Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In vivo avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences

Published: March 22, 2017 doi: 10.3791/55490
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Summary

Live sporing av individuelle WT netthinnens stamfedre i forskjellige genetiske bakgrunn åpner for vurdering av bidraget fra celle non-autonome signalering under nevrogenese. Her ble en kombinasjon av gen knockdown, kimær generasjon via embryotransplantasjon og in vivo time-lapse konfokalt avbildnings anvendes for dette formål.

Abstract

De genetiske og tekniske styrker har gjort sebrafisk virveldyr en viktig modellorganisme hvor konsekvensene av genet manipulasjoner kan spores in vivo gjennom raske utviklingsperioden. Flere fremgangsmåter kan studeres inkludert celleproliferasjon, genekspresjon, cellemigrering og morfogenese. Viktigere, kan dannelsen av kimærer gjennom transplantasjoner lett utføres, slik at mosaikk merking og sporing av individuelle celler under påvirkning av vertsmiljøet. For eksempel ved å kombinere funksjonelle genet manipulasjoner av verten embryo (f.eks, gjennom morfolino mikroinjeksjon) og levende avbildning, effektene av ytre, celle nonautonomous signaler (gitt av den genmodifiserte miljø) på enkelt transplanterte donorceller kan vurderes. Her viser vi hvordan denne tilnærmingen brukes til å sammenligne utbruddet av fluorescerende transgene uttrykk som en proxy for timingen av cellen skjebne determinasjon i forskjellige genetiske vertsmiljøer.

I denne artikkelen gir vi protokollen for microinjecting sebrafisk embryo for å markere donorceller og for å føre genet knockdown i verts embryo, en beskrivelse av transplantasjon teknikk som brukes til å generere kimære embryoer, og protokollen for å forberede og kjøre in vivo time-lapse konfokalmikroskoper avbildning av flere embryoer. Spesielt utføre Fler bildebehandling er avgjørende når man sammenligner tidspunkt for hendelser som utbruddet av genuttrykk. Dette krever innsamling av data fra flere kontroll og eksperimentelle embryoer behandles samtidig. En slik tilnærming kan lett utvides for studier av ytre påvirkninger i ethvert organ eller vev av valg tilgjengelig for å leve bildebehandling, forutsatt at transplantasjoner kan være målrettet lett i henhold til etablerte embryonale skjebne kart.

Introduction

Evnen til å visualisere viktige utviklingsprosesser i en in vivo virveldyr har bidratt til at sebrafisk en viktig modell for å studere normal og sykdomstilstander (anmeldt i 1, 2). Spesielt er det nevrale netthinnen en tilgjengelig del av det sentrale nervesystemet. Netthinnen gir seg enkelt utføre studier av nevrogenese på grunn av sin svært organisert, men likevel relativt enkel struktur, og sin svært konservert nevroner typer over arter virveldyr 3. Dynamics of cellular atferd som spredning, cellesyklus exit, asymmetrisk celledeling, skjebne spesifikasjon, differensiering, og nevrale kretser dannelse kan følges gjennom hele prosessen med retinogenesis, som er gjennomført i den sentrale netthinnen av sebrafisk med 3 d postfertilization ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Videre kan de funksjonelle kravene til forskjellige gener i alle de ovenfor nevnte trinn skal samtidig vurdert i sebrafisk hinnen, noe som gir en fordel fremfor andre virveldyr modeller hvori fenotyper som følge av anvendelsen av genet knockout teknikker kan bare bli vurdert ved obduksjon av fast vev. Spesielt er anvendelse av transgene linjer der vi kan visualisere og overvåke ekspresjon av fluorescerende proteiner som reporter-transgener i netthinnen, gjør det mulig å oppnå tidsoppløsning av genekspresjon som ligger under dannelsen av en bestemt neuronal celletype. På grunn av den raske utviklingen av sebrafisk, kan disse hendelsene visualiseres gjennom hele utviklingsperioden, og dermed gi dypere innsikt i det timelige betydningen av genuttrykk i forhold til nervecelle identitet oppkjøp og celle atferd.

Endelig kan disse metodene kan kombineres effektivt i sebrafisk med genereringen av kimæren via transplantasjoner, noe som resulterer i innsikt i to viktige aspekter av genfunksjon. For det første, å undersøke celler transplantert fra en donor embryo, i hvilken et bestemt gen er slått ned mens de utvikler i et umerket villtype miljø, gjør det mulig for oss å innhente relevant informasjon om genfunksjon i en celle-autonome måte. Dette fører til viktige innsikter om funksjonen til retinal skjebne bestemmende faktorer innenfor stamceller de er vanligvis uttrykt i. Dette er eksemplifisert ved undersøkelse av utviklings skjebne utfallet av stamfedre som ikke lenger kan generere funksjonell protein fra disse genene 4, 6, 8, 9. Utnytte denne tilnærmingen, har vi vist at mange skjebne bestemmende faktorer (for eksempel Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handle celle-autonomously å kjøre spesifikke retinal nevronale skjebner; mangel på genekspresjon fører først og fremst til en skjebne bryter, slik at cellene med genet knockdown være levedyktig ved å innta en alternativ celle skjebne 4, 6, 7, 10. For det andre kan slike kimære eksperimenter brukes til å vurdere hvordan villtype forfedre oppføre seg når de utvikler innen ulike genetiske miljøer. For eksempel, ved å sammenligne utviklingen av WT celler som vanligvis uttrykker et gen av interesse (og reporter transgenet) i et WT versus manipulert vert miljø (for eksempel genet knockout / knockdown), de resulterende virkninger på genekspresjon og celle skjebne kan vurderes . Mangelen på visse typer neuron i vertsmiljøet, for eksempel, har blitt vist å påvirke villtype progenitor oppførsel i en celle ikke-autonome måte, for å forspenne dem mot å differensiere til den underrepresented or mangler nevroner typer 4, 7, 11, 12. Gitt at netthinnens nerveceller er født i en fredet histogenic rekkefølge etter sekvensielt timet uttrykket av spesifikke nevronale skjebne determinant gener (skjebne genekspresjon) (anmeldt i 13), brukte vi disse metodene for å demonstrere hvordan timingen av skjebnen genuttrykk i villtype forfedre påvirkes når slike stamceller utvikler seg i netthinnens vertsmiljøer med induserte avvikende celle komposisjoner. Her skisserer vi disse tilnærmingene som bevis for hvordan kombinasjonen av relativt vanlige og brukte teknikker gjør det mulig for undersøkelse av timingen av skjebnen genuttrykk i utviklingen av netthinnens stamfedre 8, 9.

