Introduction
في هندسة الأنسجة وbiosensing، والقدرة على التحكم في التنظيم المكاني للبروتينات وخلايا على نطاق ميكرون، أصبحت ذات أهمية متزايدة على مدى العقود الأربعة الماضية 1، 2، 3. وقد سمح التنظيم المكاني دقيقة من البروتينات والخلايا الباحثين لدراسة التفاعل بين الخلايا وركائز التي تحتوي على أنواع مماثلة أو مختلفة من الخلايا، لتوجيه نمو الخلايا، ولشل حركة الجزيئات الحيوية لتصنيع أجهزة الاستشعار 4، 5، 6، 7، 8، 9.
وتشمل الأساليب الحالية للبروتينات الزخرفة photopatterning وmicrocontact الطباعة. Photopatterning تستخدم المواد الحساسة للضوء التي crosslinked عند التعرض لغلاهالأشعة فوق البنفسجية (UV) الضوء. ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تستهدف الضوئية الرئيسية (التي تتكون من مناطق شفافة مع المناطق الداكنة لمنع الأشعة فوق البنفسجية نقل الضوء) يسبب يشابك في مناطق محددة والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لمرفق لاحق من المواد الحيوية أو خلايا 10 و 11. في حين أن هذا المخطط هو دقيق جدا ويسمح لمراقبة دقيقة من تضاريس سطح الثقافة، فإنه يقتصر على الجزيئات الحيوية حساسة للأشعة فوق البنفسجية التي يمكن نمط من الأشعة فوق البنفسجية (12). microcontact الطباعة هي طريقة شعبية أخرى من الزخرفة بروتينات معينة 13 و 14. في هذه الطريقة، يتم التعامل على siloxane (PDMS) ختم بولي ميثيل مع مجموعة متنوعة من الكواشف تعديل السطح قبل نقعه في حل الركيزة الجزيئية البيولوجية الذي تم اختياره. ثم يتم الضغط برفق على ساترة الزجاج أو أي سطح آخر وهكذا "ختم" جزيء حيوي على سطح الثقافة. هوويفر، يقتصر ختم لنوع من المواد التي يمكن نقلها وكذلك بلل من الجزيئات الحيوية لسطح PDMS ختم 15.
الزخرفة مباشرة من الخلايا يمكن أن يكون أكثر صعوبة وتعتمد على أساليب معقدة مثل ركائز للتحويل، وأساليب الاستنسل مقرها، أو الزخرفة مع خلية التصاق جزيئات محددة 16 و 17. تقتصر هذه الأساليب في قدرتها على خلايا نمط نظرا لعدم وجود متوافقة ركائز التصاق الخلية، عدم توافق عملية للعمل مع الخلايا الحساسة البيولوجية والقيود، عدم الاتساق في استنساخ الزخرفة، وتعقيد الإجراءات. على سبيل المثال، مع ركائز للتحويل، تحتاج ركائز مخصصة لتكون مصممة لكل نوع من الخلايا، لتبديل تمسكهم أنواع معينة من الخلايا دون تدهور عند التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية والحرارة المستخدمة في عملية 17 < الطبقة سوب = "XREF"> 18، 19، 20. أساليب الزخرفة على أساس الاستنسل وتنوعا في قدرتها على خلايا النمط. ومع ذلك، فإنه من الصعب لتصنيع الإستنسل PDMS في سمك مناسبة للاستخدام 16، 21. الحقن المباشر للخلايا في القنوات ميكروفلويديك PDMS لها بعض المزايا مثل: 1) سهولة في تلفيق من القنوات ميكروفلويديك و2) ملاءمة لكثير من الخلايا وركائز مختلفة. ومع ذلك، فإن القضية السائدة من القبض على فقاعة الهواء أثناء عملية الحقن بسبب للا مائية من PDMS دون استخدام تنظيف البلازما، أو وسائل أخرى لتقليل فقاعات الهواء، ويجعل من الصعب خلق باستمرار خلايا نقوش على الزجاج أو البلاستيك السطوح 21.
