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Biology

3 डी उपगोल उत्पादन के लिए एक कुशल और लचीला सेल एकत्रीकरण विधि

Published: March 27, 2017 doi: 10.3791/55544
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's University Cancer Research Institute, 2Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University
* These authors contributed equally

Abstract

Monolayer सेल संस्कृति पर्याप्त रूप से ऊतकों के vivo व्यवहार है, जो जटिल सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत शामिल है मॉडल नहीं है। तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति तकनीक हाल ही में एक पक्षपाती सेल संस्कृति की कमियों को संबोधित करने के लिए विकसित नवीनता है। इन विट्रो में ऊतक analogues पैदा करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, इन तरीकों में, अक्सर जटिल है, स्थापित करने के लिए महंगे हैं विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और आम तौर पर केवल कुछ प्रकार की कोशिकाओं के साथ संगतता के द्वारा सीमित हैं। यहाँ, हम लगातार आकार है कि ट्यूमर और सामान्य कोशिका लाइनों की एक किस्म के विकास के साथ संगत है की बहुकोशिकीय 3 डी spheroids में कोशिकाओं कुल के लिए एक तेजी से और लचीला प्रोटोकॉल का वर्णन। हम लंगर स्वतंत्र अंडाकार आकृति पीढ़ी को बढ़ावा देने और एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से सेल monolayers के गठन को रोकने के लिए सीरम और मिथाइल सेलुलोज (एमसी) के अलग सांद्रता का उपयोग। व्यक्ति के लिए इष्टतम स्थितियोंidual सेल लाइनों अंडाकार आकृति गठन के माध्यम में एम सी या सीरम सांद्रता का समायोजन करके प्राप्त किया जा सकता है। 3 डी उत्पन्न spheroids आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला, सेल संकेतन या जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन, उम्मीदवार दवा स्क्रीनिंग, या इस तरह के ट्यूमर सेल आक्रमण और पलायन के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन में शामिल है, में उपयोग के लिए एकत्र किया जा सकता है। प्रोटोकॉल भी आसानी से एकल कक्षों से प्रतिरूप spheroids उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित है, और लंगर स्वतंत्र विकास और anoikis-प्रतिरोध का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल पैदा करने और आदेश के ऊतकों के 3 डी microenvironment पुनरावृत्ति और सामान्य और ट्यूमर कोशिकाओं के vivo विकास मॉडल के लिए 3 डी सेल spheroids के उपयोग के लिए एक आसानी से परिवर्तनीय तरीका प्रदान करता है।

Introduction

ट्यूमर सेल व्यवहार के जैविक रूप से प्रासंगिक आकलन परंपरागत दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति तरीकों का उपयोग कर, भाग में, क्योंकि इन पर्याप्त रूप से सेल microenvironment विवो में पाया प्रतिबिंबित नहीं करते चुनौती दे रहा है। संस्कृति (जैसे, Boyden कक्ष assays) में बाह्य मैट्रिक्स घटकों को शामिल करने के लिए वैकल्पिक तरीकों में विवो ऊतक पर्यावरण के अधिक physiologically प्रतिनिधि हैं। हालांकि, वे अलग-अलग सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए सीमित किया जा सकता है, और सेल मैट्रिक्स और सेल सेल बातचीत है कि ऊतक या ट्यूमर के विकास को 1, 2, 3 में योगदान के विवो संयोजन में जटिल पुनरावृत्ति नहीं है।

बहुकोशिकीय spheroids के उपयोग, हाल ही में एक दृष्टिकोण है कि अधिक सही विवो सेल के विकास 1 की कॉम्पैक्ट वास्तुकला reproduces है4। Spheroids सामान्य कोशिकाओं की कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी इस तरह के मेटास्टेटिक विकास या दवा प्रतिरोध 4 के रूप में ट्यूमर प्रगति की विशेषताओं, मॉडल करने के लिए ट्यूमर analogues के रूप में कार्य कर सकते हैं।

Spheroids एक मैट्रिक्स 5, या अधिक तेजी में एम्बेडेड एकल कोशिकाओं के प्रसार द्वारा गठित किया जा सकता है, कई कोशिकाओं के एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के द्वारा एक एकल कोशिका क्लस्टर (जैसे, फांसी ड्रॉप, centrifugation तरीकों) 6, 7 के रूप में। मौजूदा सेल एकत्रीकरण तकनीक महंगा सामग्री या विशेष उपकरण की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, इन spheroids आकार और morphologies की एक विस्तृत श्रृंखला है और बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए, विकास की स्थिति या मुश्किल उपचार के बीच तुलना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। अंत में, इन तरीकों द्वारा उत्पन्न spheroids प्रोटीन extracel से अलग करने के लिए मुश्किल हो सकता हैlular मैट्रिक्स जिसमें वे अन्य अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए एम्बेडेड रहे हैं।

यहाँ, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यू-नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेट और एक निष्क्रिय आसंजन को बढ़ावा देने के मैट्रिक्स, मिथाइल सेलुलोज का उपयोग करते हुए लगातार आकार सेल spheroids का तेजी से गठन के लिए एक मजबूत और आसानी से परिवर्तनीय सेल एकत्रीकरण कार्यप्रणाली का वर्णन है। एक बार का गठन, इन बहुकोशिकीय spheroids आसानी से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग के लिए अलग कर रहे हैं। प्रोटोकॉल भी आसानी से सेल प्रसार, जो अन्य सेल प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के माध्यम से spheroids उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित है। यहाँ, हम सेल आक्रमण assays, immunofluorescence धुंधला द्वारा मात्रा, और एक anoikis परख, ये दो अलग अलग अंडाकार आकृति गठन प्रोटोकॉल का उदाहरण अनुप्रयोगों के रूप में दिखा।

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Protocol

नोट: सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्री सूची में सूचीबद्ध हैं।

