Abstract
ثقافة الخلية أحادي الطبقة لا نموذجا كاف السلوك في الجسم الحي من الأنسجة، الذي ينطوي على خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات المعقدة. ثلاثي الأبعاد تقنيات زراعة (3D) الخلية هي ابتكار حديث وضعت لمعالجة أوجه القصور في زراعة الخلايا الملتصقة. بينما العديد من التقنيات لتوليد نظائرها الأنسجة في المختبر تم وضعها، وهذه الأساليب هي في كثير من الأحيان معقدة ومكلفة لتأسيس، تتطلب معدات متخصصة، وتقتصر عموما التوافق مع فقط أنواع الخلايا معينة. هنا، نحن تصف بروتوكول سريع ومرن لتجميع الخلايا في الأجسام الشبه الكروية 3D متعددة الخلايا من حجم ثابت متوافق مع نمو مجموعة متنوعة من الأورام وخطوط الخلايا العادية. نحن نستخدم تركيزات مختلفة من المصل وميثيل السليلوز (MC) لتشجيع جيل كروي مستقل مرسى ومنع تشكيل الطبقات الوحيدة الخلية بطريقة استنساخه للغاية. الظروف المثلى لالكلاسيكي فرديخطوط الخلايا idual لا يمكن أن يتحقق من خلال تعديل MC أو تركيزات مصل في المتوسط تشكيل كروي. الأجسام الشبه الكروية 3D المتولدة يمكن جمعها لاستخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك إشارات الخلية أو دراسات التعبير الجيني، مرشح فحص المخدرات، أو في دراسة العمليات الخلوية مثل غزو الخلايا السرطانية والهجرة. كما تكييف بروتوكول بسهولة لتوليد الأجسام الشبه الكروية نسيلي من الخلايا واحدة، ويمكن تكييفها لتقييم النمو المستقل مرسى وanoikis المقاومة. وعموما، يوفر بروتوكول لدينا وسيلة للتعديل بسهولة لتوليد واستخدام الكروية خلية 3D من أجل تلخيص المكروية 3D الأنسجة ونموذج للنمو في الجسم الحي من الخلايا الطبيعية والسرطانية.
Introduction
تقييم بيولوجيا السلوك الخلايا السرطانية يتحدى باستخدام ثنائي الأبعاد (2D) منهجيات زراعة الخلايا التقليدية، في جزء منه لأن هذه لا تعكس بشكل كاف المكروية الخلايا الموجودة في الجسم الحي. النهج البديلة تتضمن مكونات المصفوفة خارج الخلية في الثقافة (على سبيل المثال، بويدن المقايسات غرفة) هي ممثلة أكثر من الناحية الفسيولوجية للفي الجسم الحي بيئة الأنسجة. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تقتصر على تقييم سلوك الخلية الفردية، وليس تلخيص مجمع في مجموعات المجراة من خلية مصفوفة وخلية خلية التفاعلات التي تساهم في الأنسجة أو الورم النمو 1، 2، 3.
استخدام الكروية المتعددة الخلايا هو نهج مؤخرا أن يستنسخ أكثر دقة الهندسة المعمارية المدمجة في الجسم الحي نمو الخلايا 1،4. الكروية يمكن استخدامها لتحقيق التفاعلات خلية مصفوفة من الخلايا الطبيعية، ولكن يمكن أن تعمل أيضا نظائرها ورم لنموذج خصائص تطور الورم، مثل النمو المتنقل أو المقاومة للأدوية (4).
ويمكن تشكيل الأجسام الشبه الكروية من انتشار الخلايا واحد جزءا لا يتجزأ من مصفوفة 5 أو أكثر بسرعة، من خلال تشجيع تجميع خلايا متعددة لتشكيل كتلة خلية واحدة (على سبيل المثال، والشنق قطرة، وأساليب الطرد المركزي) 6 و 7. قد تتطلب تقنيات خلية تجميع القائمة مواد مكلفة أو المعدات المتخصصة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الأجسام الشبه الكروية لديها مجموعة واسعة من الأحجام والأشكال التضاريسية وقد يكون من الصعب إنتاج بكميات كبيرة، مما يجعل المقارنات بين ظروف النمو أو العلاجات الصعبة. وأخيرا، يمكن الكروية التي تولدها هذه الأساليب يكون من الصعب عزل من extracel البروتينيةمصفوفة lular التي هي جزء لا يتجزأ من أجل الاستخدام في تطبيقات أخرى.
هنا، نحن تصف منهجية خلية تجميع قوية وسهولة التعديل على الإسراع في تشكيل الأجسام الشبه الكروية خلية الحجم باستمرار باستخدام لوحات المتاحة تجاريا U-أسفل الخلية طارد ومصفوفة تعزيز التصاق الخاملة، ميثيل السليلوز. تشكلت مرة واحدة، يتم عزل هذه الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا بسهولة لاستخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات. كما تكييفها بروتوكول بسهولة لتوليد الأجسام الشبه الكروية من خلال تكاثر الخلايا، والتي يمكن استخدامها لتقييم عمليات الخلايا الأخرى. هنا، وتبين لنا المقايسات غزو الخلايا، كميا عن طريق تلطيخ المناعي، وفحص anoikis، كمثال تطبيقات هذين مختلف البروتوكولات تشكيل كروي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم سرد كافة الكواشف والمواد الاستهلاكية في قائمة المواد: ملاحظة.
1. إنتاج كروي من قبل تجميع الخلية
- الميثيل السليلوز الحل: إعداد 100 مل من 100 ملغ / مل السليلوز الميثيل.
- الحرارة 50 مل عالى النقاء H 2 O إلى 80 درجة مئوية. إضافة 10 غرام من مسحوق السليلوز الميثيل وتستنهض الهمم حتى فرقت الجسيمات بالتساوي.
- جلب إلى الحجم النهائي مع عالى النقاء البارد H 2 O ويقلب في 4 درجات مئوية حتى يصبح حل واضح والقش الملون، ويحتوي على أي مواد صلبة واضحة.