توسع هذا العمل على شعري micromolding 22، 23،معشوقة = "XREF"> 24 و 25 و 26 و تقارير طريقة لحقن البروتين والخلايا تعليق في microchannels. الطريقة المستخدمة هنا يدل على الزخرفة من ركائز وكلا الزخرفة المباشرة وغير المباشرة لأنواع معينة من الخلايا. هذه التقنية يتغلب للا مائية عالية من PDMS ويلغي وجود فقاعات أثناء الحقن إما ركائز أو الخلايا عن طريق الاستفادة من نفاذية الغاز من PDMS 27. توضح هذه الورقة استخدام هذه التقنية مع العديد من ركائز مختلفة وأنواع الخلايا. كما يسلط الضوء على المادة في تصنيع قوالب الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام ضوئيه التقليدية فضلا عن بسيطة ولاصقة منخفضة التكلفة طريقة الشريط المفيد في الموارد إعدادات محدودة 28، 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. بعض المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول سامة ومسرطنة. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة (غطاء الدخان، صندوق قفازات) ومعدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل والأحذية المغلقة اصبع القدم) عند استخدام المواد السامة أو حمض / قاعدة.
1. تصنيع ماستر لقوالب لينة الطباعة الحجرية باستخدام الطباعة التصويرية
- رسم تخطيط متناهية باستخدام أداة رسم التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
- طباعة تخطيط على طبق من ذهب قناع فارغة باستخدام الكاتب قناع الليزر.
- شطف رقاقة السيليكون 4 بوصة مع الأسيتون تليها الأيزوبروبانول والجافة مع بندقية الهواء النيتروجين لضمان عدم ترك أي مذيب على الرقاقة.
- يذوى رقاقة عن طريق الخبز على طبق ساخن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- اختر مقاومة للضوء سلبي مصممة للارتفاع المطلوب من و microchannels. Fأو سبيل المثال، استخدم مقاومة للضوء سلبي SU-8 50 للحصول على microchannels مع ارتفاع 50 ميكرون.
- تسمح الرقاقة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة، ثم محاذاة رقاقة على ظرف من المغطي تدور.
- الاستغناء عن 4 مل (1 مل / بوصة قطر الرقاقة) من مقاومة للضوء سلبي على مركز الرقاقة.
- تدور معطف الرقاقة مع دورة تدور على مرحلتين باستخدام الدوار. أولا، وتطبيق دورة انتشار 500 دورة في الدقيقة مع تسارع من 100 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 10 ثانية. ثم تطبيق دورة دوران 2000 دورة في الدقيقة مع تسارع من 300 دورة في الدقيقة / ق 2 لمدة 30 ثانية للحصول على طلاء 50 ميكرون من مقاوم الضوء على رقاقة.
- خبز لينة الرقاقة في خطوتين على طبق ساخن وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لطلاء 50 ميكرون من مقاومة للضوء، لأول مرة قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ثم المنحدر فورا درجة الحرارة صفيحة ساخنة لمرحلة ما بعد خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تسمح الرقاقة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم تحميلرقاقة على خشبة المسرح الطباعة الحجرية.
- محاذاة قناع على الرقاقة باستخدام قناع اليجنر وفضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في كثافة من 1.5 ميغاواط / سم 2 ل 146 ق لتطبيق الجرعة الكلية للأشعة فوق البنفسجية من 220 ميغا جول / سم 2 المطلوبة ل 50 ميكرون طبقة سميكة من مقاومة للضوء.
- تطبيق بعد التعرض خبز إلى رقاقة في خطوتين على طبق ساخن. لطلاء 50 ميكرون من مقاومة للضوء، لأول مرة قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وعلى الفور تكثيف درجة الحرارة صفيحة ساخنة لمرحلة ما بعد خبز أنه في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تطوير رقاقة في قبل غمر الرقاقة في SU-8 المطور ويهز بلطف حتى تصبح ملامح واضحة على الرقاقة. تطوير رقاقة ل~ 6 دقائق للمقاومة للضوء سميكة 50 ميكرون.
- شطف المطور الزائد مع الأيزوبروبانول والإيثانول، ثم تجفيف رقاقة مع بندقية الهواء النيتروجين.
- من الصعب خبز رقاقة السيليكون على طبق ساخن على 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- ضع الرقاقة في مجفف مع 25 ميكرولتر من وكيل silanizing tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
ملاحظة: عامل silanizing غير قابلة للتآكل، وبالتالي ينبغي أن تستخدم في غطاء الدخان حمض / قاعدة، مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (نظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية). - تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق وفضح الرقاقة لأبخرة من سيلاني لمدة 30 دقيقة دون الإفراج عن فراغ.
- نقل رقاقة في طبق بيتري الحجم بشكل مناسب.
2. تصنيع ماستر لقوالب لينة الطباعة الحجرية باستخدام شريط لاصق
- رسم تخطيط متناهية باستخدام أداة رسم CAD وطباعة الرسم على ورقة بيضاء.
