Introduction
In weefselengineering en biosensoren, de mogelijkheid om de ruimtelijke organisatie van eiwitten en cellen op een schaal urn besturen, wordt steeds belangrijker in de laatste vier decennia 1, 2, 3 worden. Nauwkeurige ruimtelijke organisatie van eiwitten en cellen heeft onderzoekers toegestaan om de interactie tussen cellen en substraten met soortgelijke of verschillende soorten cellen, celgroei leiden en om biomoleculen te immobiliseren voor het vervaardigen van biosensoren 4, 5, 6, 7, 8 onderzoeken 9.
De huidige methoden van patroonvorming eiwitten omvatten photopatterning en microcontact afdrukken. Photopatterning maakt gebruik van lichtgevoelig materiaal dat wordt verknoopt na blootstelling aan Ultreen violet (UV) licht. UV licht gericht op een fotomasker (bestaande uit transparante gebieden met donkerdere gebieden UV lichttransmissie voorkomen) veroorzaakt verknoping in specifieke regio's die vervolgens kunnen worden gebruikt voor verdere bevestiging van biomaterialen of cellen 10, 11. Hoewel dit systeem is zeer nauwkeurig en maakt nauwkeurige regeling van de topografie van het kweekoppervlak, is beperkt tot UV-gevoelige biomoleculen die kunnen worden gevormd door UV-straling 12. Microcontactprinten is een populaire methode van patroonvorming van specifieke eiwitten 13, 14. In deze werkwijze wordt een poly- dimethylsiloxaan (PDMS) stempel behandeld met verschillende oppervlaktemodificatie reagentia voordat geweekt in een oplossing van het gekozen biomoleculaire substraat. Vervolgens wordt voorzichtig op een glazen dekglaasje of ander oppervlak aldus "stempelen" het biomolecuul op het kweekoppervlak gedrukt. However, stempelen is beperkt tot het type materiaal, dat kan worden overgedragen als de bevochtigbaarheid van biomoleculen aan het oppervlak van het PDMS stempel 15.
Directe patroonvorming van cellen kan moeilijker zijn en voert complexe methoden zoals omschakelbare substraten, stencil gebaseerde methoden, of modelleren specifieke celadhesiemoleculen 16, 17. Deze methoden zijn beperkt in hun vermogen om cellen patroon door het ontbreken van compatibele celadhesie substraten onverenigbaarheid van het proces te laten werken met gevoelige biologische cellen en beperkingen, inconsistentie te reproduceren patroonvorming en complexiteit van de procedure. Bijvoorbeeld, met schakelbare substraten behoeftedouane substraten worden ontworpen voor elk celtype, om hun hechting aan specifieke celtypen te schakelen zonder afbraak bij blootstelling aan het UV-licht en warmte gebruikt in proces 17, < sup class = "xref"> 18, 19, 20. Stencil gebaseerde patronen methoden zijn veelzijdig in hun vermogen om patroon cellen; echter, is het moeilijk om PDMS stencils vervaardiging op geschikte dikten voor 16, 21. Directe injectie van cellen in PDMS microkanalen u voordelen zoals: 1) gemak in vervaardiging van microfluïdische kanalen en 2) geschiktheid voor verschillende cellen en substraten. De heersende vraag luchtbel vangen tijdens het injectieproces vanwege de hydrofobiciteit van PDMS zonder gebruik van plasmareiniging, of andere methoden om luchtbellen te verminderen, is het moeilijk om consequent gevormde cellen op glazen of kunststof oppervlakken 21 maken.
