Abstract
La culture de cellules monocouches ne modélise pas adéquatement le comportement in vivo des tissus, ce qui implique des interactions cellule-cellule et cellule-matrice complexes. Trois dimensions techniques de culture (3D) des cellules sont une innovation récente développée pour remédier aux insuffisances de la culture de cellules adhérentes. Bien que plusieurs techniques pour générer des analogues de tissus in vitro ont été mis au point, ces méthodes sont souvent complexes, coûteux à mettre en place, nécessitent un équipement spécialisé, et sont généralement limités par la compatibilité avec seulement certains types de cellules. Ici, nous décrivons un protocole rapide et flexible pour l'agrégation des cellules en sphéroïdes multicellulaires 3D de taille uniforme qui est compatible avec la croissance d'une variété de tumeurs et de lignées cellulaires normales. Nous utilisons des concentrations variables de sérum et la méthylcellulose (MC) afin de promouvoir un ancrage indépendant de la génération sphéroïde et éviter la formation de monocouches de cellules d'une manière hautement reproductible. Les conditions optimales pour individual lignées cellulaires peuvent être obtenues en ajustant les MC ou les concentrations sériques dans le milieu de formation de sphéroïde. Les sphéroïdes 3D générées peuvent être collectées pour une utilisation dans une large gamme d'applications, y compris la signalisation cellulaire ou des études d'expression de gènes, le criblage de médicaments candidats ou pour l'étude des processus cellulaires tels que l'invasion des cellules tumorales et la migration. Le protocole est également facilement adaptée pour générer des sphéroïdes clonale à partir de cellules simples, et peut être adapté pour évaluer la croissance indépendante de l'ancrage et anoïkose résistance. Dans l' ensemble, notre protocole fournit une méthode facilement modifiable pour produire et utiliser des sphéroïdes de cellules 3D afin de récapituler le micro - environnement 3D de tissus et de modéliser la croissance in vivo des cellules normales et tumorales.
Introduction
Évaluation Biologiquement pertinente du comportement des cellules tumorales est difficile en utilisant traditionnelle en deux dimensions (2D) méthodologies de culture cellulaire, en partie parce que ceux-ci ne reflètent pas de manière adéquate le microenvironnement cellulaire trouvé in vivo. Des approches alternatives comprenant des composants de la matrice extracellulaire dans la culture (par exemple, les dosages de la chambre de Boyden) sont représentatifs de plus de vue physiologique in vivo dans l' environnement tissulaire. Cependant, elles peuvent être limitées à une évaluation du comportement des cellules individuelles et ne sont pas récapituler le complexe en association in vivo des interactions cellule-matrice et cellule-cellule qui contribuent à la croissance du tissu ou de la tumeur 1, 2, 3.
L'utilisation des sphéroïdes multicellulaires est une approche récente qui reproduit plus fidèlement l'architecture compacte de la croissance cellulaire in vivo en 1,4. Sphéroïdes peuvent être utilisées pour étudier les interactions cellule-matrice de cellules normales, mais elles peuvent également agir comme des analogues de la tumeur pour modéliser les caractéristiques de la progression tumorale, comme la croissance métastatique ou la résistance aux médicaments 4.
Sphéroïdes peuvent être formés par la prolifération des cellules isolées noyées dans une matrice 5, ou plus rapidement, en favorisant l'agrégation des cellules multiples pour former un groupe unique de cellules (par exemple, goutte suspendue, des procédés de centrifugation) 6, 7. Les techniques actuelles d'agrégation cellulaire peuvent nécessiter des matériaux coûteux ou d'équipements spécialisés. En outre, ces sphéroïdes ont un large éventail de tailles et de morphologies et peuvent être difficiles à produire en grandes quantités, ce qui rend les comparaisons entre les conditions de croissance ou traitements difficiles. Enfin, sphéroïdes générés par ces méthodes peuvent être difficiles à isoler du extracel protéiniquematrice lular dans laquelle ils sont intégrés pour une utilisation dans d'autres applications.
Ici, nous décrivons une méthode d'agrégation cellulaire robuste et facilement modifiable pour la formation rapide de sphéroïdes de cellules de taille uniforme en utilisant des plaques disponibles dans le commerce à fond en U cellulaire hydrophobe et une matrice inerte favorisant l'adhérence, la cellulose de méthyle. Une fois formés, ces sphéroïdes multicellulaires sont facilement isolées pour une utilisation dans un large éventail d'applications. Le protocole est également facilement adaptée pour générer des sphéroïdes par le biais de la prolifération cellulaire, qui peuvent être utilisés pour évaluer d'autres processus cellulaires. Ici, nous montrons des essais d'invasion cellulaire, quantifiés par immunofluorescence, et un essai de anoikis, comme exemples d'applications de ces deux protocoles de formation sphéroïde différents.
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Protocol
REMARQUE: Tous les réactifs et consommables sont répertoriés dans la liste des matières.
1. Production Spheroid par Cell Agrégation
- Une solution de méthylcellulose: Préparer 100 ml de 100 mg / ml de méthylcellulose.
- Chauffer 50 ml ultrapure H 2 O à 80 ° C. Ajouter 10 g de méthylcellulose en poudre et agiter jusqu'à ce que les particules sont réparties de façon égale.
- Porter à volume final avec ultrapure froid H 2 O et agiter à 4 ° C jusqu'à ce que la solution devient limpide, de couleur paille, et ne contient pas de solides visibles.