Denne protokollen beskriver en eksperimentell tilnærming som kombinerer time-lapse bildebehandling med den enkle performing transplantasjon i ex vivo utvikle sebrafisk embryo å følge individuelle mosaically merkede celler i hele perioden med utviklings retinogenesis. Ved å utføre funksjonelle genet manipulasjoner enten i verten embryo, giver embryo, begge eller ingen av delene, kan man vurdere celle autonomi av genfunksjon. Denne fremgangsmåten kan tilpasses vidt til tilsvarende problemstillinger i hvilket som helst annet system hvor de individuelle komponentene som er beskrevet her er egnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i henhold til bestemmelsene i Australian National Health and Medical Research Council anbefaling for omsorg og bruk av dyr, og ble godkjent av institusjonelle etikkomiteer.

1. Utarbeidelse av Sebrafisk

  1. Voksen fisk sammenkobling
    1. Sett opp voksen fisk som par (eller to par) i riktig størrelse avl tanks kvelden før bruk.
    2. For å holde den kvinnelige skilles fra den mannlige, bruk en skillelinje å aktivere fisk å se, men ikke røre hverandre.
    3. I morgen, etter å ha slått på lyset, fjerne skillevegger og la fisken til å pare seg uforstyrret.
    4. Etter vellykket parring legger voksen fisk tilbake til sine opprinnelige tanker.
      MERK: Host og giver stammer kan være det samme, for eksempel, noen villtype (WT) stammer. For denne studien donor embryoer avledet fra transgene linjer Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) ellerTg (vsx1: GFP), hvor ekspresjonen av skjebne determinant faktorene som driver tidlig eller sen neural skjebne kan visualiseres, henholdsvis 14, 15, 16. For å sammenligne effekten av ulike genetiske miljøer, kan verts embryoer være spesifikke mutanter eller morphants som beskrevet nedenfor.
  2. embryo samling
    1. Bruk en te sil for å samle inn egg fra avl boksen. Se etter egg hver 15 min for å bestemme tidspunktet for fødselen og sikre encellede stadium embryoer er samlet for etterfølgende trinn.
    2. Skyll embryoer med E3 medium (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2 og 2% metylenblått i destillert vann) og plassere dem i Petri-skåler som inneholdt ~ 40 ml E3 17 ved en maksimal densitet på 50 egg per 90 mm diameter petriskål.
    3. Merk petriskålene med belastningen navn, dato og klokkeslett forfødsel. Bruk en Pasteur overføringspipetten å fjerne eventuelle rester mens viser embryoene under dissekere mikroskop.
    4. Hold embryoene ved 28,5 ° C til ~ 3 h postfertilization (HPF) for transplantasjon, eller fortsette med microinjections.
      MERK: For transplantasjoner, mål for donor og verts embryoer på samme alder. Derfor utnytter forskjellige oppdretts temperaturer mellom 25 - 32 ° C i henhold til Kimmel et al. 18 å forsinke eller fremskynde en clutch av befruktede egg for å matche den andre.
    5. Hold ~ 20 av de transgene donor embryoer uninjected ved 32 ° C i tiden fra samlingen til time-lapse imaging (24 - 28 timer senere).
      MERK: Disse vil utvikle raskere enn eksperimentell kohorten og vil uttrykke fluorescerende markører tidligere. De kan dermed brukes til å sette opp parametrene (laser makt, gevinst) for bildebehandling. I dette spesielle eksempel avbildning av den eksperimentelle kullet begynner før transgene ekspresjon (for å vurderedet eksakte tidspunktet for denne hendelsen).

2. Forberedelse til Mikroinjeksjon

  1. Mikroinjeksjon nål forberedelse
    1. Bruk en nål avtrekker å trekke nåler fra hver borsilikatglass kapillarrør (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm lang glass kapillære) i sentrum for å få to nåler av samme lengde. Målet for nåler som taper med lange skaft.
      MERK: Eksempel innstillingene for nål avtrekker brukes her leveres i Materialer List.
    2. Oppbevar trakk nåler i en petriskål og fest ved å trykke dem inn i en stripe av moldable kitt eller tape.
    3. Før injeksjonen bringe nålespissen i fokus under et dissekere mikroskop og bruke pinsett for å bryte åpne nålen på spissen. Målet for en skarp konisk spiss med en liten åpning (figur 1C).
    2. <li> Morpholino forberedelse til verts embryoer
    1. Bestill morfolino oligonukleotider spesielt utviklet for det aktuelle genet, samt en standard kontroll morpholino eller en passende fem basepar mismatch å kontrollere for prosessuelle og håndtering effekter.
      MERK: Her en oversettelse blokkerer Ptf1a morfolino med sekvensen 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'som hemmer utviklingen av de mellomliggende horisontale født og amacrine celler, og en standard kontroll sebrafisk morfolino rettet mot humane betaglobin-intron-mutasjon (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 ble anvendt.
    2. Forbered en 1 mM morfolino stamløsning (~ 8 til 8,5 ng / NL) og oppbevar ved romtemperatur.
    3. På dagen for injeksjon, oppvarming av en aliquot (10 ul) av morfolino ved 65 ° C i 10 min, spinne kort og plasser på is for å kjøle ned fra 65 ° C (etter som det kan holdes ved romtemperatur under bruk). ther vil reversere noen potensielt aggregering i morpholino-løsning, noe som kan redusere effektiviteten av knockdown.
      1. For Ptf1a morfolino og tilsvarende standardkontrollen morfolino, forberede en arbeidsløsning med 6 ng / nL ved å fortynne den morpholino stamløsning med destillert vann. Hold ved romtemperatur.
        MERK: Bruk 2 nL av morpholino per embryo som Ptf1a morpholino krever en relativt høy arbeids konsentrasjon av 12 ng per embryo som bestemmes tidligere 7. For de fleste morpholinos, 2 - er 5 ng per embryo effektive, så fortynne aksjen til 2-5 ng / NL og injisere en nL i hver embryo.
  2. Forbereder fluorescerende histone fusjon reporter konstruerer for merking donor embryoer
    MERK: For å skille / visualisere donorceller i verten embryo, er det ulike tilnærminger til å merke donor embryo, inkludert mikroinjeksjon av H2A-GFP (hvis du bruker transgene givere medrøde fluorescerende journalister) eller H2B-RFP (hvis du bruker transgene givere med grønne fluorescerende reportere) mRNA i plommen i encellede stadium donor embryo.
    1. Linear minst 1 ug plasmid inneholdende reporter DNA.
      MERK: Her pCS2 + plasmid (generert og vennlig levert av professor David Turner fra University of Michigan og professor Ralph Rupp fra senteret München Biomedical) inneholder H2A-GFP eller H2B-RFP (generert av Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, university of London) ble linearisert med NotI restriksjonsenzymnedbrytning.
    2. Rense DNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kits som per produsentens instruksjoner.
    3. Transkribere mRNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett med passende polymerase i henhold til produsentens anvisninger. For pCS2 + plasmid, bruk en SP6 polymerase kit.
    4. Rens mRNA ved hjelp av kommersielle kits eller fenol-kloroform ekstraksjon fulgt av isopropanol nedbør som per produsentens anvisningers. Spe mRNA i ultrarent vann (20-30 mL), måle konsentrasjonen med et spektrofotometer og oppbevares ved -80 ° C.
    5. På dagen for injeksjon, forberede en arbeidsløsning av mRNA i sterilt vann til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ul og holde på is. Ubrukt mRNA lager tilbake til -80 ° C.