Dit werk breidt uit op capillaire micromolding 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 en rapporteert een werkwijze voor eiwit en celsuspensies injecteren in microkanalen. De hier gebruikte methode toont de patronen van substraten en zowel directe als indirecte patroonvorming van specifieke celtypen. Deze techniek overwint de hydrofobiciteit van PDMS en elimineert de aanwezigheid van bellen tijdens het inspuiten van zowel substraten of cellen door gebruik te maken van de gaspermeabiliteit van PDMS 27. Dit demonstreert het gebruik van de techniek met verschillende substraten en celtypen. Het artikel beschrijft tevens de vervaardiging van vormen voor zachte lithografie onder toepassing van gebruikelijke fotolithografie en een eenvoudige en goedkope plakband werkwijze bruikbaar in omgevingen met beperkte hulpbronnen 28, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Een deel van de chemicaliën die worden gebruikt in dit protocol zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alle nodige veiligheidsvoorschriften (zuurkast, dashboardkastje) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen) bij het gebruik van giftige of zuur / base materialen.
1. Fabricage van Master mallen voor Soft Lithography gebruik van fotolithografie
- Teken de layout van het microkanaal met een computer-aided design (CAD) tekenprogramma.
- Print de lay-out op een lege masker plaat met behulp van laser masker schrijver.
- Spoel een 4 inch siliciumwafel met aceton gevolgd door isopropanol en droog met een stikstof luchtkanon zodat geen oplosmiddel achterblijft op de wafer.
- Dehydrateer de wafer door het voor 5 minuten op een hete plaat bakken bij 200 ° C.
- Selecteer een negatieve fotoresist ontwikkeld voor de gewenste hoogte van de microkanalen. Fof bijvoorbeeld gebruik negatieve fotolak SU-8 50 tot microkanalen met een hoogte van 50 urn.
- Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur, en lijn de wafer op de as met een spin coater.
- Verdeel 4 ml (1 ml / inch diameter van de wafel) negatieve fotoresist op het midden van de wafel.
- Spin de vacht van de wafer met een twee-staps centrifugeren met behulp van een spinner. Breng eerst een spreiding cyclus van 500 rpm met een versnelling van 100 rpm / s 10 s. Eventueel een centrifuge van 2000 rpm met een versnelling van 300 rpm / s 2 tot 30 s op een 50 urn bekleding van fotoresist verkrijgen op een wafer.
- Zachte bak de wafer in twee stappen op een hete plaat volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Een 50 urn bekleding van fotoresist, eerste pre-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 6 minuten en daarna onmiddellijk opvoeren van de verwarmingsplaat temperatuur post-bak de wafer bij 95 ° C gedurende 20 min.
- Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur en plaats hetwafer op de lithografie podium.
- Lijn het masker op de wafer via mask aligner en bloot de wafer aan UV-licht (volgens de instructies van de fabrikant) met een intensiteit van 1,5 mW / cm2 gedurende 146 s op de totale UV-dosis van 220 mJ toepassing / cm2 nodig om een 50 pm dikke laag fotoresist.
- Solliciteer na blootstelling bakken van de wafer in twee stappen op een hete plaat. Voor een 50-um laag van fotoresist, eerste pre-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 min en onmiddellijk opvoeren van de verwarmingsplaat temperatuur post-bakken bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Ontwikkelen van de wafer in door onderdompeling de wafer in SU-8 ontwikkelaar en voorzichtig schudden tot de kenmerken duidelijk op de wafer worden. Ontwikkelen van de wafel voor ~ 6 min voor de 50 micrometer dik fotolak.
- Spoel overtollige ontwikkelaar met isopropanol en ethanol, vervolgens drogen van de wafel met een stikstof luchtpistool.
- Hard bak de siliciumwafel op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 15 minuten.
- Plaats dewafer in een exsiccator met 25 pi van de silaneren middel tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichloorsilaan.
LET OP: De silaneren middel is corrosief, daarom moet worden gebruikt in een zuur / base zuurkast, met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen). - Onder vacuüm gedurende 5 min en de wafer bloot te dampen silaan gedurende 30 min zonder het vacuüm.
- Breng de wafer in een geschikte grootte petrischaal.
2. Fabricage van Master mallen voor Soft Lithography met plakband
- Teken de lay-out van het microkanaal met behulp van een CAD tekenprogramma en print de tekening op wit papier.