- تنظيف شريحة زجاجية كبيرة بما يكفي لاستيعاب تصميم مع الأيزوبروبانول ثم تجف الشريحة مع بندقية الهواء.
- إرفاق شريط لاصق على الشريحة الزجاجية تنظيفها. يجب الحرص على عدم اعتراض أي فقاعات الهواء.
- الشريط جانبي GLASS تنزلق على ورقة مع تصميم ومع الشريط لأعلى.
- استخدام مشرط لقطع الشريط على شريحة زجاجية باستخدام تصميم ورقة كمرجع ثم تقشر الشريط من المناطق غير المرغوب فيها من شريحة زجاجية.
- شطف الشريحة الزجاجية مع الأيزوبروبانول وجاف ثم مع بندقية الهواء. خبز الشريحة الزجاجية في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- لفة بلطف على الشريط مع بكرة مطاطية لإزالة فقاعات الهواء والسماح الشريحة ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
3. لينة الطباعة الحجرية تصنيع الأجهزة PDMS
- مزيج PDMS المطاط الصناعي وكيل علاج في نسبة 10: 1 (ث: ث)، وتحريك الخليط بقوة، ثم ديغا الخليط عن طريق وضعها في غرفة فراغ حتى لا تظهر فقاعات الهواء في الخليط.
- يصب الخليط على قالب السيليكون silanized أو العفن شريط لاصق في طبق بتري للحصول على طبقة سميكة من PDMS وديغا و~ 2 مم حتى عن الهواء تختفي فقاعات.
- علاج PDMS في فرنعند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- استخدام مشرط لقطع طبقة PDMS 5 مم على الأقل بعيدا عن الميزات وثم قشر PDMS شفي من العفن باستخدام الملقط.
- لكمة ثقب مدخل واحد مع خزعة 1 مم لكمة في أي مكان على متناهية، ويفضل أن يكون في نهاية شبكة من microchannels كما رأينا في الشكل 2A و 4B.
- تنظيف PDMS يلقي بشريط لاصق لإزالة جزيئات الغبار كثف على الجهاز. تعقيم الجهاز متناهية PDMS (PDMS الزهر) قبل الشطف بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول تليها منزوع الأيونات معقمة الماء (DI)، وفضح للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- الحفاظ على جهاز PDMS العقيمة في طبق بتري معقمة حتى الاستخدام.
4. الركيزة الزخرفة
- وضع PDMS العقيمة يلقي باستخدام الملقط على ساترة زجاجية معقمة أو طبق بتري وتطبيق ضغط لطيف باستخدام غيض من ملاقط.
ملاحظة: يلقي PDMS يجعل امتثالي لكن ختم عكسها مع GLساترة الحمار أو طبق بتري تشكيل microchannels دون استخدام أية مواد لاصقة. - وضع قطرة (20 - 40 ميكرولتر) من الحل الركيزة على مدخل تغطي تماما ثقب مدخل. نمط بولي-D-ليسين (PDL) عن طريق وضع قطرات 20 ميكرولتر من PDL في المخزن بورات ثنائي الصوديوم على مدخل و microchannels.
- وضع طبق بتري في فراغ من ~ 254 mmHgA (أي ما يعادل لإيواء فراغ في المختبرات البيولوجية) لمدة 10 دقيقة، ومراقبة الهواء يخرج من القناة على شكل فقاعات.
- الافراج عن فراغ ومراقبة الحل الركيزة التي تصب في متناهية.
- احتضان طبق في الظروف الملائمة لالتزام الركيزة. انظر الجدولين 1 و 2 للشروط الحضانة (وهذه تختلف تبعا الركيزة). لPDL الزخرفة، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تقشر بعناية الطابع PDMS باستخدام الملقط معقمة وغسل نمط على ساترة الزجاج ثلاث مرات بالماء DI. إضافة محلول 1٪ زلال المصل البقري (BSA) إلى طبق بتري لتغطية صحن أو الزجاج ساترة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
ملاحظة: هذا سوف يقلل التزام غير محددة في مناطق غير المصقول. - نضح قبالة حل جيش صرب البوسنة 1٪، والركيزة نمط هو الآن جاهزة للاستخدام.
5. الزخرفة غير المباشرة من الخلايا
- إعداد تعليق خلية في مستنبت المصل خالية. يتم سرد نوع من الخلايا وكثافة الخلايا في الجدول 1.
- إضافة تعليق الخلية إلى طبق بيتري منقوشة تماما وغمر المنطقة نقوش في تعليق خلية.
- احتضان طبق بتري عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على الركيزة المزخرفة.
