Introduction
В тканевой инженерии и биодатчиков, способность контролировать пространственную организацию белков и клеток по шкале мкм, приобретает все большее значение в течение последних четырех десятилетий 1, 2, 3. Точная пространственная организация белков и клеток позволило исследователям изучить взаимодействие между клетками и субстратов , содержащих аналогичные или различные типы клеток, чтобы направлять рост клеток, а также для иммобилизации биомолекул для изготовления биосенсоров 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Современные методы формирования паттерна белков включают photopatterning и микроконтактной печати. Photopatterning использует светочувствительный материал, который сшивается при воздействии Ultrфиолетовый (УФ) излучения. УФ - свет направлен на фотошаблон (состоящей из прозрачных областей с темными областями для предотвращения передачи УФ - света) вызывает сшиванием в определенных областях , которые затем могут быть использованы для последующего прикрепления биоматериалов или клеток 10, 11. В то время как эта схема является очень точным и позволяет точно контролировать топографии поверхности культуры, она ограничена УФ-чувствительных биомолекул , которые могут быть составлены по образцу с помощью УФ - излучения 12. Микроконтактной печати является еще одним популярным методом структурирование специфических белков 13, 14. В этом способе, поли-диметил силоксан (PDMS) марка обрабатывают различными модификации поверхности реагентов до того, замачивают в растворе выбранного биомолекул субстрата. Затем аккуратно прижимают покровным стеклом или другой поверхности, таким образом, "штампования" биомолекулу на поверхность культуры. эйВеверу, штамповку ограничивается типом материала , который может быть передан, а также смачиваемость биомолекул на поверхности ПДМС штамп 15.
Прямое структурирование клеток может быть более сложным и опирается на сложные методы , такие как переключаемые подложек, трафаретов на основе методов или кучность с определенными молекулами клеточной адгезии , 16, 17. Эти методы ограничены в их способности шаблон клеток из-за отсутствия совместимых субстратов клеточной адгезии, Несовместимость процессе работы с чувствительными биологическими клетками и ограничениями, несогласованности в воспроизведении формирования рисунка и сложности процедуры. Например, с переключаемыми субстраты, изготовленные на заказ субстраты , должны быть разработаны для каждого типа клеток, чтобы переключить их присоединение к конкретным типам клеток без деградации под воздействием УФ - света и тепла , используемых в процессе 17 < вир класс = "Xref"> 18, 19, 20. Методы, основанные паттерна Трафарет являются универсальными в их способности к модели клеток; Тем не менее, трудно изготовить PDMS трафареты при соответствующих толщинах для использования 16, 21. Прямая инъекция клеток в PDMS микроканалов имеют ряд преимуществ, таких как: 1) легкость в изготовлении микроканалов и 2) пригодность для многих различных клеток и субстратов. Тем не менее, распространенной проблемой захвата пузырьков воздуха в процессе инъекции из - за гидрофобности PDMS без использования плазменной очистки, или другие методы , чтобы уменьшить пузырьков воздуха, затрудняет последовательно создавать узорчатые клетки на стеклянных или пластмассовых поверхностей 21.
Эта работа расширяет капиллярного micromolding 22, 23,деваха = "Xref"> 24, 25, 26 и передает метод впрыснуть белка и клеточные суспензии в микроканалов. Метод, используемый здесь, демонстрирует кучность субстратов и как прямую, так и косвенную структурирование специфических типов клеток. Этот метод позволяет преодолеть высокую гидрофобность PDMS и исключает наличие пузырьков во время инъекции либо субстраты или клетки, воспользовавшись газопроницаемости ПДМС 27. В этом документе показано использование метода с несколькими различными субстратами и типов клеток. В статье также подчеркивается , изготовление пресс - форм для мягкой литографии с использованием обычного фотолитографии, а также простой и клейкую недорогой метод ленты полезный в условиях ограниченных ресурсов 28, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в данном протоколе являются токсичными и канцерогенными свойствами. Пожалуйста, используйте все надлежащие практики в области безопасности (вытяжной шкаф, перчаточный ящик) и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длина, закрытые носок обуви) при использовании токсичных или кислоты / базовых материалов.
1. Изготовление пресс-форм для Master Soft Литография с использованием фотолитографии
- Нарисуйте расположение микроканала с помощью системы автоматизированного проектирования (САПР) инструмент для рисования.