- Reinig een glasplaatje groot genoeg is om het ontwerp met isopropanol tegemoet en droog de dia met een luchtpistool.
- Bevestig plakband op het gereinigde glasplaatje. Wees voorzichtig niet te vangen eventuele luchtbellen.
- Tape de zijkanten van de glass schuif op het papier met het ontwerp, met de tape naar boven.
- Gebruik een scalpel om de tape bezuinigen op het glaasje met het ontwerp voor een papieren als een referentie en dan loslaten tape tegen ongewenste gebieden van het glaasje.
- Spoel het glaasje met isopropanol en vervolgens droog met een luchtpistool. Bak het glaasje in een oven bij 65 ° C gedurende 30 minuten.
- Schud via tape met een rubberrol om luchtbellen te verwijderen en de slede afkoelen tot kamertemperatuur.
3. Soft Lithography Fabrication van het PDMS Devices
- Meng PDMS elastomeer en de verharder in een verhouding van 10: 1 (w: w), roer het mengsel krachtig, waarna wordt ontgast het mengsel door deze in een vacuümkamer totdat er geen luchtbellen verschijnen in het mengsel.
- Giet het mengsel op een gesilaniseerd silicium schimmel of plakband schimmel in een petrischaaltje een ~ 2 mm dikke laag PDMS en ontgast te krijgen tot alle luchtbellen verdwijnen.
- Genezen van de PDMS in een ovenbij 65 ° C gedurende 2 uur.
- Gebruik een scalpel om de PDMS laag uitgesneden ten minste 5 mm afstand van de functies en pel de uitgeharde PDMS uit de mal met behulp van pincet.
- Punch één inlaatopening met een 1 mm biopsie punch overal op het microkanaal, bij voorkeur aan het einde van een netwerk microkanalen zoals in figuur 2a en 4b.
- Reinig de uitgebrachte met plakband om stofdeeltjes geadsorbeerd op het apparaat te verwijderen PDMS. Steriliseer het PDMS microkanaal inrichting (PDMS cast) door spoelen met een oplossing van 70% ethanol gevolgd door steriel gedeïoniseerd (DI) water en blootstellen aan UV gedurende 30 min.
- Houd het steriel PDMS apparaat in een steriele petrischaal tot gebruik.
4. Substrate patroonvorming
- Plaats de steriele PDMS gegoten met behulp van een pincet op een steriele glazen dekglaasje of petrischaal en druk zachtjes met de punt van de pincet.
LET OP: De PDMS cast maakt een conforme maar omkeerbare afdichting met de glass dekglaasje of petrischaal vormen microkanalen zonder gebruik van lijm. - Plaats een druppel (20-40 ui) van de substraatoplossing aan de inlaatzijde volledig bedekt de inlaatopening. Patroon Poly-D-Lysine (PDL) door een 20 ul druppel PDL in natriumtetraboraat buffer aan de inlaatzijde van de microkanalen.
- Zet de petrischaal in een vacuüm van ~ 254 mmHgA (equivalent aan vacuümbron in biologische laboratoria) gedurende 10 min, en let lucht die uit het kanaal in de vorm van bellen.
- Laat de stofzuiger en let op de substraat oplossing stroomt in de microkanaal.
- Incubeer de schotel op de juiste voorwaarden voor het substraat therapietrouw. Zie de tabellen 1 en 2 voor incubatieomstandigheden (deze varieert afhankelijk van de ondergrond). PDL patronen, incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Trek voorzichtig de PDMS stempel met steriele pincet en was het patroon op glas dekglaasje driemaal met DI-water. Voeg een oplossing 1% runderserumalbumine (BSA) aan de petrischaal om de schotel of glazen dekglaasje te bedekken en incubeer overnacht bij 37 ° C.
Opmerking: Dit zal niet-specifieke hechting in ongecoate regio's te verminderen. - Aspireren van de 1% BSA-oplossing en het gevormde substraat is nu klaar voor gebruik.