1. सेल एकत्रीकरण द्वारा उपगोल उत्पादन

  1. मिथाइल सेलुलोज समाधान: 100 मिलीग्राम / एमएल मिथाइल सेलुलोज के 100 एमएल तैयार करें।
    1. हीट 50 एमएल ultrapure एच 2 ओ को 80 डिग्री सेल्सियस। 10 ग्राम मिथाइल सेलुलोज पाउडर डालें और आंदोलन जब तक कणों समान रूप से बिखरे हैं।
    2. ठंड ultrapure एच 2 ओ के साथ अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर हलचल जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है, भूसे रंग का, और कोई दिखाई ठोस होता है।
    3. एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं undissolved ठोस दूर करने के लिए। तैयार समाधान aliquoted और अप करने के लिए 12 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      नोट: मिथाइल सेलुलोज एक गैर साइटोटोक्सिक, निष्क्रिय, निलंबित एजेंट सेल सेल आसंजन बढ़ाने के लिए और एक पक्षपाती सेल monolayer के गठन को हतोत्साहित करने के रूप में कार्य करता है। मिथाइल सेलुलोज पानी में घुलनशील है और निम्नलिखित spher दूर धोया जा सकता हैOID पीढ़ी।
  2. उपगोल गठन मध्यम
    नोट: उपयोग करने से पहले तुरंत अंडाकार आकृति गठन के माध्यम से तैयार करें। दुकान मत करो।
    1. उचित संस्कृति के माध्यम में 1-5 मिग्रा / एमएल के लिए मिथाइल सेलुलोज समाधान पतला।
    2. बाँझ और undissolved ठोस दूर करने के लिए एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं।
  3. Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
    1. 1x और उपयोग करने से पहले एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए पतला। तैयार समाधान कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  4. सेल अंडाकार आकृति उत्पादन (चित्रा 1)
    नोट: अग्रिम में सभी अभिकर्मकों तैयार करें। यह धूल, फाइबर या अन्य अघुलनशील कणों द्वारा समाधान के संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इन प्रदूषणों से उपस्थिति पर प्रतिकूल अंडाकार आकृति के गठन को प्रभावित करेगा। संस्कृति के माध्यम से और अन्य समाधान एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से जब पीओएस इन कणों को दूर करने के लिए पारित किया जाना चाहिएअसंभव। जब समाधान के हस्तांतरण के रूप में इन अतिरिक्त फाइबर लागू कर सकते हैं कपास फ़िल्टर pipettes के प्रयोग से बचें।
    1. उचित संस्कृति में 70% संगम संस्कृति सेल monolayers मध्यम 10% सीरम के साथ पूरक। महाप्राण संस्कृति के माध्यम से और 1x पीबीएस के साथ कुल्ला मलबे को हटाने के लिए। Trypsin EDTA (0.05% trypsin) एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश के लिए हदबंदी बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. सेना की टुकड़ी पुष्टि करने के लिए 10X बढ़ाई खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण किया। सीरम पूरक संस्कृति के माध्यम से 7 एमएल के साथ हदबंदी बफर बेअसर।
    3. 10 मिनट के लिए धीरे गोली कोशिकाओं के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
    4. सतह पर तैरनेवाला निकालें। 1 एमएल अंडाकार आकृति गठन के मध्यम में Resuspend सेल गोली एक फिल्टर टिप के साथ एक P1000 पिपेट का उपयोग।
      ध्यान दें: सेल निलंबन झुरमुटों से मुक्त होना चाहिए।
      1. सेल गोली triturate करने के लिए, एक मामूली कोण जबकि पर ट्यूब के नीचे के खिलाफ विंदुक टिप प्रेसpipetting सेल गोली वंचित करने के लिए। अधिक से अधिक 3 triturating से बचें - 5 बार के रूप में इस कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं। पिपेट धीरे धीरे और विंदुक टिप की संपूर्ण सामग्री बुलबुले बनाने से बचने के लिए निष्कासित नहीं है।
    5. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन पतला।
      ध्यान दें: सेल नंबर अलग आकार के spheroids उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। Trypan क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के नीले धुंधला resuspended कोशिकाओं की व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    6. एक बाँझ, धूल से मुक्त मल्टीचैनल पिपेट जलाशय सेल निलंबन स्थानांतरण और एक 96 अच्छी तरह से यू-नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μL बांटना फिल्टर सुझावों का उपयोग करें।
      1. साथ छान ultrapure एच 2 ओ कुल्ला जलाशय धूल और फाइबर हटा दें।
      2. सेल निलंबन समय समय पर, जबकि जलाशय के तल पर बसने से कोशिकाओं को रोकने के लिए बोने मिक्स। बुलबुले बनाने से बचने के लिए, एक रिवर्स pipetting तकनीक का उपयोग करते हुए मिश्रण और dispensinजी।
    7. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) और अंडाकार आकृति गठन के लिए दैनिक निरीक्षण किया। प्रकोष्ठों में अच्छी तरह से 6 घंटे के भीतर प्रत्येक के नीचे करने के लिए समझौता करना चाहिए और 24-48 घंटे (चित्रा 2) के भीतर एक अंडाकार आकृति में आम तौर पर दिखाते हैं।
    8. सफल अंडाकार आकृति के गठन की पुष्टि के लिए, एक P10 टिप का उपयोग करें और धीरे से अंडाकार आकृति के ऊपर पिपेट मध्यम जबकि 10X बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे देख। ठीक से बनता spheroids प्लेट और रोल से ढीला, उनके 3 डी संरचना की पुष्टि करेगा।
      नोट: मिथाइल सेलुलोज और सीरम सांद्रता अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए प्रत्येक कोशिका पंक्ति में एकल अंडाकार आकृति के गठन उपज के लिए अच्छी तरह से प्रति। चयनित कक्ष लाइनों के लिए इस तरह से अनुकूलित शर्तों तालिका 1 में दिखाया जाता है, और spheroids के उदाहरण चित्रा 2 बी में गठन किया। Spheroids अधिक समय के लिए विकसित किया जा सकता है संकेत से लेकिन जैसा कि वे बड़े हो जाते हैं वे उत्तरोत्तर अधिक कठिन हो जानाविखंडन के बिना संभालने के लिए। कोशिकाओं एक monolayer, उपग्रह spheroids फार्म, या अच्छी तरह से नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने में विफल रहते हैं, मिथाइल सेलुलोज और सीरम की एकाग्रता आगे इष्टतम अंडाकार आकृति गठन (चित्रा 3 बी) के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस तरह के फाइबर या धूल (चित्रा 3) के रूप में contaminants युक्त spheroids का प्रयोग न करें। पूर्व गठित spheroids इस तरह वृद्धि कारक है, जीवित कोशिका दाग, या विश्लेषण के लिए अवरोधकों के रूप में ब्याज की यौगिकों के साथ इलाज किया जा सकता है।

2. उपगोल आक्रमण परख (चित्रा 4)