- Печать макета на пустой маски пластины с использованием лазерной маски писателя.
- Полоскание 4 дюйма кремниевой пластины с ацетоном с последующим изопропанола и сушат с воздушным пистолетом азота, чтобы гарантировать, что растворитель не остается на пластине.
- Обезвоживают вафлю обжигом его на горячей плите при 200 ° С в течение 5 мин.
- Выберите негативного фоторезиста, предназначенный для желаемой высоты микроканалов. Fили пример, использование негативного фоторезиста SU-8, чтобы получить 50 микроканалов высотой 50 мкм.
- Дайте вафля остыть до комнатной температуры, а затем выровнять пластину на патроне спина для нанесения покрытий.
- Разлить по 4 мл (1 мл / дюйм диаметра пластины) от негативного фоторезиста на центр пластины.
- Спин пальто пластины с отжимом двухступенчатой использованием вертушку. Во-первых, применить спред цикл 500 оборотов в минуту с ускорением 100 оборотов в минуту / с в течение 10 с. Затем применить цикл отжима в 2000 оборотов в минуту с ускорением 300 оборотов в минуту / с 2 в течение 30 с , чтобы получить 50 мкм покрытие из фоторезиста с на пластине.
- Мягкая выпекать пластина в два этапа на горячей плите в соответствии с инструкциями изготовителя. Для получения 50 мкм покрытия фоторезиста в, сначала предварительно испечь пластины при 65 ° С в течение 6 мин, а затем сразу же сползать температуры горячей пластины пост-испечь пластины при 95 ° С в течение 20 мин.
- Дайте вафля остыть до комнатной температуры, а затем загрузитьполупроводниковой пластине на сцену литографии.
- Совместите маску на пластине с помощью маски Aligner и разоблачить пластины УФ - излучения (в соответствии с инструкциями изготовителя) при интенсивности 1,5 мВт / см 2 для 146 с , чтобы применить общую УФ дозу 220 мДж / см 2 требуется для 50 мкм слой фоторезиста.
- Применить пост выпекать экспозиции пластины в два этапа на горячей плите. Для 50-мкм покрытия фоторезиста в первую предварительно выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин и сразу же наращиваем температуры горячей пластины пост-выпекать при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
- Разработка пластины в окунанием пластины в СУ-8 разработчик и осторожно встряхивая до тех пор, пока функции станет ясно на пластине. Разработка пластины для ~ 6 мин для толстой фоторезиста 50 мкм.
- Смойте излишки проявителя с изопропанола и этанола, а затем высушить пластины с воздуха азотом пушки.
- Жесткий выпекать кремниевой пластины на горячей плите при 150 ° С в течение 15 мин.
- Поместитевафельные в эксикаторе с 25 мкл silanizing агента tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-трихлорсилана.
Примечание: silanizing агент является едким веществом, таким образом, должен быть использован в кислотной / щелочной вытяжкой, с соответствующими средствами индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, закрытые носок обуви). - Применение вакуума в течение 5 мин и подвергать облатку к парам силана в течение 30 мин, не отпуская вакуума.
- Перенос пластины в подходящего размера чашки Петри.
2. Изготовление пресс-форм для Master Soft Литография с помощью клейкой ленты
- Нарисуйте расположение микроканала, используя инструмент для рисования САПР и напечатать рисунок на белой бумаге.
- Очистите стеклянный слайд, достаточно большой, чтобы приспособить конструкцию с изопропилового спирта, а затем высушить слайд с воздушным пистолетом.
- Прикрепите клейкую ленту на очищенную стекло. Будьте осторожны, чтобы не поймать пузырьки воздуха.
- Заклеивайте стороны GLAсс скользят на бумагу с дизайном, с лентой стороной вверх.
- Используйте скальпель, чтобы разрезать ленту на предметном стекле с использованием дизайнерской бумаги в качестве эталона, а затем отделите ленту от нежелательных областей стекло.
- Промыть стекло с изопропанолом и затем сушат с воздушным пистолетом. Выпекать предметное стекло в печи при температуре 65 ° С в течение 30 мин.
- Аккуратно пролонгировать ленту с помощью резинового валика для удаления пузырьков воздуха и позволить ползун, чтобы охладить до комнатной температуры.
