Summary
בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.
Introduction
מחלת האלצהיימר היא הפרעה ניוונית של מערכת העצבים כי תופעות למעלה מ -35 מיליון בני אדם ברחבי העולם. 1 מעורב מאוד ב שתחילתה והתפתחותה של המחלה, היא בטא עמילואיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד פפטיד (Aβ). 2 Aβ נע בין 36 כדי 43 חומצות אמינו אורך, עם זאת, הוא חשב כי גרסת חומצה 42-אמינו, עמילואיד בטא 42 (Aβ42), הוא הצורה הרעילה ביותר של החלבון. 3 זה נובע לרוב ליכולת של Aβ42 להיווצר קושי diffusible, מינים oligomeric כי הם האמינו להיות ישויות הנוירו במיוחד. 4 על מנת לקדם את ההבנה שלנו של הפפטיד Aβ, זה הכרחי כדי להשיג חומר טוהר גבוה באופן שיגרתי. הנוכחות של זיהומי עקבות הוכחה לשנות את מאפייני נטיית צבירה דראמטי של הפפטיד. 5
Traditionally, כרומטוגרפיה הנוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) הפרדת פפטידים הידרופובי כגון Aβ נעשתה באמצעות שילוב של C 4 או C 8 שלבים נייחים מבוסס סיליקה לבין שלב נייד חומצי. 6 עם זאת, בתנאים כאלה יכולים להוות אתגר הטיהור של הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד Aβ (PI כ 5.5) 7 כלומר בתנאים חומציים, צבירת פפטיד הוא גדל וכתוצאה מכך רחבות, שאינו נפתרו פסגות HPLC כי הם לעתים קרובות קשים לבודד מיוצרים (איור 2 א). יתר על כן, פסגות רחבה כל כך בדרך כלל מכילות זיהומים היכולים להשפיע על פרופיל אגרגציה של הפפטיד, ובדרך כלל דורשים סיבובים הבאים של טיהור אשר יכול באופן דרמטי להשפיע על כמות פפטיד המיוצר.
פולי (סטירן / divinylbenzene) בשלב נייח, PLRP-S, מייצג אמצעים חלופיים תחנותפפטידים הידרופובי יינג. השלב נייח הועסק בתחום הטיהור של מספר חלבונים שונים וחומצות ריבונוקלאית שליח (mRNA). 8, 9 השלב נייח-S PLRP לא דורש ליגנד אלקיל נוספות עבור הפרדת פאזות הפוכה, ויותר מכך הוא יציב מבחינה כימית ב- pH גבוה אשר מוביל deaggregation של הפפטיד. 7 בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 פפטידים (Aβ40).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparative טיהור HPLC של Aβ40 או פפטיד Aβ42
- הכן את החוצצים הבאים לטיהור HPLC.
- הכן חיץ (20 מ"מ NH 4 OH) על ידי הוספת 1.3 מ"ל של NH 4 OH (פתרון 28%) 1,000 מ"ל מים ultrapure.
- הכן חיץ B (אצטוניטריל 80% עם 20 מ"מ NH 4 OH) על ידי הוספת 1.3 מ"ל של NH 4 OH (פתרון 28%) לפתרון של 800 מ"ל של אצטוניטריל HPLC כיתה ו -200 מ"ל מים ultrapure.
- הכן חיץ פירוק מדגם (0.1% NH 4 OH) על ידי הוספת 100 μL של NH 4 OH (פתרון 28%) ל -100 מ"ל של מים ultrapure.
- הגדרת מכשיר HPLC כפי שמוצג באיור 1.
- התאימו את בקבוקי ממס המכילים חיץ A ו- B חיץ אל פתחי הכניסה של המשאבה HPLC באמצעות צינורות פולימר. צרף צינורות הפולימר למשאבת HPLC עם הולם מקשה אחת. ודא כי צינורות פולימר שלחיץ כל מצויד שסתום היניקה של המכשיר נכה. התאימו את המשאבה HPLC עם מסלק גזים.
- זוג המשאבה HPLC כשהמפרצון הטור preparative 300 8 מיקרומטר 25 מ"מ х 300 מ"מ (איור 1 ב ', כה בעמודה השמאלית, ראה רשימת חומרים) באמצעות צינורות פולימר.
- צרף צינורות הפולימר לעמודת preparative עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. ודא כי בעמודת הפולימר היא מכוונת בצורה הנכונה.
הערה: השלב הנייח של טור preparative מורכבת פולי (סטירן divinylbenzene) חלקיקים. את הכיוון הנכון של טור הפולימר מסומן על המארז החיצוני עם חצים כיוונית יחידים.
