Summary
Test comportamentali è utilizzato in studi pre-clinici per valutare gli effetti fenotipici di una malattia o un trattamento benessere di un animale. Al fine di valutare globalmente funzionamento del motore, abbiamo selezionato le prove per la locomozione generale, forza muscolare e di coordinazione: campo aperto-test, il test di rete e il rotarod test, rispettivamente.
Abstract
Test comportamentali è utilizzato in studi pre-clinici per valutare gli effetti fenotipici ed esiti che dispone di una particolare malattia o un trattamento benessere e la salute dell'animale. Ci sono numerosi test comportamentali che possono essere applicate. Abbiamo selezionato un test per la locomozione generale, campo aperto test (OFT); un test per la forza muscolare, la mesh testare (MT); e un test per il coordinamento, il rotarod test (RR). Test può essere realizzato su base settimanale o mensile. Come un test per la locomozione generale, l'OFT opere oggettivamente monitoraggio parametri di movimento mentre il mouse è in un'apparecchiatura di campo aperto. Il campo è in genere una finestra di 2' x 2', e i movimenti vengono registrati tramite telerilevamento laser o tramite acquisizione video. Il mouse è posizionato al centro del campo aperto e può spostarsi liberamente per il test. La MT utilizza la latenza per un mouse per cadere uno schermo invertito come una misura della forza muscolare. Un mouse è posizionato su uno schermo, che è invertito sopra una scatola trasparente ed è cronometrato per loro latenza a cadere. Vengono eseguite tre prove, con il meglio delle tre prove ha segnate per quel giorno. Un punteggio di 60 s è il tempo massimo è rimasto un mouse invertito. I topi sono dati un periodo di riposo di 5 minuti tra tentativi di prova di mesh. Infine, un protocollo accelerato sulla RR valuta resistenza e coordinazione motoria. Durante un periodo di prova, un mouse cammina su una canna rotante in quanto aumenta in velocità da 4 giri/min a 40 giri al minuto oltre 5 min. La prova termina quando il mouse tocca il sensore di pressione magnetizzata al momento di cadere. Ogni mouse subisce tre prove, e la prova migliore è segnata per quel giorno. Questo dati comportamentali combinati consentono la valutazione globale della mobilità, coordinazione, forza e movimento degli animali da esperimento. Almeno due delle tre misure di test comportamentali deve mostrare miglioramento per un animale a qualificarsi come avendo complessiva migliorata funzione motoria.
Introduction
L'obiettivo dei test comportamentali è misurare la caratterizzazione fenotipica, sia in studi per un nuovo modello murino di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale o per una versione di prova di un nuovo trattamento. Ci sono una varietà di test comportamentali da scegliere. La spiegazione razionale per l'utilizzo di una combinazione di test comportamentali è spesso completamente per valutare i risultati di trattamento pre-clinico. La batteria di test comportamentali nel presente documento comprende la prova di campo aperto (OFT), la prova della maglia (MT) e il rotarod test (RR).
L'OFT è usato come una misura di attività locomotrice generale1,2,3,4,5,6,7. Questa valutazione permette il mouse per muoversi liberamente in un campo aperto, e le misurazioni effettuate sono i movimenti del mouse nel corso della prova del comportamento. Le analisi quantitative effettuate con un OFT comprendono allevamento, lunghezza percorsa, tempo trascorso movimento (ad es., camminare e correre) ed i cambiamenti in attività nel corso del tempo (ad es., salto e più lento/iperattivo movimenti), motivo per cui è utile e analisi approfondita del comportamento del roditore.
La MT è utilizzato per valutare la forza dei topi1,2,8,9,10,11. L'uso di tutte e quattro le membra per appendere fuori di una rete di griglia metallica consente la misurazione non invasiva della capacità dei topi per mostrare tensione sostenuta arto mentre opporre gli effetti della gravità. Questa valutazione avviene posizionando un cursore del mouse su una maglia invertita e temporizzazione sua latenza a cadere. Questo test valuta la forza muscolare del mouse misurando quanto tempo può contenere se stesso sullo schermo invertito prima di cadere.