- تمر من خلال مرشح 0.45 ميكرون لإزالة المواد الصلبة غير منحل. يمكن aliquoted الحل استعداد وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
يخدم الميثيل السلولوز كمجموعة غير السامة للخلايا، خامل تعليق وكيل، لتعزيز التصاق الخلية خلية وتثبيط تشكيل أحادي الطبقة خلية ملتصقة: ملاحظة. الميثيل السليلوز هو للذوبان في الماء، ويمكن أن جرفت التالية spherجيل OID.
- متوسطة تشكيل كروي
ملاحظة: إعداد المتوسطة تشكيل كروي فورا قبل الاستخدام. لا تخزن.- تمييع الميثيل حل السليلوز إلى 1-5 ملغ / مل في مستنبت المناسبة.
- تمر من خلال مرشح 0.22 ميكرون لتعقيم وإزالة المواد الصلبة غير منحل.
- الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(PBS)
- تمييع ل1x أخرى ويمر عبر مرشح 0.45 ميكرون قبل الاستخدام. قد تكون مخزنة حل استعداد إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
- إنتاج كروي الخلية (الشكل 1)
ملاحظة: إعداد جميع الكواشف مقدما. من المهم تجنب التلوث من الحلول من خلال الغبار والألياف أو جزيئات غير قابلة للذوبان الأخرى. إن وجود هذه الملوثات تؤثر سلبا على تشكيل كروي. يجب أن يتم تمرير ثقافة المتوسطة وغيرها من الحلول من خلال مرشح 0.45 ميكرون لإزالة هذه الجزيئات عند نقاط البيعsible. تجنب استخدام ماصات تصفيتها القطن عند نقل الحلول وهذه يمكن أن إدخال الألياف إضافية.- الطبقات الوحيدة الخلية الثقافة إلى 70٪ التقاء في الثقافة المناسبة تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل. نضح مستنبت وشطف مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة الأنقاض. إضافة 3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪ التربسين) عازلة التفكك إلى صحن 10 سم ثقافة الخلية، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تفقد الخلايا تحت المجهر في 10X التكبير لتأكيد انفصال. تحييد عازلة التفكك مع 7 مل من مستنبت تستكمل المصل.
- تعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة إلى خلايا بيليه بلطف.
- إزالة طاف. بيليه الخلية resuspend في 1 مل تشكيل كروي المتوسطة باستخدام ماصة P1000 مع الفلتر.
ملاحظة: يجب أن يكون التعليق الخلية خالية من كتل.- ليسحن بيليه الخلية، اضغط على طرف ماصة ضد الجزء السفلي من أنبوب في زاوية طفيف في حينpipetting لللقص بيليه الخلية. تجنب الطحن أكثر من 3-5 مرات وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا. ماصة ببطء وعدم طرد محتويات طرف ماصة لتجنب خلق فقاعات.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع تعليق خلية إلى 1 × 10 4 خلية / مل.
ملاحظة: يمكن أن يكون الأمثل وعدد الخلايا لتوليد الأجسام الشبه الكروية من أحجام مختلفة. التريبان تلطيخ الأزرق من الخلايا التالفة يمكن أن تستخدم لتأكيد بقاء الخلايا معلق. - تعليق خلية نقل إلى العقيمة، خالية من الغبار ماصة الأقنية الخزان واستخدام النصائح مرشح للاستغناء 100 ميكرولتر في كل بئر من جيد 96 U-أسفل لوحة خلايا طارد.
- خزان شطف مع تصفيتها عالى النقاء H 2 O لإزالة الغبار والألياف.
- مزيج تعليق خلية دوري بينما البذر لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي من الخزان. لتجنب خلق فقاعات، واستخدام تقنية pipetting لعكس حين خلط وdispensinز.
- لوحات نقل إلى نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) وتفقد يوميا لتشكيل كروي. يجب أن الخلايا تستقر في الجزء السفلي من كل بئر في 6 ساعات وتجميع عموما إلى كروي ضمن 24-48 ساعة (الشكل 2).
- لتأكيد تشكيل كروي ناجح، استخدم طرف P10 وبلطف ماصة المتوسطة على كروي مع مراعاة تحت المجهر في التكبير 10x. صحيح الكروية شكلت سوف تخفف من لوحة ولفة، مؤكدا هيكل 3D الخاصة بهم.
وينبغي أن تحدد ميثيل السليلوز ومصل تركيزات من قبل المعايرة لكل خط الخلية لانتاج تشكيل كروي واحد لكل بئر: ملاحظة. وأظهرت الظروف الأمثل في هذا الطريق لخطوط الخلية المحددة في الجدول رقم 1، وأمثلة من الكروية تشكلت في الشكل 2B. قد نمت الكروية لفترة أطول مما هو مذكور ولكن عندما تصبح أكبر عندما يكبرون تدريجيا أكثر صعوبةللتعامل مع دون تجزئة. إذا تشكل خلايا أحادي الطبقة، الكروية الأقمار الصناعية، أو تفشل في تستقر في قاع البئر، قد تحتاج إلى مزيد من التعديل لتكوين كروي الأمثل (الشكل 3B) تركيز ميثيل السليلوز ومصل الدم. لا تستخدم الكروية التي تحتوي على ملوثات مثل الألياف أو الغبار (الشكل 3A). الكروية قبل تشكيلها يمكن علاجها مع المركبات ذات الأهمية مثل عوامل النمو والبقع الخلية الحية، أو مثبطات للتحليل.
2. الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص (الشكل 4)
- الكولاجين تحييد
- تبريد جميع السوائل إلى 4 درجات مئوية، وعقد على الجليد عند العمل مع الكولاجين لمنع البلمرة غير المرغوب فيها.
- إعداد الطازجة 0.1 م و 0.01 م حلول من هيدروكسيد الصوديوم والطازجة 0.1 M حمض الهيدروكلوريك في عالى النقاء H 2 O. ممر جميع الحلول من خلال 0.22 ميكرون مرشحات.
- مزيج نوع البقري 1 الكولاجين (3.1 ملغ / مل الأسهم)، 0.01 M هيدروكسيد الصوديوم و 10x برنامج تلفزيوني (8: 1: 1 نسبة من حيث الحجم) والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 باستخدام البارد 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. التركيز النهائي من الكولاجين هو 2.5 ملغ / مل.