- צרף צינורות הפולימר לעמודת preparative עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. ודא כי בעמודת הפולימר היא מכוונת בצורה הנכונה.
- חבר היציאה של העמודה לגלאי הגל הכפולים באמצעות צינורות פולימר מפעיל את גלאי גל 214 ננומטר ו -280 ננומטר.
- לשנות את אורך הגל על ידי שינוי הפרמטרים גל איתור באפשרות שיטת מכשיר ההתקנה שלהתוכנה המובנית HPLC.
- צרף צינורות הפולימר אל המפרצון של גלאי הגל עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. צרף צינורות פולימר אל שסתום הפלט של גלאי גל. צרף צינורות הפולימר שסתום היציאה של גלאי HPLC עם הולם מקשה אחת אצבע חזק. זה יהיה צינורות אוסף המדגם.
הערה: עדר כרומופור חזק על הפפטיד Aβ מכתיב כי 214 ננומטר לשמש סגול העיקרי (UV) גל לאיסוף שיא.
איור 1: התקנה ניסיונית של המכשיר HPLC המשמש לטיהור של פפטידים בטא עמילואיד. (א) משאבת HPLC הרביעון המצויד מסלק גזי גלאי גל משתנים מוגדרים 214 ננומטר ו -280 ננומטר; (ב) HPLC עמודות המשמשות לטיהור של פפטידים בטאו עמילואיד, ממשמאל לימין, 25 x 300 מ"מ 2 טור preparative, 7.5 x 300 מ"מ 2 טור preparative למחצה ו -4.6 x 250 מ"מ 2 טור אנליטי; (C) מזרק ידני עם 20 μL לולאת הזרקת נירוסטה המשמשת HPLC אנליטי; (ד) מזרק ידני עם 10 לולאת הזרקת חלד מיליליטר פלדה המשמשת לטיהור preparative preparative למחצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לתכנת את התוכנה HPLC להפעיל את שיטת טיהור כפי שמוצג בטבלה 1. הזן את שיטת טיהור על ידי שינוי פרמטר הזמנים ממס (באפשרות שיטת מכשיר ההתקנה מובנה בתוך התוכנה HPLC). הפעל את משאבת HPLC על ידי לחיצה על הכפתור "על" על תוכנת HPLC.
הערה: המשאבה תתחיל לספק יחס להתנעת חיץ חיץ B דרך ההכנהטור arative ואת מכשיר HPLC.- השארת המערכת במשך 30 דקות כדי לאזן באופן מלא.
| זמן / min | % של הצפה | % של ב B הצפת | ד קצב הזרימה / min מ"ל -1 |
| 0 | 80 | 20 | 6 |
| 45 | 75.5 | 24.5 | 6 |
| 45.01 | 80 | 20 | 6 |
| 52.01 | 80 | 20 | 6 |
| 52.02 | 73 | 27 | 6 |
| 85 | 73 | 27 | 6 |
| 92 | 5 | 95 ג | 6 |
<strong> טבלה 1: לוח זמנים עבור טיהור של פפטידים Aβ42 ו Aβ40 שימוש בעמודה פולימר מ"מ 25 × 300. חיץ A - H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH; ב 80% MeCN / 20% H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH; רן צלזיוס למשך 15 דקות לשטוף את העמודה לפני הזריקה הבאה של מדגם; ד כדי להפעיל בקצב זרימה של 6 מ"ל / דקה על המכשור HPLC, מגבלת הלחץ צריך להיות מופחת עד 200 בר.
- טיהור של מדגם הפפטיד Aβ
הערה: פפטיד הגולמי הושג באמצעות סינתזת פפטיד מוצק שלב אוטומטית. 10- ממיסים 3 מ"ג של הפפטיד Aβ גולמי 4 מ"ל של חיץ פירוק המדגם. Sonicate המדגם במשך 30-60 שניות בטמפרטורת החדר ואת בתדר של 40 kHz לסייע פירוק.
- להזריק את המדגם על הטור HPLC באמצעות מזרק פלסטיק 5 מ"ל מצויד 16-מדמחט נירוסטה. הפעל את שיטת טיהור כפי שמתואר-צעד משנה 1.3.