Il RR valuta il coordinamento del mouse mentre si utilizza l'accelerante protocollo1,2,7,8,9,12,13. L'apparato di rotarod è costituito da una trave cilindrica che ruota in aria a partire da 4 giri/min. Il mouse può imparare questa abilità di coordinazione motoria e quindi è sfidato da un aumento lento, incrementale fino a 40 giri/min. Classicamente, il protocollo di velocità costante è una misura della forza muscolare, mentre il protocollo di accelerazione per il RR valuta la coordinazione, la resistenza e la forza muscolare1,2,7, 14.
I vantaggi di queste tre prove comportamentali sono che che sono ampiamente accettate in tutto il roditore comportamentale prova comunità2,7,8,9e quando presi non solo come la somma del prove individuali, ma collettivamente, può essere utilizzato come una valutazione globale del comportamento fenotipico quando indagare i diversi risultati di trattamenti sperimentali. L'OFT è uno dei test solo per attività locomotrice nel complesso2. La RR è anche uno dei pochi modi per valutare coordinamento2, diversi da quelli per l'utilizzo di software di analisi di andatura, che non verrà discusso qui. Ci sono alcuni modi in cui può essere valutata la forza muscolare di un mouse; Tuttavia, utilizzando la MT, o un filo pendere test, è stato utilizzato prevalentemente nella letteratura ed è accettata come un metodo affidabile per testare la forza muscolare2,8,9,10, 11. molte altre tecniche per la misurazione di locomozione generali e il coordinamento sono estremamente che richiede tempo e non può produrre dati affidabili (ad es., tempi manualmente il movimento del mouse o manualmente pittura zampe per analisi del passo). I sistemi automatici per l'OFT e la RR aumentano l'affidabilità e la validità dei dati prodotti e risparmiare tempo e fatica.
Ad esempio, dato il neurodegeneration del modello del topo malattia di Sandhoff, durante l'esecuzione di questa batteria di test, l'OFT sarebbe il primo di questi test utilizzati per valutare le anomalie del motore che sono di solito visto in questo modello di topo a partire dai 3 mesi di età. I deficit nella coordinazione motoria dovrebbero anche diventare apparente inizio a 12 settimane di età. Deficit di forza muscolare dovrebbe iniziare circa 14 settimane di età, ma in definitiva diventano molto più significativi di 16 settimane.
Questi test sono utili quando lo studio delle malattie che causano danni significativi di motori, compreso di malattie neurodegenerative9 come Sandhoff malattia1,8,13, morbo di Parkinson7, Malattia di Huntington, sclerosi multipla. Il test può essere utilizzato anche per studiare l'invecchiamento e a formulare valutazioni comparative geriatriche o misure di salute. Disturbi della deambulazione e cambiamenti nella locomozione e l'equilibrio sono visti in molti di questi stati di malattia. Tuttavia, l'utilità di questi test non è limitata alle malattie con sintomi neuromuscolari prevalenti.
Siete pregati di notare che non ci sono stati nessun variabili di confusione notate per quanto riguarda la motivazione o la novità di una delle misure di test comportamentali descritte. È indispensabile per determinati stati di malattia e patologie che i ricercatori acquisiscano dati comportamentali preliminari prima il mouse presenta sintomi fenotipici; il ricercatore deve quindi periodicamente (ogni settimana) garantire che tutte le motorie sono contabilizzate. Molte malattie hanno una rapida insorgenza dei sintomi fenotipici e senza test settimanali, questi sintomi non sarebbero essere contabilizzati.
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Protocol
Tutti i protocolli qui descritti sono stati eseguiti in conformità con e sono stati approvati dalla, Comitato di cura della Regina Università degli animali. La frequenza del controllo comportamentale può essere settimanale o mensile o una combinazione dei due (cioè, mensili e settimanali quando uno si aspetta di vedere la più grande differenza altrove).
Nota: Murini studi comportamentali sono in gran parte sesso/età/ceppo-dipendente, e pertanto è essenziale per raccogliere i punti di tempo proprio e rimanere coerenti attraverso gruppi sperimentali. Fattori ambientali (ad es., profumi, rumore, temperatura, umidità illuminazione, ecc.) notevolmente influenzano il comportamento e l'ansia nei topi. Provare a ridurre questi fattori ambientali per quanto possibili.
1. aperto campo prova
Nota: Prima del test comportamentali, gli animali dovrebbero essere abituata alla camera dove il test si svolgerà per 10-15 min prima dell'inizio della prova. Accertarsi che dispositivi di protezione personale e tutte le attrezzature locali vengono seguite linee guida per i protocolli dei test comportamentali.