  1. निष्प्रभावी कोलेजन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस तक सभी तरल पदार्थ कूल और बर्फ पर पकड़ जब कोलेजन के साथ काम अवांछित polymerization रोकने के लिए।
    2. 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से ultrapure एच 2 ओ दर्रा सभी समाधान में NaOH और ताजा 0.1 एम एचसीएल के ताजा 0.1 एम और 0.01 एम समाधान तैयार करें।
    3. गोजातीय प्रकार मिक्स 1 कोलेजन (3.1 मिलीग्राम / एमएल शेयर), 0.01 एम NaOH और 10x पीबीएस (8: 1: मात्रा से 1 के अनुपात) और 7.4 पीएच ठंड 0.1 एम NaOH और एचसीएल का उपयोग करने के लिए समायोजित करें। कोलेजन के अंतिम एकाग्रता 2.5 मिलीग्राम एमएल है /।
    4. 2-3 मिमी की गहराई तक इमेजिंग पोत भरने के लिए पर्याप्त निष्प्रभावी कोलेजन तैयार करें। 100 μL की एक न्यूनतम 8 अच्छी तरह से टिशू कल्चर चैम्बर माल की सूची में सूचीबद्ध स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए आवश्यक है।
  2. कोलेजन में spheroids एम्बेडिंग (चित्रा 4)
    1. कोट 50 निष्प्रभावी कोलेजन μL की एक न्यूनतम के साथ एक 8 अच्छी तरह से टिशू कल्चर चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे।
      1. रिवर्स pipetting तकनीक का प्रयोग करें कोलेजन में बुलबुले बनाने से बचने के लिए। अच्छी तरह से सतह पर समान रूप से कोलेजन प्रसार करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें।
        नोट: यह कोलेजन आधार परत निलंबन में spheroids पकड़ और आम तौर पर 1-2 मिमी मोटी है जाएगा। आधार परत ऊपरी परत कोलेजन पर एक meniscus के गठन को कम करता है। यदि आधार परत भी पतली है, spheroids चैम्बर स्लाइड के नीचे के साथ संपर्क कर सकते हैं औरएक सेल monolayer के रूप में।
    2. चैम्बर स्लाइड, और एक 35 मिमी टिशू कल्चर ultrapure एच 2 ओ से भरा पकवान, एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोलेजन polymerized है, आम तौर पर 1 घंटे। स्टोर बर्फ पर कोलेजन निष्प्रभावी शेष।
      नोट: पानी से भरे 35 मिमी पकवान नमी प्रदान और सुखाने पाएगा। चैम्बर स्लाइड परख भर में इस नमी कक्ष में रहना चाहिए। कोलेजन आधार परत रात भर भाजन करने के लिए छोड़ा जा सकता है। अब incubations आम तौर पर एक और अधिक कठोर जेल में परिणाम।
    3. एक p1,000 फिल्टर टिप का उपयोग करना, 96 अच्छी तरह से यू-नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेट 1.5 एमएल में शीर्ष नलियों तस्वीर से पूर्व गठित spheroids (कदम 1.4.7) इकट्ठा। पिपेट धीरे-धीरे और दोहराया से बचने या जोरदार pipetting spheroids के तरल पदार्थ से बाल काटना कम से कम। एकाधिक spheroids 8 अच्छी तरह से टिशू कल्चर चैम्बर स्लाइड में से एक अच्छी तरह से करने के हस्तांतरण के लिए एक एकल ट्यूब में जमा किया जा सकता है।
    4. एक tabl में एकत्र spheroids अपकेंद्रित्र2-5 एस के लिए 2,000 XG और कम से ETOP microcentrifuge एक P200 पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें। आवश्यकता से अधिक समय के लिए centrifugation से बचें, इस spheroids अलग तोड़ने या एक साथ पेड़ों का झुरमुट के लिए पैदा कर सकता है।
      नोट: सतह पर तैरनेवाला के सबसे बंद pipetting के बाद, ट्यूब ध्यान से एक साफ कागज तौलिया अतिरिक्त तरल दूर बाती खत्म करने के लिए उलटा किया जा सकता है। spheroids सुखाने के लिए अनुमति न दें।
    5. एक विस्तृत बोर P200 टिप का उपयोग करना, धीरे 50 निष्प्रभावी कोलेजन μL में spheroids resuspend। एकत्र spheroids के प्रत्येक ट्यूब के लिए यह करो इससे पहले कि किसी भी spheroids चैम्बर स्लाइड में स्थानांतरित कर रहे हैं। spheroids कि चैम्बर स्लाइड के हस्तांतरण के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर निष्प्रभावी कोलेजन में resuspended दिया है रखें।
    6. इनक्यूबेटर से चैम्बर स्लाइड निकालें और ध्यान कोलेजन आधार परत के शीर्ष पर अंडाकार आकृति-कोलेजन मिश्रण पिपेट। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2 तक कोलेजन polymerized है।
      1. बुलबुले बनाने से बचने के लिए पिपेट की संपूर्ण सामग्री बांटना नहीं है। Dropwआईएसई pipetting कोलेजन आधार परत को परेशान करने की संभावना को कम कर देता है।
    7. धीरे-धीरे एक न्यूनतम 100 की μL गर्म चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह करने के लिए वांछित chemoattractants, अवरोधकों, या अन्य उपचार युक्त संस्कृति के माध्यम जोड़ें। यदि तरल इसे पर भी सख्ती pipetted है कोलेजन परत युक्त spheroids आंसू सकता है। संस्कृति के माध्यम से धीरे-धीरे कोलेजन को परेशान करने से बचने के लिए एक अच्छी तरह से नीचे की ओर तिरस्कृत किया जा सकता है।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 चैम्बर स्लाइड सेते सेल आक्रमण की अनुमति है। आसपास के कोलेजन में सेल आक्रमण brightfield या प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा मनाया और epifluorescence, confocal या प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का उपयोग तरीकों की एक किस्म के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

3. आक्रमण की मात्रा: brightfield माइक्रोस्कोपी

  1. निर्धारित समय के अंतराल पर, छवि एक brightfield माइक्रोस्कोप (कदम 2.2.8) का उपयोग 10X बढ़ाई कोलेजन एम्बेडेड spheroids।
    नोट:लंबी अवधि के रहते सेल प्रयोगों, एक गर्म खुर्दबीन मंच और सीओ 2 विनियमित चैम्बर 37 डिग्री सेल्सियस पर spheroids और 5% सीओ 2 जबकि इमेजिंग बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. ImageJ जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आसपास के कोलेजन और औसत दूरी हर समय बिंदु पर आक्रमण में हमलावर कोशिकाओं की संख्या को मापने के लिए invasiveness यों।

4. आक्रमण की मात्रा: लाइव सेल दाग के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. कदम 2.2.8 के बाद, इस तरह के DAPI, Calcein AM, या अन्य सेल ट्रैकिंग यौगिक निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल लाइन के लिए उचित रूप में एक फ्लोरोसेंट दाग के साथ चैम्बर स्लाइड्स में मध्यम पूरक।
    नोट: invasiveness की मात्रा का ठहराव के लिए, अंडाकार आकृति भर सजातीय धुंधला आवश्यक नहीं है। दाग की गहरी पैठ, अब incubations आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए (> 3 ज) आवश्यक हो सकता है।
  2. दाग निकालें और 500 μL गर्म 1x पीबीएस के साथ बदलें। में10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर cubate अतिरिक्त दाग हटाने के लिए। दो बार की एक न्यूनतम दोहराएँ।
  3. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, हमलावर spheroids के माध्यम से ऑप्टिकल वर्गों के अधिग्रहण।
    नोट: लेजर प्रकाश के लिए दीर्घ phototoxicity और photobleaching को सीमित करने का दोहराव इमेजिंग के दौरान कम से कम किया जाना चाहिए।
  4. एक जेड-प्रक्षेपण, जो अंडाकार आकृति का कुल क्षेत्रफल यों इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पन्न करने के लिए ImageJ जैसे सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, हमलावर कोशिकाओं, और दूरी की संख्या कोलेजन मैट्रिक्स में आक्रमण किया।
  5. एक उदाहरण के रूप में, आक्रमण यों तो, पृष्ठभूमि बाहर करते हैं, केवल अंडाकार आकृति और कोशिकाओं पर हमला करने पर प्रकाश डाला, और अपने क्षेत्र को मापने के लिए छवि सीमा समायोजित करें। मूल अंडाकार आकृति के क्षेत्र invasiveness यों तो इस कुल में से घटाया जा सकता है।