- إعداد ما يكفي من الكولاجين تحييد لملء وعاء التصوير على عمق 2-3 ملم. مطلوب ما لا يقل عن 100 ميكرولتر لكل بئر من 8 جيدا زراعة الأنسجة الشرائح غرفة المدرجة في قائمة المواد.
- تضمين الكروية في الكولاجين (الشكل 4)
- معطف أسفل كل بئر من شريحة 8 جيدا غرفة زراعة الأنسجة مع ما لا يقل عن 50 ميكرولتر تحييد الكولاجين.
- استخدام تقنية pipetting لالعكسي لتجنب خلق فقاعات في الكولاجين. استخدام غيض ماصة لنشر الكولاجين بالتساوي على السطح جيدا.
ملاحظة: هذه الطبقة قاعدة الكولاجين عقد الكروية في تعليق وهو عادة 1-2 مم. طبقة الأساس يقلل من تشكيل الغضروف المفصلي على طبقة الكولاجين العليا. إذا كانت طبقة الأساس هي رقيقة جدا، قد الكروية اجراء اتصالات مع الجزء السفلي من الشريحة الغرفة وتشكيل أحادي الطبقة الخلية.
- استخدام تقنية pipetting لالعكسي لتجنب خلق فقاعات في الكولاجين. استخدام غيض ماصة لنشر الكولاجين بالتساوي على السطح جيدا.
- ضع الشريحة الغرفة، و35 مم طبق زراعة الأنسجة مليئة عالى النقاء H 2 O، في صحن 10 سم زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى تتم بلمرة الكولاجين، عادة 1 ساعة. متجر المتبقية تحييد الكولاجين على الجليد.
ملاحظة: إن طبق مملوء بالمياه 35 ملم توفر الرطوبة ومنع الجفاف. يجب أن تبقى الشريحة الغرفة في هذه القاعة الرطوبة في جميع أنحاء فحص. طبقة الأساس الكولاجين قد يكون غادر لبلمرة بين عشية وضحاها. حضانات أطول يؤدي عادة في هلام أكثر جمودا. - باستخدام p1،000 مرشح طرف، وجمع الكروية شكلت قبل (الخطوة 1.4.7) من لوحة الخلية طارد 96-جيدا U-السفلى في 1.5 مل المفاجئة أعلى الأنابيب. ماصة ببطء وتجنب تكرار أو pipetting لقوي للحد من السوائل القص من الكروية. قد تكون مجمعة الكروية متعددة في أنبوب واحد لنقلها إلى بئر واحدة من 8 جيدا زراعة الأنسجة الشرائح الغرفة.
- الطرد المركزي الكروية التي تم جمعها في طبلETOP microcentrifuge في 2000 x ج لمدة 2-5 الصورة وإزالة طاف باستخدام ماصة P200. تجنب الطرد المركزي لمدة أطول من اللازم، لأن هذا قد يسبب الكروية إلى التفكك أو تتجمع معا.
ملاحظة: بعد pipetting لمن أكثر من طاف، قد تكون معكوسة أنبوب بعناية على منشفة ورقية نظيفة لذبالة بعيدا السوائل الزائدة. لا تسمح الكروية لتجف. - باستخدام واسعة تتحمل P200 طرف، و resuspend بلطف الكروية في 50 ميكرولتر تحييد الكولاجين. هل كل هذا لأنبوب الكروية التي جمعت قبل نقل أي الكروية في الشريحة الغرفة. الحفاظ الكروية التي تم معلق في الكولاجين تحييد على الجليد حتى جاهزة للنقل إلى الشرائح غرفة.
- إزالة الشرائح الغرفة من الحاضنة وماصة بعناية خليط كروي الكولاجين فوق طبقة الأساس الكولاجين. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى تتم بلمرة الكولاجين.
- لا تستغني عن محتويات ماصة لتجنب خلق فقاعات. Dropwايسي pipetting ليقلل من فرص إزعاج طبقة قاعدة الكولاجين.
- ببطء إضافة ما لا يقل عن 100 ميكرولتر حرارة متوسطة الثقافة التي تحتوي على chemoattractants المطلوب، مثبطات، أو العلاجات الأخرى إلى كل بئر من الشريحة الغرفة. قد يمزق تحتوي الكروية طبقة الكولاجين إذا كان pipetted السائل على ذلك بقوة أيضا. مستنبت يمكن الاستغناء ببطء أسفل الجانب من بئر لتجنب إزعاج الكولاجين.
- احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للغزو الخلايا. غزو الخلايا في الكولاجين المحيطة قد يكون بسبب brightfield أو مضان التصوير وكميا من قبل مجموعة متنوعة من أساليب استخدام epifluorescence، متحد أو ضوء المجهر ورقة.
- معطف أسفل كل بئر من شريحة 8 جيدا غرفة زراعة الأنسجة مع ما لا يقل عن 50 ميكرولتر تحييد الكولاجين.
3. الكمي من الغزو: Brightfield المجهر
- في فترات زمنية محددة، الصورة الكروية الكولاجين جزءا لا يتجزأ من في 10X التكبير باستخدام المجهر brightfield (الخطوة 2.2.8).
ملاحظة: للحصول علىالتجارب الخلية الحية على المدى الطويل، مرحلة المجهر ساخنة وCO 2 تنظم غرفة يمكن استخدامها للحفاظ الكروية عند 37 درجة مئوية وCO 2 في حين التصوير 5٪. - تحديد الغازية باستخدام برنامج مثل يماغيج لقياس عدد الخلايا الغازية في الكولاجين المحيطة ومتوسط المسافة غزا في كل نقطة زمنية.