Nota: Nessun addestramento prima della prova.
- Assicurarsi che il computer e il programma OFT sono, in esecuzione e correttamente connesso alla fotocamera o casella campo aperto. Fare clic sul programma smartware, l'icona di campo aperto e "OK". Ha scelto la fonte di "convertitore analogico digitale" tra le opzioni della fotocamera. Fare clic su "rilevamento" e assicurarsi che lo spazio intero campo è visualizzato e che le dimensioni sono 30 x 30 cm.
Nota: Attrezzatura layout possono variare a seconda dei vincoli di spazio, ma assicurarsi che il computer e il campo aperto apparato è vicino a vicenda in una stanza ben illuminata per la cattura video corretto. - Fare clic su "taratura" "istantanea" e poi "OK" per assicurarsi che il mouse viene rilevato all'interno dei confini del campo aperto. Fare clic su "tempo" per pre-impostare una quantità di tempo per testare i topi; in questo caso, impostare 5 min.
- Immettere gli argomenti facendo clic sull'icona di "soggetti". Fare clic su "utilità di pianificazione" ed evidenziare tutti i test per soggetto e quindi fare clic sulla doppia freccia verde e "fase uno, sessione uno;" questo porterà in tutti i soggetti al fine di iniziare a raccogliere dati.
- Posizionare il mouse al centro del campo aperto e clicca sull'icona "start" per richiedere il programma per iniziare la registrazione. Testare un solo mouse alla volta.
- Una volta completato 5 min, il programma passa automaticamente al prossimo argomento. In questo caso, rimuovere il mouse che ha completato il test e inserire il prossimo soggetto in campo aperto. Cliccare su "start".
- Pulire l'apparecchio. Ripetere i passaggi da 1.3-1.4 per i restanti soggetti.
- Al fine di analizzare i dati una volta che tutti i soggetti sono passati attraverso test, fare clic sull'icona "analizzare" nella parte superiore destra dello schermo. Fare clic su "analizzare" nuovamente e quindi "relazione di sintesi". Facoltativamente, esportare i dati su una chiavetta USB.
2. maglia Test
Nota: La superficie e le dimensioni della mesh a MT possono influenzare le prestazioni. A MT, se un mouse cade entro i primi 10 s durante il periodo di raccolta primi 2 punti, sarà rimesso sulla mesh immediatamente per un secondo tentativo. La mesh utilizzata nel presente documento era una rete metallica, con i fori della maglia circa 1,5 mm di diametro.
Nota: Eseguire questi test allo stesso tempo del giorno è consigliato, poiché i parametri fisiologici e biochimici fluttuano durante tutta la giornata. Peso corporeo può influenzare le prestazioni in questo test e pertanto deve essere preso in considerazione.
- Posizionare un mouse al centro di una mesh e invertire la maglia almeno 20 cm sopra un contenitore trasparente. Una volta invertito, avviare il timer.
- Tempo e registrare il tempo di latenza a cadere. Se il mouse non rientra entro 60 s, dargli un punteggio di 60 s e condotta no ulteriori test. Consentire il mouse a riposare per almeno 5 min. Questa è la fine della prova 1.
- Pulire giù l'attrezzatura e durante l'intervallo Inter-prova 5-min, prova un secondo mouse, se necessario. Ripetere i passaggi da 2.1-2.2 per le prove 2 e 3, se necessario (fino a quando il mouse non segna 60 s, dovrebbero essere sottoposti a tre prove).
3. Rotarod Test
Nota: La superficie e il diametro dello stelo su RT possono influenzare le prestazioni. Su RT, se un mouse cade entro i primi 10 s durante i primi punti di tempo 2 collezione, metterlo sulla barra immediatamente per un secondo tentativo.
Nota: Eseguire questi test allo stesso tempo del giorno è consigliato, poiché i parametri fisiologici e biochimici fluttuano durante tutta la giornata. Peso corporeo può influenzare le prestazioni in questo test e pertanto deve essere preso in considerazione.
- Accendere l'IITC rotarod e il computer. Garantire che essi siano collegati correttamente per la registrazione di dati.