5. आक्रमण की मात्रा: इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: सभी समाधान और buffers एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाना चाहिए इससे पहले कि रेमो के लिए उपयोगमलबे, जो नकारात्मक धुंधला प्रभावित कर सकते हैं ve।

  1. पीबीएस + धो बफर तैयार करें। 1x पीबीएस को तैयार है और 0.1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2 CaCl और 2 MgCl जोड़ें। बफर आटोक्लेव के बाद 2 CaCl और 2 MgCl जोड़ रहे हैं मत करो। समाधान फिल्टर निष्फल और कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. तटस्थ बफर formalin (NBF) निर्धारण बफर तैयार करें। 1 एम NaOH के 5 बूँदें 0.6 ग्राम paraformaldehyde में जोड़े। साथ पीबीएस + 20 एमएल के लिए ले आओ और 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक paraformaldehyde (लगभग 1 घंटे) भंग कर रहा है। कमरे के तापमान को शांत और 1 एम एचसीएल के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें।
    ध्यान दें: NBF निर्धारण बफर तुरंत उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए।
  3. गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) अवरुद्ध बफर तैयार करें। 3% w / वी पर पीबीएस + में बीएसए भंग। समाधान फ़िल्टर निष्फल किया जा सकता है और कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत लेकिन सबसे अच्छा नए सिरे से तैयार किया जाता है। गर्मी नहीं है।
  4. Permeabilization बफर तैयार करें। पतला ट्राइटन X-1000.2% पीबीएस + में वी / वी करने के लिए।
    नोट: Permeabilization बफर उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए।
  5. वैकल्पिक रूप से, Mowiol बढ़ते मध्यम तैयार करते हैं। गठबंधन 2.4 जी Mowiol, 6 ग्राम ग्लिसरॉल, और 6 एमएल ultrapure एच कमरे के तापमान पर एक रोटेटर में 3 घंटे के लिए 2 ओ मिक्स। 12 एमएल 0.2 एम Tris-सीएल (8.5 पीएच) जोड़ें। 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण के साथ सेते हैं।
    1. 15 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र अघुलनशील सामग्री गोली। विरोधी विरंजन एजेंट, इस तरह के रूप में 2.5% DABCO जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 μL aliquots में स्टोर।
  6. Spheroids के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (चित्रा 5)
    नोट: धीरे-धीरे चैम्बर स्लाइड से जोड़ सकते हैं या तरल पदार्थ को हटाने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें। , एक Aspirator के प्रयोग से बचें के रूप में इस कोलेजन परत को बाधित कर सकता है।
    1. spheroids को तैयार है और 2 से 1 वर्गों में वर्णित के रूप में कोलेजन से भरे कक्ष स्लाइड में एम्बेड।
      नोट: कोलेजन autofluorescence पतली परत या सी की छोटी मात्रा का उपयोग करके कम किया जा सकताollagen।
    2. प्रत्येक कक्ष स्लाइड से जितना संभव हो उतना संस्कृति के माध्यम से निकालें।
    3. संक्षेप में 500 μL पीबीएस + धोने बफर के साथ कोलेजन परत कुल्ला अवशिष्ट मध्यम हटा दें।
    4. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 500 μL ताजा पीबीएस + धो बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते spheroids धोने के लिए। दो बार दोहराएँ।
    5. 500 μL NBF निर्धारण बफर के साथ पीबीएस + धो बफर बदलें। 25 मिनट - 20 के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. NBF निर्धारण बफर निकालें और 500 μL पीबीएस + धोने बफर के साथ कुल्ला। ताजा पीबीएस के साथ + 5 मिनट के लिए धोने धोने 3 बार की एक न्यूनतम बफर।
      नोट: फिक्स्ड spheroids कई दिनों के लिए ताजा पीबीएस + धोने बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। 0.01% सोडियम azide भंडारण के दौरान माइक्रोबियल विकास को बाधित करने के लिए धोने बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
    7. पीबीएस + 500 μL permeabilization बफर के साथ बफर धोने बदलें। 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    9. वैकल्पिक रूप से, बीएसए अवरुद्ध बफर हटा दें। छुरी या कैंची, आबकारी spheroids और कोलेजन परत से आसपास के 3 मिमी x 3 मिमी क्षेत्र का उपयोग करना। एक विस्तृत बोर P1000 टिप का उपयोग करना, ताजा बीएसए अवरुद्ध बफर के साथ धीरे rinsing द्वारा कोलेजन के excised ब्लॉक जगह देना। 1.5 एमएल ट्यूब कोलेजन ब्लॉक स्थानांतरण।
    10. 2 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। ट्यूब ध्यान से साफ कागज तौलिया पर उलटा किया जा सकता अतिरिक्त तरल दूर बाती।
  7. spheroids के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी की पर्याप्त मात्रा ऐसी है कि पूरे कोलेजन परत समान रूप से जलमग्न है जोड़ें। ऊपर वैकल्पिक कदम (5.6.8.1-5.6.8.2) आम तौर पर एंटीबॉडी के छोटे संस्करणों के उपयोग की अनुमति।
  8. कम से कम 10 एमएल पीबीएस + धोने buf के साथ एक कंटेनर में चैम्बर स्लाइड डूब10 मिनट के लिए फेर धोने के लिए। दो बार की एक न्यूनतम दोहराएँ।
    1. वैकल्पिक, अगर spheroids कोलेजन परत पहले (चरण 5.6.8.1) से excised थे, 1 एमएल पीबीएस + की एक न्यूनतम जोड़ने धोने 1.5 एमएल ट्यूब बफर और धीरे आंदोलन। 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए लेना करने की अनुमति दें।
    2. जितना संभव हो उतना पीबीएस + धोने बफर निकालें और पीबीएस + के साथ कपड़े धोने धो दोहराएँ दो बार की एक न्यूनतम बफर। कई मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र कोलेजन ब्लॉक गोली।
      नोट: धो बफर में डुबकी लगाने से पहले 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा चैम्बर स्लाइड की साफ बाहर सतहों।
  9. दोहराएँ कदम 5.6.9-5.6.10 उचित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर।
    नोट: यदि spheroids इमेजिंग के बर्तन में सीधे दाग थे, चरण 5.6.13 आगे बढ़ें।
  10. वैकल्पिक, spheroids पहले कोलेजन परत से excised रहे थे (चरण 5.6.8.1), स्वच्छ कांच स्लाइड और confocal माइक्रोस्कोपी-संगत 70% इथेनॉल के साथ coverslips।
    1. कोलेजन ब्लॉक और ultrapure एच 2 में resuspend से जितना संभव हो उतना धोने बफर निकालें ओ बढ़ते से पहले इस कदम के तुरंत प्रदर्शन करना। पानी में भिगोने से सना हुआ ब्लॉकों मत छोड़ो।
    2. ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, कोलेजन ब्लॉक और गिलास स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण के किनारे समझ।
    3. संदंश का प्रयोग जगह में कोलेजन धारण करने के लिए, कोलेजन ब्लॉक से अतिरिक्त तरल बाती को क्लीन कपास झाड़ू का उपयोग करें, यकीन है कि कोलेजन सीधे छूने के लिए नहीं कर रही है।
      नोट: कोलेजन कपास झाड़ू यह धीरे या तो संदंश का उपयोग कर हटाया जा सकता है के लिए अटक हो जाता है, या पानी में डूब गए हैं।
  11. रिवर्स pipetting तकनीक का उपयोग करना, मज्जा ब्लॉक और नमूना से अधिक जगह coverslip पर 100 μL Mowiol बढ़ते मध्यम बांटना।
    1. coverslip के नीचे से अतिरिक्त Mowiol बढ़ते मध्यम और पानी बाहर बाती एक कपास झाड़ू या कागज तौलिया का उपयोग करें।
    2. Mowiol बढ़ते मध्यम 4 डिग्री पर रात भर कड़ा करने की अनुमति देंसी सील नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों।
  12. छवि पर दाग confocal या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग spheroids ब्याज, आक्रामक संरचनाओं के गठन, आदि (आंकड़े 5 ब, 5C) के प्रोटीन का स्थानीयकरण निरीक्षण करने के लिए।
    नोट: सना spheroids photobleaching को रोकने के लिए प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।