5. indirecte patroonvorming van cellen
- Bereid de celsuspensie in serumvrij kweekmedium. Het celtype en celdichtheid staan in tabel 1.
- Voeg de celsuspensie aan de patroon petrischaal en het patroon regio celsuspensie volledig onder te dompelen.
- Incubeer de petrischaal bij 37 ° C in een incubator gedurende 15 minuten om de cellen te hechten aan het substraat patroon.
- Zuig het overtollige celsuspensie van de petrischaal en was de gevormde cellen driemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) onder zacht schudden gedurende 10 s tot losse cellen te verwijderen.
- Voeg de appropriate kweekmedium de patroon celculturen en incubeer de gevormde cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator.
6. Directe patroonvorming van cellen
Opmerking: Deze techniek is een alternatief voor de indirecte patroonvorming cel beschreven in stap 5. Anders dan in stap 5, in deze techniek worden cellen gevormd op weefselcultuuroppervlakken met of zonder substraat coating.
- Steriliseer het microfluïdische apparaat door spoelen met een oplossing van 70% ethanol, gevolgd door DI-water.
- Week de inrichting overnacht in een oplossing van 1% BSA aan de celadhesie aan het PDMS voorkomen.
- Droog het apparaat bij kamertemperatuur en bevestig deze aan de onderkant van de weefselkweek behandelde petrischaal.
- Bereid de celsuspensie in serumvrij kweekmedium. Het celtype en celdichtheid worden in tabel 2.
- Plaats een druppel (4-8 ui) van de celsuspensie, genoeg om het vullenmicrokanalen, aan de inlaatzijde volledig bedekt de inlaatopening.
- Zet de petrischaal in een vacuüm gedurende 10 min en observeren lucht die uit het kanaal in de vorm van bellen. Laat het vacuüm en observeer de celsuspensie stroomt in de microkanaal.
- Incubeer de petrischaal in een incubator celadhesie bevorderen volgens de incubatieomstandigheden (afhankelijk van celtype patroon) in tabel 2 vermeld. Voeg PBS aan de petrischaal onderdompelen PDMS het apparaat.
- Schil de PDMS voorzichtig van de petrischaal met een pincet en was het patroon met PBS. Voeg celcultuur media om de petrischaal en plaats de celkweek in de incubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze werkwijze maakt de patroonvorming van eiwitten en indirecte patroonvorming van cellen onder toepassing doodlopende microkanalen met afmetingen van slechts 10 urn en machines in bijna alle biologische laboratoria wanneer de kapitein mal gemaakt. Deze techniek kan worden gebruikt met PDMS microkanalen gemaakt met traditionele zachte fotolithografie, of PDMS microfluïdische kanalen gecreëerd met plakband vervaardiging (figuur 1) 28, 29. We hebben eerder aangetoond dat het gebruik van deze procedure indirecte patroonvorming van neuronale cellen voor evaluatie van axon begeleiding fotoreceptoren 4, 30, en hebben nu aangetoond dat deze volgens verschillende andere celtypen van verschillende oorsprong. Embryonale rat corticale neuronen patroon op de poly-D-lysine (PDL) en laminine oppervlakken aantonen algemeen adherence de gevormde ruimtes groei langs de PDL en laminine strepen (figuur 3A). C2C12 myoblasten cellijnen ook houden aan het patroon gebied en aan te tonen fusie in meerkernige myotubes (Figuur 3B). We hebben ook aangepast deze techniek directe cel patronen gezien met fibroblasten in figuur 4. Zoals eerder gemeld, deze directe cel patroonvormingswerkwijze toonden geen nadelig effect op celoverleving 30. De variabelen die leiden tot succesvolle directe of indirecte patroonvorming van genoemde celtypen zijn weergegeven in tabel 1 en 2. Dus in de toekomst, kunnen onderzoekers deze techniek patroon cel nuttige ontdekken verschijnselen in verband met hun specifieke patronen.