3. Mikroinjeksjon av Morpholinos og / eller mRNA i Single-celle Stage Embryoet

MERK: Microinjections brukes til å merke alle donorceller og for å forberede de ulike vertsmiljøer (kontroll og genet knockdown) og involverer injeksjoner av mRNA eller morfolino antisensoligonukleotider 20, 21.

  1. Laster og kalibrering av kanylen
    1. Returlast kanylen med 3 mL av morpholino og / eller histon-fluorescerende fusion mRNA løsning ved hjelp microloader pipetter.
    2. Rist solution mot kanylen tips til det ikke er bobler gjenstår. Bruk kanyler med en intern glass sett slik at løsningen vil bli primært trukket til tuppen av kapillær virkning.
    3. Fest kanylen til en holder montert i en micromanipulator (3D manuell mikromanipluatoren) og sikre en tett forsegling inne i røret boliger.
    4. Slå på strømmen og gasstilførselen til trykkregulert microinjector.
    5. Fordyp nålespissen i en dråpe av mineralolje i en skål (hvis du bruker en graticule okularet) eller sveve nålespissen direkte over en mikrometer lysbilde for å kalibrere rulle volum. Måle injeksjonsvolum ved hjelp av fotpedalen og justere gasstrykket og / eller varighet til injeksjonsvolumet er tilsvarende en nL (125 um diameter).
      MERK: Fordelen med mikrometer lysbildet er at målingene er uavhengig av forstørrelse som ble brukt ved mikroskopet, men ved hjelp av okulartrådkorset instead, kan injeksjonen slipp og skala være i fokus samtidig.
  2. embryo mikroinjeksjon
    1. Plasser et objektglass i en petriskål og bruke en overføringspipetten å sette encellede stadium embryoer langs glidekanten. Juster til en enkelt kolonne ved å bruke en microloader pipettespiss med halvparten av tynn spiss avskåret. Fjern så mye væske som mulig med en fin overføringspipetten å hindre bevegelser under injeksjoner (figur 1A).
    2. Senk nålen mot hverandre embryo, og trenge gjennom chorion og eggeplomme i en jevn slag (figur 1B).
    3. Når nålespissen er sentrert i eggeplomme, microinject ved å trykke på pedalen. Injisere en nL av H2A-GFP eller H2B-RFP mRNA i plommen i en enkelt celle stadiet donor embryo (transgene). Injisere 2 nL av standard MO eller Ptf1a MO inn eggeplomme av en enkelt celle stadiet villtype vert embryo ved å trykke på pedalen to ganger. Vellykkede injeksjoner kan visualiseres ved smal l romlig deformasjon i eggeplomme.
    4. Fjern kanylen, flytte parabolen som inneholder embryoene å bringe neste embryo på plass og fortsetter å injisere inntil hele kolonnen av befruktede egg blir injisert (50 - 60 embryoer).
    5. Etter injisering alle embryoer, løfter fatet opp på en 30 - 45 ° vinkel og bruke en mild strøm av E3 medium (klemme flaske) til å overføre de injiserte embryoer inn i en ny ren petriskål.
    6. Plasser embryoet fatet i en inkubator (enten ved 28,5 ° C eller annen temperatur for å sikre at giver- og verts embryoer er på tilsvarende alder).
    7. Gjenta trinn 3.2.1 - 3.2.6 som er nødvendig for å få ~ 100 donor embryoer eller ~ 200 - 250 verts embryoer.
    8. På 1-2 HPF, sjekk embryoene under et dissekere mikroskop og fjern eventuelle ubefruktede egg som ikke har avansert til 2- eller 4-celle etapper med en Pasteur overføringspipetten.

4. Forberedelse til transplantasjoner

ontent "> MERK: transplantasjoner brukes til å generere kimære embryoer slik at for effekten av ulike genetiske vertsmiljøer skal vurderes innen tilsvar WT donor stamceller 9, 22, 23.