6. Anoikis परख

नोट: अंडाकार आकृति गठन प्रोटोकॉल आसानी से सेल प्रकार की एक किस्म में लंगर स्वतंत्र विकास और anoikis प्रतिरोध यों के लिए अनुकूल है।

  1. Anoikis परख के लिए कोशिकाओं सीडिंग (चित्रा 6)
    1. धारा 1.4 में अंडाकार आकृति उत्पादन के लिए निर्देशों का पालन करें, लेकिन 30 मिलीग्राम / एमएल मिथाइल सेलुलोज की एक न्यूनतम का उपयोग अंडाकार आकृति गठन मध्यम तैयार करने के लिए।
      नोट: जब गरम, 30 मिलीग्राम / एमएल मिथाइल सेलुलोज एक मोटी जेल है कि निलंबन में कोशिकाओं का उत्पादन करना चाहिए रखती है।
    2. सप्ताह के लिए और में कई दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते10X एक माइक्रोस्कोप का उपयोग बढ़ाई नियमित रूप से spect। प्रकोष्ठों कि anoikis विरोध पैदा करना और कालोनियों के रूप में करना चाहिए।
    3. संख्या और अच्छी तरह से प्रत्येक में गठित कालोनियों के आकार को मापने के द्वारा anoikis यों।
      नोट: एक बार कालोनियों का गठन कर रहे हैं, वे मिथाइल सेलुलोज दूर करने के लिए धोया और के रूप में वर्णित है, अंडाकार आकृति आधारित assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

हम सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेटें और एम सी के साथ पूरक अंडाकार आकृति गठन मीडिया का उपयोग असतत spheroids उत्पन्न करने के लिए एक लचीला और कुशल विधि का वर्णन है। एम सी और सीरम का उचित शर्तों के तहत, व्यक्ति की कोशिकाओं पर बसा है और अच्छी तरह से नीचे करने के लिए कम से कम पालन के साथ spheroids फार्म के लिए अच्छी तरह से केंद्र में एक साथ पालन करें। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, spheroids सेल लाइनों की एक किस्म (चित्रा 2 बी) से उत्पन्न किया गया। एम सी और सीरम सांद्रता का अनुमापन इष्टतम स्थितियों जहां केवल एक ही अंडाकार आकृति है कि काफी मजबूत fragmenting बिना हेरफेर की अनुमति है का गठन किया है की पहचान करने के लिए प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए आवश्यक है। बेहतर, spheroids व्यास में 200 से 500 माइक्रोन के बीच थे, और कम से कम सेल मलबे के साथ कसकर पक्षपाती कोशिकाओं शामिल थे। Spheroids क्षति के बिना कोमल हैंडलिंग बच गया है, की अनुमति उन्हें एकत्र की है और परीक्षणों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जाएगा।

(चित्रा 3 ए), जो मृत कोशिकाओं का समुच्चय के परिणामस्वरूप से समझौता किया जा सकता है। जब संभाला धूल या अन्य फाइबर संदूषण, एकाधिक या अनियमित आकार के सेल समूहों है कि केवल कमजोर एकत्रित गठन किया गया, और उसके एवज में spheroids की उपस्थिति में आसानी से अलग तोड़ दिया। उपगोल गठन भी अंडाकार आकृति गठन मध्यम (चित्रा 3 बी) में एम सी के सबऑप्टिमल सांद्रता या सीरम से प्रभावित था। हमारे परीक्षण में, कई सेल लाइनों एम सी के अभाव में, या कम सांद्रता में सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेटों का पालन करने में सक्षम थे, और एक सेल monolayer (चित्रा 3 बी-द्वितीय) से घिरा हुआ एक अंडाकार आकृति के गठन में हुई। सबऑप्टिमल एम सी परिस्थितियों में BxPC-3 सेल के विकास के लिए एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। सामान्य में, एम सी के उच्च सांद्रता में अच्छी तरह का पालन करने से कोशिकाओं को रोका, लेकिन बहुत अधिक एम सी की एकाग्रता से सेल सेल आसंजन, और रोका कोशिकाओं को कमअच्छी तरह से नीचे करने के लिए व्यवस्थित, ढीले समुच्चय और कई उपग्रह spheroids (चित्रा 3 बी-आई) के गठन में जिसके परिणामस्वरूप। सीरम की एकाग्रता भी सेल अस्तित्व, और सेल सेल, और सेल-प्लास्टिक आसंजन प्रभावित है और अलग-अलग सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा करने की जरूरत है। ऐसे HCT-116 और Panc-1 के रूप में सेल लाइनों के लिए, भी एक उच्च सीरम एकाग्रता अत्यधिक सेल प्रसार और बड़े आकार के spheroids है कि आसानी से निपटने के द्वारा क्षतिग्रस्त हो गए थे, या अच्छी तरह से प्लास्टिक के लिए सेल आसंजन पदोन्नत के उत्पादन और एक monolayer का गठन (में हुई चित्रा 3 बी-iii)। दिलचस्प है, अपर्याप्त सीरम के प्रभाव सेल लाइनों के बीच मतभेद था। HCT-116 सेल अस्तित्व कम हो गया था और spheroids का गठन छोटे थे, कम सीरम में मृत कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा हैं। इसके विपरीत, Panc-1 कोशिकाओं सीरम के अभाव में सक्षम थे, लेकिन अधिक अनुयायी बन गया है, और कई समुच्चय के रूप में अच्छी तरह से एक सेल का गठन monolayer (चित्रा 3 बी-चतुर्थ, पंचम)।

