표는 종양 사이트 및 통풍 관 암 세포 내에 축적을 증가 하 고 건강 한 조직에 원치 않는 부작용을 감소를. 종양 세포에 분자 페이로드 AC 타겟 배달 치료 종양을 검출 하는 매우 유망한 접근 이다. 그러나, 효 험의 부족 endosome 함정으로 인 한 고 스트림 lysosomal 저하 아래로 남아 중요 한 도전. 이 프로토콜 ChAcNLS 펩 티 드를 활용 하 여 차세대 ACs의 건설에 대 한 예를 들어, 설명된 절차는 세포내 전달된 페이로드의 양을 증가 하는 것을 목적으로 개발 되 고 하는 펩 티 드 수정 AC에 에 암 세포를 대상으로.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는: 1) 식별 하 고 높은 MW 제한 집계 종; 세포내 축적;를 결정 하기 위한 분석 전에 세포의 trypsinization 2) 3) 세포질 분별 법 절차;의 품질 보증 수행 그리고 4) 이미징 종양 vivo에서타겟팅을 평가 하는 애완 동물을 수행.
그것은 중요 한 mAbs 바이러스 파생 된 펩 티 드의 활용 mAbs 사이 intramolecular 가교에 의해 발생 가능성이 가장 높은 MW 집계 종 귀착되 지 않는다. 이 초기 관심사 이며 더 진행 하기 전에 처리 되어야 합니다. 원치 않는 집계를 포함 하는 펩타이드 수정 acs 전진 세포내 그리고 vivo에서 페이로드 배달 프로필 같은 측면에 거짓 증거를 제공 하는 결과 줄 수 있습니다. 반응 maleimides mAbs에 대부분 공유 집계에 대 한 책임입니다. 하나의 솔루션 sulfo SMCC mAb 비율을 줄이는 것입니다. 또 다른 대안은 Cys, 리스, 같은 아미노산의 N-아 세 틸 유도체를 사용 하는, Ser, 자신과 세 maleimide 활성화 mAb 45펩 티 드 활용 중. 및 측면 체인 SMCC의 maleimide moiety 반응 및 내 항 체 가교를 줄일 수 있습니다. 또는, 활용 후 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리 단위체 종 45격리를 사용할 수 있습니다. 펩 티 드 항 체에의 사이트 활용 또한 수행할 수 있습니다. 예를 들어 항 체 탄수화물 단위체 종 24를 효율적으로 생산을 보여줘 펩 티 드에 활용에 대 한 수정할 수 있습니다.
SDS 페이지 12 %polyacrylamide 젤과 AC 종에 있는 큰 크기 다름의 광범위 한 관점을 얻기 위해 저렴 하 고 효과적인 방법입니다. %Polyacrylamide 증가 사용 하는 경우 무거운 체인 및 intramolecular 종 분리 구별 하기 어려울 것 이다입니다. 반대로, 감소 %polyacrylamide, 사용 하는 경우 경 쇄는 젤에서 실행 가능성이 높습니다. 4-20 %polyacrylamide 또한 포함 된 그라데이션 젤 좋은 보존 한 젤에 무 겁 고 가벼운 사슬에 대 한 이동 제공 합니다. 다양 한 분석 기법 바이오 분석에 사용할 수 있는, 중 고성능 액체 착 색 인쇄기 및 모 세관 전기 이동 법-SDS SDS 페이지 분리 및 ACs 46의 특성화에 대 한 보다 우량 하다. 그럼에도 불구 하 고, SDS-페이지는 이러한 새로운 에이전트의 초기 건설을 분석 하 고 다음 행동의 다음 과정에 결정 하는 초기 고 저렴 한 방법입니다.
향상 된 시각화 및 세포내 축적 사이에서 상대적인 증가에 허용 하기 때문에 세포 표면 단백질 및 바인딩된 ACs의 최대 수를 제거 하는 솔루션 0.25 %trypsin (2.3 단계)를 포함 하는 셀의 부 화는 중요 하다. 항 체를 참조 합니다. 카메라 매개 변수는 최대 형광 강도에서 이미지를 캡처 설정 됩니다. 이것은 변형 때문에 셀에서 AC는 누적 된 금액입니다. 따라서, 최대 강도에서 이미지를 캡처 수 있습니다 적은 AC 누적 된 셀에 대 한 평가 또한. 그러나, 암 항 종양 세포에 높은 표현 일반적으로 됩니다. 셀은 트립 신에 의해 소화 대상이 되지, 하는 경우 세포 표면에 ACs에서 나오는 형광 이미지를 지배 하 고 있는 것 이라고. 또한, trypsinization 없이 개발은 미묘 하지만 중요 한 세포내 축적 속성으로 ACs와 제한 될 수 있습니다.