3. Мягкая литография Изготовление из PDMS устройств
- Смешайте PDMS эластомер и его отвердитель в соотношении 10: 1 (вес: вес), и смесь перемешивали энергично, и затем дегазировать смесь, поместив ее в вакуумную камеру, пока пузырьки воздуха не появляются в смеси.
- Смесь вылить в силанизированного формы кремния или клейкой ленты формы в чашке Петри, чтобы получить ~ 2 мм толщиной слоя PDMS и Дега, пока все пузырьки воздуха исчезают.
- Вылечить PDMS в печипри 65 ° С в течение 2 ч.
- Используйте скальпель, чтобы разрезать слой PDMS по меньшей мере, 5 мм от особенностей, а затем очистить отвержденных PDMS прочь пресс-формы, используя пинцет.
- Удар одно входное отверстие с биопсией 1 мм удар в любом месте на микроканалов, предпочтительно в конце сети микроканалов , как показано на рисунке 2а и 4b.
- Очистить PDMS литье с помощью клейкой ленты, чтобы удалить частицы пыли, адсорбированные на устройство. Стерилизация Микроканал устройство PDMS (PDMS CAST) путем промывки раствором 70% -ного этанола с последующей стерильной деионизированной (ДИ) воды и подвергать воздействию УФ в течение 30 мин.
- Хранить стерильную PDMS устройство в стерильную чашку Петри до использования.
4. Подложка Образцу
- Поместите стерильные PDMS отлитые с помощью пинцета на стерильную стеклянную покровного или чашку Петри и применить мягкое давление, используя кончик пинцетом.
ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS литая делает конформное но обратимое уплотнение с ГЛпопка покровное или чашку Петри формирования микроканалов без использования какого-либо клея. - Поместите капельку (20 - 40 мкл) раствора субстрата на входе полностью закрывающей входное отверстие. Шаблон поли-D-лизином (PDL), путем размещения 20 мкл капельку PDL а в буфере тетраборат натрия на входе в микроканалов.
- Поместите чашку Петри в вакууме ~ 254 mmHgA (эквивалент для размещения вакуума в биологических лабораториях) в течение 10 мин, и наблюдать воздух, поступающий из канала в виде пузырьков.
- Отпустите вакуума и наблюдать раствор субстрата, протекающей в микроканале.
- Выдержите блюдо в соответствующих условиях для присоединения субстрата. Приведены в таблицах 1 и 2 для условий инкубации (они варьируются в зависимости от подложки). Для PDL кучность, инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С.
- Аккуратно снимите штамп PDMS с помощью стерильных пинцетов и промойте рисунок на стекло покровное трижды дистиллированной водой. Добавить раствор 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в чашке Петри, чтобы покрыть блюдо или покровного стекла и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
Примечание: Это приведет к снижению неспецифической соблюдения в непокрытых регионах. - Аспирируйте от 1% раствора БСА и узорной субстрат теперь готов к использованию.
5. Косвенное структурирование клеток
- Приготовьте суспензию клеток в культуральной среде, не содержащей сыворотки. Типа клеток и плотность клеток приведены в таблице 1.
- Добавить клеточной суспензии в узорной Петри и полностью погрузить в воду узорчатую область в клеточной суспензии.
- Инкубируйте чашки Петри при температуре 37 ° С в термостате в течение 15 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к узорной подложки.
- Аспирируйте избыток суспензии клеток от чашки Петри и мыть узорчатых клеткам трижды фосфатно-солевым буфером (PBS) при осторожном встряхивании в течение 10 с для удаления неприкрепленные клетки.
- Добавьте Appropriate культуральная среда для узорчатых культур клеток и инкубировать узорчатую клеток при 37 ° С в СО 2 инкубаторе.
6. Прямой структурирование клеток
Примечание: Этот метод является альтернативой косвенном кучность клеток, описанной в пункте 5. Однако, в отличие на этапе 5, в этой технике клетки узорной на поверхности для культивирования тканей с или без покрытия подложки.
- Стерилизация микрожидкостных устройств путем промывки раствором 70% этанола с последующим ДИ воды.
- Замачивание устройство в течение ночи в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина, чтобы предотвратить адгезию клеток к PDMS.
- Высушить устройство при комнатной температуре и прикрепить ее к нижней части культуры ткани, обработанной чашке Петри.
- Приготовьте суспензию клеток в бессывороточной культуральной среде. Типа клеток и плотность клеток приведены в таблице 2.