- Assicurarsi che il programma è in esecuzione il protocollo accelerato. Impostare la lunghezza desiderata del rotarod test su xxx (l'intervallo valido è 000 e 999); in questo caso, premere 300 *. Impostare il numero di corsie da utilizzarsi per xxx (l'intervallo valido è 001 attraverso 005); in questo caso, premere 005 *. Impostare la velocità di partenza di xxx rpm (immettere 3005 per 5 giri/min; l'intervallo valido è 001 attraverso 045); in questo caso, premere 004 *.
- Impostare la velocità massima a xxx rpm (immettere 4.030 per 30 rpm; l'intervallo valido è 001 attraverso 045); in questo caso, premere 040 *. Impostare la velocità di rampa a xxx in s (invio 5.030 per una rampa di 30 s per velocità massima; l'intervallo valido è 000 e 999); in questo caso premere 300 *. Impostare l'unità su modalità mouse (immettere 6001 per mouse avanti e 6002 per mouse inverso); in questo caso, premere 6001 *.
- Garantire che tutte le corsie magnetizzate sono bilanciate prima di iniziare la prova. Posizionare un mouse in ogni corsia del rotarod.
- Premere start per avviare il programma. Mentre i topi cadono, rimuoverli dal loro corsie prontamente per garantire che essi non "inciampare" le altre corsie.
- Consentire i topi a riposare per un intervallo Inter-trial di 10 min. Questa è la fine della prova 1. Durante l'intervallo Inter-trial, pulire l'apparecchiatura e inizia la prova per la prossima serie di topi.
- Ripetere i passaggi 4-6 come necessario. Se un mouse rimane sul rotarod per la versione di prova completa 5-min, ulteriori prove non sono necessarie per quel mouse.
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Representative Results
Gli animali di studio possono subire il paradigma comportamentale prova settimanale o mensile per ospitare i punti di tempo necessario richiesti per l'analisi. Vedere la Figura 1 per esempi sui tempi di test comportamentali. Nei dati rappresentativi qui sotto, preso da Osmon ha et al. (2016), i topi hanno subito la batteria di test comportamentali mensile, cominciando a 12 settimane di età, fino al loro endpoint umano circa 40 settimane di età. I tempi di test comportamentali a volte è critico per un esperimento, soprattutto quando la sopravvivenza di non trattata contro animali trattati varia drasticamente e sono richiesti confronti.
Anche se questi test non sono utilizzati esclusivamente per i disordini neurodegenerative, abbiamo usato i topi di Sandhoff (Vedi Figura 2). Questo mouse modello ottiene sempre più traballante e non coordinati da 12-16 settimane di età, se non trattata e normalmente richiedono euthanization a 16 settimane di età1. I dati in Figura 2D viene illustrato l'utilizzo del rotarod come un mezzo per vedere come i topi trattati si comportano rispetto ai normali topi eterozigoti. La divergenza dei due gruppi a 40 settimane indica l'inizio di coordinamento in diminuzione del gruppo di trattamento rispetto ai controlli normali. In altri modelli del mouse dove è all'esame un fenotipo più lieve, si raccomanda l'ulteriore espansione e specializzazione di questa batteria di test.
Quando si selezionano i risultati pertinenti per la pubblicazione, è importante tenere a due fattori principali di mente. Il primo è che la metrica utilizzata dovrebbe essere scelto per essere specifici per il modello animale utilizzato. Nell'OFT, la misura più comunemente usata è "lo spostamento di tempo" (come si vede nella Figura 2); Tuttavia, "distanza percorsa" è anche una metrica comune per la locomozione generale. In RR, "fine rpm" e "distanza percorsa" sono comunemente usate metriche. Il secondo fattore nella scelta di quale metrica dovrebbe essere scelto come un risultato adatto ruota intorno a quale metrica rivela la più significativa divergenza o convergenza negli esiti comportamentali, a seconda di quale sono attesi i risultati.
Dati raccolti potrebbero essere analizzati usando multipli test statistici, ma per coerente test comportamentali settimanali o mensili utilizzando stessi topi, è suggerito un 2 vie ripetere-misure analisi della varianza (2-way RM-ANOVA). Le misure ripetute ANOVA consente la valutazione longitudinale dei risultati dall'animale stesso e consente il confronto dei cambiamenti nel comportamento degli animali nel corso del tempo, così come tra i gruppi. La correzione di Bonferroni è anche suggerita. Quando si confrontano i trattamenti all'interno stesso timepoint, un one-way ANOVA è suggerito, come si vede nella Figura 2.