4. الكمي من الغزو: الإسفار المجهري مع وصمة عار خلايا الحية
- الخطوة التالية 2.2.8، تكملة المتوسطة في الشرائح غرفة مع وصمة الفلورسنت مثل دابي، Calcein صباحا، أو غيرها من المركبات تتبع الخلية المناسب للخط الخلوي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: للحصول على القياس الكمي للغزو، وتلطيخ متجانس في جميع أنحاء كروي ليست ضرورية. للتطبيقات التي تتطلب اختراق أعمق من وصمة عار، حضانات أطول (> 3 ح) قد يكون ضروريا. - إزالة وصمة عار واستبدالها مع 500 ميكرولتر دافئ برنامج تلفزيوني 1X. فيcubate عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة وصمة عار الزائدة. أكرر ما لا يقل عن مرتين.
- باستخدام المجهر مضان، والحصول على المقاطع البصرية من خلال الكروية الغازية.
وينبغي التقليل من التعرض المديد لضوء الليزر أثناء التصوير المتكرر للحد من الضيائية وphotobleaching من: ملاحظة. - استخدام برامج مثل يماغيج لتوليد Z-الإسقاط، والتي يمكن استخدامها لتحديد المساحة الإجمالية للكروي، أرقام غزو الخلايا، والمسافات غزت في مصفوفة الكولاجين.
- وكمثال على ذلك، لتحديد الغزو، وضبط عتبة الصورة لاستبعاد الخلفية، وتسليط الضوء فقط كروي والخلايا الغازية، وقياس منطقتهم. مجال كروي الأصلي يمكن أن تقلل من هذا المجموع لتحديد الغازية.
5. الكمي من الغزو: المناعي
ملاحظة: يجب أن يتم تمرير جميع الحلول والمخازن من خلال مرشح 0.45 ميكرون قبل استخدامها لريمولقد الحطام، والتي يمكن أن تؤثر سلبا على تلطيخ.
- إعداد العازلة يغسل PBS +. إعداد برنامج تلفزيوني 1X وإضافة CaCl 2 و MgCl 2 إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم. لا الأوتوكلاف عازلة بعد تضاف CaCl 2 و MgCl 2. قد يكون الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة فلتر تعقيم.
- إعداد محايد عازلة تثبيت مخزنة الفورمالين (NBF). إضافة 5 قطرات من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 0.6 غرام امتصاص العرق. جلب إلى 20 مل مع برنامج تلفزيوني + واحتضان عند 60 درجة مئوية حتى يذوب امتصاص العرق (حوالي 1 ساعة). تبرد لدرجة حرارة الغرفة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك.
ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد عازلة تثبيت بنك الفجيرة الوطني مباشرة قبل الاستعمال. - إعداد ألبومين المصل البقري (BSA) حظر العازلة. حل جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني + في 3٪ ث / ت. الحل قد يكون تصفية تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية لعدة أيام ولكن من الأفضل إعداد الطازجة. لا تسخن.
- إعداد Permeabilization العازلة. تمييع تريتون X-100إلى 0.2٪ ت / ت في برنامج تلفزيوني +.
ملاحظة: Permeabilization عازلة ينبغي إعداد مباشرة قبل الاستعمال. - اختياريا، وإعداد MOWIOL المتوسطة المتزايدة. الجمع بين 2.4 ز MOWIOL، 6 ز الجلسرين، و 6 مل عالى النقاء H 2 O. ميكس لمدة 3 ساعات في المدورة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 12 مل 0.2 M تريس الكلورين (درجة الحموضة 8.5). احتضان مع خلط عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. إضافة مادة مضادة للتبيض، مثل 2.5٪ DABCO. مخزن في 500 مكل في -20 درجة مئوية.
- المناعي تلطيخ الكروية (الشكل 5)
ملاحظة: استخدام ماصة لإضافة ببطء أو إزالة السوائل من الشرائح الغرفة. تجنب استخدام الشافطة، لأن هذا قد يعطل طبقة الكولاجين.- إعداد الكروية وتضمينها في الشرائح غرفة مليئة الكولاجين، كما هو موضح في الأقسام 1-2.
ملاحظة: الكولاجين تألق ذاتي يمكن التقليل باستخدام طبقات رقيقة أو كميات صغيرة من جollagen. - إزالة الكثير من مستنبت ممكن من كل شريحة الغرفة.
- لفترة وجيزة شطف طبقة الكولاجين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة في برنامج تلفزيوني + لإزالة المتوسطة المتبقية.
- إضافة 500 ميكرولتر الطازجة PBS + غسل العازلة إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لغسل الكروية. كرر مرتين.
- استبدال برنامج تلفزيوني + غسل العازلة مع 500 العازلة تثبيت ميكرولتر بنك الفجيرة الوطني. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل20-25 دقيقة.
- إزالة عازلة تثبيت بنك الفجيرة الوطني وشطف مع 500 ميكرولتر غسل العازلة في برنامج تلفزيوني +. يغسل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني جديد + العازلة غسل ما لا يقل عن 3 مرات.
ويمكن تخزين الثابتة الكروية في 4 درجات مئوية في + غسل العازلة جديدة في برنامج تلفزيوني لعدة أيام: ملاحظة. ويمكن إضافة 0.01٪ أزيد الصوديوم لغسل العازلة لمنع نمو الجراثيم أثناء التخزين. - استبدال برنامج تلفزيوني + غسل العازلة مع 500 العازلة permeabilization ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
- اختياريا، وإزالة BSA عازلة الحجب. باستخدام مشرط أو مقص، الكروية المكوس والمحيطة 3 مم منطقة × 3 مم من طبقة الكولاجين. باستخدام واسعة تتحمل P1000 طرف، إزاحة كتلة رفعه من الكولاجين من قبل الشطف بلطف مع العازلة BSA حجب الطازجة. نقل كتلة الكولاجين لأنبوب 1.5 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف. أنبوب يمكن مقلوب بعناية على منشفة ورقية نظيفة لذبالة بعيدا السوائل الزائدة.
- إعداد الكروية وتضمينها في الشرائح غرفة مليئة الكولاجين، كما هو موضح في الأقسام 1-2.
- إضافة إلى الأجسام المضادة الأولية الكروية ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إضافة كمية كافية من الأجسام المضادة الأولية مثل أن طبقة الكولاجين بأكملها غارقة بالتساوي. الخطوات اختياري فوق (5.6.8.1-5.6.8.2) تسمح عادة استخدام كميات أصغر من الأجسام المضادة.
- غمر الشرائح الغرفة في وعاء مع لا يقل عن 10 مل برنامج تلفزيوني + غسل BUFفر لمدة 10 دقيقة لغسل. أكرر ما لا يقل عن مرتين.
- اختياري، إذا ما تم رفعه الكروية من طبقة الكولاجين سابقا (الخطوة 5.6.8.1)، إضافة ما لا يقل عن 1 مل PBS + غسل العازلة إلى أنبوب 1.5 مل وتستنهض الهمم بلطف. السماح لينقع لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
- إزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني + غسل العازلة ممكن، وتكرار الغسيل مع برنامج تلفزيوني + غسل العازلة ما لا يقل عن مرتين. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة عدة دقائق لتكوير كتلة الكولاجين.
ملاحظة: الأسطح الخارجية النظيفة من الشريحة الغرفة عن طريق المسح مع الايثانول 70٪ قبل غمر في غسل العازلة.
- كرر الخطوات 5.6.9-5.6.10 باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المناسب.
ملاحظة: إذا كانت ملطخة الكروية مباشرة في وعاء التصوير، انتقل إلى الخطوة 5.6.13. - اختياري، إذا ما تم رفعه الكروية من طبقة الكولاجين سابقا (الخطوة 5.6.8.1)، شرائح زجاجية نظيفة وcoverslips المجهر متوافق مبائر مع 70٪ من الإيثانول.
- إزالة أكبر قدر من غسل العازلة ممكن من كتلة الكولاجين وresuspend في عالى النقاء H 2 O. تنفيذ هذه الخطوة على الفور قبل التركيب. لا تترك كتل الملون النقع في الماء.
- باستخدام ملقط يميل غرامة، فهم حافة كتلة الكولاجين ونقل إلى شريحة زجاجية.
- باستخدام ملقط لعقد الكولاجين في المكان، واستخدام ممسحة قطنية نظيفة لذبالة السائل الزائد من كتلة الكولاجين، والتأكد من عدم لمس الكولاجين مباشرة.
ملاحظة: إذا أصبح الكولاجين عالقا على مسحة القطن ويمكن إزالته بلطف إما باستخدام ملقط، أو عن طريق غمر في الماء.
- باستخدام تقنية pipetting لالعكسي، الاستغناء عن 100 ميكرولتر MOWIOL المتوسطة المتزايدة على كتلة الكولاجين ومكان ساترة فوق العينة.
- استخدام قطعة من القطن أو منشفة ورقية لالفتيل MOWIOL الزائد تصاعد المتوسطة والماء من تحت ساترة.
- السماح MOWIOL المتوسطة المتزايدة لتتصلب بين عشية وضحاها في 4 درجاتحواف جيم ختم ساترة مع طلاء الأظافر.
- صورة الكروية الملون باستخدام متحد البؤر أو مضان المجهر لمراقبة توطين البروتينات من الفائدة، وتشكيل الهياكل الغازية، وما إلى ذلك (أرقام 5B، 5C).
ملاحظة: يجب أن تكون ملطخة الكروية محمية من الضوء لمنع photobleaching من.
6. Anoikis الفحص
ملاحظة: يتم تكييف بروتوكول تكوين كروي بسهولة لقياس النمو المستقل مرسى والمقاومة anoikis في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.
- بذر خلايا لanoikis فحص (الشكل 6)
- اتبع الإرشادات لإنتاج كروي في القسم 1.4 ولكن استخدام ما لا يقل عن 30 ملغ / مل ميثيل السليلوز لإعداد المتوسطة تشكيل كروي.
ملاحظة: عند درجة حرارة، يجب أن 30 ملغ / مل السليلوز الميثيل تنتج مادة هلامية سميكة الذي يحمل الخلايا في تعليق. - احتضان الخلايا لعدة أيام إلى أسابيع وفيSPECT بانتظام في 10X التكبير باستخدام المجهر. يجب أن الخلايا التي تقاوم anoikis تتكاثر وتشكل المستعمرات.
- تحديد anoikis عن طريق قياس عدد وحجم المستعمرات التي شكلت في كل بئر.
ملاحظة: عندما يتم تشكيل المستعمرات، يمكن غسلها لإزالة ميثيل السليلوز وتستخدم لفحوصات على أساس كروي، كما هو موضح.
- اتبع الإرشادات لإنتاج كروي في القسم 1.4 ولكن استخدام ما لا يقل عن 30 ملغ / مل ميثيل السليلوز لإعداد المتوسطة تشكيل كروي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تصف طريقة مرنة وفعالة لتوليد الأجسام الشبه الكروية منفصلة باستخدام ألواح الخلايا طارد وسائل الإعلام تشكيل كروي تستكمل مع MC. في ظل الظروف المناسبة من مولودية ومصل الدم، والخلايا الفردية تسوية والالتزام معا في مركز البئر لتشكيل الأجسام الشبه الكروية مع التزام الحد الأدنى من أسفل جيدا. باستخدام هذا البروتوكول، تم إنشاؤها الكروية من مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا (الشكل 2B). مطلوب المعايرة مولودية وتركيزات مصل لكل خط الخلية لتحديد الظروف المثلى حيث يتم تشكيل فقط كروي واحد هو قوي بما يكفي للسماح التلاعب دون تفتيت. على النحو الأمثل، وكانت الكروية بين 200-500 ميكرون في القطر، وتتكون من خلايا ملتصقة بإحكام مع الحد الأدنى من الحطام الخلية. نجا الكروية التعامل مع لطيف دون ضرر، والسماح لهم لجمعها واستخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من المقايسات.
her.within الصفحات = "1"> تشكيل الجسم الشبه الكروي يمكن أن يتعرض للخطر من الملوثات البكتيرية أو غيرها من الميكروبات (الشكل 3A)، مما أسفر عن مجاميع من الخلايا الميتة. في وجود الغبار أو تلوث الألياف الأخرى، متعددة أو مجموعات الخلايا غير منتظمة الشكل التي تم تشكيلها فقط تجميع ضعيفة، والشبه الكروية الناتجة كسر بسهولة بعيدا عند التعامل معها. تأثر تشكيل كروي أيضا تركيزات دون المستوى الأمثل من MC أو مصل الدم في المتوسط تشكيل كروي (الشكل 3B). في تجاربنا، كان العديد من خطوط الخلايا قادرة على الانضمام إلى لوحات الخلايا طارد في غياب، أو في تركيزات منخفضة، مولودية، وأسفرت عن تشكيل كروي محاطة أحادي الطبقة الخلية (الشكل 3B-II). وأظهرت نمو الخلايا BxPC-3 في ظروف دون المستوى الأمثل MC كمثال على ذلك. بشكل عام، تركيزات أعلى من MC منعت الخلايا من التمسك جيدا، ولكن تركيز عالية جدا من MC تقليل التصاق الخلية خلية، والخلايا منعه من تسوية إلى قاع البئر، مما أدى إلى تشكيل مجاميع فضفاضة والكروية الفضائية العديدة (الشكل 3B-ط). تركيز مصل الدم تتأثر أيضا بقاء الخلية، وخلية خلية، والتصاق الخلايا البلاستيكية ويحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط مختلفة من الخلايا. لخطوط الخلايا مثل كليات التقنية العليا-116 وPANC-1، أدى تركيز عال جدا المصل في تكاثر الخلايا المفرط وإنتاج الأجسام الشبه الكروية الضخمة التي تضررت بسهولة عن طريق المناولة، أو الترويج التصاق الخلية إلى البلاستيك جيدا وتشكيل أحادي الطبقة ( الشكل 3B-ج). ومن المثير للاهتمام، وآثار عدم كفاية الدم تختلف بين خطوط الخلايا. تم تخفيض كليات التقنية العليا-116 بقاء الخلية وكانت الكروية شكلت الصغيرة، التي تحتوي على نسبة كبيرة من الخلايا الميتة في مصل الدم المنخفض. في المقابل، كانت PANC-1 خلايا قابلة للحياة في غياب المصل، ولكن أصبحت أكثر تمسكا، وشكلت مجاميع متعددة فضلا عن أحادي الطبقة الخلية (الشكل 3B-والرابع والخامس).
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> في المقايسات الغزو، ومعلق الكروية شكلت مسبقا في الكولاجين تحييد لتوليد مصفوفة جامدة خارج الخلية (القسم 2.2، الشكل 4). إضافة لاحقة من جاذب كيميائي بفعل الخلايا الفردية للانتقال إلى الخارج من كروي وغزو في مصفوفة المحيطة بها (الشكل 4B). ويمكن قياس عدد من غزو الخلايا وبعد غزو من خلال الفحص المجهري brightfield، أو بواسطة المجهر مضان في وجود وصمة عار الخلية الحية مثل دابي أو Calcein AM (المواد 3 و 4). في تجاربنا، والتغيرات المورفولوجية، مثل تشكيل نتوءات، كانت مرئية في غضون 6 ساعات في المعاملة مع جاذب كيميائي، ويمكن ملاحظة خلايا عديدة فصل تماما من كروي والغازية في الكولاجين في غضون 18 إلى 48 ساعة. لتجاربنا، وجدنا أن 12 إلى 18 ساعة من الغزو كانت مثالية، كما أسفرت مرات حضانة أطول في الخلايا تتحرك بعيدا جدا عنكروي للتصوير الأمثل. يمكن تصوير ثابت الكروية جزءا لا يتجزأ من الكولاجين بواسطة brightfield، لقياس المسافة وعدد من الخلايا الغازية، أو المناعي المجهري (الأقسام 3-5)، لرؤية الهياكل الغازية التي شكلتها الخلايا (أرقام 5B، 5C).
وهناك تعديل للوصف بروتوكول تكوين كروي، حيث يتم تعليق الخلايا الفردية في تركيز أعلى MC (30 ملغ / مل) يمكن استخدامها لمراقبة المقاومة anoikis. في هذه التركيزات مولودية والمتوسطة لا يزال من الممكن نقلها بواسطة ماصة في حين باردا، ولكن سميكة إلى هلام الصلبة عند 37 درجة مئوية. ظلت خلايا مقاومة للAnoikis معلق إلى هذه الوسيلة في تعليق وانتشرت على مدى فترة من 2-4 أسابيع، وتشكيل الأجسام الشبه الكروية مع وقف التنفيذ بمساحات مختلفة (الشكل 6B). الخلايا التي تعتمد على مرسى لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في ظل هذه الظروف. كنا قادرين على تحديد anoikis المقاومة عن طريق عد خدرإيه الكروية شكلت في كل بئر.
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول تشكيل 3D الجسم الشبه الكروي. وفصل الخلايا المزروعة في الثقافة أحادي الطبقة، عد، مكعبات، ومعلق في المتوسط تشكيل كروي تستكمل مع ميثيل السليلوز (MC) والمصل (من الأول إلى الرابع). والمصنف تعليق في لوحة خلايا طارد U-السفلى في الكثافة المطلوبة للسماح بتشكيل الكروية من الحجم المطلوب (ت)، وحضنت لوحة لإنتاج واحد، كروي خلية منفصلة في كل (السادس) أيضا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: محسن الجسم الشبه الكروي شروط تشكيل.(أ) تشكيل كروي تحت الظروف المثلى للخلايا SH-SY5Y. 1000 الخلايا المزروعة في لوحات خلايا طارد U-السفلى في وسائل الإعلام تستكمل مع 5٪ مصل و 1 ملغ / مل تجميع MC إلى الكروية التعاقد خلال 24 ساعة. (ب) صور الممثل الكروية التي شكلتها خطوط الخلايا المختلفة تحت الظروف المثلى هو مبين في الجدول رقم 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: تشكيل كروي تحت ظروف دون المستوى الأمثل. (أ) الأجسام الشبه الكروية شكلت في وجود الملوثات. أدى التلوث الميكروبي في موت الخلايا والأجسام الشبه الكروية تجميع فضفاضة. في ظل وجود ملوثات غير قابلة للذوبان، مثل الغبار أو الألياف والخلايا انضمت إلى هذه المواد ولم aggregأكل. (ب) تشكيل الجسم الشبه الكروي في الأمثل المتوسطة تشكيل كروي. BxPC-3 خلايا المصنف في وجود فائض MC (10 ملغ / مل) تشكيل العديد من الأجسام الشبه الكروية الأقمار الصناعية (ط)، في حين أن عدم كفاية MC (0 ملغ / مل) أسفرت عن المجاميع الخلية التي انضمت إلى أسفل بشكل جيد وشكل أحادي الطبقة (ب ). وقد لوحظت نتائج مماثلة لخطوط الخلايا الأخرى اختبار (لا يظهر). أدى المصل الزائد (20٪) زيادة في كليات التقنية العليا-116 تكاثر الخلايا وأحادي الطبقة تشكيل (ج). كان المصل غير كافية (0٪) آثار خط معين الخلية تتراوح بين موت الخلايا في كليات التقنية العليا-116 (رابعا) لتشكيل الأجسام الشبه الكروية الأقمار الصناعية في PANC-1 (ت). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الغزو الفحص عن طريق الأجسام الشبه الكروية. (A) ربوتكأerview من فحص غزو كروي. وقبل المغلفة السفينة التصوير مع طبقة من الكولاجين تحييد وحضنت لبلمرة الكولاجين (الأول والثاني). يتم جمع الكروية قبل تشكلت في أنابيب 1.5 مل ومعلق في الكولاجين تحييد (من الثالث إلى السادس). ومضافين الخليط كروي الكولاجين على الكولاجين قاعدة طبقة وحضنت لبلمرة الكولاجين (من السابع الى الثامن). متوسط النمو التي تحتوي على مركبات المطلوب ثم يتم مضافين على الطبقات كروي الكولاجين بلمرة وحضنت للسماح للغزو الخلايا (التاسع والعاشر). (ب) في وجود جاذب كيميائي، وتظهر الخلايا الغازية في المحيط مصفوفة الكولاجين من PANC-1 كروي جزءا لا يتجزأ في النقاط الزمنية المشار إليها. وتظهر كل لوحة صورة النقيض من المرحلة المكتسبة باستخدام الهدف 10X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: المناعي تلون الأجسام الشبه الكروية جزءا لا يتجزأ من الكولاجين. (أ) نظرة عامة على بروتوكول لتلطيخ المناعي من الكروية. يتم غسلها الكروية جزءا لا يتجزأ، الثابتة (NBF)، وسدت (BSA) مباشرة في وعاء التصوير. الكروية يمكن أن تكون ملطخة مباشرة، أو رفعه وملطخة في حجم أصغر، مثل أنبوب 1.5 مل. يجب غسلها الكروية مع العازلة الزائد بعد كل وصمة عار لتقليل مضان الخلفية. الكروية الملون يمكن تصوير مباشرة في وعاء أو شنت تحت ساترة للتصوير والتخزين. الصور (B) المناعي خلية كروي TPC-1 جزءا لا يتجزأ من الكولاجين وسمح لغزو لمدة 24 ساعة. (C) الصور تظهر خلايا phalloidin الملون نموذجية من المناطق المشار إليها في B. تظهر كل لوحة 20 ميكرون Z-الإسقاط (0.2 ميكرومتر الخطوات) اكتسبت باستخدام الهدف 60X: خلايا داخل كروي بODY حوالي 20 ميكرون من على سطح الأرض (1)، وخلايا جاحظ في الكولاجين (2)، والخلايا الغازية من خلال الكولاجين (3). الحانات النطاق = 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تشكيل كروي Anoikis الفحص. (أ) نظرة عامة على بروتوكول لanoikis الفحص. وتعد الخلايا كما هو موضح في الشكل رقم 1، ولكن معلق في المتوسط تشكيل كروي تحتوي على ما لا يقل عن 30 ملغ / مل MC الذي يشكل طبقة سميكة لعقد الخلايا الفردية في تعليق ومنع تجميع الخلية (الأول والثاني). والمصنف تعليق خلية في لوحات خلايا طارد U-القاع وحضنت (الثالث والرابع). يمكن رصد الخلايا مع وقف التنفيذ لتشكيل كروي من انتشار الأسلحة النووية، مشيرا إلى مقاومة anoikis. (
| الخط الخلوي | MC (ملغ / مل) | مصل (٪) | حضانة التقريبية زمن |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 ساعة |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 إلى 5 أيام |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5-7 أيام |
| كليات التقنية العليا-116 | 3 | 10 | 2-4 أيام |
| TT | 1 | 10 | 7-10 أيام |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1-2 أيام |
الجدول 1: تشكيل كروي الأمثل متوسطة التركيب والحضانة تايمز لخطوط خلية التحقق من صحتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم طريقة سريعة ومرنة لإنتاج الأجسام الشبه الكروية خلية 3D في تصميم نموذج لهندسة الأنسجة في الجسم الحي باستخدام الكواشف مكلفة ومتاحة على نطاق واسع. بروتوكول لدينا يستغل الخصائص غير السامة للخلايا وتعزيز التصاق MC 8 و 9 للتوسط تجميع الخلايا وتقليل تكوين خلايا أحادي الطبقة. وخلافا للمصفوفات البروتين على أساس معزولة من مصادر حيوانية، MC غير خامل، لا تحتوي على عوامل النمو، وإزالتها بسهولة عن طريق الغسيل، مما يسمح للعزلة الكروية لاستخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات من دون وجود مصفوفة المتبقية. يستخدم بروتوكول لدينا التجميع السريع لأعداد الخلايا ثابتة لتوليد الأجسام الشبه الكروية الحجم متجانس، مما يسمح للمقارنات مباشرة لالكروية نمت في ظل ظروف تجريبية مختلفة. ويمكن تكييف هذه الطريقة للثقافات متباينة لنموذج في نمو الورم في الجسم الحي من خلال الجمع بين الأرقام الثابتة من عدة أنواع الخلايا المرتبطة الورم (على سبيل المثال الخلايا الليفية، كريات الدم البيضاء، والخلايا اللحمية) لتمثل أكثر دقة البيئة الورم.
ويمكن إجراء تعديلات لدينا بروتوكول باستخدام خلايا المصنف في تركيزات عالية من MC لمراقبة نمو مستقل مرسى الخلايا قادرة على التكاثر في تعليق، وربما يمكن توظيفه كأداة لفحص anoikis (القسم 6) لتحديد أو قياس تحول الخلية. الكروية الناتجة عن بروتوكول لدينا هي مثالية لتطبيقات مثل فحص المخدرات، مما يتيح المقارنة بين نمو الخلايا، والتمثيل الغذائي، البقاء على قيد الحياة، والغزو بين الظروف العلاج. ويمكن أيضا أن يكون متضمنا الكروية معزولة في المصفوفة خارج الخلية، مثل الكولاجين، لتقييم وقياس غزو الخلايا في-المكروية 3D (القسم 2.2، الشكل 4) أن أكثر دقة النماذج في نمو الورم في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها لعزل كميات كبيرة من الأجسام الشبه الكروية من المصفوفة MC للبروتين أو إعداد RNA، والسماح شالسرس لتقييم إشارة الخلية أو التعبير الجيني تغييرات في استجابة لظروف العلاج أو النمو.
يتطلب بروتوكول لدينا تشكيل كروي الأمثل من المصل وتركيزات MC، وعدد الخلايا المزروعة لكل خط الخلية. خصائص الخلية خط محددة، مثل بقاء الخلية، خلية خلية والإلتصاق خلايا من البلاستيك، ويمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على السهولة التي يتم تشكيلها الكروية. بشكل عام، خطوط الخلايا مع بقاء الفقيرة في الثقافة أحادي الطبقة المطلوبة تركيزات مصل أعلى لتشجيع تشكيل كروي، بينما يفضل تركيز MC أعلى لخطوط الخلايا لاصقة للغاية. لذا من المستحسن أن يتم إجراء المعايرة من المصل ومولودية لتحديد الظروف المثلى لبقاء الخلية (تركيز مصل الدم)، مع التقليل أحادي الطبقة وتشكيل كروي الأقمار الصناعية (تركيز MC). هذه الشروط ينبغي أن يؤدي إلى توليد كروي منفصلة واحد لكل بئر من دون الأقمار الصناعية. الأمثل حجم كروي لالتحليل التي تعتمد على الطلب ويتأثر عدد الخلايا المزروعة، تركيز مصل الدم (الخطوة 1.4.7). بذر خلايا أقل تنتج المجاميع الصغيرة التي هي أكثر سهولة ملطخة متجانس، ولكن قد لا تتكاثر في الجسم الحي خلية خلية والتفاعلات خلية المكروية. زيادة عدد الخلايا المصنف يولد الكروية الكبيرة، التي قد تحتوي على نواة ميتة تمثيلية من الناحية الفسيولوجية 10 التي يمكن أن تؤثر على سلوك الخلية وتغيير تفسيرات للنمو أو بقاء المقايسات. ومع ذلك، عندما كبيرة جدا، قد يكون الكروية هشة وكسر بسهولة بعيدا أو التالفة أثناء العزلة. الكروية الكبيرة هي أيضا أصعب بكثير لتصور دون منصات التصوير المتخصصة لباجتزاء البصرية (مثل ضوء ورقة المجهر الفلورسنت) أو عن طريق دمج أو cryosectioning وتلطيخ المقاطع العرضية من خلال كروي 11. ونحن نوصي حجم كروي الهدف من 200-500 ميكرون إلى المرونة وسهولة التعامل مع معظم التطبيقات. وعموما، فإن من الأهمية بمكان لتحسين الظروف لتشكيل كروي في كلا بطريقة خلية خط محددة وبالتطبيق.
وتتطلب بروتوكولات إنتاج كروي اهتماما خاصا لتجنب تلوث الكروية من الغبار والجسيمات الأخرى. خلايا التمسك الغبار والملوثات الأخرى غير قابلة للذوبان، مما أدى في شكل غير منتظم، فضفاضة خلية ملتصقة المجاميع غير صالحة للاستخدام في التحليل (الشكل 3A). مصادر التلوث يمكن التقليل من خلال تمرير جميع الحلول من خلال مرشح 0.45 ميكرون، بدهن أحادي الطبقة الخلية مع متوسط تصفيتها قبل التفكك (الخطوة 1.4.1)، والشطف الخزانات ماصة الأقنية مع الماء عالى النقاء تصفيتها فورا قبل الاستخدام (الخطوة 1.4.6.1). وعلاوة على ذلك، الماصات المصلية التي تم تصفيتها القطن، والتي يمكن أن تسلط الألياف إلى حلول، ينبغي تجنبها. وإن لم يكن حاسما، والغبار يمكن تخفيضها عن طريق تمرير dissociatخلايا إد من خلال 100 ميكرون مصفاة الخلية قبل البذر (الخطوة 1.4.6). خسارة التبخر المتوسطة هي من الاعتبارات التقنية الإضافية، وخاصة في أوقات حضانة تتجاوز 1 أسبوع، مثل تلك التي تتطلبها خطوط الخلايا معينة لتشكيل كروي (الجدول 1) أو خلال فحوصات anoikis (القسم 6). التبخر يمكن التقليل من البذر الخلايا في الآبار في منطقة وسط لوحات متعددة جيدا، وملء محيط الآبار مع الماء عالى النقاء، وختم فضفاضة حواف لوحة أو أرفق لوحة في غرفة ترطيب.
الكروية خلية 3D هي نموذجا قيما لدراسة كل من السلوك الطبيعي للخلايا والأورام وعلم وظائف الأعضاء. بروتوكول لدينا هو طريقة سريعة واقتصادية لتوليد الأجسام الشبه الكروية خلية 3D بحجم باستمرار والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من فحوصات والتطبيقات. وتمثل هذه الأجسام الشبه الكروية أدوات قيمة لتوصيف نمو الورم والمكروية التفاعلات وكذلك نماذج للعلاقات العامةتقييم eclinical من علاجات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