Figuur 1: Fabricage van Mold van Soft Lithography. Links: Photolithography proces. SU-8 is gespincoat op een silicium wafer, blootgesteld aan UV-straling, en ontwikkeld om overmaat SU-8 te verwijderen. Rechts: Scotch fabricageproces. Plakband is om een schone glasplaatje bevestigd, gesneden met een scalpel, en overtollige tape wordt zorgvuldig verwijderd. PDMS cast wordt vervolgens vervaardigd uit elke vorm met behulp van zachte lithografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van een PDMS Inrichting voor Substrate patronen. (A) PDMS microfluïdische gegoten met inlaat voor microfluïdische patroonvorming van substraten. Stikstofinlaat werd uitgeponst aan het uiteinde van microkanalen. (B) microfluïdische kanaal gezien onder fasecontrast microscopie. Microkanalen zijn 15 mm lang en 20 urn breed is,d gescheiden door 200 urn. Figuur 2 is overgenomen met toestemming van IOP Publishing. Alle rechten voorbehouden 30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Indirecte Cell patroonvorming. (A) Vacuum bijgestaan eiwit patroonvorming proces. PDMS microfluïdische kanaal inrichting op een petrischaaltje bevestigd wordt substraatoplossing geladen in de inlaat, wordt vacuüm toegepast om kort kamer gerekt, PDMS apparaat verwijderd, patroon gewassen en klaar voor gebruik. (B) embryonale corticale rat neuronen gezaaid op een dekglaasje met een patroon PDL en laminine substraat. (C) C2C12 myoblast cellijnen gekweekt op gevormde PDL en laminine. Figuren 3a en 3c worden weergegeven met permission van IOP Publishing. Alle rechten voorbehouden 30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Direct Cell patroonvorming. (A - c) fibroblasten patroon via directe cel patronen. (A) microfluïdische kanaal apparaat vervaardigd met behulp van plakband lithografie. (B) microfluïdische kanalen na het vullen met fibroblast celsuspensie met behulp van vacuüm bijgestaan patronen techniek. (C) fibroblasten na verwijdering van microfluïdische apparaat. (D) calceïne-AM kleuring van fibroblasten na microfluïdische patroonvorming. (E) fase contrast beeld van fibroblasten na microfluïdische patroonvorming. (F - g 30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Indirect Cell patroonvorming | Substraat | Eiwit Incubation Voorwaarden | celdichtheid | Cell Adhesie Duur |
| PC12 | Collageen-1 | 1 uur bij 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 uur bij 37 ° C |
| fibroblast | Collageen-1 | 1 uur bij 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 uur bij 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminine | 1 uur bij 37 ° C, wassen PBS, overnacht bij 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min bij 37 ° C |
| Embryonale Rat corticale neuronen | PDL + Laminine | 1 uur bij 37 ° C, wassen PBS, overnacht bij 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min bij 37 ° C |
| Salamander Retinal Neuronen | Sal-1 | gedurende de nacht bij 10 ° C | N / A | 1 uur bij 10 ° C |
Tabel 1: Indirect Cell patroonvorming Voorwaarden. Lijst van incubatiecondities zoals type substraat, tijd, temperatuur, en celdichtheid voor typische celtypen. Onderzoekers moeten de incubatietijd voorwaarden voor hun eigen model substraten en celtype te optimaliseren. Sal-1 is het antilichaam substraat gebruikt Salamander retinale neuronen groeien.