הערה: המערכת מאפשרת הזרקה מדגמת להיעשות באמצעות מזרק ידני מצויד עם לולאת הזרקת נירוסטה 10 מיליליטר (1D איור). הפפטיד Aβ הרצוי יהיה elute בין 72 ו -74 דקות בתור שיא נפתר חדה (איור 2 ג). - אסוף המדגם לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל. אשר את זהותו של שיא Aβ באמצעות ספקטרומטריית מסה הזרקה ישירה של eluent שנאספו. 11 אחסן את eluent עד 12 שעות ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: אחסון של הפתרון לפרקי זמן ארוכים יותר מ -12 שעות לא מומלץ בשל פוטנציאל החמצון של הפפטיד. - לבודד את הפפטיד מטוהרים על ידי פלאש הקפאת aliquot שנאספו / aliquots של הפפטיד Aβ בחנקן נוזלי Lyophilize. בצע lyophilization ידי ייבוש בהקפאה המדגם בטמפרטורה של C ° -60 וכן presבטוח של 20 mTorr לתקופה של 24 שעות.
- הפעל את פרוטוקול HPLC אנליטי כמפורט להלן כדי לקבוע את הטוהר של הפפטיד Aβ. פפטידים חנות בצורה lyophilized שלהם ב -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה של עד 6 חודשים.
2. ניתוח HPLC אנליטי של חלבון Aβ מטוהרים
- כן מאגרי HPLC כפי שמתואר בסעיף קטן 1.1. של הפרוטוקול הנ"ל.
- הגדר את HPLC אנליטי לפי צעד 1.2.1 וכפי מתואר באיור 1 עם טור אנליטית 4.6 × 250 מ"מ (איור 1 ב ', כה בעמודה ימנית) ואת המזרק הידני עם 20 μL לולאת הזרקת נירוסטה (תרשים 1C) מצויד כלי.
- לתכנת את תוכנת HPLC כדי להפעיל את השיטה האנליטית כפי שמוצג בטבלה 2 שלהלן הוראות דומות לאלו בשלב 1.3.
| זמן /דקות | % של הצפה | % של ב B הצפת | זרימת דקות דרג / מיליליטר -1 |
| 0 | 95 | 5 | 1 |
| 30 | 50 | 50 | 1 |
טבלה 2: לוח זמנים לניתוח טוהר HPLC של הפפטיד Aβ. חיץ A - H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH; ב 80% MeCN / 20% H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH.
- ניתוח טוהר הפפטיד Aβ
- הכן פתרון 1 מ"ג / מ"ל של הפפטיד מטוהרים באמצעות פירוק של הפפטיד בפתרון חיץ המדגם.
הערה: ניתן למצוא את מתכון החיץ בסעיף קטן 1.1. ריכוז החלבון נקבע על ידי מדידת ספיגת חלבון 280 ננומטר (א 280nm). 12 מ ' מקדם הכחדה olar (ε) המשמש לקביעת ריכוז הוא ε = 1,490 dm 3 mol -1 -1 ס"מ. 13 - להזריק 20 μL של 1 מ"ג / מ"ל (222 מיקרומטר) פתרון על הטור HPLC ולהפעיל את השיטה האנליטית כי היה ההתקנה בשלב 2.3.
הערה: הפתרון הנותר לא נעשה שימוש לצורך הניתוח אפשר להקפיא פלאש בחנקן נוזל lyophilized להתאושש הפפטיד Aβ. ניתן למצוא את פרטי Lyophilization בסעיף קטן 1.4.4. הפפטיד Aβ יהיה elute מהעמודה אנליטית בין 16 ו -18 דקות (איור 2 ד). השתמש בתוכנת ניתוח אינטגרציה מובנית המלווה את מכשיר HPLC כדי לקבוע את הטוהר של הפפטיד Aβ. טוהר נקבע על ידי שילוב כל פסגות הפרט על ספקטרום חישוב שטח אחוז פפטיד-שיא. בדרך כלל, טיהור של> 95% יש לוודא.
- הכן פתרון 1 מ"ג / מ"ל של הפפטיד מטוהרים באמצעות פירוק של הפפטיד בפתרון חיץ המדגם.