- Поместите капельку (4 - 8 мкл) клеточной суспензии, достаточно, чтобы заполнитьмикроканалов, на входе полностью закрывающей входное отверстие.
- Поместите чашку Петри в вакууме в течение 10 мин и наблюдать воздух, поступающий из канала в виде пузырьков. Отпустите вакуума и наблюдать клеточную суспензию, протекающей в микроканале.
- Выдержите чашку Петри в инкубаторе , чтобы способствовать адгезии клеток на условиях инкубации ( в зависимости от типа клетки узорной) , указанным в таблице 2. Добавить PBS в чашке Петри погружая устройство PDMS.
- Пил PDMS тщательно от чашки Петри с помощью пинцета и мыть шаблон с PBS. Добавить среды для культивирования клеток на чашку Петри и помещают культуры клеток в инкубаторе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод позволяет кучность белков и непрямого паттернировании клеток с использованием тупиковых микроканалов с размерами размером до 10 мкм и оборудованием практически во всех биологических лабораториях после того, как мастер-форма изготовлена. Этот метод может быть использован с PDMS микроканалов , созданных с использованием традиционных мягких фотолитографии или с PDMS микроканалов , созданных с изготовлением клейкой лентой (Рисунок 1) 28, 29. Ранее мы уже продемонстрировали использование этой процедуры в косвенном паттернировании нервных клеток для оценки аксонов в фоторецепторов 4, 30, и теперь продемонстрировал свое применение в нескольких дополнительных типов клеток различного происхождения. Эмбриональные коры головного мозга крыс нейроны узорчатые на поли-D-лизин (PDL) и ламинин поверхности демонстрируют общий adherencе к узорчатых областей и роста вдоль PDL и ламинин полосками (рис 3А). C2C12 миобластов клеточные линии также придерживаться узорной области и продемонстрировать слияние в многоядерные мышечные трубки (рис 3B). Мы также адаптировать эту технику для прямого клеточного паттерна , как видно с фибробластами на рисунке 4. Как сообщалось ранее, этот метод прямого клеточного паттерна не показали никакого отрицательного влияния на выживаемость клеток 30. Переменные , которые приводят к успешному прямой или косвенной паттернировании , указанных типов клеток приведены в таблице 1 и 2. Таким образом, в будущем, исследователи могут использовать эту технику для модели клеток и обнаружить явления, связанные с их конкретным кучность.
Рисунок 1: Изготовление пресс - формы Soft Литография. Слева: литографическая печатная формау процесса. SU-8 спина покрытием на кремниевой подложке, подвергается воздействию УФ-излучения, и разработана для удаления избытка SU-8. Справа: клей Процесс изготовления ленты. Клейкая лента прикреплена к чистой предметное стекло, разрезали скальпелем, а избыток ленты осторожно удаляют. PDMS литье затем изготавливают из каждой формы, используя мягкую литографию. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Пример PDMS устройства для субстрата кучность стрельбы . (А) PDMS микрожидкостных бросок с входным отверстием , используемый для микрожидком паттернировании субстратов. Входную штампуют на одном конце микроканалов. (Б) Микрожидкостных канала , как показано под фазово - контрастной микроскопии. Микроканалов 15 мм в длину, шириной 20 мкм,d разделены 200 мкм. Рисунок 2 воспроизводится с разрешения IOP Publishing. Все права защищены 30. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Непрямой Cell кучность стрельбы . (А) при помощи вакуума процесс формирования рисунка белка. ПДМС устройство Микрожидкостных канал прикреплен к чашке Петри, раствор субстрата загружают в входное отверстие, вакуум на короткое время применяется к камере и выпустили, ПДМС устройство удаляется, образец промывают, и готов к использованию. (Б) эмбриональные нейроны коры головного мозга крыс высевали на покровное с узорной PDL и ламинин подложки. (С) C2C12 миобластов клеточных линий , выращенных на узорной PDL и ламинин. Фигуры 3a и 3c воспроизводятся с рermission от IOP Publishing. Все права защищены 30. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Прямая Cell кучность стрельбы . (А - с) Фибробласты узорчатый с помощью прямого клеточного паттерна. (А) Микрожидкостных устройство канала изготовлены с использованием клейкой лентой литографию. (Б) микроканалов после заполнения фибробласты клеточной суспензии с использованием вакуумной техники помогли кучность стрельбы . (С) фибробласты после удаления микрожидком устройства. (D) кальцеином AM окрашивание фибробластов после микрожидком кучность. (Е) Фазовый контраст изображения фибробластов после микрожидком паттерна. (Е - г 30. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Непрямой Cell Образцу | подложка | Белковые Условия инкубации | Плотность клеток | Продолжительность клеточной адгезии |