- Passer à travers un filtre de 0,45 um pour éliminer les solides non dissous. solution préparée peut être aliquoté et conservé à 4 ° C pendant jusqu'à 12 mois.
REMARQUE: Méthylcellulose sert non cytotoxique, inerte, un agent de suspension pour améliorer l'adhérence cellule-cellule et décourager la formation d'une monocouche de cellules adhérentes. La méthylcellulose est soluble dans l'eau et peut être lavé suivant Sphergénération oid.
- Milieu de formation Spheroid
NOTE: Préparer immédiatement milieu de formation sphéroïde avant utilisation. Ne pas stocker.- Diluer la solution de méthylcellulose à 1 à 5 mg / ml dans le milieu de culture approprié.
- Passer à travers un filtre de 0,22 um pour stériliser et éliminer les solides non dissous.
- Phosphate de solution saline tamponnée de Dulbecco (PBS)
- Diluer à 1x et passer à travers un filtre de 0,45 um avant utilisation. solution préparée peut être conservée indéfiniment à la température ambiante.
- Production de cellules sphéroïde (Figure 1)
NOTE: Préparer tous les réactifs à l'avance. Il est important d'éviter la contamination des solutions de poussière, de fibres ou d'autres particules insolubles. La présence de ces contaminants nuira formation sphéroïde. Le milieu de culture et d'autres solutions doivent être passés à travers un filtre de 0,45 um pour éliminer ces particules lorsque possible. Évitez l'utilisation de pipettes de coton filtré lors du transfert de solutions comme celles-ci peuvent introduire des fibres supplémentaires.- Des monocouches de cellules de culture jusqu'à 70% de confluence dans le milieu approprié de culture supplémenté avec 10% de sérum. Aspirer milieu de culture et rincer avec 1x PBS pour éliminer les débris. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA (0,05% trypsine) tampon de dissociation dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm, et on incube les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Inspecter les cellules au microscope à un grossissement de 10X pour confirmer le détachement. Neutraliser tampon de dissociation avec 7 ml de milieu de culture additionné de sérum.
- Centrifugeuse suspension de cellules à 500 xg pendant 10 min à cellules doucement granulés.
- Retirer le surnageant. boulette de cellules remise en suspension dans 1 ml de milieu de formation de sphéroïdes en utilisant une pipette P1000 avec un embout de filtre.
REMARQUE: La suspension cellulaire doit être exempt de grumeaux.- Pour triturer culot cellulaire, appuyez sur la pointe de la pipette contre le fond du tube à un angle léger toutpipetage au cisaillement culot cellulaire. Évitez triturant plus de 3 - 5 fois car cela peut endommager les cellules. Pipette lentement et ne pas expulser tout le contenu de la pointe de la pipette pour éviter de créer des bulles.
- Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et on dilue la suspension de cellules à 1 x 10 4 cellules / mL.
REMARQUE: Le nombre de cellules peut être optimisé pour générer des sphéroïdes de différentes tailles. Trypan coloration bleue des cellules endommagées peut être utilisée pour confirmer la viabilité des cellules remises en suspension. - Transfert suspension cellulaire à un réservoir multicanal de pipette sans poussière stérile et utiliser des embouts de filtre pour distribuer 100 pi dans chaque puits d'un 96 puits plaque de cellule-répulsif U-bas.
- Rincez le réservoir avec filtre ultrapure H 2 O pour enlever la poussière et les fibres.
- Mélanger la suspension de cellules périodiquement pendant le semis pour empêcher les cellules de se fixer au fond du réservoir. Pour éviter de créer des bulles, utiliser une technique de pipetage inverse tout en mélangeant et dispensing.
- Des plaques de transfert à la culture tissulaire incubateur (37 ° C et 5% de CO 2) et d' inspecter tous les jours pour la formation de sphéroïde. Les cellules doivent se déposer au fond de chaque puits dans les 6 h et agréger généralement dans un sphéroïde 24-48 h (Figure 2).
- Pour la confirmation de la formation sphéroïde réussie, utilisez une pointe de p10 et doucement la pipette moyenne sur le sphéroïde tout en observant au microscope à un grossissement de 10X. Bien sphéroïdes formés vont se desserrer de la plaque et le rouleau, ce qui confirme leur structure 3D.
NOTE: la cellulose de méthyle et les concentrations sériques doivent être déterminées par titrage pour chaque lignée cellulaire pour obtenir la formation d'un seul sphéroïde par puits. Des conditions optimisées de cette manière pour les lignées cellulaires sélectionnées sont présentés dans le tableau 1, et des exemples des sphéroïdes formés dans la figure 2B. Spheroids peuvent être cultivées pendant plus longtemps que ne l'indique, mais comme ils deviennent plus grands qu'ils grandissent progressivement plus difficileà manipuler sans fragmentation. Si les cellules forment une monocouche, sphéroïdes par satellite, ou ne parviennent pas à se déposer au fond du puits, la concentration de la méthylcellulose et le sérum peut avoir besoin d'être corrigée en outre optimale formation sphéroïde (figure 3B). Ne pas utiliser de sphéroïdes contenant des contaminants tels que des fibres ou des poussières (figure 3A). Préformées sphéroïdes peuvent être traités avec des composés intéressants, tels que des facteurs de croissance, les taches de cellules vivantes ou des inhibiteurs d'analyse.