"איור 2" src = "/ files / ftp_upload / 55,482 / 55482fig2.jpg" />
איור 2: עקבות HPLC נציג של Aβ42. (א) מסורתית C 4 טיהור סיליקה, תנאים: חיץ: H 2 O עם 0.1% trifluoroacetic חומצה (TFA), מאגר B: MeCN (אצטוניטריל) עם 0.1% TFA, שיפוע: 20 עד 27% חיץ B למעלה מ -40 דקות לאחר מכן על ידי B 27% חיץ isocratic; (ב) טיהור preparative שימוש בעמודה פולימר 2 25 x 300 מ"מ, תנאים: הצפת: H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH, B חיץ: 80% MeCN / 20% H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH, שיפוע : 20 עד 27% חיץ B מעל 70 דקות ולאחריה B חיץ isocratic 27%; (C) אופטימלי טיהור preparative שימוש בעמודת פולימר 25 x 300 מ"מ 2, תנאים מתוארים בטבלת 1 ממוקמת בסעיף קטן 1.3 של טקסט תיאור פרוטוקול; (ד) HPLC אנליטי שימוש בעמודת פולימר 4.6 x 250 מ"מ 2, המנצחitions: הצפת: H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH, B חיץ: 80% MeCN / 20% H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH, שיפוע-5 עד 50% חיץ B למעלה מ -30 דקות. עבור חלקים A, B ו- C השיא המתאים Aβ42 מסומן בכוכבית. אוסף של שיא Aβ42 מסומן בחלק ג חושפת טוהרת> 95% כפי שמוצגת חלק ספקטרומטריית ד Mass שמש כדי לקבוע את זהותו של שיא Aβ42. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטיהור של הפפטיד Aβ42 באמצעות שילוב של השלב הנייח PLRP-S לבין תוצאות שלב ניידות גבוהה pH ביצירת פסגה חדה, נפתרה לייצור הפפטיד Aβ בכל זמן שמירה בין 72 ו -74 דקות (איור 2 ג). אישור של זהות שיא נעשה באמצעות ספקטרומטריית מסה הזרקה ישירה של eluent שנאספו. Eluent ניתן לאחסן ב -20 ° C בתמיסה עד 12 שעות. תקופות ארוכות יותר של אחסון עלולות לגרום חמצון של החלבון. כדי לבודד את הפפטיד המטוהר, את eluent הוא פלאש קפוא בחנקן נוזל lyophilized. HPLC אנליטי של הפפטיד המטוהר מגלה טוהר> 95% (איור 2 ד). ההליך אותו יכול לשמש כדי לטהר את הפפטיד Aβ40 (איור 3 א) ללא שינוי של השיטה. אנליטית HPLC מצביע על טוהר Aβ40 להיות יותר מ 95% (איור 3B). 
איור 3: עקבות HPLC נציג של Aβ40. (א) אופטימלי טיהור preparative שימוש בעמודת פולימר 25 x 300 מ"מ 2, תנאים מתוארים בטבלת 1 ממוקמת בסעיף קטן 1.3 של טקסט תיאור פרוטוקול. השיא המתאים Aβ40 מסומן בכוכבית. (ב) HPLC אנליטי שימוש בעמודה פולימר 4.6 x 250 מ"מ 2, תנאים: הצפת: H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH, B חיץ: 80% MeCN / 20% H 2 O עם 20 מ"מ NH 4 OH, שיפוע : B חיץ 5 עד 50% יותר מ -30 דקות. אוסף של שיא Aβ40 מסומן בחלק א 'מגלה טוהר> 95% כפי שמוצג חלק ספקטרומטריית ב Mass שמש כדי לקבוע את זהותו של שיא Aβ40. אנא לחץ אותהדואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
על מנת לאשר כי הפפטיד מטוהרים יכול ליצור תערובות oligomeric, ביצענו crosslinking-induced צילום של חלבונים ללא שינוי (PICUP) כפי שתואר לעיל 14, 15 ו הצליחו לצפות היווצרות oligomer וחסונה. 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיהור HPLC של הפפטיד Aβ תלויה מאוד על הבחירה של שני השלב הנייח המועסקים בתחום הטיהור בשלב הנייד נבחר כדי elute הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד ואת הנטייה גבוהה עבור צבירה לדקלם תנאי chromatographic מסורתיים להפרדת חלבונים הידרופובי (C4 או בשלב נייח C8 מצמיד עם eluent הנייד חומצי) מאתגר, עם הפפטיד Aβ משחרר כמו נקבה ממושכת, שאינו נפתר שיא (איור 2 א).