चित्रा 4) उत्पन्न करने के लिए। एक chemoattractant प्रेरित व्यक्ति की कोशिकाओं के बाद के अलावा अंडाकार आकृति से बाहर ले जाने के लिए और आसपास के मैट्रिक्स (चित्रा 4 बी) में आक्रमण करने के लिए। हमलावर कोशिकाओं और दूरी पर आक्रमण की संख्या में इस तरह के DAPI या Calcein AM रूप में एक जीवित कोशिका दाग की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा या brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, (धारा 3, 4)। हमारे परीक्षण में, इस तरह के उभार के गठन के रूप में रूपात्मक परिवर्तन, दिखाई उपचार के 6 घंटे के भीतर chemoattractant के साथ थे, और कई कोशिकाओं को पूरी तरह से अंडाकार आकृति से detaching और 18 से 48 घंटे के भीतर कोलेजन में हमलावर मनाया जा सकता है। हमारे प्रयोगों के लिए, हमने पाया है कि आक्रमण की 12 से 18 ज, आदर्श था के रूप में लंबे समय तक ऊष्मायन बार कोशिकाओं से बहुत दूर जाने में हुईइष्टतम इमेजिंग के लिए अंडाकार आकृति। फिक्स्ड कोलेजन एम्बेडेड spheroids brightfield द्वारा imaged किया जा सकता है, दूरी और हमलावर कोशिकाओं की संख्या, या immunofluorescence माइक्रोस्कोपी (धारा 3-5), कोशिकाओं (आंकड़े 5 ब, 5C) द्वारा गठित आक्रामक संरचनाओं के दृश्य के लिए यों तो।

वर्णित अंडाकार आकृति गठन प्रोटोकॉल है, जो कोशिकाओं में अलग-अलग उच्च एकाग्रता एम सी में निलंबित कर रहे हैं (30 मिलीग्राम / एमएल) anoikis प्रतिरोध पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक संशोधन। इन एम सी सांद्रता में, मध्यम अभी भी पिपेट द्वारा जबकि शांत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन गाढ़ा एक ठोस जेल में। Anoikis प्रतिरोधी इस माध्यम में resuspended कोशिकाओं निलंबन में बने रहे और 2-4 सप्ताह की अवधि में प्रचूर मात्रा में, अलग आकार (चित्रा 6B) के निलंबित spheroids के गठन। एंकोरेज निर्भर कोशिकाओं इन परिस्थितियों में spheroids फार्म नहीं है। हम सुन्न की गणना के द्वारा anoikis प्रतिरोध यों करने में सक्षम थेspheroids के एर अच्छी तरह से प्रत्येक में गठन किया।