| PC12 | Коллаген-1 | 1 ч при 50 ° C | 5 × 10 6 / мл | 1 ч при 37 ° C |
| фибробласт | Коллаген-1 | 1 ч при 50 ° C | 5 × 10 6 / мл | 1 ч при 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 час при температуре 37 ° С, промыть PBS, в течение ночи при 37 ° C | 2 х 10 6 / мл | 15 мин при 37 ° C |
| Эмбриональные Крыса корковых нейронов | PDL + Laminin | 1 час при температуре 37 ° С, промыть PBS, в течение ночи при 37 ° C | 2 х 10 6 / мл | 15 мин при 37 ° C |
| Salamander сетчатке Нейроны | Сал-1 | в течение ночи при 10 ° С | N / A | 1 ч при 10 ° C |
Таблица 1: Косвенные Ячейка паттернирования Условия. Список условий инкубации, таких как тип подложки, времени, температуры и плотности клеток для типичных типов клеток. Исследователи должны оптимизировать условия инкубации для их собственных модельных субстратов и типа клеток. Сал-1 является субстратом антитела используются для выращивания нейронов Salamander сетчатки глаза.
| Прямая Cell Образцу | подложка | Плотность клеток | Время клеточной адгезии |
| PC12 | Коллаген-1 | 6 х 10 6 / мл | 1 ч при 37 ° C |
| фибробласт | Коллаген-1 | 6 х 10 6 / мл | 1 ч при 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 х 10 6 / мл | 15 мин при 37 ° C |
| Эмбриональные Крыса корковых нейронов | PDL + Laminin | 2 х 10 6 / мл | 15 мин при 37 ° C |
| Salamander сетчатке Нейроны | Сал-1 | N / A | 1 ч при 10 ° C |
Таблица 2: Прямые условия Cell кучность стрельбы . Список условий инкубации, такие как температура, время и плотность клеток для типичных типов клеток. Исследователи должны оптимизировать условия инкубации для их собственного типа модели клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как обычные фотолитографии является хорошо отработанной технологией для создания пресс-форм для мягкой литографии, оборудования, материалов и навыков, необходимых для использования обычного фотолитографии не легко доступны для большинства лабораторий. Для лабораторий, не имеющих доступа к этим ресурсам, мы представили изготовление клейкой ленты в качестве способа создания форм с относительно простыми функциями для микрожидкостных устройств. Этот метод позволяет в любой лаборатории, чтобы создать и использовать микрожидкостных устройства для исследовательских целей с легко доступных инструментов. Метод клейкая лента может быть улучшена с недорогой рабочий стол винил резак 31. Обои для рабочего виниловые резаки могут увеличить воспроизводимости, разрешение, а также сложность компоновки. Каждый из этих вариантов, обычные фотолитографии, настольные резаки, или изготовления клейкой ленты имеют разные возможности и ограничения и исследователи должны тщательно рассмотреть, какой метод будет достаточнодля своих нужд.
В отвержденных PDMS, длинные полимерные цепи диметилсилоксана образуют решетку, нанопористого структуру , которая создает пустые области , которые могут быть заполнены молекулами воздуха 27. Этот Газопроницаемый свойство является ключом к нашему способу заполнения микроканалов. При помещении в условиях низкого давления, молекулы воздуха удаляются из объемного материала PDMS, а также самих 25 микроканалов. Когда PDMS затем подвергают воздействию атмосферного давления, сыпучий материал и микроканалы ПДМС сохраняют отрицательное давление в течение некоторого времени , 25, 30. Это отрицательное давление привлекает жидкости в микроканалов автоматически заполняющих микроканалов. Это отрицательное давление продолжает привлекать жидкости в канал, пока объемные PDMS не уравновешивается с атмосферным давлением.