  1. Donor embryo utvalg
    1. På tre HPF, sjekk donor embryoer ved 2 - 5x forstørrelse for merking signalet under et fluorescens mikroskop. Velg velutviklet (symmetrisk cellemasse med lik størrelse celler) embryoer med et sterkt fluorescerende signal ved hjelp av GFP pluss filter (460-500 nm eksitasjon, 510 nm lang pasning utslipp) eller Texas Red filter (540-580 nm eksitasjon, 610 nm langpasning utslipp) (figur 1D). De transgene journalister er ennå ikke uttrykt.
  2. Agarose injeksjon plate og petriskål forberedelse
    1. Hell smeltet 2% agarose fortynnet i E3 medium til et 90 mm diameter petriskål og la den kjøle seg ned før fatet er trygtå røre. Varm agarose kan på annen måte deformere formen.
    2. Flyte en plaststøpeform med kileformede fremspring (6 x 25 / mugg) på agarose (figur 2D, E). Unngå luftbobler ved å plassere en side av formen på agarose og sakte senke ned den andre siden. Pass på at formen er sentrert i fatet eller mot siden av det dypeste punktet av de kileformede fremspring for å gi nok klaring for transplantasjon nål.
    3. Tillat agarose for fullstendig å størkne ved romtemperatur.
    4. Sett agarose fatet ved 4 ° C i 30 minutter og fjerne støpeformene ved forsiktig løftes fra ett hjørne (for eksempel med pinsett). Forbered agarose injeksjon plater dagen før forsøket og oppbevar ved 4 ° C med et lite volum av E3 medium og parafin folien for å hindre dem fra å tørke ut.
    5. Før transplantasjonen, fyll agarose injeksjon plate med E3 medium og legg inn en 28,5 ° C inkubator i minst 30 min.
      6. <li> Siden dechorionated embryo holde seg til plast, kan du bruke glass retter eller belegge innsiden av petriskåler (90 mm diameter) med et tynt lag med 2% agarose i E3. Forbered en tallerken for dechorionated verts embryo, en tallerken for dechorionated donor embryoer og en tallerken for hver 40 transplantert embryoer. Lagre som beskrevet for injeksjonsplaten (4.2.4).
  3. Overføringspipetten forberedelse
    1. Skjær tuppen av en lang skjema fint trukket glass tips Pasteur pipette (2 ml volum, 230 mm lengde, 100 mm lang tip) til en lengde som gir komfortabel manøvrering (valgfritt) ved å skrape med en diamant kniv mens roterende inntil spissen faller off (figur 1F).
    2. Sørg for at kuttet er rett. Brann polish glassoverførings pipette ved å dreie snittflaten i en Bunsen-brenner for å generere glatte ender, slik som å ikke skade dechorionated embryoer (figur 1F).
      MERK: Holde pipettespissen i flammen for lenge will resultat i åpningen som tettes opp eller blir for liten for embryoer.
  4. Dechorionating blastula scene donor og verts embryoer
    1. Dechorionate embryoer enten manuelt med to fine tang ved å rive åpen hver chorion uten å berøre embryo, eller enzymatisk ved hjelp av protease for å tillate samtidig hurtig dechorionation av et stort antall embryoer 9.
      1. Forbered en 100x stamløsning på 50 mg / ml protease blanding, gjør 100 ul porsjoner og lagre dem ved -20 ° C.
      2. Tilsett 100 ul av bestanden protease til 10 ml E3 medium (sluttkonsentrasjon på 0,5 mg / ml protease).
      3. Plasser godt utviklede vert og donor embryoer i to separate liten Erlenmeyer begerglass (10 ml) og fjerne så mye væske som mulig.
      4. Tilsett 5 ml av 0,5 mg / ml protease løsning til hver beger og virvle embryoene mens du ser på dem under et dissekere mikroskop. Se etter tegn på deformering av chorion.
      5. Hold virvlende. Så snart den første embryo er ute av chorion (figur 1D, asterisker), utføre tre raske skyllinger med E3 medium for å fjerne proteasen oppløsningen ved å helle ut det meste av væsken og påfylling kolben ved forsiktig å helle i E3 langs siden. La ikke dechorionated embryoer for å komme i kontakt med luft i en hvilken som helst av de etterfølgende trinn inntil slutten av transplantasjon (seksjon 5), som de vil briste. La det være tilstrekkelig oppløsning i kolben mellom rensing.
      6. Med ilden polert glass overføringspipetten, overføre embryoene fra erlenmeyerkolbe begeret til glasspetriskåler eller agarose (2% i E3 medium) belagt plast retter. Forsiktig pipette under overføring for å fjerne eventuelle gjenværende svekket chorion.
  5. Transplantasjon nål forberedelse
    1. Bruk en nål avtrekker for å trekke to nåler fra hver borosilikat tynn vegg glassrør (1,0 mm OD/ 0,78 mm ID / 100 mm lengde) med de samme innstillingene som mikroinjeksjon pipetter.
      MERK: Eksempel innstillingene for nål avtrekker brukes her leveres i Materials List. Transplantasjoner nåler ikke har en glassinnsatsen, da dette skader cellene sugd inn nålen.
    2. Trekk nåler på forhånd, lagre i en petriskål og sikre ved å trykke inn en stripe av moldable kitt eller tape.
    3. Før transplantasjonen bringe nålespissen i fokus under et dissekere mikroskop og bruke pinsett for å bryte åpne nålen på spissen. Bruk fin pinsett for å justere formen av nålen for å ta sikte på en fløyte-form (figur 2G), eller bruke alternative metoder som er beskrevet for å generere spiss form 23.

5. Chimera Generation via blastula Transplantasjon

  1. transplantasjon oppsett
    MERK: Her ble en selv-montert transplantasjon apparat som brukes (Figur 2A
  2. Transplantasjons nålen i samme nåleholderen brukes til mikroinjeksjon over mount (montert på micromanipulator, trinn 3.1.3) (figur 2A).
  3. Koble fra injisere røret som forbinder enden av mikropipette holderen til trykket regulert microinjector brukes for microinjections. Feste injeksjonsrøret som er koblet til en 1 ml sprøyte (figur 2A, B), som representerer den transplantasjon riggen.
    1. Sørg for at alle tilkoblinger er tett forseglet med parafin film eller moldable kitt. Forhindre embryoer fra å komme i kontakt med luft ved å sikre at det alltid er noe E3 medium i transplantasjon nålen selv. Betjene sprøyten manuelt for å suge celler / væske inn i og ut av transplantasjonen nålen.
  • embryo innretting
    1. Overfør donor embryoene med glass-pipette inn i den første kolonne av agarose formen. Overfør verts embryoer i kolonner 2til 6 av agarose formen (figur 2F). Plasser embryoene med pipetten slik at blastomere siden vender opp.
  • transplantasjon
    1. Forsiktig hviler transplantasjonen nålen på en blastomere celle av en donor embryo og langsomt suge opp ca 20 - 50 celler inn i transplantasjonen nålen (figur 2 H). Unngå å suge opp eggeplomme.
    2. Løft transplantasjon nålen fra donor embryo ved hjelp av micromanipulator. Beveg agarose støpeformen rett til venstre og før transplantasjon kanylespissen gjennom siden av cellemassen i dyret pol av den første verts embryo. Innskudds 5 - 10 celler i nærheten av overflaten i henhold til skjebne kartlegging viser at dette område gir opphav til forhjernen / øye felt 24 (fig 2I). Hold nålespissen midt i E3 medium gjennom hele prosedyren.
  • Stell av transplanterte embryoer
    1. Ta av donor embryoer ennd forlater verts embryoene i agarose formen for 1-2 timer ved 28,5 ° C. Fyll glass eller plast (belagt med 2% agarose) petriskåler med E3 medium som inneholder 0,003% N-phenylthiourea (PTU) for å forhindre pigmentdannelse da dette vil forstyrre bildebehandling. Overfør verts embryoer i disse rettene med ilden polert glass pipette og inkuber ved 28,5 ° CO / N.
      FORSIKTIG: Bruk hansker når du håndterer PTU.

