Introduction
組織工学とバイオセンシングでは、ミクロンスケールのタンパク質や細胞の空間的な組織を制御する能力は、最後の四十年1、2、3の上にますます重要になってきています。タンパク質および細胞の正確な空間的な組織は、研究者は、細胞増殖を誘導すること、およびバイオセンサー4、5、6、7、8の製造のために生体分子を固定化するために、細胞の同様のまたは異なる種類を含む細胞と基板の間の相互作用を調べることを可能にしました9。
パターニングタンパク質の現在の方法は、光パターン及びマイクロコンタクト印刷が挙げられます。フォトパターンはultrに曝露されると架橋されている感光材料を利用しますバイオレット（UV）光。 （UV光の透過を防止するために、暗い領域と透明な領域からなる）、フォトマスクに向けられたUV光は、生体材料またはセル10,11の後続の結合のために使用することができる特定の領域に架橋させます。この方式は非常に正確であり、培養表面のトポグラフィーを正確に制御することができるが、それは、UV放射12によってパターニングすることができるUV感受性生体分子に限定されます。マイクロコンタクトプリント法は、特定のタンパク質13、14をパターニングする別の一般的な方法です。この方法では、ポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプは、選択された生体分子の基質の溶液に浸漬される前に、表面改質剤の様々な治療されます。次に、それを静かにこのように培養表面上に生体分子を「スタンプ」カバーガラスまたは他の表面に押し付けられます。ホーweverは、スタンプはPDMS 15をスタンプの表面への生体分子の濡れ性と同様に転写することができる材料の種類に限定されます。
細胞の直接パターニングがより困難になり、そのような特定の細胞接着分子16、17と切り替え可能基板、ステンシルベースの方法、またはパターニングのような複雑な方法に依存していることができます。これらの方法は、原因互換性細胞接着基板の欠如、敏感な生体細胞および制約で動作するプロセスの不適合、パターニング再生の矛盾、及び手順の複雑さにパターン細胞の能力が制限されています。例えば、切替可能な基質と、カスタム基板は、<、プロセス17において使用されるUV光及び熱への暴露時に劣化することなく、特定の細胞型への付着を切り替え、すべての細胞型のために設計される必要があります SUPクラス= "外部参照"> 18、19、20。ステンシルベースのパターニング方法は、パターンのセルにその能力に多目的です。しかしながら、使用16、21のために適切な厚さでPDMSステンシルを製造することは困難です。 1）マイクロ流体チャネルの製造及び2に容易に）多くの異なる細胞と基質のための適性：PDMSマイクロ流体チャネルへの細胞の直接注射は、次のようないくつかの利点を持っています。しかし、注入プロセス中に気泡の捕捉の流行問題は、気泡を減少させるプラズマ洗浄、または他の方法を使用せずにPDMSの疎水性のために、それが困難一貫ガラスまたはプラスチック表面21上にパターン化された細胞を作製することができます。
この作品は、毛細管マイクロモールド22、23と膨張します小娘= "外部参照"> 24、25、26およびマイクロチャネルへのタンパク質や細胞懸濁液を注入する方法を報告します。ここで使用される方法は、基板のパターン形成および特定の細胞型の両方の直接的および間接的なパターニングを示しています。この技術は、PDMSの高い疎水性を克服し、PDMS 27のガス透過性を利用して基板または細胞のいずれかの注入時の気泡の存在を排除します。本稿では、いくつかの異なる基質と細胞型と技術の使用を示しています。記事はまた、従来のフォトリソグラフィと同様に、リソースの限定された設定28、29で有用なシンプルかつ低コストの粘着テープ法を用いたソフトリソグラフィ用の金型の製造を強調しています。
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Protocol
注：使用前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質の一部は有毒で発ガン性があります。毒性または酸/基材を使用した場合、すべての適切な安全対策（ヒュームフード、グローブボックス）および個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）を使用してください。
フォトリソグラフィを用いて、ソフトリソグラフィのためのマスター金型の1製作
- コンピュータ支援設計（CAD）図面ツールを使用してマイクロチャネルのレイアウトを描きます。
- レーザーマスク描画装置を用いて、マスクブランク板にレイアウトを印刷します。
- いかなる溶媒をウェハ上に残っていないことを確実にするために窒素エアガンイソプロパノール及びドライ続いアセトンで4インチシリコンウエハをすすぎます。
- 5分間、200℃のホットプレート上で焼成することにより、ウエハを脱水。
- マイクロチャネルの所望の高さのために設計されたネガ型フォトレジストを選択します。 Fまたは、例えば、50μmの高さのマイクロチャネルを得るために、ネガティブフォトレジストSU-8 50を使用します。
- ウェハを室温に戻します、その後、スピンコーターのチャック上にウエハを合わせます。
- ウェーハの中心に、ネガ型フォトレジストの4mLの（ウェーハの1ミリリットル/インチ直径）を分配します。
- スピナーを用いた2段階の回転周期にコートにウェハをスピン。まず、10秒間100回転/秒の加速度で500回転の広がりサイクルを適用します。その後、ウエハ上のフォトレジストの50μmのコーティングを得るために、30秒間300回転/秒2の加速度で2000回転の回転サイクルを適用します。
- ソフトメーカーの指示に従って、ホットプレート上の2つのステップでウェハを焼きます。フォトレジストの50μmのコーティングについては、6分間の65℃でのウエハプリベーク最初にして、すぐに20分間95℃でポストベークするウエハホットプレートの温度を上昇します。
- ウェハを室温まで冷却した後、ロードしますリソグラフィステージ上にウエハ。
- マスクアライナを用いてウェハ上にマスクを合わせ、ために必要な220ミリジュール/ cm 2の総UV線量を適用するために146秒間、1.5ミリワット/ cm 2の強度で（製造業者の指示に従って）UV光にウェハを公開フォトレジストの厚さ50μmの層。
- ホットプレート上の2つのステップでウェハに露光後ベークを適用します。フォトレジストの50μmのコーティングのために、1分間65℃、ウェハプリベーク、直ちに最初のポストベークすること、95℃で5分間、ホットプレートの温度をランプアップ。
- SU-8現像液にウェハを浸漬し、特徴は、ウェハ上明確になるまで、穏やかに振とうすることにより、ウェーハを開発します。厚さ50μmのフォトレジスト用〜6分間ウェハを開発します。
- その後、窒素エアガンでウェハを乾燥、イソプロパノール及びエタノールで余剰の現像を洗い流してください。
- ハード15分間、150℃のホットプレート上にシリコンウェハを焼きます。
- 置きシラン化剤25μLのトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシランでデシケーター中でウェハ。
注：シラン化剤は、腐食性のある、このようにして、適切な個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）と、酸/塩基ドラフト内で使用されるべきです。 - 5分間の真空を適用し、真空を解除せずに30分間シランの蒸気にウェハを公開します。
- 適切なサイズのペトリ皿にウェハを転送します。
粘着テープを使用したソフトリソグラフィ用のマスター金型の2製作
- CADの描画ツールを使用して、マイクロチャネルのレイアウトを描き、白い紙に図面を印刷します。
- イソプロパノールで設計を収容した後、空気銃でスライドを乾燥するのに十分な大きスライドガラスを清掃してください。
- 清浄なガラススライド上に粘着テープを取り付けます。任意の気泡をトラップに注意しないこと。
- GLAの両側をテープssはテープ側を上にして、デザインを紙の上にスライドさせます。
- 参考として、紙のデザインを使用して、スライドガラス上にテープをカットした後、スライドガラスの不要な領域からテープを剥離するメスを使用してください。
- イソプロパノールでガラススライドを洗浄した後、エアガンで乾燥。 30分間65℃のオーブン中にスライドガラスを焼きます。
- 穏やかに気泡を除去し、スライドを室温に冷却させるために、ゴムローラーを用いてテープの上に転がります。
PDMSデバイスの3ソフトリソグラフィ製作
- 10の比でPDMSエラストマーと硬化剤を混合する：1（W：W）、混合物を激しく撹拌し、その後に気泡を混合物に表示されなくなるまで真空チャンバ内に配置することによって混合物を脱気。
- すべての気泡が消えるまで、PDMSと脱ガスの〜2ミリメートルの厚さの層を得るために、ペトリ皿の中でシラン化されたシリコン型や粘着テープの金型に混合物を注ぎます。
- オーブンでPDMSを治します2時間65℃。
- 離れの特徴から少なくとも5ミリメートルPDMS層をカットした後、ピンセットを用いて、金型から硬化PDMSを剥離するメスを使用してください。
- 好ましくは、 図2a及び図4bに見られるように、マイクロチャネルのネットワークの端部で、任意の場所にマイクロチャネルに、1mmの生検パンチを備えた単一の入口穴を開ける。
- デバイス上に吸着ダスト粒子を除去するために、粘着テープでキャストPDMSを清掃してください。滅菌脱イオン（DI）水、続いて70％エタノール溶液ですすぐことにより、PDMSマイクロチャネルデバイス（PDMSキャスト）を滅菌し、30分間UVにさらします。
- 使用するまで滅菌ペトリ皿中の滅菌PDMSデバイスを保管してください。
4.基板のパターニング
- 滅菌ガラスカバースリップまたはペトリ皿の上にピンセットを用いて鋳造滅菌PDMSを置き、ピンセットの先端を使用して穏やかな圧力を適用します。
注：PDMSキャストはGLと共形が、可逆的シールを作りますお尻のカバースリップまたは任意の接着剤を使用せずにマイクロチャネルを形成するペトリ皿。 - 完全入口孔を覆って、入口に基質溶液の - （40μL20）の液滴を配置します。マイクロチャネルの入口に四ホウ酸ナトリウム緩衝液中のPDLの20μLの液滴を配置することにより、パターンポリ-D-リジン（PDL）。
- 10分間（生物学研究所内の真空を収容するのに相当）、および気泡の形でチャネルから出てくる空気を観察〜254 mmHgAの真空中でペトリ皿を置きます。
- 真空を解除し、マイクロチャネルに流入基質溶液を観察します。
- 基板密着性のための適切な条件で皿をインキュベートします。 （これらは基板に応じて変化）インキュベーション条件を表1及び表 2を参照のこと。 PDLのパターニングに、37℃で1時間インキュベートします。
- 慎重に滅菌ピンセットを使用してPDMSスタンプをはがしし、DI水で3回カバーガラス上にパターンを洗います。 皿またはガラス製カバースリップをカバーし、37℃で一晩インキュベートするペトリ皿に、1％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を加えます。
注：これはコーティングされていない地域での非特異的付着を軽減します。 - 1％BSA溶液を吸引除去し、パターニングされた基板を使用する準備が整いました。
細胞の5.間接パターニング
- 無血清培地中の細胞懸濁液を調製します。細胞型および細胞密度を表1に示します。
- パターン化されたペトリ皿に細胞懸濁液を添加し、完全に細胞懸濁液中のパターン領域を水没。
- 細胞がパターン化された基板に付着することを可能にするために15分間インキュベーター中で37℃でペトリ皿をインキュベートします。
- ペトリ皿からの過剰の細胞懸濁液を吸引し、穏やかに付着していない細胞を除去するために10秒間振盪しながらリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でパターン形成細胞を3回洗浄します。
- Aを追加パターン化された細胞培養物にppropriate培地及びCO 2インキュベーター中37℃でパターン化細胞をインキュベートします。
細胞の6.ダイレクトパターニング
注：この方法は、しかし、ステップ5とは異なり、この技術では、細胞を基板コーティングの有無にかかわらず、組織培養表面上にパターン化された手順5で説明した間接的な細胞パターン形成に代わるものです。
- DI水、続いて70％エタノールの溶液で洗浄することにより、マイクロ流体デバイスを滅菌します。
- PDMSへの細胞接着を防止するために、1％BSAの溶液中で一晩デバイスを浸します。
- 室温でデバイスを乾燥させ、組織培養処理ペトリ皿の底に取り付けます。
- 無血清培地中の細胞懸濁液を調製します。細胞型および細胞密度を表2に示します。
- 満たすのに十分の細胞懸濁液 - （8μL4）、液滴を配置マイクロチャネルは、入口に完全に入口穴をカバーしています。
- 10分間真空中でペトリ皿を入れ、泡の形でチャネルから出てくる空気を観察します。真空を解除し、マイクロ流路に流入する細胞懸濁液を観察します。
- 表2に記載された（パターン化細胞のタイプに依存）インキュベーション条件に従って、細胞接着を促進するためのインキュベーターでペトリ皿をインキュベートします。 PDMSデバイスを沈めるシャーレにPBSを追加します。
- ピールPDMS慎重にピンセットでシャーレを切り、PBSでパターンを洗います。ペトリ皿に細胞培養培地を加え、インキュベーター内で細胞培養を置きます。
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Representative Results
この方法は、タンパク質およびマスターモールドが行われた後、ほぼすべての生物学研究室では10μmと利用可能な機器と小さい寸法のデッドエンドマイクロ流体チャネルを用いた細胞の間接的なパターニングのパターニングを可能にします。この技術は、伝統的なソフトフォトリソグラフィ、または粘着テープの製造（ 図1）28、29で作成されたPDMSマイクロ流体チャネルとを使用して作成されたPDMSマイクロ流体チャネルと共に利用することができます。我々は以前30、光受容体4における軸索ガイダンスの評価のための神経細胞の間接的なパターニングで、この手順を使用することを実証している今、様々な起源のいくつかの追加の細胞型においてその使用を実証しました。ポリ-D-リジン（PDL）上にパターン化胚性ラット皮質ニューロンとラミニンの表面は、一般的なadherencを実証しますPDLおよびラミニンストライプ（ 図3A）に沿ってパターン形成された領域と成長に電子。 C2C12筋芽細胞株はまた、パターン化された領域に付着し、多核筋管（ 図3B）に融合を実証します。 図4の線維芽細胞に見られるように我々はまた、直接細胞パターニングのためのこの技術を適応しています。以前に報告されたように、この直接の細胞パターン形成方法は、細胞の生存30に有害な影響を示しませんでした。記載の細胞タイプの正常な直接的または間接的なパターニングをもたらす変数が、表1及び2に記載されています。このように将来的には、研究者は、パターンセルにこの技術を利用し、その特定のパターニングに関連する現象を発見することができます。
図1：ソフトリソグラフィにより金型の作製。左：フォトリソグラフyのプロセス。 SU-8は、UV放射線に露光、シリコンウエハー上にスピンコートし、そして過剰なSU-8を除去するために開発されました。右：粘着テープの製造プロセス。粘着テープは、外科用メスで切断し、清浄なガラススライドに取り付けられ、そして過剰なテープを慎重に除去します。 PDMSキャストは、ソフトリソグラフィを用いてそれぞれの型から製造されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：基板パターン形成のためのPDMSデバイスの例。 （a）は、基板のマイクロ流体パターニングのために使用される入口とマイクロ流体キャストをPDMS。入口は、マイクロチャネルの一端に打ち抜きました。 （b）は、位相差顕微鏡下で見られるようなマイクロ流体チャネル。マイクロ流体チャネルは、幅20μm、長さ15ミリメートル、ありますdを200μmとすることにより分離しました。図2は、IOP出版の許可を得て再現されます。すべての著作権は、30を禁じます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：間接細胞パターン形成。 （a）は、真空補助タンパク質パターニングプロセス。 PDMSマイクロ流体チャネル装置は、基質溶液は、入口にロードされ、真空が簡単にチャンバに適用され、解放された、PDMSデバイスが除去され、パターンを洗浄し、そして使用する準備ができて、ペトリ皿に取り付けられています。 （b）は、胚性皮質ラットの神経細胞は、パターン化されたPDLおよびラミニン基板とカバーガラス上に播種しました。 （C）C2C12筋芽細胞株は、パターン化PDLおよびラミニン上で増殖させました。図3aおよび図3cは、pで再現されていますIOP出版からermission。すべての著作権は、30を禁じます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：直接細胞パターニング。 （ - c）の直接的な細胞パターニングを経てパターン化線維芽細胞。 （a）は、マイクロ流体チャネル装置は、粘着テープのリソグラフィを用いて製造しました。 （b）は、真空支援のパターニング技術を用いて線維芽細胞懸濁液を充填した後、マイクロ流体チャネル。 （c）は、マイクロ流体デバイスの除去後に線維芽細胞。 （d）のマイクロ流体パターニング後の線維芽細胞のカルセインAM染色。マイクロ流体パターニング後の線維芽細胞の（e）の位相コントラスト画像。 （F - グラム 、30を禁じます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 間接細胞パターニング | 基板 | タンパク質インキュベーション条件 | 細胞密度 | 細胞接着時間 |
| PC12 | コラーゲン-1 | 50℃で1時間 | 5×10 6 / mLの | 37℃で1時間 |
| 線維芽細胞 | コラーゲン-1 | 50℃で1時間 | 5×10 6 / mLの | 37℃で1時間 |
| C2C12 | PDL +ラミニン | 37℃で1時間、37℃で一晩、PBSを洗います | 2×10 6 / mLの | 37℃で15分間 |
| 胚ラット皮質ニューロン | PDL +ラミニン | 37℃で1時間、37℃で一晩、PBSを洗います | 2×10 6 / mLの | 37℃で15分間 |
| サラマンダー網膜ニューロン | SAL-1 | 一晩10℃で | N / A | 10℃で1時間 |
表1：間接細胞パターン形成条件。典型的な細胞タイプの基質の種類、時間、温度、および細胞密度などの培養条件のリスト。研究者は、独自のモデル基質および細胞型のためのインキュベーション条件を最適化すべきです。 SAL-1は、サンショウウオ網膜神経細胞を成長させるために使用される抗体の基板です。
| 直接細胞パターニング | 基板 | 細胞密度 | 細胞接着時間 |
| PC12 | コラーゲン-1 | 6×10 6 / mLの | 37℃で1時間 |
| 線維芽細胞 | コラーゲン-1 | 6×10 6 / mLの | 37℃で1時間 |
| C2C12 | PDL +ラミニン | 2×10 6 / mLの | 37℃で15分間 |
| 胚ラット皮質ニューロン | PDL +ラミニン | 2×10 6 / mLの | 37℃で15分間 |
| サラマンダー網膜ニューロン | SAL-1 | N / A | 10℃で1時間 |
表2：直接細胞パターニング条件。典型的な細胞型のための温度、時間、および細胞密度などの培養条件のリスト。研究者は、独自のモデル細胞型のためのインキュベーション条件を最適化すべきです。
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Discussion
従来のフォトリソグラフィは、ソフトリソグラフィ用の金型を作成するための十分に確立された技術、設備、材料、従来のフォトリソグラフィを使用するために必要なスキルですが、ほとんどの研究室に容易に入手できません。これらのリソースへのアクセスのない研究室のために、我々は、マイクロ流体デバイスのための比較的単純な機能を備えた金型を作成する方法として、粘着テープの製造を提示しています。この方法は、任意の研究室が作成し、容易に入手可能なツールと研究目的のためのマイクロ流体デバイスを利用することができます。粘着テープ法は、低コストのデスクトップビニルカッター31とを向上させることができます。デスクトップビニルカッターは、再現性、解像度、並びにレイアウトの複雑さを増加させることができます。これらのオプションは、従来のフォトリソグラフィ、デスクトップカッター、または粘着テープ製造の各異なる機能と制限や研究者を持って、慎重に十分であろう方法を検討する必要があります自分のニーズのために。
硬化したPDMSは、ジメチルシロキサンの長いポリマー鎖は、空気分子27を充填することができる空き領域を作成し、格子、ナノ多孔質構造を形成します。このガス透過性プロパティは、マイクロ流体チャネルを充填する手法の鍵となります。低圧環境に置かれたとき、空気分子がPDMSバルク材料並びにマイクロチャネル自体25から除去されます。 PDMSは、その後大気圧にさらされたとき、PDMSバルク材料とマイクロチャネルは、いくつかの時間25、30負圧を保持します。この負圧が自動的にマイクロ流体チャネルを充填マイクロチャネルに液体を引き込みます。この負圧は、バルクPDMSは、大気圧と平衡するまで、チャネルに液体を消費し続けます。
この真空アシスト技術がpatterniを可能にします成長基板上に特定のタンパク質と基質のngの。本研究では、いくつかの異なる基質および細胞型直接的および間接的の両方のパターンができた（ 表1および2）。しかし、実験者は彼らの特定の細胞型に対して異なるインキュベーション時間、細胞密度、または播種メディアをテストする必要があるかもしれません。これらの変数は、おそらくそれは上に置かれている表面に付着する細胞または基板のいずれかの生得的な能力に関係します。例えば、ここでC2C12細胞を2％ウマ血清を含むDMEM中で細胞を培養する前に、シーディング媒体の無血清培地の使用を必要としました。また、条件がカバーガラスやプラスチックシャーレをパターニングされているかどうかに基づいて異なる場合があります。ここでは、両方のは、様々な細胞型の特定のパターニングを可能にするためによく働きました。
この技術を利用しながら、私たちが持っていた初期の懸念の一つは、真空への曝露は、細胞生存率に影響を与える可能性のある方法でした。この研究およびp我々は真空セル30の様々な全く影響をほとんど持っていることが示されているようrevious研究は、しかし、これらの懸念を緩和する必要があります。 Wang ら。以前にHeLa細胞32をロードするために脱気し、不可逆的に密封されたマイクロ流体室を利用しました。他の研究では、マイクロ流体チャネル33にロードするヒト幹細胞は、接着性および非接着細胞、及びヒト-ハムスターハイブリッド細胞株（L）細胞を含む種々の細胞型のための真空支援細胞播種を使用しています。また、他の研究者らは、細胞33に識別可能な影響がほとんどで、この現在の研究に比べてはるかに大きい真空圧に細胞を供しています。マイクロチャネルからの空気の除去中に形成された気泡が入口で、懸濁液の液滴の表面に集まる傾向があります。多くの場合、これらの気泡は、サスペンションの表面張力に起因し破裂しないでください。我々はobservしていません気泡による細胞生存率の顕著な低下を編また、カルセインAMを用いた実験では、細胞生存率の有意な減少を示唆していません。このため、我々は徹底的により気泡に特異的に細胞死を検討していません。
パターン基板または細胞に以前の試みは、多くの場合、マイクロ流体デバイス中の気泡の形成などの問題に悩まされました。気泡の形成が困難機器またはほとんどの研究室で利用できない材料を使用することなく、容易かつ効率的に液体を注入することができました。例えば、従来の方法は、PDMSマイクロチャネル15、34の疎水性を減少させるために、プラズマ処理又はコロナ処理の使用を利用します。有効であるが、プラズマやコロナ処理機は、ほとんどの研究室で容易に入手できません。このプロトコルでは、我々は単に一般的なlaboraを用いたパターン細胞と基材への能力を実証しますクトリ掃除。粘着テープの製造技術を使用して、方法は、ほぼ任意の実験室におけるパターン基質または細胞にPDMSマイクロ流体チャネルを作成するために利用することができます。
真空パターニングプロトコルパターン基質または細胞にするために、いくつかのステップが成功したパターン形成のために重要です。まず、粘着テープマスターを製造するために、粘着テープを完全にスライドガラスに付着し、気泡を含まなければなりません。空気はテープとスライドガラスとの間の結合を弱める泡、硬化PDMSは粘着テープモールドを剥離する際に剥離されたテープにつながる可能性があります。また、気泡がチャネルの表面が非平面であることが原因のマイクロ流体チャネルの形状を歪ませるであろう。 SU-8鋳型から鋳造PDMSを作成するには、SU-8の金型は、PDMSとキャスティングする前に、シラン化されなければなりません。このステップは、PDMSの硬化後のSU-8型にPDMSの永久的な結合を防止する上で重要です。コンフォーマルシールの前にカバーガラスやプラスチックシャーレにPDMSマイクロ流体チャネルの、PDMSは、すべてのダスト粒子を除去しなければなりません。これらの粒子は、PDMSとガラスとの間の共形のシールの形成を防止し、従って、マイクロ流体チャネル内の細胞または基質の注入を防止することができます。上記のプロトコルで述べたように、粘着テープを用いてPDMSチャネルを洗浄する前にカバーガラスやプラスチックのペトリ皿にマイクロチャネルを接着するために重要です。最終的に、真空チャンバ内に装置を配置した後、真空を静かに入口孔から基板または細胞溶液の液滴の位置ずれを防止するために放出されなければなりません。
全く流体がマイクロ流体チャネルに流入観察されない場合は、チャネルに流入する液体を妨げるマイクロ流体チャネルに漏れがあってもよいです。乾燥、PDMSスタンプを削除し、それをきれいにした後、技術の手順4、5、または6を繰り返します。溶液をRELE後、マイクロチャネルに流入していない場合真空のASEは、溶液は完全にマイクロ流路の入り口を覆っていることを確認してください。これは、入口穴の中に入れながら、溶液を上下に数回ピペッティングすることによって行うことができます。基板は、マイクロチャネルに注入した後、ガラスに付着していない場合は、使用する基板のために必要な最適なインキュベーション条件を評価し、決定します。ガラス面やプラスチックシャーレからPDMSのキャストを削除すると、パターン化された細胞または基板が破壊される場合は、より薄いPDMSキャストを使用し、PBSまたはメディアにPDMSキャストを水没し、ゆっくりと静かにガラスからPDMSキャストをはがしまたはピンセットでプラスチック表面。
最後に、BSAは、パターン化されていないガラスやプラスチックの表面のいずれかへの細胞の非特異的接着を減少させるのに重要であり得ます。 BSAは、典型的には、ウエスタンブロット、免疫染色、及び他の分子生物学技術におけるブロッキング試薬として使用されます。他の研究者はまた、間接または直接のためにそれを利用しています非特異的な細胞接着35、36、37を減少させるためのプロトコルをパターニングします。私たちは、BSAと基板のインキュベーションはサンショウウオ網膜細胞を除いた大部分の細胞型のために必要であることがわかりました。これは、この細胞型38によって使用されるだけでなく、細胞接着の一般的な欠如した基板（SAL-1と呼ばれる抗体）のより特殊な性質のものであってもよいです。私たちの手では、BSAも顕著にパターン化領域への細胞の付着を減少させなかったし、主に非特異的付着を減少させるのに役立ちました。
この方法は、異なる基板および細胞型への適用で汎用性と柔軟になるように設計されているが、このプロトコルと互換性のある細胞と基板のいくつかの制限があります。なぜなら表面に細胞をパターン化する性質のため、この技術を適用することができる細胞型は、THOに限定されそれ自体、このような細胞の接触だけでなく、より低い細胞播種濃度で生き残ることができるものに、より限定された細胞で生存することができるそれらの細胞のような任意のパターニングプロトコルに従順です。例えば、一つの潜在的な用途は、原子間力顕微鏡（AFM）39のための酵母細胞のパターニングです。私たちは多くの異なる細胞基質をテストしているが、他の基板は、このような3次元ゲルを形成するものとして、この特定の技術では動作しない場合があります。ゲルは適切に形成し、パターニング後のカバーガラスやプラスチックシャーレの表面に滞在する場合は、この時点で、我々が検討していません。この技術は、複雑な形状や大面積をパターニングすることが可能です。しかし、それは、マイクロチャネルを相互接続することなく、パターンの個々の分離した形状の配列をすることはできません。相互接続されたマイクロチャネルの非存在下では、それぞれの個々の形状は、技術の面倒を作る独自の注入口を必要とするであろう。我々は、p内の任意の不均一性に気付くことはありませんでしたがタンパク質atterning、マイクロチャネルの内部にパターン化細胞の分布が不均一であってもよいです。この不均一性は、細胞懸濁液、ジオメトリ及びマイクロチャネルの寸法は、細胞懸濁液の粘度における細胞のランダムな分布に起因し得ます。
今後は、この技術は、基板と、細胞の他のタイプに適用されてもよいです。例えば、基底膜マトリックスまたはコラーゲン足場の3次元ゲルは、潜在的にパターニングされたPDMSマイクロ流体チャネルを使用して形成することができます。マイクロ流体デバイス内にヒドロゲルを注入することにより、ヒドロゲルは、マイクロ流体デバイスの形をとると3-Dプリンターまたは他の技術を使用せずに複雑なパターンを形成することが可能であり得ます。これらは容易に入手可能なツールとマイクロ流体デバイスとの構造化された足場の迅速な作成を可能にするであろう。
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Acknowledgments
この研究のための資金調達（FHKに）脊髄研究（NJCSCR）にニュージャージー州委員会によって提供された、（BLFに）CSCR14IRG005を付与し、NIHは（CHCに）R15NS087501を付与し、（ETA）はFMカービー財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
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