आकृति 1
चित्रा 1: 3 डी उपगोल गठन प्रोटोकॉल का अवलोकन। monolayer संस्कृति में विकसित कोशिकाओं, अलग कर रहे हैं गिना, pelleted, और अंडाकार आकृति गठन मध्यम मिथाइल सेलुलोज (एमसी) और सीरम (मैं-चतुर्थ) के साथ पूरक में resuspended। निलंबन वांछित आकार (v) के spheroids के गठन की अनुमति के लिए वांछित घनत्व में एक यू के नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम थाली में वरीयता दी गई है, और थाली प्रत्येक अच्छी तरह से (vi) में एक एकल, असतत सेल अंडाकार आकृति का उत्पादन करने के लिए incubated है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: अनुकूलित उपगोल गठन की स्थिति।(ए) एसएच SY5Y कोशिकाओं के लिए इष्टतम परिस्थितियों में उपगोल गठन। 1,000 कोशिकाओं 5% सीरम और 1 मिलीग्राम के साथ पूरक मीडिया में यू-नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेटों में वरीयता प्राप्त / एमएल एम सी 24 घंटे के भीतर कॉम्पैक्ट spheroids में एकत्रित। (बी) तालिका 1 में दिखाया इष्टतम परिस्थितियों में विभिन्न सेल लाइनों द्वारा गठित spheroids के प्रतिनिधि छवियाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सबऑप्टिमल शर्तों के तहत उपगोल गठन। (ए) Spheroids contaminants की उपस्थिति में गठन किया। माइक्रोबियल संदूषण कोशिका मृत्यु और शिथिल एकत्रित spheroids में हुई। ऐसी धूल या फाइबर, इन सामग्रियों का पालन कोशिकाओं के रूप में अघुलनशील contaminants, की उपस्थिति में और aggreg नहीं कियाखाया। (बी) सबऑप्टिमल अंडाकार आकृति गठन के माध्यम में उपगोल गठन। BxPC-3 कोशिकाओं अतिरिक्त एम सी की मौजूदगी में वरीयता प्राप्त (10 मिलीग्राम / एमएल) कई उपग्रह spheroids (मैं) का गठन किया है, जबकि अपर्याप्त एम सी (0 मिलीग्राम / एमएल) सेल समुच्चय है कि अच्छी तरह से नीचे का पालन किया और एक monolayer गठन के परिणामस्वरूप (ii )। इसी तरह के परिणाम अन्य परीक्षण सेल लाइनों के लिए मनाया गया (नहीं दिखाया गया है)। अतिरिक्त सीरम (20%) में वृद्धि हुई HCT-116 सेल प्रसार और monolayer गठन (iii) में हुई। अपर्याप्त सीरम (0%) सेल लाइन-विशिष्ट कोशिका मृत्यु से HCT-116 में लेकर प्रभाव पड़ा (iv) Panc-1 में उपग्रह spheroids के गठन के लिए (v)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: आक्रमण परख Spheroids का उपयोग करना। (ए) Ovअंडाकार आकृति आक्रमण परख की erview। इमेजिंग पोत निष्प्रभावी कोलेजन की एक परत के साथ पूर्व में लिपटे और कोलेजन (मैं द्वितीय) भाजन करने के लिए incubated है। पूर्व गठित spheroids 1.5 एमएल ट्यूबों में एकत्र की है और निष्प्रभावी कोलेजन (iii-vi) में resuspended हैं। अंडाकार आकृति-कोलेजन मिश्रण कोलेजन आधार परत पर मढ़ा और कोलेजन (सात-आठ) भाजन करने के लिए incubated है। विकास वांछित यौगिकों से युक्त मध्यम तो polymerized अंडाकार आकृति-कोलेजन परत पर मढ़ा और सेल आक्रमण (IX-एक्स) की अनुमति के लिए incubated है। (बी) के एक chemoattractant की उपस्थिति में, कोशिकाओं को संकेत समय बिंदुओं पर एक एम्बेडेड Panc-1 अंडाकार आकृति से आसपास के कोलेजन मैट्रिक्स में हमलावर दिखाए जाते हैं। प्रत्येक पैनल एक चरण विपरीत छवि एक 10X उद्देश्य का उपयोग कर हासिल पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: कोलेजन एम्बेडेड spheroids के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। (ए) spheroids के immunofluorescence धुंधला के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन। एंबेडेड spheroids, धो रहे हैं निश्चित (NBF), और अवरुद्ध (बीएसए) इमेजिंग के बर्तन में सीधे। Spheroids सीधे दाग जा सकता है, या excised और इस तरह एक 1.5 एमएल ट्यूब के रूप में एक छोटी मात्रा में दाग। Spheroids प्रत्येक दाग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम से कम करने के लिए निम्न अतिरिक्त बफर के साथ धोया जाना चाहिए। सना हुआ spheroids सीधे पोत में imaged या इमेजिंग और भंडारण के लिए एक coverslip के तहत रखा जा सकता है। एक टीपीसी -1 सेल अंडाकार आकृति कोलेजन में एम्बेडेड है और 24 घंटे के लिए आक्रमण करने के लिए अनुमति का (बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों। (सी) phalloidin दाग कोशिकाओं दिखा छवियों बी में संकेत क्षेत्रों के विशिष्ट प्रत्येक पैनल से पता चलता है एक 20 माइक्रोन जेड प्रक्षेपण (0.2 माइक्रोन कदम) के एक 60x उद्देश्य का उपयोग अधिग्रहण: अंडाकार आकृति ख के भीतर कोशिकाओंody लगभग 20 माइक्रोन सतह से (1), मज्जा (2) में फैला हुआ कोशिकाओं, और कोलेजन के माध्यम से हमलावर कोशिकाओं (3)। स्केल सलाखों = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: उपगोल गठन Anoikis परख। (ए) anoikis परख के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन। प्रकोष्ठों चित्र 1 में वर्णित के रूप में तैयार कर रहे हैं, लेकिन अंडाकार आकृति गठन के 30 मिलीग्राम / एमएल एम सी जो एक मोटी परत के निलंबन में व्यक्ति की कोशिकाओं पकड़ और सेल एकत्रीकरण (मैं द्वितीय) को रोकने के रूपों की एक न्यूनतम युक्त मध्यम में resuspended हैं। सेल निलंबन यू-नीचे सेल से बचाने वाली क्रीम प्लेटों में वरीयता दी गई है और incubated (III चतुर्थ)। निलंबित कोशिकाओं प्रसार से अंडाकार आकृति गठन के लिए नजर रखी जा सकती है, anoikis प्रतिरोध का संकेत है। ( यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोशिका की परत एम सी (मिलीग्राम / एमएल) सीरम (%) लगभग ऊष्मायन
पहर
एसएच SY5Y 1 5 चौबीस घंटे
BxPC -3 5 5 3 से 5 दिन
Panc-1 5 5 5 से 7 दिन
HCT-116 3 10 2 से 4 दिन
टीटी 1 10 7 से 10 दिनों के
टीपीसी -1 3 5 1 से 2 दिन

तालिका 1: इष्टतम उपगोल गठन मध्यम रचना और ऊष्मायन बार मान्य सेल लाइनों के लिए।

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Discussion

हम इन विवो ऊतकों सस्ती और व्यापक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करने की वास्तुकला मॉडल करने के लिए 3 डी सेल spheroids के उत्पादन के लिए एक तेजी से और लचीला तरीका मौजूद है। हमारी प्रोटोकॉल एम सी 8, 9 की गैर साइटोटोक्सिक और आसंजन को बढ़ावा देने के गुण सेल एकत्रीकरण मध्यस्थता और सेल monolayer गठन को कम करने का लाभ उठाते। पशु स्रोतों से अलग प्रोटीन आधारित matrices के विपरीत, एम सी, निष्क्रिय है कोई वृद्धि कारक होता है, और आसानी से धोने से हटा दिया जाता है अवशिष्ट मैट्रिक्स की उपस्थिति के बिना आवेदनों की एक किस्म में उपयोग के लिए spheroids के अलगाव की इजाजत दी। हमारी प्रोटोकॉल homogenously आकार spheroids उत्पन्न करने के लिए लगातार सेल नंबर का तेजी से एकत्रीकरण का उपयोग करता है, विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन हो spheroids के प्रत्यक्ष तुलना की इजाजत दी। इस विधि के कई ट्यूमर जुड़े सेल प्रकार की निर्धारित संख्या के संयोजन (द्वारा विवो ट्यूमर के विकास में मॉडल के लिए मिश्रित संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकताजैसे fibroblasts, ल्यूकोसाइट्स, stromal कोशिकाओं) और अधिक सही ट्यूमर पर्यावरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए।

हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग एम सी की उच्च सांद्रता में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं का संशोधन निलंबन में पैदा करने में सक्षम कोशिकाओं के लंगर स्वतंत्र विकास पर नजर रखने के लिए किया जा सकता है, और एक anoikis परख (धारा 6) की पहचान या सेल परिवर्तन यों के रूप में नियोजित किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न spheroids ऐसी दवा स्क्रीनिंग के रूप में आवेदन, सेल के विकास, चयापचय, अस्तित्व, और invasiveness उपचार की स्थिति के बीच की तुलना की अनुमति के लिए आदर्श होते हैं। पृथक spheroids भी इस तरह के कोलेजन के रूप में, एक बाह्य मैट्रिक्स में एम्बेड किया जा सकता है, आकलन और एक 3 डी-microenvironment (धारा 2.2, चित्रा 4) में सेल invasiveness यों है कि अधिक सही विवो ट्यूमर के विकास में मॉडल। इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल प्रोटीन या शाही सेना तैयार करने के लिए एम सी मैट्रिक्स से spheroids की बड़ी मात्रा को अलग-थलग करने के लिए, यू की अनुमति के इस्तेमाल किया जा सकताSERS उपचार या विकास की स्थिति के जवाब में सेल संकेत या जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए।