- نضح تعليق الخلية الزائدة من طبق بيتري وغسل الخلايا نمط ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، في حين تهز برفق لمدة 10 ثانية لإزالة الخلايا غير مرتبط.
- إضافة لمستنبت ppropriate على ثقافات خلية نمط واحتضان خلايا نمط عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2.
6. الزخرفة المباشرة للخلايا
ملاحظة: هذه التقنية كبديل لتنميط الخلية غير المباشرة هو موضح في الخطوة 5. ومع ذلك، خلافا لما حدث في الخطوة 5، في هذه التقنية على نمط الخلايا على الأسطح زراعة الأنسجة مع أو بدون طلاء الركيزة.
- تعقيم الجهاز ميكروفلويديك قبل الشطف بمحلول مكون من 70٪ من الإيثانول تليها مياه DI.
- نقع الجهاز بين عشية وضحاها في حل من 1٪ BSA لمنع التصاق الخلية إلى PDMS.
- تجفيف الجهاز في درجة حرارة الغرفة وضمها الى الجزء السفلي من طبق بتري تعامل ثقافة الأنسجة.
- إعداد تعليق خلية في وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. يتم سرد نوع من الخلايا وكثافة الخلايا في الجدول 2.
- وضع قطرة (4-8 ميكرولتر) لتعليق الخلية، وهو ما يكفي لملءmicrochannels، على مدخل تغطي تماما ثقب مدخل.
- وضع طبق بتري في فراغ لمدة 10 دقيقة ومراقبة الهواء يخرج من القناة على شكل فقاعات. الافراج عن فراغ ومراقبة تعليق الخلية التي تصب في متناهية.
- احتضان طبق بتري في حاضنة لتعزيز التصاق الخلايا وفقا للشروط الحضانة (تعتمد على نوع من الخلايا نمط) المذكورة في الجدول 2. إضافة برنامج تلفزيوني على طبق بتري غمر الجهاز PDMS.
- قشر PDMS بعناية قبالة طبق بتري مع ملاقط وغسل النمط مع برنامج تلفزيوني. إضافة وسائط الثقافة الخلية إلى طبق بتري ومكان زراعة الخلايا في الحاضنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتسمح هذه الطريقة في الزخرفة من البروتينات والزخرفة غير المباشرة من الخلايا باستخدام مسدود قنوات ميكروفلويديك مع أبعاد صغيرة مثل 10 ميكرون والتجهيزات المتوفرة في معظم المختبرات البيولوجية بمجرد اعتماد القالب الرئيسي. ويمكن استخدام هذه التقنية مع قنوات ميكروفلويديك PDMS التي تم إنشاؤها باستخدام ضوئيه الناعمة التقليدية، أو مع القنوات ميكروفلويديك PDMS التي تم إنشاؤها باستخدام شريط لاصق تلفيق (الشكل 1) 28، 29. لقد أثبتنا سابقا استخدام هذا الإجراء في الزخرفة غير المباشرة للخلايا العصبية لتقييم التوجيه محور عصبي في خلايا مستقبلة للضوء 4، 30، وأظهروا الآن استخدامه في العديد من أنواع الخلايا إضافية من أصول مختلفة. الفئران الجنينية الخلايا العصبية القشرية نمط على بولي-D-ليسين (PDL) والسطوح laminin تظهر adherenc العامه إلى المناطق المزخرفة والنمو على طول PDL والمشارب laminin (الشكل 3A). تلتزم C2C12 خطوط الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية أيضا إلى منطقة نقوش وإظهار الانصهار في myotubes متعددة النوى (الشكل 3B). تكيفنا أيضا هذه التقنية لتنميط الخلية مباشرة كما رأينا مع الخلايا الليفية في الشكل (4). كما ذكرت سابقا، وأظهرت هذه الطريقة خلية الزخرفة المباشر أي تأثير سلبي على بقاء الخلية 30. يتم سرد المتغيرات التي تؤدي إلى نجاح الزخرفة مباشرة أو غير مباشرة من أنواع الخلايا ورد في الجدول رقم 1 و 2. وهكذا في المستقبل، والباحثين قد تستخدم هذه التقنية لخلايا نمط واكتشاف الظواهر المتعلقة الزخرفة الخاصة.