    • 6. Levende Imaging Setup

    MERK: Den lille størrelsen og optiske åpenhet av sebrafisk kombinert med raske utviklingen har tillatt det å bli en nøkkel virveldyr modell for in vivo avbildning av ulike celler og organer. Imaging kan utføres på en rekke mikroskoper, som vil variere i oppsett og parametere. Følgende beskriver en passende konfokal bildeoppsett for avbildning av retinal utvikling 5, 8.

    1. kimære embryoutvalg
      1. Ved 24 - 26 HPF, skjerme de transplanterte embryoer i fluorescerende dissekere omfang til å velge sunne godt utviklede fostre som viser de transplanterte donorceller (H2A-GFP eller H2B-RFP merket) i utviklings øyet primordium.
      2. Avsette inntil 40 embryoer for montering ved pipettering inn i en ny form og legg 0,4 mg / ml Tricaine methanesulfate (MS222) for å bedøve embryoene.
        FORSIKTIG: Bruk hansker når du håndterer MS222.
    2. monterings~~POS=TRUNC embryoer
      MERK: Bruk riktig festerett, avhengig av om bildebehandling vil bli utført på en omvendt 8 eller oppreist mikroskop (beskrevet her).
      1. Fremstille et par 1,5 ml plastrør inneholdende 1 ml 1% lavt smeltepunkt agarose i 0,4 mg / ml MS222 i E3 medium og holde smeltet i et 40 ° C vannbad.
      2. Suge opp 5 embryo i en plast overføringspipetten og la embryoene akkumuleres i tuppen av tyngdekraften. Trykk på overføringspipettenpå overflaten av en av de fremstilte plastrør inneholdende 1% lavtsmeltende agarose og 0,4 mg / ml MS222 slik at embryoene å synke inn i røret mens begrense mengden av E3 overføring.
      3. Mount embryo i en 90 mm diameter petriskål for bildebehandling i oppreist mikroskop og glassbunn petriskål (alle størrelser) for bildebehandling i invertert mikroskop. Bruk en permanent markør for å visuelt dele enten parabolen i to halvdeler til bilde givere i WT verter (på den ene siden) eller morphant verter (andre siden) i samme eksperiment.
      4. Overfør de fem embryoer fra agarosen plastrøret til enten petriskål med 0,5 til 1 ml agarose. Fjern overskudd av agarose med en overføring pipette, slik at bare en liten dråpe (~ 200-300 uL) gjenstår. Hvis bildebehandling med oppreist mikroskopi, unngå å plassere embryoer innenfor 1 cm petriskål omkrets. Den nedsenking i vann dyppe linsen som brukes for avbildning vil kanskje ikke være i stand til å være sentrert i dette området på grunn av petriskålen vegg (figur 3A </ Strong>).
      5. Bruk en microloading pipette (med spissen brukket av) for å justere de embryoene sidelengs inntil agarose stivner. For begge typer av rettene blir embryoene korrekt vinklet lateralt hvis de to øynene på hver side av hodet er helt overlapp (justert i dimensjon XY) (figur 3B). For invertert mikroskop bruk, må øyet nær dekkglass skyves så nær dekkglass som mulig, for å muliggjøre avbildning gjennom z-dimensjonen innenfor rammen av de mulige fokus nivåer.
      6. Fortsett montering fem embryoer på et tidspunkt i individuelle dråper agarose. Bruk mer 1% lav smelte agarose å delta i agarose synker til hverandre og på siden av fatet for å forhindre løsner og sideveis bevegelse under imaging (figur 3A).
      7. Når du er fullt størknet, dekk fatet med E3 medium (som inneholder 0,003% PTU, 0,4 mg / ml MS222) forvarmet til 28,5 ° C.
      8. Ved hjelp av den samme tilnærmingen som er beskrevet i trinn 6.2.2- 6.2.8, montere ~ 20 transgene embryoer hevet ved 32 ° C (trinn 1.2.5) i en egen rett.
    3. Imaging parametere
      MERK: Imaging å analysere utbruddet av fluorescerende transgener ikke krever høy romlig intracellulær oppløsning. Det kan utføres med en W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70-mm objektiv på 1,5 zoom.
      1. Sett opp laseren makt og eksponeringstiden basert på transgenet intensitet for ~ 20 transgene embryoer med akselerert utvikling (dvs. hevet ved 32 ° C, trinn 6.2.8).
        NB: For studier av begynnende transgene uttrykk, de eksperimentelle embryoene viser ingen fluorescens på tidspunktet time-lapse er satt opp, og således er disse akselererte embryoer er avgjørende for å bestemme parametrene av bildebehandling.
      2. For den eksperimentelle fatet, visualisere hvert embryo og lagre posisjonen og fokus nivåer av embryoer.
        1. Velg embryoer som har riktig montering vinkel (dvs. med den laterale side av øyet så horisontalt som mulig) og et kraftig hjerteslag (en indikator på helse). Velg embryoer med noen få transplantert donorceller (identifisert av H2A-GFP eller H2B-RFP merking) først og fremst i den fremre ventral kvadrant av å utvikle netthinnen (der bølgen av genuttrykk begynner) (figur 3C).
          MERK: I sebrafisk embryoer, er den gjennomsnittlige heartrate 120 - 180 slag / minutt 25. I de bedøvede embryoene, kan en sunn hjerteslag være i området fra 60 - 120 slag / minutt. Langsommere hjerterytme kan være en indikasjon på redusert levedyktighet og disse embryo bør utelukkes fra studien.
      3. Sett z-stabler av optiske seksjoner 2 mikrometer intervaller gjennom netthinnen på opptil 15 embryoer.
        MERK: Det totale antall embryoer som kan avbildes i et gitt eksperiment vil avhenge av individuelle parametre (eksponeringstid og z-stack størrelse). Tiden det tar å avbilde en tid-poeng for alle de valgte embryoene må være shorter enn intervallet mellom tidspunktene. Ved å ofre noen dybde oppløsning, kan flere embryoer avbildes innenfor tidsintervaller. Grensene for den z-stabelen er valgt som laterale og mediale ytterpunktene av den monterte embryoer øyet og 30 um ble tilsatt til den laterale side i opprett mikroskopi oppsett, som øynene til utviklings embryoene i dette oppsettet forskyvning i Z-retningen som embryoene vokse over natten. Dette resulterer i stabler 100-170 mikrometer tykkelse (50 - 85 bilder / øye).
      4. Ta bilder hver 24 minutter ved 32 ° C (tilsvarende 0,5 HPF intervaller) ved bruk av laser / kanal passende for å transgenet.
        MERK: Embryoene forbli på scenen gjennom hele time-lapse innenfor et oppvarmet kammer omfatter hele mikroskop. Mens forsøket kan gjennomføres ved 28 ° C, blir varmere temperaturer brukes til å øke hastigheten på utvikling og sikre at de aktuelle tidspunktene i forsøket er avbildet i 16-24 h time-lapse periode.
      5. Bildekanaler som representerer donor etikett (H2A-GFP eller H2B-RFP - valgfritt) og transgene (Atoh7: RFP eller Vsx1: GFP) bruker sekvensiell skanning. For analyse, utnytte den donor etiketten bare å velge hensiktsmessige embryoer som beskrevet (ta en z-stabel ved begynnelsen av imaging), og deretter utføre time-lapse bare på kanalen for å fange opp den transgene uttrykk.
        MERK: Du kan også bruke donor etiketten bare å velge hensiktsmessige embryoer (dvs. de med bekreftet transplanterte cellene i fremre ventral kvadrant) og bildet bare transgenet kanal, omtrent halvering bildebehandling tid og nesten dobling av antall embryoer som kan avbildes og analysert per eksperiment (figur 4).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Dette arbeidet presenterer en forsøksprotokoll for å vurdere endringer i genuttrykk timing når villtype netthinnens stamfedre utvikle innenfor en morphant vert embryo. De eksperimentelle verts embryoer er Ptf1a morphants, som mangler de mellomliggende født horisontale og amacrine interneurons i netthinnen 7, 26. Disse har blitt sammenlignet med kontrollverts embryoer, som ble injisert med en standard kontroll morfolino.