| Direct Cell patroonvorming | Substraat | celdichtheid | Cell Adhesie tijd |
| PC12 | Collageen-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 uur bij 37 ° C |
| fibroblast | Collageen-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 uur bij 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminine | 2 x 10 6 / mL | 15 min bij 37 ° C |
| Embryonale Rat corticale neuronen | PDL + Laminine | 2 x 10 6 / mL | 15 min bij 37 ° C |
| Salamander Retinal Neuronen | Sal-1 | N / A | 1 uur bij 10 ° C |
Tabel 2: Direct Cell patroonvorming Voorwaarden. Lijst van incubatie-omstandigheden zoals temperatuur, tijd, en celdichtheid voor typische celtypen. Onderzoekers moeten optimaliseren van de incubatie voorwaarden voor hun eigen soort model cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl conventionele fotolithografie is een gevestigde techniek voor het creëren van vormen voor zachte lithografie, uitrusting, materialen en vaardigheden die nodig conventionele fotolithografie gebruiken zijn niet gemakkelijk beschikbaar voor de meeste laboratoria. Laboratorium zonder toegang tot deze middelen hebben we plakband vervaardiging voorgesteld als een methode om matrijzen met relatief eenvoudige functies voor microfluïdische inrichtingen. Deze methode maakt het mogelijk elk laboratorium te creëren en te benutten microfluïdische apparaten voor onderzoeksdoeleinden met direct beschikbaar gereedschap. De kleefband methode kan worden verbeterd met een low-cost desktop vinyl cutter 31. Desktop snijplotters kunnen reproduceerbaarheid, resolutie, evenals layout complexiteit toenemen. Elk van deze opties, conventionele fotolithografie, desktop cutters, of plakband fabricage hebben verschillende mogelijkheden en beperkingen en onderzoekers moeten zorgvuldig overwegen welke methode die voldoende zou zijnvoor hun behoeften.
In uitgeharde PDMS, de lange polymere ketens van dimethylsiloxaan vormen een rooster, nanoporeuze structuur die lege gebieden die kunnen worden gevuld met luchtmoleculen 27 ontstaat. Deze doorlaatbare eigenschap gas is de sleutel tot onze manier van het vullen van microfluïdische kanalen. Bij plaatsing in een lage druk omgeving worden luchtmoleculen uit de PDMS bulkmateriaal en de microkanalen 25 zelf. Wanneer de PDMS vervolgens blootgesteld aan atmosferische druk, de PDMS stortgoed en microkanalen behouden van een negatieve druk tijdje 25, 30. Deze negatieve druk trekt vloeistof in de microkanalen automatisch vullen van de microfluïdische kanalen. Deze negatieve druk blijft vloeistof in het kanaal totdat de bulk PDMS in evenwicht met de atmosferische druk.
Dit vacuüm- techniek maakt patterning specifieke eiwitten en substraten op een groeisubstraat. In deze studie, konden we patroon verschillende substraten en celtypen zowel direct als indirect (Tabel 1 en 2). Echter kan de experimentator moeten verschillende incubatietijden, celdichtheden of zaaien media testen op hun specifieke celtype. Deze variabelen waarschijnlijk betrekking op het aangeboren vermogen van zowel de cel of het substraat te houden aan de oppervlakte wordt op elkaar geplaatst. Bijvoorbeeld, hier C2C12 cellen vereist het gebruik van serumvrije media voor het zaaien media voor kweken van de cellen in DMEM met 2% paardenserum. Daarnaast kan voorwaarden variëren op basis van de vraag of een glas dekglaasje of plastic petrischaaltje wordt gevormd. Hier zijn zowel werkte goed mogelijk maakt specifieke patroonvorming van verschillende celtypen.
Een van de eerste problemen die we hadden, terwijl gebruik te maken van deze techniek was hoe de blootstelling aan vacuüm levensvatbaarheid van de cellen kunnen beïnvloeden. Deze studie en prige studies echter moeten deze bezwaren weg te nemen zoals we hebben aangetoond dat vacuüm weinig tot geen effect op een verscheidenheid van cellen 30. Wang et al. eerder gebruikt ontgast onherroepelijk afgesloten microfluïdische kamers om HeLa-cellen 32 te laden. Andere studies hebben gebruikt vacuüm- zaaien van cellen voor een verscheidenheid van celsoorten waaronder humane stamcellen, hechtende en niet-hechtende cellen en humane-hamster hybride cellijn (A L) cellen laden in microkanalen 33. Bovendien hebben andere onderzoekers cellen onderworpen aan veel grotere vacuümdrukken in vergelijking met de huidige studie met weinig tot geen waarneembaar effect op de cellen 33. Gevormde bellen tijdens het verwijderen van lucht uit de microkanaal ontmoeten elkaar op het oppervlak van de druppel van de suspensie bij de inlaat. Vaak zijn deze belletjes niet scheuren als gevolg van de oppervlaktespanning van de suspensie. We hebben niet OBSERVed een opmerkelijke afname in cellevensvatbaarheid door luchtbellen. Bovendien heeft het experiment met calceïne-AM niet wijzen op een significante daling van de levensvatbaarheid van de cellen. Daardoor hebben we niet grondig onderzocht celdood bepaald door bellen.