الشكل 1: تصنيع قالب من قبل لينة الطباعة الحجرية. اليسار: طبعة حجرية ضوئيةعملية ذ. SU-8 هو تدور المغلفة على رقاقة السيليكون، ويتعرضون للأشعة فوق البنفسجية، وضعت لإزالة الزائد SU-8. الحق: شريط لاصق عملية التصنيع. يتم إرفاق شريط لاصق على شريحة زجاجية نظيفة، وقطع مع مشرط، وإزالة بعناية الشريط الزائد. ثم يتم ملفقة PDMS المدلى بها من كل قالب باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على جهاز PDMS لالركيزة الزخرفة. (أ) PDMS يلقي ميكروفلويديك مع مدخل المستخدمة في الزخرفة ميكروفلويديك من ركائز. تعرض للكم مدخل للخروج في نهاية واحدة من microchannels. (ب) قناة ميكروفلويديك كما يرى تحت المجهر النقيض من المرحلة. قنوات الموائع الدقيقة هي 15 ملم في الطول، و 20 ميكرومتر واسعة، لد مفصولة 200 ميكرون. ويرد الشكل 2 بإذن من معهد جامعة هارفارد للنشر. جميع الحقوق محفوظة ل30. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): غير المباشرة الزخرفة الخلية. (أ) فراغ بمساعدة عملية تنميط البروتين. ويرد PDMS جهاز قناة ميكروفلويديك إلى طبق بتري، يتم تحميل حل الركيزة إلى مدخل، يتم تطبيق فراغ لفترة وجيزة إلى غرفة وأفرج عنه، وإزالة جهاز PDMS، يتم غسلها نمط، وجاهزة للاستخدام. (ب) الجنينية الخلايا العصبية الفئران القشرية المصنفة على ساترة مع منقوشة PDL و laminin الركيزة. خطوط (ج) C2C12 الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية نمت على منقوشة PDL و laminin. وترد أرقام 3A و 3C مع عermission من IOP النشر. جميع الحقوق محفوظة ل30. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الزخرفة خلية المباشرة. (أ - ج) الخلايا الليفية نمط عبر الزخرفة الخلية مباشرة. (أ) ملفقة جهاز قناة ميكروفلويديك باستخدام لاصقة الطباعة الحجرية الشريط. (ب) قنوات ميكروفلويديك بعد ملء مع تعليق الخلية الليفية باستخدام فراغ بمساعدة تقنية الزخرفة. (ج) الخلايا الليفية بعد إزالة جهاز ميكروفلويديك. (د) Calcein-AM تلطيخ الخلايا الليفية بعد الزخرفة الموائع الدقيقة. صورة النقيض (ه) المرحلة الخلايا الليفية بعد الزخرفة الموائع الدقيقة. (و - ز ل30. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| غير المباشرة الزخرفة الخلية | المادة المتفاعلة | البروتين شروط الحضانة | كثافة الخلية | التصاق الخلية مدة |
| PC12 | الكولاجين-1 | 1 ساعة عند 50 درجة مئوية | 5 × 10 6 / مل | 1 ساعة عند 37 درجة مئوية |
| الليفية | الكولاجين-1 | 1 ساعة عند 50 درجة مئوية | 5 × 10 6 / مل | 1 ساعة عند 37 درجة مئوية |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وغسل برنامج تلفزيوني، بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية | 2 × 10 6 / مل | 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية |
| الجنينية الجرذ العصبونات القشرية | PDL + Laminin | 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وغسل برنامج تلفزيوني، بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية | 2 × 10 6 / مل | 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية |
| السمندل الشبكية العصبية | سال-1 | بين عشية وضحاها في 10 درجة مئوية | N / A | 1 ساعة عند 10 ° C |
الجدول 1: غير المباشرة شروط الزخرفة الخلية. قائمة الشروط الحضانة مثل نوع الركيزة، والوقت ودرجة الحرارة وكثافة الخلايا لأنواع الخلايا العادية. يجب على الباحثين تحسين شروط الحضانة لركائز من نموذج الخاصة ونوع من الخلايا. سال-1 هو الركيزة الأجسام المضادة المستخدمة لزراعة السمندر الخلايا العصبية للشبكية.