보장 고품질 세포 분별 법은 세포질과 핵에 64Cu의 축적을 정확 하 게 평가 하는 것이 중요. AC 및 페이로드 세포내 축적을 증가 하는 ChAcNLS의 능력은 핵 34활성 지역화 때문입니다. 향후 바이러스-펩 티 드 개발 되, 이러한 펩 티이 드 수 있습니다 또한 세포내 페이로드 효율성을 증가 하는 그들의 메커니즘의 일환으로 핵을 지역화 됩니다. 따라서, 그 세포 분류를 정확 하 게이 과정을 자세히 높은 품질의 중요 하다. 이 프로토콜은 세포질 표식에 대 한 핵 및 세포질 분수 핵 표식에 대 한 평가의 중요성을 강조 한다. 후 외., AC를 개발 하는 예를 들어 문신 펩 티 드를 사용 하 여 수정 하 고 방사성 페이로드 24의 핵 축적을 탐험. 서쪽 오 점 분석 calpain, 풍부한 세포질 단백질에 대 한 핵 분수에 존재 했다. 이것은 상업적인 핵 격리 키트 사용 되었다 때문에 가능성이 높습니다. 이 프로토콜의 HT-1376 및 HT-B9 그대로 멤브레인과 농축된 핵을 분리 하기 위하여 NP-40의 필요한 다양 한 농도 세포를 설명 했다. HT-B9 셀 버퍼 lysed 했다 4% 포함 된 NP-40, Lamin 에어콘 했다 세포질 분수 나타내는 취급과 교란 핵 막 세포질 입력 Lamin a/C에 대 한 허용에. 핵과 세포질 분수 없는 경우 격리 된 신중 하 게, 그것 총 세포 축적에 핵 지 방화의 기여를 식별 하기 어려운 수 있습니다. 생물-고 인위적으로 파생 펩 티 드의 바인딩과 그물, Golgi 기구 및 미토 콘 드리 아 47,,4849등 다른 세포내 구획을 대상으로 구체적으로 보고 있다. 따라서, 세포내 구획의 절연은 점점 관련 되 고 있다.
이 프로토콜 64Cu-A14-ChAcNLS HT-1376 및 HT-B9 종양의 타겟팅의 설명으로 완료 한다. 그림 8에서 애완 동물 이미지의 시각적 검사에서 그것은 분명 증가 의해 종양 애완 동물 HT-1376와 HT-B9 종양 (그림 8A의 탁월한 타겟팅은 배경 64Cu-A14-ChAcNLS를 둘러싼 인접 감소 기준 신호 ). ROI 분석은 또한 종양을 대상으로 평가 하는 기능을 보여 줍니다. 우리의 예제에서 우리는 종양을 대상으로 계량 및 64Cu-A14-ChAcNLS를 보여주는 우수한 AC (그림 8B) ROI 종양 근육 비율을 사용 합니다. 애완 동물 화상 진 찰은 또한 AC 건강 기관에서 격리의 평가 대 한 수 있습니다. 간은 항 체를 대사 주요 기관 이다. 그림 8A 간 통풍 관은 64Cu-A14-ChAcNLS와 64Cu-A14 주입 하는 쥐에 비교 하는 방법을 보여 줍니다. 이 초기 개발 단계에서이 데이터 ChAcNLS 원치 않는 봉쇄의 원인이 되지 않습니다 제안 합니다. 64 Cu 있다 12.7 h의 반감기는 몇 일의 반감기를가지고 있는 ACs에 이상적입니다. 이전에 설명 된 대로 시각적 프로토콜 Zeglis와 루이스에 의해, 수명이 긴 동위 지르코늄-89 (89Zr)를 사용 하 여 그 물리적 반감기 mAbs에 이상적 이며, 애완 동물 50여 군데 수 페이로드입니다. 따라서, 몇 일 동안 종양 배달 평가, 89Zr 선호 하는 선택 이다. 이 치료는 높은 종양 이해에 유리한 하 고 항 체 7시간이 지남에 증가 목표 하는 경우에 특히 중요 하다. Biodistribution 또한 추가 찾아보기를 대상으로 개별 기관 이해를 확인 하기 위해 수행 해야 또는 ACs 개발의 속성을 새로 격리. 또한, 마우스 블록 대상 특이성 평가를 종양 세포에 수용 체 사이트에 수정 되지 않은 특정 항 체를 predosed 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 애완 동물 화상 진 찰 및 ROI 분석 64Cu 충분히 제공 종양의 초기 평가이 프로토콜 개발된 ACs의 배달 속성.
지금까지 바이러스 파생 된 펩 티 드로 ACs radioisotopes 배달 제한 되었습니다. 이것은 역사적인 이유 때문에 부분적으로 또한 radioisotopes 체 외에서 그리고 vivo에서 테스트, 중 계량 쉽게 및 비 침 투 전신 이미징 modalities를 사용 하 여 구상 될 수 있다 때문에. 당연히, 수송 및 페이로드 radioisotopes, chemotherapeutics, 효소, oligonucleotides, 등 외의 전달이이 필드 확장이 프로토콜에서 설명 하는 기술에 대 한 수정 개발 해야 합니다. 예를 들어 대체 페이로드의 세포내 축적을 평가 하기 위한 새로운 방법을 개발 해야 합니다. 또한, vivo에서 평가 대 한 수정 벌 이러한 페이로드를 쉽게 이미지로 수 없습니다 및 따라서 그것 biodistribution, 특이성, 그리고 종양 통풍 효율을 평가 하기 어려운 것으로 필요한 것입니다. 이러한 이유로, 방사성 핵 종 페이로드 미래 개발 대체 화물을 위한 대리 페이로드로 있어야 합니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품은 암 연구 협회 (캐나다)와 CIMS에 의해 투자 되었다. 저자 박사 Samia Ait-Mohand 및 장-프랑소와 Beaudoin 도움 감사합니다. 박사 천사 로페즈 (사우스오스트레일리아 대학교) mAb A14에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
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