Eerdere pogingen om patroon substraten of cellen werden vaak geplaagd door problemen zoals de vorming van luchtbellen in de microfluïdische inrichtingen. De vorming van luchtbellen was het moeilijk om vloeistoffen gemakkelijk en efficiënt inbrengen zonder het gebruik van apparatuur of materialen die niet in de meeste laboratoria. Bijvoorbeeld, eerdere werkwijzen gebruikt het gebruik van plasmabehandeling of coronabehandeling de hydrofobiciteit van PDMS microkanalen 15, 34 afnemen. Hoewel effectief, plasma en corona treaters zijn niet direct beschikbaar in de meeste laboratoria. In dit protocol tonen we het vermogen om cellen en substraten patroon gewoon gebruikelijke laboratory stofzuigers. Met de plakband fabricagetechniek, kan de methode worden gebruikt om PDMS microkanalen patroon substraten of cellen te creëren in bijna elk laboratorium.
Om patroon substraten of cellen met het vacuüm patroonvormende protocol verscheidene stappen zijn essentieel voor een succesvolle patroonvorming. Enerzijds de plakband meester fabriceren, de kleefband moet volledig worden bevestigd aan het glaasje en vrij van luchtbellen. Luchtbellen verzwakken de binding tussen de band en het glaasje en kunnen leiden tot de band afgepeld na uitharding PDMS is afgepeld het plakband mal. Bovendien zal bellen de geometrie van de microfluïdische kanaal waardoor het oppervlak van de kanalen niet-vlak zijn verstoren. Om de cast van SU-8 mal PDMS te maken, moet de SU-8 mal worden gesilaniseerd voordat gieten met PDMS. Deze stap is essentieel bij het voorkomen van de duurzame bevestiging van PDMS de SU-8 mal na het uitharden van PDMS. Vóór conforme afdichtingvan de PDMS microfluïdische kanaal dekglaasjes of plastic petrischalen, moet de PDMS reinigen van stofdeeltjes. Deze deeltjes kunnen de vorming van een conforme afdichting tussen PDMS en glas te voorkomen en daarmee te voorkomen dat de injectie van cellen of substraten in de microfluïdische kanaal. Zoals in het bovenstaande protocol, het reinigen van de PDMS kanalen met plakband kritisch vóór hechten van het microkanaal naar dekglaasjes of plastic petrischalen. Tenslotte, nadat het toestel in de vacuümkamer, het vacuüm moet voorzichtig vrijgegeven om verplaatsing van de druppel substraat of celoplossing het inlaatgat voorkomen.
Als geen vloeistof wordt waargenomen stroomt in de microfluïdische kanaal, kan er een lek in de microfluïdische kanaal dat zal verhinderen dat vloeistof stroomt in het kanaal. Verwijder de PDMS stempel, droog en schoon te maken en herhaalt u stap 4, 5 of 6 van de techniek. Als de oplossing niet stroomt in de microkanaal na release van vacuüm, ervoor te zorgen dat de oplossing volledig is met betrekking tot de ingang van het microkanaal. Dit kan door pipetteren oplossing en neer meerdere malen terwijl deze in de inlaat gat. Indien het substraat na het injecteren in het microkanaal, niet hechten aan het glas, evaluatie en bepaling van de optimale incubatietijd voorwaarden voor het gebruikte substraat. Als het verwijderen van de cast van het glasoppervlak of plastic petrischaaltje PDMS zorgt ervoor dat de gevormde cellen of substraten worden vernietigd, gebruik dan een dunnere PDMS cast, dompel de uitgebrachte in PBS of media PDMS, en langzaam en voorzichtig afpellen de uitgebrachte uit het glas PDMS of kunststof oppervlak met een pincet.