    Siden nevrogenesen av forskjellige typer av nerveceller på tvers av sentralnervesystemet (inkludert netthinnen) forekommer i en sterkt konservert histogenic orden 27, 28, 29, 30, 31 progresjonen av videre skjebne kan avhenge av celle ikke-autonome tilbakekoblingerfra samler tidligere født neuron typer. Denne hypotesen ble testet ved å vurdere tidspunktet for generering av senere født neural typer i transplanterte stamceller utvikler i fravær av mellomliggende født neuron typer. Som en kontroll, ble tidspunktet for tidlig født celler også kvantifisert, som bør være upåvirket uavhengig av hvorvidt de mellomliggende cellene er generert eller ikke. For dette formål, Tg (atoh7: RFP) eller Tg (atoh7: gapGFP) linjer ble anvendt for å visualisere begynnelsen av den første født ganglion celle nevrogenesen mens Tg (vsx1: GFP) linje ble brukt til å analysere utbruddet av sen født bipolar befolkningen. Annet enn i tillegg uttrykker rapportørtransgener, donorcellene fra disse embryoer er genetisk WT.

    Mikroinjeksjon av en nL mRNA (for å merke donorceller) inn i eggeplomme fra encellede trinns embryoer resulterer i fluorescerende rapportørprotein-ekspresjon av tre HPF, ved hvilkenStage este givere er valgt (figur 1). Forbered transplantasjon oppsett når embryo er rundt to HPF (figur 2). Ved 24 HPF, blir embryoer med transplanterte donorceller i de aktuelle retina steder valgt og anordnet i en lav smelte% agarose i grupper på fem (figur 3). Etter lagring embryoet posisjon, sette z-stack og tidsparametre, er time-lapse bildebehandling utført for 16-24 timer. Tidspunktet for første født ganglion-celler er angitt med utbruddet av Atoh7: RFP eller Atoh7: gapGFP transgen og tidspunktet for den siste født bipolare generasjon er angitt ved sterk oppregulering av den Vsx1: GFP transgenet, som også uttrykkes ved tydelig lavere lysstyrke nivåer i utviklings forfedre. Tidspunktet for første transgene uttrykk, slik som Atoh7: gapGFP er identifisert i enkeltceller ved hver endepunktet for avbildnings (hvite pilspisser, figur 4). Atoh7: gapGFP og ganglion celledifferensiering occurs på tilsvarende tid uansett om verten embryoet er WT eller en Ptf1a morphant mangler mellom (dvs. etter ganglion celle fødsel) horisontale og amacrine celler.

    Dataene som presenteres viser at denne eksperimentelle tilnærmingen gir et kraftig verktøy for å vurdere rollen til bestemte retinal miljøene på genekspresjon timing, med relevante konsekvenser, ikke bare for å forstå normale utviklingsprosesser, men også for fremtidige anvendelser av celle omprogrammering strategier i normale og syke tilstander .