2. Spheroid Invasion Assay (Figure 4)
- collagène neutralisé
- Refroidir tous les liquides à 4 ° C et maintenir sur la glace lorsque l'on travaille avec du collagène pour empêcher la polymérisation indésirable.
- Préparer frais 0,1 M et 0,01 M solutions de NaOH et HCl frais 0,1 à ultrapure H 2 O. passe toutes les solutions de 0,22 um filtres.
- Mélanger 1 collagène (3,1 mg / mL de stock), NaOH 0,01 M et 10x PBS (8 bovin de type 1: 1 rapport en volume), et ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH à froid 0,1 M et HCl. La concentration finale de collagène est de 2,5 mg / ml.
- Préparer suffisamment de collagène neutralisée pour remplir le récipient de formation d'image à une profondeur de 2-3 mm. Un minimum de 100 ul est nécessaire pour chaque puits de la culture tissulaire coulisse de la chambre 8 du puits inscrite dans la liste des matériaux.
- Incorporation sphéroïdes en collagène (Figure 4)
- Napper le fond de chaque puits d'une culture de tissu chambre diapositive 8 puits avec un minimum de 50 pi neutralisés collagène.
- Utiliser une technique de pipetage inverse pour éviter de créer des bulles dans le collagène. Utilisez la pointe de la pipette pour répandre le collagène uniformément sur la surface du puits.
NOTE: Cette couche de base de collagène tiendra sphéroïdes en suspension et est typiquement de 1-2 mm d'épaisseur. La couche de base et minimise la formation d'un ménisque sur la couche supérieure de collagène. Si la couche de base est trop mince, sphéroïdes peuvent prendre contact avec le fond de la glissière de chambre etformer une monocouche de cellules.
- Utiliser une technique de pipetage inverse pour éviter de créer des bulles dans le collagène. Utilisez la pointe de la pipette pour répandre le collagène uniformément sur la surface du puits.
- Placer la lame de la chambre, et une boîte de culture tissulaire de 35 mm rempli d'ultrapure H 2 O, dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que le collagène est polymérisé, typiquement 1 h. Magasin restant neutralisé collagène sur la glace.
REMARQUE: Le rempli d'eau plat 35 mm fournira l'humidité et éviter le dessèchement. La glissière de chambre doit rester dans cette chambre d'humidité tout au long de l'essai. La couche de base de collagène peut être laissée à polymériser du jour au lendemain. Incubations plus longues entraînent généralement un gel plus rigide. - En utilisant une pointe de filtre p1,000, collecter des sphéroïdes préformées (étape 1.4.7) de la plaque repoussant cellule à 96 puits à fond en U dans 1,5 ml encliquetage tubes supérieurs. Pipette lentement et éviter ou répété pipetage vigoureux pour réduire l'effet de cisaillement de fluide de sphéroïdes. sphéroïdes multiples peuvent être regroupées dans un seul tube pour le transfert à un puits de la glissière de la chambre de culture de tissu 8 puits.
- Centrifuger les sphéroïdes recueillies dans un tablETOP centrifuger à 2000 xg pendant 2-5 s et retirer le surnageant à l'aide d'une pipette de p200. Éviter centrifugation pendant plus longtemps que nécessaire, car cela pourrait provoquer des sphéroïdes à se briser ou s'agglutiner.
NOTE: Après pipetage la majeure partie du surnageant, le tube peut être inversé avec précaution sur une serviette en papier propre pour évacuer l'excès de liquide. Ne laissez pas sphéroïdes sécher. - En utilisant une pointe de perçage p200 large, resuspendre doucement sphéroïdes dans 50 ul neutralisés collagène. Pour ce faire, pour chaque tube de sphéroïdes recueillies avant que sphéroïdes sont transférés dans la glissière de chambre. Gardez sphéroïdes qui ont été remises en suspension dans le collagène neutralisé sur la glace jusqu'à ce prêt pour le transfert à des diapositives de chambre.
- Retirer la chambre de l'incubateur coulissant et pipette soigneusement le mélange sphéroïde-collagène sur le dessus de la couche de base de collagène. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à ce que le collagène est polymérisé.
- Ne pas distribuer tout le contenu de la pipette pour éviter de créer des bulles. Dropwise pipetage réduit les chances de perturber la couche de base de collagène.
- ajouter lentement un minimum de 100 ul chauffé milieu de culture contenant chemoattractants désirées, des inhibiteurs ou d'autres traitements pour chaque puits de la lame de la chambre. Les contenant sphéroïdes de la couche de collagène peuvent se déchirer si le liquide est à la pipette sur trop vigoureusement. Le milieu de culture peut être distribué lentement sur le côté d'un puits afin d'éviter de perturber le collagène.
- Incuber chambre , à 37 ° C et 5% de CO 2 pour permettre l' invasion cellulaire. L'invasion cellulaire dans le collagène environnant peut être observé par imagerie de fluorescence ou fond clair et quantifiée par une variété de méthodes utilisant épifluorescence, confocal ou microscopie nappe de lumière.
- Napper le fond de chaque puits d'une culture de tissu chambre diapositive 8 puits avec un minimum de 50 pi neutralisés collagène.
3. Quantification de Invasion: Brightfield Microscopie
- A intervalles de temps définis, l'image sphéroïdes collagène incorporé à un grossissement 10X en utilisant un microscope à fond clair (étape 2.2.8).
NOTE: Pourexpériences cellules vivantes à plus long terme, une platine de microscope chauffée et CO 2 chambre réglementés peuvent être utilisés pour maintenir sphéroïdes à 37 ° C et 5% de CO 2 , tandis que l' imagerie. - Quantifier invasivité utilisant des logiciels tels que ImageJ pour mesurer le nombre de cellules envahissantes dans le collagène environnant et la distance moyenne envahie à chaque point de temps.
4. Quantification de Invasion: Fluorescence Microscopy avec Live Mobile Stain
- 2.2.8 après l'étape, de compléter le milieu dans les coulisses de la chambre avec un colorant fluorescent tel que le DAPI, la calcéine AM, ou un autre composé adapté à la lignée cellulaire selon les instructions du fabricant, suivi de la cellule.
NOTE: Pour la quantification de l'invasivité, coloration homogène dans le sphéroïde est pas indispensable. Pour les applications nécessitant une pénétration plus profonde de la tache, incubations plus longues (> 3 h) peut être nécessaire. - Retirez la tache et le remplacer par 500 ul chaud 1x PBS. Danscubate à 37 ° C pendant 10 min pour éliminer l'excès de colorant. Répéter au moins deux fois.
- En utilisant un microscope à fluorescence, acquérir des sections optiques à travers les sphéroïdes envahissants.
NOTE: L'exposition prolongée à la lumière laser doit être minimisée lors de l'imagerie répétitive pour limiter phototoxicité et photoblanchiment. - Utiliser un logiciel tel que ImageJ pour générer une projection Z, qui peut être utilisée pour quantifier la surface totale de l'ellipsoïde, le nombre de cellules envahissantes et les distances envahies dans la matrice de collagène.
- A titre d'exemple, pour quantifier l'invasion, régler le seuil de l'image pour en exclure, en soulignant que le sphéroïde et envahir les cellules, et de mesurer leur région. La zone du sphéroïde original peut être soustrait de ce total pour quantifier invasivité.
5. Quantification de Invasion: immunofluorescence
NOTE: Toutes les solutions et les tampons doivent être passés à travers un filtre de 0,45 um avant utilisation pour remove des débris, ce qui peut affecter négativement la coloration.
- Préparer le tampon de lavage PBS +. Préparer PBS 1x et ajoute CaCl 2 et MgCl 2 à une concentration finale de 0,1 mM. Ne pas autoclaver tampon après CaCl2 et MgCl2 sont ajoutés. La solution peut être stérilisée par filtration et stockée à température ambiante.
- Préparer un tampon de fixation du formol tamponné neutre (FBN). Ajouter 5 gouttes de 1 M de NaOH à 0,6 g de paraformaldéhyde. Porter à 20 ml avec du PBS + et incuber à 60 ° C jusqu'à ce que le paraformaldehyde soit dissoute (environ 1 h). Refroidir à température ambiante et ajuster le pH à 7,4 avec du HCl 1 M.
REMARQUE: tampon de fixation FBN doit être préparée immédiatement avant utilisation. - Préparer l'albumine de sérum bovin (BSA), du tampon de blocage. Dissoudre dans du PBS + BSA à 3% p / v. La solution peut être stérilisée par filtration et stockée à 4 ° C pendant plusieurs jours, mais le mieux est fraîchement préparée. Ne pas chauffer.
- Préparer le tampon de perméabilisation. Diluer le Triton X-100à 0,2% v / v dans du PBS +.
NOTE: tampon perméabilisation doit être préparée immédiatement avant utilisation. - Eventuellement, préparer MOWIOL milieu de montage. Combiner MOWIOL 2,4 g, 6 g de glycérol, et 6 ml de H 2 O. ultrapure Mélanger pendant 3 h dans un rotateur à température ambiante. Ajouter 12 ml de 0,2 M de Tris-Cl (pH 8,5). Incuber sous agitation à 50 ° C pendant 10 min.
- Centrifuger à 5000 g pendant 15 minutes pour sédimenter la matière insoluble. Ajouter agent anti-blanchiment, tels que 2,5% DABCO. Magasin dans 500 aliquotes pi à -20 ° C.
- Immunofluorescence de sphéroïdes (Figure 5)
REMARQUE: Utiliser une pipette pour ajouter lentement ou éliminer les liquides de la chambre diapositive. Évitez l'utilisation d'un aspirateur, car cela peut perturber la couche de collagène.- Préparer sphéroïdes et intégrer dans les diapositives de la chambre de collagène rempli, tel que décrit dans les sections 1 à 2.
NOTE: Le collagène autofluorescence peut être minimisée par l'utilisation de couches minces ou de petits volumes de collagen. - Retirez autant du milieu de culture que possible de chaque diapositive de chambre.
- Rincer brièvement couche de collagène avec 500 tampon de lavage ul de PBS + pour éliminer le milieu résiduel.
- Ajouter 500 pi de tampon PBS frais + de lavage à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 minutes pour laver sphéroïdes. Répéter deux fois.
- Remplacer tampon PBS + de lavage avec 500 tampon de fixation ul FBN. Incuber à température ambiante pendant 20 - 25 min.
- Retirer le tampon de fixation FBN et rincer avec 500 pi de tampon de lavage PBS +. Laver pendant 5 min avec du PBS frais + tampon de lavage d' un minimum de 3 fois.
NOTE: fixe sphéroïdes peuvent être conservés à 4 ° C dans un tampon PBS frais de lavage + pendant plusieurs jours. azide de sodium 0,01% peut être ajouté au tampon de lavage pour inhiber la croissance microbienne pendant le stockage. - Remplacer PBS + tampon de lavage avec 500 tampon de perméabilisation ul. Incuber à température ambiante pendant 10 à 15 min.
- Eventuellement, éliminer le tampon de blocage BSA. En utilisant un scalpel ou des ciseaux, des sphéroïdes d'accise et 3 mm x alentours de 3 mm de la couche de collagène. En utilisant une pointe de perçage p1000 large, déloger le bloc excisé du collagène par rinçage doucement avec un tampon de blocage de BSA frais. Transfert bloc de collagène pour tube de 1,5 ml.
- Centrifuger à 2000 xg pendant 2 minutes et retirer le surnageant. Le tube peut être soigneusement retourné sur serviette en papier propre pour évacuer l'excès de liquide.
- Préparer sphéroïdes et intégrer dans les diapositives de la chambre de collagène rempli, tel que décrit dans les sections 1 à 2.
- Ajouter l'anticorps primaire à sphéroïdes et incuber à température ambiante pendant 1 h. Ajouter un volume suffisant d'anticorps primaire de telle sorte que la couche de collagène est entièrement immergée uniformément. Les étapes facultatives ci-dessus (5.6.8.1-5.6.8.2) permettent habituellement l'utilisation de volumes plus faibles d'anticorps.
- Immerger chambre coulissant dans un récipient avec au moins 10 ml de PBS + lavage buffer pendant 10 min pour se laver. Répéter au moins deux fois.
- Facultatif, si sphéroïdes ont été excisés de la couche de collagène précédemment (étape 5.6.8.1), ajouter un minimum de 1 ml de PBS + tampon de lavage au tube de 1,5 ml et agiter doucement. Laisser tremper pendant au moins 10 min.
- Éliminer le tampon PBS + autant que possible de lavage et répéter le lavage avec du PBS + tampon de lavage au moins deux fois. Centrifuger à 2000 xg pendant plusieurs minutes pour sédimenter bloc de collagène.
REMARQUE: Nettoyer les surfaces extérieures de la glissière de la chambre par essuyage avec 70% d'éthanol avant submergeant dans un tampon de lavage.
- Répétez les étapes 5.6.9-5.6.10 utilisant un anticorps secondaire approprié.
NOTE: Si sphéroïdes ont été colorées directement dans le récipient d'imagerie, passez à l'étape 5.6.13. - En option, si sphéroïdes ont été excisés de la couche de collagène précédemment (étape 5.6.8.1), les lames de verre propres et des lamelles couvre -objet en microscopie confocale compatible avec 70% d' éthanol.
- Retirez autant tampon de lavage que possible à partir du bloc de collagène et remettre en suspension dans ultrapure H 2 O. Effectuez immédiatement cette étape avant le montage. Ne laissez pas les blocs colorés trempage dans l'eau.
- En utilisant des pinces fines à pointe, saisir bord du bloc de collagène et transfert à lame de verre.
- Utilisation de la pince pour maintenir le collagène en place, utilisez un coton-tige propre pour évacuer l'excès de liquide à partir du bloc de collagène, en veillant à ne pas toucher directement le collagène.
REMARQUE: si le collagène est collé à un tampon de coton, il peut être retiré doucement en utilisant soit une pince, soit par immersion dans l'eau.
- En utilisant une technique de pipetage inverse, distribuer 100 pl MOWIOL milieu de montage sur le bloc de collagène et lieu lamelle sur l'échantillon.
- Utilisez un coton-tige ou une serviette en papier pour évacuer l'excès MOWIOL milieu de montage et de l'eau de sous la lamelle.
- Laisser MOWIOL milieu de montage durcir pendant une nuit à 4 °bords C. Sceau de lamelle avec du vernis à ongles.
- Sphéroïdes d' image colorées en utilisant la microscopie confocale ou de fluorescence pour observer la localisation des protéines d'intérêt, la formation de structures invasives, etc (figures 5B, 5C).
NOTE: Stained sphéroïdes doivent être protégés de la lumière pour éviter photoblanchiment.
6. anoikis Assay
NOTE: Le protocole de formation de sphéroïdes est facilement adaptable pour quantifier la croissance indépendante de l'ancrage et une résistance à anoïkose dans une variété de types de cellules.
- Ensemencement des cellules pour anoikis essai (Figure 6)
- Suivez les instructions pour la production sphéroïde dans la section 1.4, mais utiliser un minimum de 30 mg / ml de méthylcellulose pour préparer le milieu de formation sphéroïde.
NOTE: Lorsque chauffé, 30 mg / mL méthylcellulose devrait produire un gel épais qui maintient les cellules en suspension. - Incuber les cellules pendant plusieurs jours à plusieurs semaines etpecter régulièrement au grossissement 10X en utilisant un microscope. Les cellules qui résistent anoïkose doivent proliférer et former des colonies.
- Quantifier anoikis en mesurant le nombre et la taille des colonies formées dans chaque puits.
Remarque: Une fois que les colonies sont formées, elles peuvent être lavées pour éliminer la méthylcellulose et utilisés pour des essais à base sphéroïde, comme décrit.
- Suivez les instructions pour la production sphéroïde dans la section 1.4, mais utiliser un minimum de 30 mg / ml de méthylcellulose pour préparer le milieu de formation sphéroïde.
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Representative Results
Nous décrivons une méthode souple et efficace pour générer des sphéroïdes discrets en utilisant des plaques de cellules répulsifs et des médias de formation sphéroïde complétées par MC. Dans les conditions appropriées de MC et le sérum, les cellules individuelles se déposent et adhèrent ensemble au centre du puits pour former des sphéroïdes avec adhérence minimale au fond du puits. En utilisant ce protocole, les sphéroïdes ont été générées à partir d' une variété de lignées cellulaires (figure 2B). Titration de MC et les concentrations sériques est nécessaire pour chaque lignée de cellules pour identifier les conditions optimales où une seule sphéroïde est formée qui est suffisamment robuste pour permettre une manipulation sans se fragmenter. De manière optimale, les sphéroïdes se situaient entre 200 et 500 um de diamètre, et se composaient de cellules adhérentes étroitement avec les débris cellulaires minimes. Spheroids survécurent manipulation douce sans dommage, leur permettant d'être collectées et utilisées dans une grande variété de tests.
(figure 3A), ce qui a entraîné des agrégats de cellules mortes. En présence de poussière ou toute autre contamination de la fibre, multiple ou amas de cellules de forme irrégulière qui ont été faiblement agrégées formées, et les sphéroïdes résultants facilement cassé à part lors de la manipulation. Formation Spheroid a également été affectée par des concentrations suboptimales de MC ou de sérum dans le milieu de la formation sphéroïde (figure 3B). Dans nos tests, un grand nombre de lignées cellulaires ont été capables d'adhérer aux plaques de cellules résistantes à l'absence ou à faible concentration, de MC, et ont donné lieu à la formation d'un sphéroïde entouré par une monocouche cellulaire (figure 3B-ii). BxPC-3 la croissance cellulaire dans des conditions sous-optimales MC est représenté à titre d'exemple. D'une manière générale, des concentrations plus élevées de cellules MC empêchées d'adhérer aux puits, mais une concentration trop élevée de MC réduit l'adhérence cellule-cellule, et les cellules empêchésse fixer au fond du puits, ce qui entraîne la formation d'agrégats en vrac et de nombreux sphéroïdes satellites (figure 3B-i). La concentration de sérum a également affecté la survie cellulaire, et de cellule à cellule, et l'adhérence cellulaire en plastique et devait être optimisé pour les différentes lignées cellulaires. Pour les lignées cellulaires telles que HCT-116 et PANC-1, une concentration sérique trop élevée conduit à une prolifération cellulaire excessive et la production de sphéroïdes surdimensionnés qui ont été facilement endommagées par la manutention, ou promu l'adhésion cellulaire au plastique puits et la formation d'une monocouche ( La figure 3B-iii). Fait intéressant, les effets du sérum insuffisant différaient entre les lignées cellulaires. la survie des cellules HCT-116 a été réduite et les sphéroïdes formés étaient petites, contenant une forte proportion de cellules mortes en bas de sérum. En revanche, les cellules Panc-1 sont viables en l'absence de sérum, mais sont devenues plus adhérentes, et forment de multiples agrégats ainsi qu'une monocouche cellulaire (figure 3B-iv, v).
Une modification du protocole décrit la formation sphéroïde, dans lequel les cellules individuelles sont mises en suspension dans une concentration plus élevée MC (30 mg / ml) peuvent être utilisés pour contrôler la résistance à l'anoïkis. A ces concentrations MC, le milieu peut encore être transféré par pipette tout frais, mais épaissi en un gel solide à 37 ° C. Les cellules résistantes anoikis remises en suspension dans ce milieu sont restés en suspension et prolifèrent au cours d' une période de 2-4 semaines, en formant des sphéroïdes en suspension de différentes tailles (figure 6B). des cellules dépendantes de l'ancrage ne forment pas des sphéroïdes dans ces conditions. Nous avons été en mesure de quantifier anoikis résistance en comptant le engourdieer de sphéroïdes formé dans chaque puits.
Figure 1: Vue d' ensemble du protocole de formation 3D Spheroid. Les cellules cultivées en culture monocouche sont dissociées, comptées culottées et remises en suspension dans un milieu de formation sphéroïde additionné de méthylcellulose (MC) et le sérum (i-iv). La suspension est ensemencé dans une plaque de cellule repoussant à fond en U à la densité souhaitée pour permettre la formation de sphéroïdes de la taille souhaitée (v), et la plaque est incubée pour produire un seul sphéroïde cellulaire discret dans chaque puits (vi). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Optimisé Spheroid Formation Conditions.(A) la formation de sphéroïde dans des conditions optimales pour les cellules SH-SY5Y. 1.000 cellules ensemencées dans des plaques de cellules repoussant à fond en U dans un milieu supplémenté avec 5% de sérum et 1 mg / ml MC agglomérées dans sphéroïdes compactes dans les 24 h. (B) images représentatifs de sphéroïdes formés par diverses lignées cellulaires dans des conditions optimales indiquées dans le tableau 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Formation Spheroid Sous conditions sous - optimales. (A) Les sphéroïdes formés en présence de contaminants. la contamination microbienne a donné lieu à la mort cellulaire et sphéroïdes lâchement agrégées. En présence de contaminants insolubles, tels que la poussière ou des fibres, les cellules adhèrent à ces matières n'AGGREGa mangé. (B) la formation de Spheroid dans suboptimale support de formation d'sphéroïde. BxPC-3 cellules mises en culture en présence d'un excès MC (10 mg / mL) formées nombreux sphéroïdes par satellite (i), tandis que l'insuffisance MC (0 mg / ml) ont donné lieu à des agrégats de cellules qui adhéraient au fond du puits et ont formé une monocouche (ii ). Des résultats similaires ont été observés pour d'autres lignées cellulaires testées (non représentées). l'excès de sérum (20%) a entraîné une augmentation HCT-116 prolifération cellulaire et la formation monocouche (iii). sérum insuffisant (0%) avaient des effets spécifiques aux lignes cellulaires allant de la mort cellulaire dans HCT-116 (iv) la formation de sphéroïdes par satellite dans PANC-1 (v). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Invasion Assay utilisant Spheroids. (A) Overview de dosage d'invasion sphéroïde. Le récipient de formation d'image est pré-revêtu d'une couche de collagène neutralisée et on fait incuber à polymériser le collagène (i-ii). sphéroïdes préformés sont recueillis dans des tubes de 1,5 mL et remises en suspension dans le collagène neutralisé (iii-vi). Le mélange sphéroïde-collagène est superposée sur la couche de base de collagène et incubé à polymériser le collagène (vii-viii). Le milieu de croissance contenant les composés désirés sont ensuite superposée sur la couche de collagène sphéroïde-polymérisé et mis en incubation pour permettre l'invasion de cellules (ix-x). (B) En présence d'un facteur chimiotactique, les cellules sont présentées dans l' invasion de la matrice de collagène à partir d' un périphérique incorporé PANC-1 sphéroïde aux points temporels indiqués. Chaque panneau montre une image de contraste de phase acquise en utilisant un objectif 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: immunofluorescence de Spheroids collagène embarqués. (A) Vue d' ensemble du protocole pour immunofluorescence de sphéroïdes. sphéroïdes incorporés sont lavées, fixées (FBN), et bloqué (BSA) directement dans la cuve d'imagerie. Sphéroïdes peuvent être colorées directement ou excisées et colorées dans un volume plus petit, comme un tube de 1,5 ml. Spheroids doivent être lavés avec un tampon en excès après chaque tache pour minimiser la fluorescence de fond. sphéroïdes Stained peuvent être visualisés directement dans le récipient ou montés sous une lamelle pour l'imagerie et le stockage. Les images (B) , d'immunofluorescence d'un sphéroïde cellulaire TPC-1 incorporé dans le collagène et on le laisse envahir pendant 24 h. (C) Les images montrant les cellules phalloïdine colorées typiques des régions indiquées dans B. Chaque panneau montre un Z-projection 20 um (0,2 um étapes) a acquis en utilisant un objectif 60X: Les cellules dans le sphéroïde borps environ 20 um de la surface (1), faisant saillie dans les cellules de collagène (2), et des cellules qui envahissent par le collagène (3). Barres d'échelle = 25 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Formation Spheroid anoikis Assay. (A) Vue d' ensemble du protocole pour anoikis dosage. Les cellules sont préparées comme décrit à la figure 1, mais sont remises en suspension dans un milieu de formation de sphéroïdes contenant un minimum de 30 mg / ml MC qui forme une couche épaisse pour contenir les cellules individuelles en suspension et empêcher l'agrégation des cellules (i-ii). La suspension cellulaire est ensemencée dans des plaques de cellules repoussant à fond en U et on fait incuber (iii-iv). Les cellules en suspension peuvent être surveillés pour la formation sphéroïde par la prolifération, ce qui indique la résistance à la anoikis. (
| Ligne cellulaire | MC (mg / ml) | Sérum (%) | incubation approximative temps |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 heures |
| BxPC-3 | 5 | 5 | 3 à 5 jours |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5 à 7 jours |
| HCT-116 | 3 | dix | 2 à 4 jours |
| TT | 1 | dix | 7 à 10 jours |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1 à 2 jours |
Tableau 1: Optimal Formation Spheroid Composition moyenne et incubation Times lignées cellulaires Validé.
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Discussion
Nous présentons un procédé rapide et flexible pour la production de cellules sphéroïdes 3D pour modéliser l'architecture des tissus in vivo en utilisant des réactifs peu coûteux et largement disponibles. Notre protocole exploite les propriétés non-cytotoxiques et favorisant l' adhésion de MC 8, 9 de médiation agrégation cellulaire et minimiser la formation de monocouche cellulaire. A la différence des matrices à base de protéines isolées à partir de sources animales, MC est inerte, ne contient pas de facteurs de croissance, et il est facilement éliminé par lavage, ce qui permet l'isolement des sphéroïdes destinés à être utilisés dans une variété d'applications, sans la présence de la matrice résiduelle. Notre protocole utilise l'agrégation rapide du nombre de cellules compatibles pour générer sphéroïdes de taille homogène, ce qui permet des comparaisons directes de sphéroïdes cultivées dans diverses conditions expérimentales. Ce procédé peut être adapté à des cultures mixtes pour modéliser la croissance tumorale in vivo en combinant un nombre fixe de multiples types cellulaires associés à des tumeurs (par exemple , des fibroblastes, des leucocytes, des cellules stromales) pour représenter plus précisément l'environnement tumoral.