Tenslotte kan BSA kritische afnemende niet-specifieke hechting van cellen aan hetzij het effen glas of kunststof oppervlak. BSA wordt typisch gebruikt als een blokkerend reagens in western blotting, immunokleuring en andere moleculaire biologische technieken. Andere onderzoekers hebben ook gebruikt het voor directe of indirectepatroonvorming protocollen aspecifieke celhechting 35, 36, 37 afnemen. We vonden dat incubatie van het substraat met BSA noodzakelijk was voor de meeste celtypes behalve salamander retinale cellen. Dit kan zijn omdat de meer gespecialiseerde aard van het substraat (een antilichaam genaamd Sal-1), dat ook werd gebruikt als het algemene gebrek aan celhechting door dit celtype 38. In onze handen, BSA ook niet merkbaar de hechting van cellen verminderen tot gevormde ruimtes diende voornamelijk niet-specifieke hechting verminderen.
Hoewel deze methode is veelzijdig en flexibel in de toepassing ervan op verschillende substraat en celtypen te zijn, zijn er verschillende beperkingen aan dit protocol en de compatibele cellen en substraat. Vanwege de aard van patroonvorming van cellen op een oppervlak, de celtypes die deze techniek kunnen worden toegepast zijn beperkt tot those die vatbaar zijn voor elk patroon protocol zijn zoals cellen die kunnen overleven met beperktere cel tot cel contact en die kunnen overleven onderste cel enten concentraties. Bijvoorbeeld een mogelijke toepassing is de patroonvorming van gistcellen voor atomaire kracht microscopie (AFM) 39. Hoewel wij vele andere cel substraten getest, kunnen andere substraten niet met deze bijzondere techniek zoals die driedimensionele gels vormen. Momenteel hebben wij onderzocht of gels correct richten en blijven op het oppervlak van de glazen dekglaasje of plastic petrischaal na patroonvorming. Deze techniek kan patroonvorming complexe vormen en grote gebieden. Echter, het kan niet patroon een reeks van individuele gescheiden vormen zonder tussendeur microkanalen. Aangezien verbonden microkanalen zou elke afzonderlijke vorm zoekt eigen inlaat waardoor de techniek omslachtig. Hoewel we merkten geen non-uniformiteit in patterning eiwit, kan de verdeling van cellen gevormd in het microkanaal niet-uniform zijn. Deze ongelijkmatigheid kan worden veroorzaakt door de willekeurige verdeling van cellen in celsuspensies, geometrie en afmetingen van de microkanalen en viscositeit van de celsuspensie.
In de toekomst kan deze techniek worden toegepast op andere typen substraten en cellen. Bijvoorbeeld kunnen driedimensionale gels zoals basaalmembraan matrix of collageen scaffolds mogelijk worden gevormd en gevormd middels PDMS microkanalen. Door het injecteren van een hydrogel in de microfluïdische inrichting, kan de hydrogel van de vorm van het microfluïdische apparaat nemen en kunnen complexe patronen te vormen zonder het gebruik van 3-D printers en andere technologieën. Deze zouden zorgen voor snelle oprichting van gestructureerde steigers met direct beschikbare middelen en microfluïdische apparaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door de Jersey Commissie Nieuw op Spinal Cord Research (NJCSCR) (naar FHK), verlenen CSCR14IRG005 (tot BLF), NIH verlenen R15NS087501 (tot CHC), en de FM Kirby Foundation (ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