כדי לעקוף בעיה זו, בשלב נייח-S PLRP, יציבה מבחינה כימית ב- pH גבוה נמצא כיעיל עבור טיהור של הפפטיד Aβ (איור 2B ו 2C). שימוש שלב נייד pH הגבוה למזער את מידת ההצטברות, וכאשר אופטימיזציה, הוליד פסגה חדה, היטב נפתרה. בפרוטוקול אופטימיזציה, אחוז חיץ B היה במהירות switcהד מ -20% ל 27% בנקודת הזמן 52 דקות וכתוצאה מכך, הוליד לשיא Aβ מוגדר היטב (איור 2 ג). פרוטוקול אופטימיזציה זו נסמכת על כל הטומאות הידרופובי להיות eluted מהעמודה במהלך לעליה של 20 עד 24.5% הראשונית בריכוז B חיץ. אם זיהומים נמצאים שהן של הידרופוביות דומה לזו של הפפטיד Aβ, אז אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול HPLC עשויה להיות מוצדקת. השיטה אופטימיזציה היה מאוד לשחזור בין מנות אינדיבידואליות של Aβ מסונתז והיה מסוגל לטהר 40 ו -42 הן גרסאות של הפפטיד ללא שינויים בהליך אופטימיזציה (איור 3). עבור שני פפטידים, טוהר כפי שנקבע על ידי HPLC אנליטי נמצא להיות גדול מ -95%.
בהתחשב דיווחים על זיהומים עקבות לשנות את הנטייה אגרגציה של הפפטיד Aβ, רצוי כי אפיון biophysical מאונך להיות מועסק על מנת לאשרכי הפפטיד המטוהר הוא מסוגל לעבור oligomerization. שימוש שדווח בעבר פרוטוקולים בחרנו לבצע PICUP. 14, 15 ניתוח PICUP של חלבונים מטוהרים מדגים מונומר מאפיין באמצעות התפלגות האוכלוסייה hexamer לייצור הפפטיד Aβ40 ואת מונומר דרך הפצה heptamer הקשורים פפטיד Aβ42. תוצאות אלה 10 לאשר טיהור של פפטידים Aβ באמצעות בשלב נייח-S PLRP וכן תוצאות eluent הנייד גבוהה pH בחלבוני Aβ מסוגלים צבירה.
הליך הטיהור דיווח נועד להיות מסוגל לטהר עד 3 מ"ג של הפפטיד Aβ ב ריצת chromatographic יחידה. עבור הליך זה, חשוב להגדיר את קצב הזרימה של מכשיר HPLC 6 mL / min. אם ספיקות תחתונות של משאבת HPLC משמשות, בזמן ריצת HPLC צריך להיות מורחב להכיל את זה. המרהsely, שימוש ספיקות גבוהות יותר עשוי להצדיק הפחתה של זמן ריצת HPLC. עם זאת, הפחתה של זמן ריצה יכולה לגרום שיתוף elution של שיא Aβ עם פסגות אחרות, ולפיכך תקטין את הטוהר של הפפטיד Aβ שנאסף. יתר על כן, המכשור HPLC וגודל בעמודה chromatographic המשמש לטיהור יכול מאוד להשפיע על כמות החומר שניתן מטוהרים בטווח אחת. אם לא שיא מופק בזמן eluent הצפויה של הפפטיד Aβ, וכן שיא גדול מופק בזמן eluent המתאים לחזית ממס, אז יותר מדי חומר בתחילה נטען על הטור. הפחתת כמות החומר המוזרק על הטור HPLC עבור כל מחזור תעקוף את הבעיה הזו. לאחר הפפטיד Aβ טוהר, מומלץ מאוד כי הפתרון להיות lyophilized מהר ככל האפשר. אחסון ממושך של הפפטיד בתמיסה יכול להוביל לחמצון של Aβ ולכן היווצרות של זיהומים. יחידת השיטורrity של הפפטיד Aβ צריך להיקבע תמיד על ידי HPLC אנליטי. כמויות זעירות של זיהומים יכול לשנות את הנטייה אגרגציה של פפטיד דרמטי. אם עקבות HPLC אנליטי מראה נוכחות של זיהומים, אז המדגם צריך להיות מחדש נתון פרוטוקול טיהור HPLC וטוהר שלה מחדש נקבע על ידי HPLC אנליטי.
יש לקוות כי הליך לפי מידה זו לטיהור של פפטידים Aβ42 ו Aβ40 יהיה תועלת עבור הקהילה המדעית ולאפשר למשתמשים להשיג טוהר גבוה Aβ מסוגל היווצרות oligomer. זה יהיה צפוי כי הליך זה יכול להיות מותאם פפטידים amyloidogenic אחרים שקשה לבודד ולטהר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Agilent לקבלת הסיוע הטכני שלהם. קייט מרקהאם ורפאל פלומינו מזוכים לעזרה הראשונית שלהם בסינתזה וטיהור של הפפטיד Aβ וד"ר Hsiau-וויי לי הוא הודה על עזרתו בהכנת איור 1 של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