| الزخرفة الخلية مباشرة | المادة المتفاعلة | كثافة الخلية | الوقت التصاق الخلية |
| PC12 | الكولاجين-1 | 6 × 10 6 / مل | 1 ساعة عند 37 درجة مئوية |
| الليفية | الكولاجين-1 | 6 × 10 6 / مل | 1 ساعة عند 37 درجة مئوية |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 × 10 6 / مل | 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية |
| الجنينية الجرذ العصبونات القشرية | PDL + Laminin | 2 × 10 6 / مل | 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية |
| السمندل الشبكية العصبية | سال-1 | N / A | 1 ساعة عند 10 ° C |
= "1"> الجدول 2: المباشرة شروط الزخرفة الخلية. قائمة الشروط الحضانة مثل درجة الحرارة والوقت وكثافة الخلايا لأنواع الخلايا العادية. يجب على الباحثين تحسين شروط الحضانة لنوع خاص خلية نموذجهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين ضوئيه التقليدية هي تقنية راسخة لإنشاء قوالب للالطباعة الحجرية الناعمة والمعدات والمواد والمهارات اللازمة لاستخدام ضوئيه التقليدية ليست متاحة بسهولة في معظم المختبرات. للمختبرات دون الوصول إلى هذه الموارد، قدمنا لاصقة تلفيق الشريط كوسيلة لخلق قوالب مع ملامح بسيطة نسبيا لأجهزة ميكروفلويديك. هذا الأسلوب يسمح أي مختبر لخلق والاستفادة ميكروفلويديك الأجهزة لأغراض البحث مع الأدوات المتاحة بسهولة. يمكن تحسين أسلوب شريط لاصق مع منخفضة التكلفة الفينيل سطح المكتب القاطع 31. تقطيع الفينيل سطح المكتب قد يزيد استنساخ، القرار، فضلا عن تخطيط التعقيد. كل من هذه الخيارات، ضوئيه التقليدية وتقطيعها سطح المكتب، أو تلفيق شريط لاصق لديهم قدرات مختلفة والقيود والباحثين يجب أن تنظر بعناية الطريقة التي ستكون كافيةللحصول على احتياجاتهم.
في PDMS الشفاء، وسلاسل البوليمر طويلة من siloxane ميثيل تشكل شعرية، هيكل nanoporous مما يخلق المناطق الفارغة التي يمكن شغلها مع جزيئات الهواء 27. هذا العقار نفاذية الغاز هو المفتاح لدينا وسيلة لملء قنوات الموائع الدقيقة. عند وضعها في بيئة الضغط المنخفض، تتم إزالة جزيئات الهواء من المواد السائبة PDMS كذلك و microchannels أنفسهم 25. ثم عندما يتعرض PDMS إلى الضغط الجوي، والمواد السائبة PDMS وmicrochannels تحتفظ الضغط السلبي لبعض الوقت 25 و 30. ويستند هذا الضغط السلبي السائل في و microchannels سد قنوات ميكروفلويديك تلقائيا. استمر هذا الضغط السلبي لرسم سائل في القناة حتى PDMS السائبة equilibrates مع الضغط الجوي.
هذه التقنية بمساعدة فراغ يسمح patterniنانوغرام من البروتينات وركائز محددة على ركيزة النمو. في هذه الدراسة، كنا قادرين على نمط عدة ركائز مختلفة وأنواع الخلايا بصورة مباشرة وغير مباشرة (الجدول 1 و 2). ومع ذلك، قد تحتاج المجرب لاختبار أوقات مختلفة الحضانة، وكثافة الخلايا، أو وسائل الإعلام البذر لنوع معين المحمولة الخاصة بهم. هذه المتغيرات من المرجح أن تتصل القدرة الفطرية إما الخلية أو الركيزة التمسك السطح يتم وضعها على. على سبيل المثال، تتطلب هنا C2C12 خلايا استخدام وسائل الإعلام خالية من المصل لوسائل الإعلام البذر قبل زراعة الخلايا في DMEM مع مصل الحصان 2٪. بالإضافة إلى ذلك، الأحكام قد تختلف بناء على ما إذا كانت ساترة الزجاج أو طبق بتري البلاستيك يتم منقوشة. هنا، سواء عملت بشكل جيد للسماح الزخرفة محددة من أنواع الخلايا المختلفة.
كان واحدا من المخاوف الأولية كان لدينا مع استخدام هذه التقنية كيف التعرض لفراغ قد تؤثر على بقاء الخلية. هذه الدراسة وصدراسات revious، ومع ذلك، يجب أن يلطف من هذه المخاوف كما بينا ذلك الفراغ لديها القليل من أي تأثير على مجموعة متنوعة من الخلايا 30. وانغ وآخرون. تستخدم سابقا نزع الغاز مختومة بشكل لا رجعة فيه غرف ميكروفلويديك لتحميل خلايا هيلا 32. وقد استخدمت دراسات أخرى بمساعدة فراغ بذر خلية لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الإنسان الجذعية، الخلايا الملتصقة وغير ملتصقة، وخط الخلية البشرية المهجنة الهامستر (A L) خلايا تحميل إلى قنوات الموائع الدقيقة 33. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتعرض غيرهم من الباحثين الخلايا لضغوط فراغ أكبر بكثير بالمقارنة مع هذه الدراسة الحالية مع قليل من دون تأثير ملحوظ على الخلايا 33. الفقاعات تشكلت أثناء إزالة الهواء من متناهية تميل إلى التجمع على سطح الحبرية للتعليق على المدخل. في كثير من الأحيان هذه الفقاعات لا تمزق بسبب التوتر السطحي للتعليق. نحن لم observإد انخفاض ملحوظ في بقاء الخلية بسبب الفقاعات. وبالإضافة إلى ذلك، التجربة مع Calcein-AM لا تشير إلى انخفاض كبير في بقاء الخلية. وبسبب هذا، ونحن لم فحصها بدقة موت الخلايا على وجه التحديد بسبب الفقاعات.