Этот вакуум-помощь методика позволяет patterniнг специфических белков и субстратов на субстрат роста. В данном исследовании мы смогли шаблон несколько различных субстратов и типов клеток как непосредственно , так и косвенно (Таблица 1 и 2). Тем не менее, экспериментатор может понадобиться испытать разные времена инкубации плотности клеток, или высева сред для их конкретного типа клеток. Эти переменные, вероятно, относятся к врожденной способности либо клетки или подложки, чтобы прилипать к поверхности его размещаемым на. Например, здесь C2C12 клетки требуется использование сыворотки среды для высева сред перед тем культивирования клеток в DMEM с 2% лошадиной сыворотки. Кроме того, условия могут меняться в зависимости от того, является ли узорной покровное стекло или пластик чашку Петри. Здесь оба работали хорошо, чтобы позволить конкретной структурировании различных типов клеток.
Одним из первых проблем, мы имели во время использования этой техники было то, как воздействие вакуума может повлиять на жизнеспособность клеток. Это исследование и рrevious исследования, однако, должны облегчить эти проблемы , как мы показали , что вакуум имеет практически никакого влияния на различные клетки 30. Wang и др. ранее использовались дегазировали необратимо герметизируют микрожидкостных камеры для загрузки HeLa клетки 32. Другие исследования использовали вакуумную при содействии посева клеток для различных типов клеток , включая человеческие стволовые клетки, прилипшие и не прилипшие клетки, а человек-хомячка линии клеток гибридом (A L) ячеек для загрузки в микроканалов 33. Кроме того, другие исследователи подвергли клетки значительно больших давлений вакуума по сравнению с этим текущего исследования с практически без заметного влияния на клетки 33. Пузырьки, образующиеся в процессе удаления воздуха из микроканала имеют тенденцию собираться на поверхности капли суспензии на входе. Часто эти пузырьки не разрываться из-за поверхностного натяжения суспензии. Мы не Observэд заметное снижение жизнеспособности клеток из-за пузырьков. Кроме того, эксперимент с кальцеин-АМ не предполагает значительное снижение жизнеспособности клеток. Из-за этого мы не тщательно изучены гибель клеток, специально из-за пузырьков.
Предыдущие попытки шаблон субстраты или клетки часто страдают от таких проблем, как образование пузырьков воздуха в микрожидкостных устройств. Образование пузырьков воздуха затрудняет вводить жидкости легко и эффективно без использования оборудования или материалов, которые не доступны в большинстве лабораторий. Например, предыдущие методы используются использование плазменной обработки или обработки коронным разрядом , чтобы уменьшить гидрофобность PDMS микроканалов 15, 34. В то время как эффективная, плазменная и коронный Протравливатели не всегда доступны в большинстве лабораторий. В этом протоколе, мы демонстрируем способность модели клеток и субстратов, просто используя общий Laboraтори. Вакуум С помощью метода изготовления клейкой ленты, методика может быть использована для создания PDMS микроканалов для формирования рисунка субстраты или клетки почти в любой лаборатории.
Для того, чтобы шаблон субстраты или клетки с протоколом вакуумной структуризации, несколько шагов имеют решающее значение для успешного формирования паттерна. Во-первых, для изготовления мастер клейкой ленты, клейкая лента должна быть полностью прикреплена к стеклу и без пузырьков воздуха. Воздушные пузырьки ослабить связь между лентой и предметное стекло и может привести к ленте быть отслаивается при отверждении PDMS отделилось от клейкой ленты формы. Кроме того, пузырьки будут искажать геометрию микрожидком канала, вызывающего на поверхность каналов, чтобы быть не плоской. Для того, чтобы сделать PDMS отлиты из SU-8 пресс-формы, СУ-8 пресс-форма должна быть силанизированы перед заливкой с PDMS. Этот шаг имеет решающее значение в предотвращении постоянного связывания PDMS на СУ-8 формы после отверждения PDMS. Перед конформной герметизациииз PDMS микрожидкостных канала на покровных стеклах или пластиковые чашки Петри, то ПДМС должны быть очищены от всех частиц пыли. Эти частицы могут предотвратить образование конформного уплотнения между PDMS и стекла и, таким образом, предотвратить инъекции клеток или субстратов в микрожидком канал. Как указано в приведенном выше протоколе PDMS очистки каналов с помощью клейкой ленты является критическим до присоединения к Микроканал покровные стекла или пластиковые чашки Петри. И, наконец, после размещения устройства в вакуумную камеру, вакуум должен быть мягко освобожден, чтобы предотвратить смещение капелькой субстрата или клеточного раствора, поступающего из впускного отверстия.
Если жидкость не наблюдается, протекающий в микрожидком канал, может быть утечка в микрожидком канале, который допускал бы жидкость течь в канал. Удалите PDMS штамп, сухой и очистить его, а затем повторите шаг 4, 5 или 6 из техники. Если раствор не поступает в микроканале после RELEаза вакуума, убедитесь, что раствор полностью покрывает вход микроканала. Это может быть сделано с помощью пипетки раствор вверх и вниз несколько раз, в то время как положить его в впускное отверстие. Если субстрат, после введения в микроканале, не присоединяется к стеклу, оценить и определить оптимальные условия инкубации, необходимые для используемого субстрата. При удалении PDMS отлиты из поверхности стекла или пластиковой чашке Петри вызывает узорные клетки или подложки должны быть уничтожены, использовать более тонкий PDMS литье, погрузить PDMS отлит в PBS или средств массовой информации, и медленно и осторожно слезть PDMS, отлитые из стекла или пластиковые поверхности с помощью пинцета.
И, наконец, БСА может иметь решающее значение в снижении неспецифической адгезии клеток к либо без рисунка стекла или пластиковой поверхности. БСА, как правило, используется в качестве блокирующей реагента в вестерн-блоттинга, иммунное окрашивание, а также других методов молекулярной биологии. Другие исследователи также использовали его для косвенной или прямойпротоколы паттерна для уменьшения неспецифической клеточной адгезии 35, 36, 37. Мы обнаружили, что инкубирование субстрата с БСА была необходима для большинства типов клеток для клеток саламандры сетчатки глаза, за исключением. Это может быть из - за более специализированного характера субстрата (антитело называется SAL-1) , который был использован, а также общее отсутствие клеточной адгезии с помощью этой клетки типа 38. В наших руках, БСА также не заметно уменьшить адгезию клеток к узорчатых областей и в основном служили для уменьшения неспецифического присоединения.
Хотя этот метод разработан, чтобы быть универсальным и гибким в применении к различным субстрата и клеточных типов, существует несколько ограничений этого протокола и совместимых клеток и субстрата. Из-за самой природы кучность клеток на поверхности, типы клеток, что этот метод может быть применен к ограничены ТхоSE, которые могут быть подвергнуты любому протоколу структуризации, такие, как те клетки, которые способны выживать с более ограниченным межклеточных контактов, а также те, которые могут выживать при более низких концентрациях посева клеток. Например, один из возможных применений является структурирование дрожжевых клеток для атомно - силовой микроскопии (AFM) 39. В то время как мы тестировали множество различных клеточных субстратов, другие подложки могут не работать с этой конкретной методики, такие как те, которые образуют трехмерные гели. В это время, мы не исследовали, если гели правильно формировать и остаться на поверхности покровного стекла или пластиковой чашке Петри после кучность стрельбы. Эта техника способна структурирование сложных форм и больших площадей. Тем не менее, он не может паттерн массив отдельных разделенных форм без соединительных микроканалов. При отсутствии взаимосвязанных микроканалов, каждая индивидуальная форма потребует самостоятельно на входе делает технику громоздким. В то время как мы не заметили каких-либо неравномерность в рatterning белок, распределение клеток с рисунком внутри микроканала может быть неравномерным. Эта неравномерность может быть из-за случайного распределения клеток в клеточной суспензии, геометрии и размеров микроканалов и вязкости суспензии клеток.
В дальнейшем, этот метод может быть применен к другим типам субстратов и клеток. Например, трехмерные гели, такие как матрицы базальной мембраны или коллагеновые каркасы потенциально могут быть составлены по образцу и формируется с использованием PDMS микроканалов. За счет инжекции гидрогель в микрожидком устройство, гидрогель может принимать форму микрожидкостных устройства и иметь возможность создавать сложные шаблоны без использования 3-D принтеров или других технологий. Это позволило бы для быстрого создания структурированных каркасах с легко доступных инструментов и микрожидкостных устройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансирование этого исследования было предоставлено Джерси комиссии по Нью-спинного мозга исследований (NJCSCR) (до FHK), грант CSCR14IRG005 (до BLF), NIH грант R15NS087501 (к УПС) и FM Кирби Foundation (ЭТА).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