Des modifications de nos cellules de protocole en utilisant ensemencés dans des concentrations élevées de MC peuvent être faites pour surveiller la croissance indépendante de l'ancrage des cellules capables de proliférer en suspension et peuvent être utilisés comme un dosage anoïkis (section 6) pour identifier ou quantifier la transformation cellulaire. Spheroids générés par notre protocole sont idéales pour des applications telles que le criblage de médicaments, ce qui permet la comparaison de la croissance cellulaire, le métabolisme, la survie et l'invasivité entre les conditions de traitement. Sphéroïdes isolées peuvent également être incorporés dans une matrice extracellulaire, telle que le collagène, pour évaluer et quantifier l' invasivité de cellules dans un microenvironnement 3D (section 2.2, figure 4) qui modélise avec plus de précision dans la croissance tumorale in vivo. En outre, notre protocole peut être utilisé pour isoler de grandes quantités de sphéroïdes de la matrice MC pour une protéine ou préparation d'ARN, ce qui permet uSERS pour évaluer signal de cellule ou l'expression des gènes en réponse à des changements de traitement ou de conditions de croissance.
Notre protocole de formation de sphéroïde nécessite une optimisation des concentrations sériques et de MC, et le nombre de cellules ensemencées pour chaque lignée cellulaire. Caractéristiques de lignées de cellules spécifiques, telles que la viabilité cellulaire, cellule-cellule et cellule-adhésivité plastique, peuvent affecter de façon significative la facilité avec laquelle les sphéroïdes sont formés. D'une manière générale, les lignées cellulaires à faible viabilité en culture monocouche nécessaires concentrations sériques plus élevées pour favoriser la formation de sphéroïde, tandis que des concentrations plus élevées de MC ont été préférées pour les lignées cellulaires hautement adhésives. Nous recommandons donc que les titrages de sérum et MC être effectués pour déterminer les conditions optimales pour la survie des cellules (concentration sérique), tout en minimisant monocouche et formation sphéroïde par satellite (concentration MC). Ces conditions devraient conduire à la génération d'un seul sphéroïde discret par puits sans satellites. Taille du sphéroïde optimale pourl'analyse dépend de l'application et est affectée par le nombre de cellules mises en culture et de la concentration sérique (étape 1.4.7). Ensemencement moins de cellules produit plus petits agrégats qui sont plus facilement colorées de manière homogène, mais peut ne pas reproduire dans la cellule-cellule in vivo et les interactions cellulaires-microenvironnement. L' augmentation du nombre de cellules ensemencées génère de plus grandes sphéroïdes, qui peut contenir un noyau hypoxique physiologiquement représentant 10 qui peut affecter le comportement des cellules et de modifier l' interprétation des tests de croissance ou de survie. Cependant, quand trop grand, sphéroïdes peuvent être fragiles et se brisent facilement en dehors ou endommagés lors de l'isolement. Grandes sphéroïdes sont également beaucoup plus difficile à visualiser sans plates - formes d'imagerie spécialisées pour le sectionnement optique (par exemple nappe de lumière de microscope fluorescent) ou en intégrant ou cryosectioning et la coloration des coupes transversales à travers le sphéroïde 11. Nous recommandons une taille cible de sphéroïde de 200-500 um pour la flexibilité etla facilité de manipulation pour la plupart des applications. Dans l'ensemble, il est essentiel d'optimiser les conditions pour la formation de sphéroïdes d'une manière à la fois la lignée cellulaire spécifique et spécifique à l'application.
protocoles de production Spheroid nécessitent une attention particulière pour éviter la contamination des sphéroïdes par la poussière et d'autres particules. Les cellules adhèrent à la poussière et d' autres contaminants insolubles, ce qui entraîne de forme irrégulière, de façon lâche cellules adhérentes agrégats impropres à une utilisation dans les analyses (figure 3A). Les sources de contamination peuvent être réduites au minimum en faisant passer toutes les solutions à travers un filtre de 0,45 um, le rinçage de la monocouche cellulaire avec du milieu filtré avant la dissociation (étape 1.4.1), et un rinçage des réservoirs de pipette multicanaux avec de l'eau ultrapure filtrée immédiatement avant utilisation (Étape 1.4.6.1). En outre, les pipettes sérologiques coton-filtré, ce qui peut répandre des fibres dans les solutions, devraient être évités. Bien que non critique, la poussière peut être encore réduite en passant dissociatcellules ed à travers un tamis cellulaire de 100 um avant l'ensemencement (étape 1.4.6). La perte par évaporation du milieu est une considération technique supplémentaire, en particulier pour des temps d'incubation de plus de 1 semaine telles que celles requises par certaines lignées cellulaires pour la formation sphéroïde (tableau 1) ou lors des essais de anoikis (article 6). L'évaporation peut être réduite au minimum par ensemencement des cellules dans des puits dans la région centrale de plaques à puits multiples, les puits de remplissage du périmètre avec de l'eau ultra-pure, et sceller de manière lâche les bords de la plaque ou enfermant la plaque dans une chambre humidifiée.
sphéroïdes de cellules 3D est un modèle utile pour l'étude du comportement à la fois des cellules normales et tumorales et la physiologie. Notre protocole est une méthode rapide et économique pour la production de sphéroïdes de cellules 3D de taille uniforme qui peuvent être utilisés dans une variété de dosages et d'applications. Ces sphéroïdes représentent des outils précieux pour la caractérisation des interactions de croissance de la tumeur et microenvironnement ainsi que des modèles pour prévaluation eClinique des nouvelles thérapies.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
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- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
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