وكثيرا ما تعاني المحاولات السابقة لركائز نمط أو خلايا من مشاكل مثل تشكيل فقاعات الهواء في أجهزة ميكروفلويديك. جعل تشكيل فقاعات الهواء من الصعب حقن السوائل بسهولة وكفاءة دون استخدام المعدات أو المواد التي لا تتوفر في معظم المختبرات. على سبيل المثال، استخدمت الأساليب السابقة استخدام العلاج البلازما أو العلاج الاكليل لتقليل للا مائية من microchannels PDMS 15، 34. في حين فعالة، والبلازما وآلات معالجة الهالة ليست متاحة بسهولة في معظم المختبرات. في هذا البروتوكول، ونحن إثبات القدرة على خلايا نمط وركائز ببساطة عن طريق استخدام مختبر مشتركالفراغات حزب المحافظين. باستخدام تقنية تصنيع شريط لاصق، ويمكن استخدام منهجية لخلق PDMS قنوات ميكروفلويديك إلى ركائز نمط أو خلايا في ما يقرب من أي مختبر.
من أجل ركائز نمط أو الخلايا التي تحتوي على بروتوكول الزخرفة فراغ، عدة خطوات حاسمة لتنميط ناجحة. أولا، لافتعال سيد شريط لاصق، شريط لاصق يجب إرفاق تماما على شريحة زجاجية وخالية من فقاعات الهواء. فقاعات الهواء إضعاف الرابطة بين الشريط وشريحة زجاجية وربما يؤدي إلى الشريط يتم خلع عندما شفي ومقشر PDMS قبالة العفن شريط لاصق. وبالإضافة إلى ذلك، سوف فقاعات تشويه هندسة قناة ميكروفلويديك مما تسبب في سطح القنوات أن يكون غير مستو. لجعل PDMS يلقي من SU-8 العفن، يجب silanized القالب SU-8 قبل الصب مع PDMS. هذه الخطوة حاسمة في منع ارتباط دائم من PDMS على القالب SU-8 بعد المعالجة من PDMS. قبل الختم امتثاليقناة PDMS ميكروفلويديك إلى coverslips الزجاج أو أطباق بتري بلاستيكية، يجب تنظيف PDMS من جميع ذرات الغبار. هذه الجسيمات قد يمنع تشكيل ختم امتثالي بين PDMS والزجاج، وبالتالي منع حقن الخلايا أو ركائز في قناة ميكروفلويديك. كما جاء في البروتوكول أعلاه، وتنظيف قنوات PDMS مع شريط لاصق غير حاسمة قبل الانضمام متناهية لcoverslips الزجاج أو أطباق بتري البلاستيكية. وأخيرا، بعد وضع الجهاز في فراغ الغرفة، الفراغ يجب أن يتم الافراج بلطف لمنع تهجير قطرات من الركيزة أو خلية الحل من ثقب مدخل.
إذا لوحظ أي سائل تصب في قناة ميكروفلويديك، قد يكون هناك تسرب في قناة ميكروفلويديك الذي من شأنه أن يمنع السائل من التدفق إلى القناة. إزالة الطابع PDMS وجافة وتنظيفه ثم كرر الخطوة 4، 5، أو 6 من هذه التقنية. إذا لم يكن الحل تتدفق متناهية بعد releبورصة عمان من فراغ، وضمان أن الحل يغطي تماما مدخل متناهية. ويمكن القيام بذلك من قبل pipetting الحل صعودا وهبوطا عدة مرات أثناء وضعه في حفرة المدخل. إذا الركيزة، بعد حقن في متناهية، لا نعلق على الزجاج وتقييم وتحديد شروط الحضانة المثلى اللازمة لالركيزة المستخدمة. إذا إزالة PDMS يلقي من على سطح الزجاج أو طبق بتري البلاستيك يسبب الخلايا نمط أو ركائز ليتم تدميرها، واستخدام أرق PDMS الزهر، وغمر PDMS يلقي في برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام، وببطء وبلطف قشر قبالة PDMS يلقي من الزجاج أو سطح البلاستيك مع ملاقط.
وأخيرا، قد BSA يكون حاسما في تقليل التصاق غير محددة من خلايا إما الزجاج unpatterned أو سطح من البلاستيك. وعادة ما تستخدم BSA بمثابة كاشف الحجب في النشاف الغربي، المناعية، وغيرها من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. وقد استخدمت باحثون آخرون أيضا لأنها غير مباشرة أو مباشرةبروتوكولات الزخرفة لتقليل الخلايا غير محددة التصاق 35، 36، 37. لقد وجدنا أن تلك الحضانة الركيزة مع ديوان الرقابة المالية اللازمة لمعظم أنواع الخلايا باستثناء خلايا الشبكية السمندل. وهذا قد يكون بسبب طبيعة أكثر تخصصا من الركيزة (جسم مضاد يدعى سال-1) التي تم استخدامها وكذلك نقص عام في التصاق الخلية عن طريق هذا النوع من الخلايا 38. في أيدينا، BSA كما لم تنخفض بشكل ملحوظ التزام الخلايا إلى مناطق نمط وخدم أساسا إلى انخفاض التزام غير محدد.
في حين أن هذه الطريقة صممت لتكون مرنة ومرونة في تطبيقه على الركيزة والخلايا أنواع مختلفة، وهناك العديد من القيود على هذا البروتوكول وخلايا متوافقة والركيزة. ونظرا للطبيعة الزخرفة الخلايا على السطح، أنواع الخلايا أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على تقتصر على ثوحد ذاتها والتي هي قابلة للأي بروتوكول الزخرفة مثل تلك الخلايا التي تكون قادرة على البقاء على قيد الحياة مع المزيد من الخلايا محدودة للاتصال المحمولة، فضلا عن تلك التي يمكن البقاء على قيد الحياة في تركيزات أقل خلية البذر. على سبيل المثال، تطبيق واحد محتمل هو الزخرفة من خلايا الخميرة لمجهر القوة الذرية (AFM) 39. ولئن كنا قد اختبرت العديد من ركائز مختلفة من الخلايا، قد لا تعمل ركائز أخرى مع هذه التقنية معينة مثل تلك التي تشكل المواد الهلامية ثلاثية الأبعاد. في هذا الوقت، ونحن لم فحصها إذا الهلام يشكل بشكل صحيح والبقاء على سطح ساترة الزجاج أو البلاستيك طبق بتري بعد الزخرفة. هذه التقنية قادرة على الزخرفة الأشكال المعقدة ومناطق واسعة. ومع ذلك، فإنه لا يمكن نمط مجموعة من الأشكال فصل الفردية دون ربط microchannels. في غياب microchannels مترابطة، فإن كل شكل على حدة يتطلب مدخل خاص بها جعل تقنية مرهقة. في حين أننا لم نلاحظ أي عدم تماثله في صatterning البروتين، توزيع خلايا نمط داخل متناهية قد تكون غير موحدة. قد يكون راجعا إلى التوزيع العشوائي للخلايا في تعليق خلية، والهندسة وأبعاد و microchannels، واللزوجة لتعليق الخلية هذا غير التوحيد.
في المستقبل، يمكن تطبيق هذه التقنية لأنواع أخرى من ركائز والخلايا. على سبيل المثال، والمواد الهلامية ثلاثية الأبعاد مثل مصفوفة الغشاء القاعدي أو السقالات الكولاجين من الممكن أن تكون منقوشة وشكلت باستخدام PDMS قنوات الموائع الدقيقة. عن طريق حقن هيدروجيل في الجهاز ميكروفلويديك، قد يستغرق هيدروجيل على شكل الجهاز ميكروفلويديك ويكون قادرا على تشكيل أنماط معقدة من دون استخدام الطابعات 3-D أو غيرها من التكنولوجيات. ومن شأن هذه تسمح لخلق السريع السقالات منظم مع الأدوات المتاحة بسهولة والأجهزة ميكروفلويديك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل لجنة ولاية نيو جيرسي في الحبل الشوكي البحوث (NJCSCR) (لFHK)، منح CSCR14IRG005 (لBLF)، المعاهد الوطنية للصحة منح R15NS087501 (لCHC)، ومؤسسة كيربي FM (لايتا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