Figura 1: esempi di possibili Timeline sperimentale per il test comportamentali. Test comportamentale può essere fatto con una varietà di sequenze temporali, a seconda delle necessità sperimentali. Test può essere fatto su base mensile, settimanale o combinatoria. Nell'esempio fornito, il periodo di studio dura per 23 settimane, dove la settimana 0 è l'amministrazione di trattamento. Quando test si verifica su base mensile, i test vengono eseguiti su settimane 4, 8, 12, 16 e 20. Quando test si verifica su base settimanale, le prove sono condotte ogni settimana (settimane 1-22) prima l'endpoint di 23 settimane. Quando test si verifica su base combinatoria, le prove vengono effettuate settimanalmente su settimane 1-8, e quindi le prove sono effettuate mensilmente su settimane 12, 16 e 20 prima dell'endpoint di 23 settimane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: i risultati dei test comportamentali mensili dove animali trattati sovraperformare animali non trattati. A 12 settimane, gli animali trattati sovraperformare animali non trattati su "tempo in movimento" OFT (A) e la "latenza a cadere" in MT (E). Non ci sono differenze statistiche fra gli animali trattati e non trattati nel rpm"rotarod fine" a 12 settimane (C). Nel corso di analisi comportamentale del mensile, i topi trattati eseguire in modo simile ai normali controlli eterozigoti l' OFT (B), il RR (D)e il MT (F). Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software statistico (ad es. GraphPad), One-way ANOVA test sono stati eseguiti sull'analisi settimana 12 (2A, Ced E) e 2-way RM-ANOVA test sono stati eseguiti sull'analisi mensile ( 2B, D, e F). Tutte le barre di errore sono SEM. Questa cifra per volta da Osmon ha et al. 1 e ristampato con il permesso da Mary Ann Liebert Publishers, Inc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per tutti i test, pulire e disinfettare la superficie per ridurre al minimo i contagi e distrattori ai topi. Inoltre, essere certi che i topi sono dato sufficienti periodi di riposo tra una prova e tra comportamentale prove quando si utilizza l'OFT, RR e Mt.
Nell'OFT, è fondamentale che ogni mouse è posizionato al centro di campo aperto e che il programma viene avviato al momento del rilascio del mouse verso il centro. Essere sicuri che non ci sono nessun movimenti della mano che i sensori possono registrare all'avvio del programma.
Per la MT, è importante avere una barriera tra l'area di rete dove il mouse si blocca e i lati del contenitore in che stanno cadendo. È stato notato che quando i topi possono raggiungere il lato del contenitore, rilasciano lentamente il loro paws anteriori e quindi la loro schiena zampe per saltare giù. Una barriera tra le mura e il centro della maglia di nastratura notevolmente riduce questo comportamento e consente una misura più accurata della forza muscolare.
Da solo, ciascuna di queste prove è una buona misura per la locomozione generale (prova in loco aperta), forza muscolare (test di rete) e di coordinamento (rotarod)2,7,8. Tuttavia, presi insieme, la collezione completa di questi tre test comportamentali consente la valutazione generale di locomozione in topi. Questo gruppo di test indipendente conferma la mancanza di effetti in danno del motore il complesso funzionamento motore di confondimento. La principale limitazione di questi metodi è la valutazione generale di locomozione, che è problematico per estremamente specifico deficit nel funzionamento comportamentale. Inoltre, questi test, come tutti i test comportamentali, sono soggette a cambiamenti nel comportamento a causa di fattori di stress esterni, come suono, cambiamenti di temperatura e cicli di luce. È prudente mantenere un ambiente esterno coerente per tutti i soggetti di prova. Questa batteria di test comportamentali può essere ampliata per includere i test per l'atassia e la memoria. Altri metodi per lo studio della forza muscolare2,8,9 includono lo svolgimento di velocità costante RR per correlare i risultati di forza muscolare con il Mt. Per valutazioni più specifiche sulla forza muscolare, coordinamento o atassia, ci sono presa forza2 e pesi test15 e fascio di equilibrio o andatura analisi analisi2, rispettivamente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la nuova speranza Resarch Fondazione per il finanziamento della nostra ricerca e il loro continuo supporto. Vorremmo anche ringraziare IITC parziale sostegno finanziario per questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
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