हमारे अंडाकार आकृति गठन प्रोटोकॉल सीरम और एम सी सांद्रता, और प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के अनुकूलन की आवश्यकता है। इस तरह के सेल व्यवहार्यता, सेल सेल और सेल प्लास्टिक चिपचिपाहट के रूप में सेल लाइन-विशिष्ट विशेषताओं, काफी आसानी के साथ जो spheroids का गठन कर रहे हैं प्रभावित कर सकते हैं। सामान्य तौर पर, monolayer संस्कृति में गरीब व्यवहार्यता के साथ सेल लाइनों, अंडाकार आकृति गठन को बढ़ावा देने के लिए, जबकि उच्च सांद्रता एम सी अत्यधिक चिपकने वाला सेल लाइनों के लिए पसंद किया गया उच्च सांद्रता सीरम की आवश्यकता है। इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि सीरम और एम सी के अनुमापन जबकि monolayer और उपग्रह अंडाकार आकृति गठन (एम सी एकाग्रता) को कम करने, सेल अस्तित्व (सीरम एकाग्रता) के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए किया जा सकता है। इन शर्तों उपग्रहों के बिना अच्छी तरह से प्रति एक असतत अंडाकार आकृति की पीढ़ी में परिणाम चाहिए। के लिए इष्टतम अंडाकार आकृति आकारविश्लेषण के आवेदन पर निर्भर है और वरीयता प्राप्त कोशिकाओं और सीरम एकाग्रता (चरण 1.4.7) की संख्या से प्रभावित है। कम कोशिकाओं सीडिंग छोटे समुच्चय है कि और अधिक आसानी से एक ही ढंग से दाग रहे हैं पैदा करता है, लेकिन इन विवो सेल सेल और सेल microenvironment बातचीत में पुन: पेश नहीं कर सकते। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने से बड़ा spheroids है, जो एक physiologically प्रतिनिधि hypoxic कोर 10 कि सेल व्यवहार को प्रभावित करने और विकास या अस्तित्व assays की व्याख्याएं बदल सकते हैं शामिल कर सकते हैं उत्पन्न करता है। हालांकि, जब बहुत बड़ी है, spheroids नाजुक हो सकता है और आसानी से अलग टूट या अलगाव के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं। बड़ा spheroids भी बहुत कठिन ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए इमेजिंग प्लेटफार्मों विशेष (जैसे प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप) के बिना या embedding या अंडाकार आकृति 11 के माध्यम से cryosectioning और पार वर्गों के धुंधला द्वारा कल्पना करने के लिए कर रहे हैं। हम लचीलेपन के लिए 200-500 माइक्रोन का लक्ष्य अंडाकार आकृति आकार सलाह देते हैं औरसबसे अनुप्रयोगों के लिए से निपटने में आसानी। कुल मिलाकर, यह दोनों एक सेल लाइन विशेष और आवेदन विशेष ढंग से अंडाकार आकृति गठन के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

अंडाकार आकृति उत्पादन प्रोटोकॉल विशेष ध्यान देने की जरूरत धूल और अन्य विविक्त द्वारा spheroids के संक्रमण से बचने के लिए। कोशिकाओं, धूल और अन्य अघुलनशील contaminants का पालन अनियमित आकार में जिसके परिणामस्वरूप, शिथिल पक्षपाती सेल विश्लेषण में उपयोग (चित्रा 3) के लिए अनुपयुक्त समुच्चय। संदूषण के सूत्रों का कहना तुरंत उपयोग करने से पहले फ़िल्टर ultrapure पानी के साथ एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सभी समाधान गुजर रहा है, हदबंदी से पहले मध्यम फ़िल्टर के साथ सेल monolayer rinsing (चरण 1.4.1), और rinsing मल्टीचैनल पिपेट जलाशयों द्वारा कम किया जा सकता है (चरण 1.4.6.1)। इसके अलावा, कपास फ़िल्टर सीरम वैज्ञानिक pipettes, जो समाधान में फाइबर डाला सकता है, बचा जाना चाहिए। हालांकि गंभीर नहीं, धूल आगे dissociat गुजर द्वारा कम किया जा सकताएक 100 माइक्रोन सेल झरनी बोने (चरण 1.4.6) के लिए पहले के माध्यम से एड कोशिकाओं। माध्यम की बाष्पीकरणीय नुकसान विशेष रूप से इस तरह के अंडाकार आकृति गठन (तालिका 1) के लिए या anoikis assays (धारा 6) के दौरान कुछ सेल लाइनों द्वारा अपेक्षित उन के रूप में 1 सप्ताह से अधिक ऊष्मायन बार, के लिए, एक अतिरिक्त तकनीकी विचार है। वाष्पीकरण बहु अच्छी तरह प्लेटें के केंद्र क्षेत्र में कुओं में कोशिकाओं को बोने, ultrapure पानी के साथ कुओं परिधि भरने, और शिथिल थाली के किनारों सील या एक humidified कक्ष में प्लेट संलग्न द्वारा कम किया जा सकता है।

3 डी सेल spheroids दोनों सामान्य और ट्यूमर सेल व्यवहार और शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल हैं। हमारी प्रोटोकॉल लगातार आकार 3 डी सेल spheroids कि assays और आवेदनों की एक वर्गीकरण में इस्तेमाल किया जा सकता है की पीढ़ी के लिए एक तेजी से और किफायती तरीका है। ये spheroids जनसंपर्क के लिए ट्यूमर के विकास और microenvironment बातचीत के लक्षण वर्णन के लिए मूल्यवान उपकरण के साथ ही मॉडल का प्रतिनिधित्वउपन्यास के उपचारों के eclinical मूल्यांकन।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buffers
10x Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific  AM9625
Calcium Chloride Solution Sigma-Aldrich 21114 Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution Sigma-Aldrich M1028 Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name Company Catalog number Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate Greiner Bio-One 650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma-Aldrich D5546 For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium Thermo Fisher Scientific 2112722 For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051 Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M7027 Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium Sigma-Aldrich R8758 For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605028 Dissociation buffer
Name Company Catalog number Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen Corning Incorporated 354231 Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose  Thermo Fisher Scientific 11054-20 Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10 Chemoattractant
Name Company Catalog number Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass Electron Microscopy Sciences 72225-01 For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin Bioshop Canada Incorporated ALB001 Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV Sigma-Aldrich 290734 Antifade
Glycerol  Bioshop Canada Incorporated GLY001 Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software Freeware, NIH - Used for image analysis 
Microslides VWR International 48312-024 For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88 EMD-Millipore 475904 Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde  EMD-Millipore PX0055-3 Used in fixation buffer
Triton X-100 Bioshop Canada Incorporated TRX777 Used in permeabilization buffer

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References

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  3. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 121 तीन आयामी अंडाकार आकृति ट्यूमर microenvironment सेल संस्कृति सेल एकत्रीकरण मिथाइल सेलुलोज आक्रमण बाह्य मैट्रिक्स प्रवास anoikis immunofluorescence
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Maritan, S. M., Lian, E. Y.,… More

Maritan, S. M., Lian, E. Y., Mulligan, L. M. An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production. J. Vis. Exp. (121), e55544, doi:10.3791/55544 (2017).

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