    Figur 1
    Figur 1: Mikroinjeksjon i plommen i Single-celle Stage Embryoet brukes til å merke donorceller og å generere ulike vertsmiljøer. A) Embryoet er justert mot kanten av en glassplate med de fleste av de omkringliggende væske reflyttes. B) Nålen er satt inn i midten av eggeplomme og enten H2A-GFP eller H2B-RFP mRNA (for donor) eller morfolino (standard MO eller Ptf1a MO for verts) blir injisert. C) Injeksjonsnålen er generert ved hjelp av en nål avtrekker som genererer to symmetriske nåler fra hver kapillar. Hver trakk nål senere må ha tipset brutt med pinsett for å åpne nålen samtidig gi en skarp vinklet spiss (ikke sløv) som enkelt kan settes inn i embryoer. D) Donor embryoer injisert med H2B-RFP mRNA ved encellede stadium starte uttrykker fluorescerende reporter proteiner med 2,5 HPF, på hvilket stadium de smarteste og mest jevnt merket embryoer kan velges. E) Rundt 2,5 til 3 HPF, donor og verts embryoer blir enzymatisk dechorionated bruker proteaser. Virvlende av erlenmeyerkolben gir mekanisk kraft som er nødvendig for å bryte åpne svekket chorions og bringer dechorionated embryos inn til sentrum. Så snart den første (asterisk) eller noen få dechorionated embryoer blir observert, hurtig men forsiktig skylling sørger for at protease-oppløsning fjernes. F) For overføring av dechorionated embryo, er glass overføring pipetter utnyttet. Disse kan i utgangspunktet forkortet (valgfritt) til ønsket lengde som er komfortabelt manøvreres av brukeren, ved å skrape glasset i riktig posisjon med en diamant kniv før det løsner. Dette resulterer i en kraftig kutt spissen, som må være brann-polert for å glatte eventuelle grove kanter som kan skade celler blir sugd inn i pipetten under overføring. Skala barer A, B, D, E = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2: Transplantasjon Setup. B) Den transplantasjon slangen vist indikerer hvor potensielle lekkasjer ved leddene er ganske enkelt forebygges ved hjelp av formbart kitt og parafin film. C) En høyere forstørrelse riss av forbindelsen mellom injeksjonsrøret og en hvilken som helst passende produksjonsrøret for å koble til sprøyten. Mens alle slanger kan anvendes, idet røret benyttet her har en diameter som tett passer til en 10 ul pipettespiss. Bruk parafin film for å sikre en tett forsegling. D) Formen har 150 (6 x 25) kiler for å generere de trekantede tribuner i agarose injeksjonsplaten. E) Tilnærmede dimensjoner av hver kileform er vist. Selskapet målinger er proprietær. F)Preparerte agarose injeksjon plater med kileformede fordypninger brukes med donor embryoer som er lagt til den første kolonnen og kolonner 2 - 6 fylt med verts embryoer. Transplantasjoner utføres på tvers av raden, der celler hentet fra en donor i hver rad kan transplanteres inn i 5 verts embryoer. Innenfor hver mold, kan celler fra opptil 25 donorer bli transplantert inn opp til 125 verts embryoer. Legg merke til støpeformen er plassert asymmetrisk i den dypere ende av kilen nærmere petriskål kant. Dette gjør at transplantasjon nålen fra høyre uten å treffe petriskål kanten. G) Det transplantasjon nålen er trukket med de samme parametrene som injeksjonsnålen til å resultere i en lang konisk spiss er vist her. Nålen må brytes for å generere et større innvendig diameter som kan ta opp cellene uten å deformere dem. Jo høyere strøm innfelt viser at spissen på nålen transplantasjon bør være vinklet, og ideelt sett har en "fløyte" -form som visti dette eksemplet. H) Høyere kraft visningen viser retningen på verts embryoer med celler på toppen. Transplantasjonen nål settes inn i cellen massen av blastula trinnet vertsembryo sideveis (hvit asterisker) og skjøvet inn i fremtiden øyet, som vist her. Donorceller kan sees i transplantasjonen nål (pil) og således den grove antall celler transplantert kan kontrolleres. I) To eksempler (venstre og høyre) viser at umiddelbart etter transplantasjon, embryoer med hell transplanterte cellene i riktig sted umiddelbart kan sorteres ut ved hjelp av donor etiketten (f.eks H2B-RFP). En fluoriserende kanal ble lagt til lysfelt ved hjelp av "lineær Dodge (legg)" under lag-menyen i rastergrafikk editor. Scale bar (for H, I) = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


    Figur 3: Embryo Monterings for Time-lapse Imaging. A) petriskål (90 mm) som viser flere lav smelte agarose dråper som inneholder fem befruktede egg hver forbundet med agarose for å danne et fast nettverk for å hindre at enkeltdråper løsner. B) Høyere makt visning av 24 HPF embryoer justert sideveis og innebygd i størknet agarose. For den ideelle vinkelen, bør de to øynene plasseres på toppen av hverandre (i z-dimensjonen). Avhengig av genet av interesse, monterings bør utsettes inntil like før aktuelle tidspunkt (for eksempel 26 HPF av ganglion-celledifferensiering eller 35 HPF for starten av den bipolare celledifferensiering). C) Confocal bilde av en enkelt optisk z-delen som viser overlapping av lysfelt og røde kanaler (med "lineær Dodge (legg)" under lag-menyen irastergrafikk editor) for å utvikle øye med noen merkede donorceller (røde) i en ellers umerkede verten miljøet. Scale bar B = 1 mm, skala bar C = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4: Timing av Neurogenesis kan visualiseres i Transgene donorceller transplantert inn forskjellige verts miljøer. Mikrografer fra time-lapse bilde av utviklings WT donorceller fra Tg (atoh7: gapGFP) transgene embryoer transplantert inn umerkede WT vert. Transgene uttrykk utbruddet er indisert for noen få celler ved hvite pilspisser. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon of denne figuren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Forstå hvilken grad nabocellene påvirke tidspunktet for uttrykk av avgjørende celle skjebne avgjørende faktorer er viktig når du tar sikte på å effektivt instruere embryonale eller induserte multipotent stamceller til å differensiere i en bestemt post-mitotisk celletype eller mønstrede vev. Videre undersøke disse molekylære hendelser i utviklings cellene i levende dyr gir relevant dynamisk (temporal og romlig) informasjon om den bestemte cellulære sammenhenger knyttet til disse hendelsene i vivo tillegg. Slike studier kan ikke være lett oppnås i alle virveldyr modeller.

    I presenterte protokollen, er mottagelig sebrafisk embryo utnyttet som et virveldyr modell for å løse disse spørsmålene i vivo, i den relativt enkle, men likevel svært organisert tredimensjonale mønstrede vev av virveldyr netthinnen. Dette eksemplifiseres ved å teste hypotesen om at tappe en bestemt celle retinaltypen påvirker genekspresjon timing og utviklings skjebne av netthinnens stamceller. Vi kan i tillegg benytte den donor-cellemarkør for å spore spesifikke celler tilbake i tid for å vurdere, for eksempel, hvor lang tid før ekspresjon av et transgen en postmitotic celle gikk sin siste divisjon, eller vurdere den generelle virkemåten til denne celle (f.eks migrering) ved forskjellige trinn forut for den transgene ekspresjon i forskjellige miljøer. For disse studiene, til en kombinasjon av relativt lett å utføre teknikker er presentert, som inkluderer morfolino-formidlet gen slå ned, transplantasjon og levende avbildning. For transplantasjon metode, introduserer protokollen en roman, relativt enkelt og billig transplantasjon rigg og demonstrerer hvor lett denne drifts oppsett.

    Denne protokollen er ikke begrenset til retina. Den kan også brukes til å studere en rekke forskjellige dynamiske cellulære prosesser, som krever å løsrive av celle-autonome utvikling;ental programmer fra celle non-autonome miljømessige påvirkninger. Imidlertid, mens lite feilsøking er nødvendig, en rekke kritiske trinn må tas i betraktning før et nytt forsøk. En viktig forutsetning for vellykket bruk av teknikken er at det organ eller vev av valget må lett kunne målrettes i tidlig embryo ved bruk av kart skjebne. Hvis effektiviteten av vevet målretting ikke tidligere er blitt testet, dette må først optimaliseres og standardisert. Antallet microinjected og transplanterte embryoer kan økes og vist før leve bildebehandling for å oppnå tilstrekkelig embryoer med donorceller korrekt integrert og plassert innenfor det aktuelle vev. I tillegg, mens denne protokollen kan lett brukes på tidlige embryonale sebrafisk stadier, søknad til senere stadier som vokser larvene blitt vanskeligere for to grunner. For det første, effektiviteten av genet knockdown oppnåelig med morpholinos avtar over tid (deventende på hver morpholino, er det vanligvis mest effektive før tre DPF). For å overstyre dette problemet, er bruk av genetiske mutanter som donor embryoer for transplantasjon foretrekke. For det andre, som sebrafisk vokser, dypere deler av larvene blir mindre tilgjengelig for bildebehandling med en konfokalmikroskop, spesielt på høyere forstørrelser (høy effekt mål) hvor arbeidsavstanden av mikroskopet målet er mer begrenset. Dermed hver vev av interesse i relevant alder må først vurderes for sin amenability til bildebehandling.

    Time-lapse bildebehandling kan utføres enten på en invertert eller oppreist konfokal mikroskop.

    Det er en rekke fordeler ved den opprettstående mikroskop, hvis tilgjengelig. Ved den nødvendige temperatur, inndampning av den nedsenking stoffet som brukes (for eksempel vann eller neddykking olje med vann brytningsindeks) på et invertert mikroskop kan føre til fullstendig uttørking. Dette krever konstant overvåking ogslutt påfylling, med risiko for å plassere prøven ut av fokus. Dette kan delvis unngås ved hjelp av automatisering for å senke målet en definert avstand, og legger nedsenking substans og heve målet igjen, men i vår erfaring, er omstilling ofte fortsatt nødvendig, noe som skulle skje før i begynnelsen av neste tidspunkt for bildebehandling . For det andre, den største dekkbunn retter vi utplassert er fortsatt mye mindre (50 mm i diameter) enn standard 90 mm i diameter Petri-skåler som anvendes for stående mikroskopi. Dette betyr at antall embryoer som kan monteres og embryoet middels volum tilsatt er mer begrenset ved bruk av invertert mikroskop. Ikke desto mindre tidsintervallparameterne vanligvis utgjør den viktigste begrensende faktor for antall embryoer som kan avbildes og derfor størrelsen på fatet er likevel egnet. Når du bruker svært høy forstørrelse mål, kan invertert mikros tillate en større dybde i z-dimensjonen øyet ogMålet er bare adskilt av en tynn dekkglass. Når man kombinerer meget høy forstørrelse med opprettstående mikroskopi, må agarose fallet som dekker embryoet holdes så tynt som mulig. Totalt sett er data innhentet ved hjelp av stående eller invertert mikroskopi er av tilsvarende kvalitet.

    For generering av data av høy kvalitet, er det flere viktige skritt som må tas i betraktning. For det første er utvalget av fargemerkede givere avgjørende for å få transplantert embryoer med et passende antall transplanterte cellene i øyet på begynnelsen av time-lapse filmer (noen, men ikke for mange). Proteasen enzymatiske dechorionation er et kritisk trinn og inkubasjon i protease bør holdes på et minimum, etterfulgt av rask, men skånsom skylles for å ikke påvirke den etterfølgende helsen av embryoene. Alder matching av donor og vertsembryoer gir mulighet for nøyaktig vev målretting ifølge kart skjebnen og for effektiv integrering av cellene. En godt formet transplantasjon neEdle er viktig, slik at spissen er liten og skarp nok til å sette inn i verts embryo uten å forårsake mye skade, men stort nok i innvendig diameter til å ikke gi mekaniske skader cellene blir transplantert. Under transplantasjon, hvis utstyret ikke er fullstendig lukket (særlig ved tilknytningspunkter), er det meget vanskelig å kontrollere bevegelsen av E3 medium og cellene manuelt inn i og ut av transplantasjonen nålen. Dette er mest tydelig når det er strømme enten inn i eller ut av den transplantasjon nålen uten manuelt å endre sprøytevolumet. I dette tilfellet alle ledd må re-sjekket og lukkes. Dette bør bli testet i forkant av forsøket.

    Til slutt, i løpet av tiden som har gått mellom transplantasjon og time-lapse oppsett, er det avgjørende at de transplanterte embryoene får lov til å utvikle seg på lav tetthet mens omhyggelig rense ut noen usunne embryoer. Dette er spesielt viktig, når tidspunktet for utvikling eller gene uttrykket blir etterforsket. Ved vurdering tidspunktet for en hvilken som helst prosess (f.eks genekspresjon), må kontroller brukes for å utelukke ikke-spesifikke bivirkninger av morpholino-teknologi. I vårt arbeid bruker vi timingen av transgene uttrykk i en urelatert vev (f.eks muskel) upåvirket av det spesifikke genet målrettet av morpholino.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av en ARC DECRA å PRJ (DE120101311) og av en Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) forskningsstipend til LP (PO 1440 / 1-1). Den australske Regenerative Medicine Institute er støttet av midler fra staten regjeringen i Victoria og den australske føderale regjeringen. Vi erkjenner Dr Jeremy Ng Chi Kei, som har utført forsøkene beskrevet her som er publisert i Kei et al. 2016. Vi er takknemlige for bestemmelsene i transgen fisk fra Prof. Higashijima og takke profs. Turner og Rupp for levering av pCS2 + plasmid og Dr. Wilkinson for å generere H2B-RFP og H2A-GFP konstruksjoner. Vi takker FishCore anlegget ansatte (Monash University) for å ta vare på dyrene våre.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
    Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
    borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
    borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
    glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
    Injection tube (2 m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
    Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
    microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
    microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
    micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
    microloader tip Eppendorf 5242956003
    Mineral oil Sigma M5904-500ML
    needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
    Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
    Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
    Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
    Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
    N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
    Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
    Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
    SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
    2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
    3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
    4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
    5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
    6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
    7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
    8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
    10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
    11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
    12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
    13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
    14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
    15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
    16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
    17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
    18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
    19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
    20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
    21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
    22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
    23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
    24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
    25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
    26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
    27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
    28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
    29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
    30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
    31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

    Tags

    Developmental Biology Sebrafisk transplantasjon chimera live bildebehandling celle non-autonome netthinnen genekspresjon timing neurogenesis
    <em>In vivo</em> avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi,… More

    Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter