Abstract
Tek tabakalı hücre kültürü yeterli kompleks hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini içeren dokuların in vivo davranış, modelde mevcut değildir. Üç boyutlu (3D) hücre kültür teknikleri yapışık hücre kültürü eksikliklerin giderilmesi için geliştirilen yeni bir yeniliktir. In vitro doku analogları üretmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir birlikte, bu yöntemler, kurma pahalı sıklıkla karmaşık özel teçhizat gerektirebilir ve genellikle sadece belirli hücre tipleri ile uyumluluğu ile sınırlıdır. Burada, tümör ve normal hücre çizgileri, çeşitli büyüme ile uyumlu uygun boyutta çok-3D parçacıklarının içine hücreleri toplanmasını sağlayan bir hızlı ve esnek bir protokol açıklar. Bu ankrajdan bağımsız sferoid nesil teşvik etmek ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde, hücre mono tabakaları oluşumunu önlemek için, serum ve metil selüloz (MC) arasında değişen konsantrasyonlarda kullanmaktadır. Bireysel için en uygun koşullarınidual hücre çizgileri küremsi oluşturulması ortamda MC veya serum konsantrasyonlarını ayarlanması ile elde edilebilir. üretilen 3 boyutlu sferoidler hücre sinyal veya gen ekspresyon çalışmaları, bir aday ilaç tarama, veya tümör hücre istilası ve göç gibi hücresel süreçleri çalışma da dahil olmak üzere geniş bir uygulama aralığında, kullanım için toplanabilir. Protokol de kolayca tek hücre klonal sferoidler üretmek üzere uyarlanmış olan ve ankrajdan bağımsız büyüme ve anoikis direncini değerlendirmek için adapte edilebilir. Genel olarak, iletişim kuralı üreten normal ve tümör hücrelerinin in vivo büyüme dokuların 3D mikro-özetlemek ve model-leştirilmesi için 3D hücresi parçacıklarının kullanılması için kolaylıkla değiştirilebilir bir yöntem sağlar.
Introduction
Tümör hücre davranışı biyolojik ilgili değerlendirme bu yeterli in vivo bulundu hücre mikro yansıtmaz, çünkü kısmen, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültür yöntemleri kullanılarak meydan okuyor. Kültür (ör Boyden Chamber tahlilleri) halinde hücre dışı matris bileşenleri içeren alternatif yaklaşımlar, in vivo doku ortamının daha fazla fizyolojik olarak temsilidir. Bununla birlikte, tek tek hücre davranışının değerlendirilmesi ile sınırlı olabilir ve doku ya da tümör büyümesi 1, 2, 3 katkıda hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri in vivo kombinasyonlarında karmaşık özetlemek yoktur.
Çok hücreli sferoidler kullanımı, daha doğru in vivo hücre büyümesi 1 kompakt mimarisini yeniden üreten bir son yaklaşımdır4. Sferoidler normal hücrelerin hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir, aynı zamanda bu tür metastatik büyüme ya da ilaç direnci 4 tümör progresyonu özelliklerini modeli tümör analogları olarak hareket edebilir.
Sferoidler bir matris 5 veya daha hızlı bir şekilde yerleştirilmiş tek hücre çoğalması ile oluşturulabilir, birden fazla hücre toplanmasını teşvik ederek, tek bir hücre kümesi (örneğin, asılı damla, santrifüj yöntemleri) 6, 7 oluşturulur. Mevcut hücre toplama teknikleri pahalı malzeme veya özel ekipman gerekebilir. Buna ek olarak, bu sferoidler boyutları ve morfolojileri geniş bir yelpazede ve büyüme koşulları ya da zor tedaviler arasındaki karşılaştırmalar, büyük miktarlarda üretilmesi için zor olabilir. Son olarak, bu yöntem tarafından üretilen sferoidler proteinli ekstrasellüler izole etmek zor olabilirlular matrisi içinde diğer uygulamalarda kullanılmak üzere yerleştirilmiştir.
Burada, ticari olarak temin edilebilen U tabanlı hücre itici plakalar ve bir atıl yapışkanlık arttırıcı matrisi, metil selüloz ile tutarlı bir şekilde boyutlandırılmış, hücre parçacıklarının hızlı oluşumu için sağlam ve kolayca değiştirilebilir hücresi agregasyonu yöntemler tarifedilmiştir. Oluştuktan sonra, bu çok hücreli küreler kolaylıkla geniş bir uygulama aralığında kullanım için izole edilir. Protokol de kolayca diğer hücre süreçleri değerlendirmek için kullanılabilir hücre çoğalması ile parçacıklarının üretilmesi için uyarlanmıştır. Burada, bu iki farklı küremsi oluşumu protokoller, örneğin uygulamaları immünofloresan boyama ile miktarı, hücre istilası deneyleri, bir anoikis deneyi göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm reaktifler ve sarf malzemeleri Listesi'nde yer almaktadır.
Hücre Toplama tarafından 1. Sfero Üretim
- Metil selüloz çözeltisi: 100 mg / ml metil selüloz 100 mL hazırlayın.
- Isı 50 ml ultra saf H2O ila 80 ° C. 10 g metil selüloz tozu eklenir ve parçacıkları eşit şekilde dağılana kadar çalkalayın.
- Soğuk ultra saf, H2O ile nihai hacme getirmek ve çözelti berrak hale gelinceye kadar 4 ° C 'de karışmaya, saman renkli ve hiç bir görünür katı ihtiva etmektedir.
- çözünmemiş katıların ayrılması için bir 0.45 um filtre içinden geçirin. Hazırlanan çözelti, alikotlandı ve 12 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
Not: Metil selüloz hücre-hücre yapışmasını geliştirmek ve yapışık hücre tek katmanının oluşumunu engellemek amacıyla sitotoksik olmayan, atıl, süspansiyon maddesi olarak kullanılır. Metil selüloz suda çözünürdür ve spher uymalı, yıkanabiliroid nesil.
- Küre formasyonu ortamı
NOT: Kullanmadan önce hemen sfero oluşum ortamı hazırlayın. tutmayın.- Uygun bir kültür ortamı içinde 1-5 mg / ml metil selüloz çözeltisi ile seyreltilir.
- sterilize ve çözünmemiş katıların ayrılması için bir 0.22 um filtre içinden geçirin.
- Dulbecco fosfat tamponlu tuz (PBS)
- 1x ve kullanmadan önce, 0.45 um'lik bir filtreden geçirmek için seyreltilir. Hazırlanan çözelti, oda sıcaklığında süresiz depolanabilir.
- Hücre sfero üretimi (Şekil 1)
NOT: Önceden tüm reaktifler hazırlayın. Toz, lif veya diğer çözünmeyen parçacıklar tarafından çözümlerin kirlenmesini önlemek için önemlidir. Bu kirleticilerin varlığı olumsuz steoid oluşumunu etkiler. Kültür ortamı ve diğer çözümler zaman POS bu parçacıkların çıkarılması için 0.45 um filtreden geçirildi olmalıdırsible. Bu ek lifleri tanıtmak gibi çözümler aktarırken pamuk süzülmüş pipetler kullanmaktan kaçının.- uygun bir kültür içinde% 70 ortak akışa kadar kültür hücre mono tabakaları, orta,% 10 serum ile takviye edilmiştir. Aspire kültür ortamı ve enkaz kaldırmak için 1x PBS ile durulayın. Tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin), 10 cm hücre kültür tabağına disosiasyon tamponu 3 mL ekleyin ve CO2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
- dekolmanı onaylamak için 10X büyütmede mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Serum-takviyeli kültür ortamında 7 mL ayrılma tamponu nötralize.
- 10 dakika hafifçe pelet hücreler için 500 xg'de Santrifüj hücre süspansiyonu.
- süpernatantı. bir filtre ucu ile bir P1000 pipet kullanarak 1 ml sfero oluşumu ortamında tekrar süspansiyon hücre pelet.
NOT: hücre süspansiyonu kümeleri serbest olmalıdır.- Hücre topağı çiğnemek için, küçük bir açıyla ise tüpün dibine pipet basınpipet hücre pelletini kesme. Bu hücrelere zarar verebileceği 5 kez - en fazla 3 triturating kaçının. Pipet yavaş ve hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için pipet tüm içeriğini sınırdışı yok.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 1 x 10 4 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin.
NOT: Hücre sayısı farklı boyutlarda parçacıklarının üretilmesi için optimize edilebilir. hasarlı hücrelerin tripan mavi boyası, yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler canlılığı teyit etmek için kullanılabilir. - Aktarım hücresi steril, tozsuz çok kanallı pipet rezervuara süspansiyonu ve 96 oyuklu U tabanlı hücre itici plakanın her oyuğuna 100 uL dağıtılması için filtre ipuçlarını kullanın.
- Süzülmüş ultra saf H 2 O ile durulayın rezervuar toz ve tüyleri temizleyin.
- haznenin dibine çökelme hücreleri önlemek için tohumlama periyodik ise hücre süspansiyonu karıştırın. karıştırma ve dağıtıyor sırasında hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için, ters pipetleme tekniği kullanmakörn.
- Doku kültürü kuluçka makinesine transfer plakaları (37 ° C ve% 5 CO2) ve sferoid oluşumu için günlük olarak kontrol edin. Hücreler de 6 saat içinde her dibe ve 24-48 saat (Şekil 2) içinde bir sfero içine araya genellikle gerekir.
- Başarılı sfero oluşumu teyidi için, bir p10 ucu kullanın ve yavaşça 10X büyütmede mikroskop altında gözlemlerken sfero üzerinde orta pipetle. Düzgün oluşturulmuş sferoidler kendi 3D yapısını teyit plaka ve rulo gevşetin.
NOT: Her hücre çizgisi, oyuk başına tek bir sfero oluşumunu elde etmek için metil selüloz ve serum konsantrasyonlarının titrasyon ile tespit edilmelidir. Seçilen hücre hattı, bu şekilde optimize koşullar Tablo 1 'de gösterilmektedir, ve parçacıklarının örnekleri Şekil 2B'de kurdu. belirtilenden daha sferoidler uzun süre yetiştirilen olabilir ancak büyük olmak gibi onlar giderek daha zor büyümekparçalanma olmadan işlemek için. Hücreler tek tabaka, uydu küreler oluşturma ya da kuyunun dibine çöker başarısız olursa, metil selüloz ve serum konsantrasyonu, daha uygun küre formasyonu (Şekil 3B) için ayarlanması gerekebilir. Bu tür elyaflar veya toz (Şekil 3A) gibi kirletici maddeleri içeren küremsiler kullanmayın. Önceden oluşturulmuş sferoidler bu analiz için büyüme faktörleri, canlı hücre lekeleri veya inhibitörleri olarak ilgi çekici bir bileşik ile muamele edilebilir.
2. Sferoid Yayılması deneyindeki (Şekil 4)
- nötralize kollajen
- 4 ° C'ye kadar tüm sıvıları soğutmak ve istenmeyen polimerizasyonu önlemek için kolajen ile çalışırken buz üzerinde tutun.
- 0.22 mikron filtreler aracılığıyla ultra saf H 2 O geçirin bütün çözümleri NaOH ve taze 0.1 M HCl taze 0.1 M ve 0.01 M çözüm hazırlayın.
- 1: Sığır tip 1 kolajen (3.1 mg / ml stok), 0.01 M NaOH ve 10 x PBS (8 karıştırın: 1 hacim olarak oran) ve soğuk 0.1 M NaOH ve HCI kullanılarak pH 7.4'e ayarlanır. kollajen nihai konsantrasyon / ml 2.5 mg'dır.
- 2-3 mm'lik bir derinliğe kadar görüntüleme kabı doldurmak için yeterli nötralize kolajen hazırlayın. 100 uL az Malzeme Listesi listelenen 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün her bir kuyu için gereklidir.
- Kolajen parçacıklarının gömülmesi (Şekil 4)
- Kat kolajen nötralize 50 uL minimum 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün her çukuruna alt.
- kolajen kabarcıkları oluşturarak önlemek için ters pipetleme tekniği kullanın. kuyu yüzeyi üzerinde eşit kolajen yaymak için pipet kullanın.
NOT: Bu kolajen taban katmanı süspansiyonda parçacıklarının tutun ve genellikle 1-2 mm kalınlığında olacak. taban tabakası üst kollajen tabakası üzerinde bir menisküs oluşmasını önler. Taban tabakası çok ince ise, küremsi odasının slayt alt temas yapabilir veHücre tek tabaka oluşturur.
- kolajen kabarcıkları oluşturarak önlemek için ters pipetleme tekniği kullanın. kuyu yüzeyi üzerinde eşit kolajen yaymak için pipet kullanın.
- 10 cm doku kültürü çanak odasına slayt ve ultra saf H 2 O ile dolu bir 35 mm doku kültürü çanak yerleştirin. Kollajen, tipik haliyle 1 saat polimerize kadar 37 ° C'de inkübe edin. Mağaza buz üzerinde kolajen nötralize kalan.
NOT: su dolu 35 mm çanak nem sağlar ve kurumasını önleyecektir. slaytı tahlilinde boyunca bu nem odasında kalmalıdır. kolajen taban tabakası, gece boyunca polimerleşmeye bırakılır olabilir. Uzun inkubasyon genellikle daha sert bir jel ile sonuçlanır. - Bir p1,000 filtre ucu kullanarak üst tüpler ek 1.5 mL, 96 oyuklu U tabanlı hücre itici plaka önceden oluşturulmuş sferoidler (aşama 1.4.7) toplar. Pipet yavaşça tekrarlanan önlemek ve ya kuvvetli pipetleme sferoidler sıvı-kesme aza indirmek için. Çoklu sferoidler 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün bir oyuğuna transfer için tek bir tüp içerisinde toplanmış olabilir.
- Bir tabl toplanan küremsilerin santrifüj2-5 saniye için 2000 xg ve en ETOP mikrosantrifüj P200 pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. Bu sferoidler parçalayın ya da bir araya gelme neden olabilir, gerekli olandan daha uzun süre santrifüj kaçının.
NOT: süpernatant çoğu kapalı pipetle sonra tüp dikkatli aşırı sıvı uzak fitil temiz bir kağıt havlu üzerine ters çevrilmiş olabilir. sferoidler kurumasına izin vermeyin. - Geniş delik P200 ucu kullanarak, yavaşça kolajen nötralize 50 mcL parçacıklarının tekrar süspansiyon. Herhangi bir Sferoidler odası slayt aktarılır önce toplanan sferoidlerin her tüp için bunu yapın. oda slaytlar transfer için hazır olana kadar buz üzerinde nötralize kollajen içinde yeniden süspanse edilmiştir parçacıklarının tutun.
- inkübatör odasına slayt çıkarın ve dikkatlice kolajen taban tabakasının üstüne sfero-kollajen karışımı pipetle. Kollajen polimerize kadar CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5.
- hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için pipet tüm içeriğini dağıtmak yok. Dropwimkb pipet kollajen taban tabakası rahatsız şansını azaltır.
- Yavaş yavaş uL slaytı, her sıra için, istenen kimyasal çekici inhibitörleri ya da diğer tedaviler ihtiva eden kültür ortamı ısıtıldı en az 100 ekleyin. Sıvı çok şiddetle bunun üzerine pipetle ise kollajen tabakası içeren sferoidler yırtılabilir. Kültür ortamı yavaş yavaş kolajen rahatsız etmemek için bir kuyu tarafı aşağı reçete edilebilir.
- Hücre istilasını izin vermek için 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde odasına slayt inkübe edin. Çevre kollajen içine hücre istilasını aydınlık veya floresan görüntüleme tarafından gözlemlenen ve Epifloresans konfokal veya hafif tabaka mikroskobu kullanarak çeşitli yöntemler ile ölçülebilir.
- Kat kolajen nötralize 50 uL minimum 8 oyuklu doku kültür oda sürgünün her çukuruna alt.
Invasion 3. Niceleme: aydınlık Mikroskopi
- ayarlanan zaman aralıklarında, görüntü aydınlık mikroskop (adım 2.2.8) kullanılarak 10X büyütmede parçacıklarının kollajen gömülü.
NOT: Satılıkdaha uzun süreli canlı hücre deneyleri, ısıtılmış bir mikroskop aşamasında ve CO2 düzenlenir odası 37 ° C'de parçacıklarının ve% 5 CO2, görüntüleme sağlamak için kullanılabilir. - Çevredeki kolajen ve her zaman noktasında işgal ortalama mesafe içine işgalci hücrelerin sayısını ölçmek için böyle ImageJ gibi yazılımları kullanarak invazivliğini ölçmek.
Invasion 4. Niceleme: Canlı Hücre Leke ile Floresan Mikroskopi
- Adım 2.2.8 Aşağıdaki gibi DAPI, Calcein AM, ya da üreticinin talimatlarına göre hücre hattına uygun diğer hücre izleme bileşik olarak bir floresan boya ile oda slaytlar orta tamamlar.
Not: invaziflik ölçümü için, sfero boyunca homojen boyama gerekli değildir. leke derin nüfuz, uzun inkubasyon gerektiren uygulamalar için (> 3 saat) gerekli olabilir. - leke çıkarın ve 500 uL sıcak 1x PBS ile değiştirin. İçinde10 dakika için 37 ° C 'de cubate Boya fazlasını uzaklaştırmak için. İki kez en az tekrarlayın.
- bir floresan mikroskop kullanılarak, işgalci sferoidler aracılığıyla optik bölümleri kazanır.
Not: lazer ışığına uzun süre maruz fototoksisite ve photobleaching sınırlamak için tekrar eden görüntüleme sırasında en aza indirilmelidir. - sfero toplam alanı ölçmek için kullanılabilecek bir Z çıkıntı oluşturmak için, ImageJ olarak yazılımını kullanarak, akın eden hücre, ve mesafe sayısı kollajen matris işgal.
- Bir örnek olarak, istila ölçmek için, yalnızca sfero ve hücreleri istila vurgulama, arka plan dahil ve bunların alanı ölçmek için görüntü eşik ayarlayın. Orijinal sfero alan invazivliğini ölçmek için bu toplam çıkartılabilir.
Invasion 5. Niceleme: İmmünofloresan
Not: kullanımı remo önce, tüm çözeltiler ve tamponlar, 0.45 um'lik bir filtreden geçirilmesi gerektiğiniolumsuz boyama etkileyebilir enkaz, ettik.
- PBS + yıkama tamponu hazırlayın. 1x PBS hazırlamak ve 0.1 mM nihai bir konsantrasyona kadar CaCl2 ve MgCI2 ilave edin. CaCl2 ve MgCl2 eklendikten sonra tampon otoklavlamayın. Çözelti filtre ile sterilize edilmiş ve oda sıcaklığında depolanabilir.
- nötr tamponlu formalin (NBF) tespit tampon hazırlayın. 0.6 gr paraformaldehid ile 1 M NaOH 5 damla ekleyin. PBS + 20 mL'ye getirilmektedir ve paraformaldehit (yaklaşık 1 saat) eriyene kadar 60 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığına soğutulur ve 1 M HCI ile pH 7.4 ayarlanır.
NOT: NBF tespit tampon kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. - büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile bloke tamponu hazırlayın. Ağ / hac% 3 PBS + BSA içinde çözündürülür. Çözelti filtre sterilize edilir ve birkaç gün boyunca 4 ° C'de saklanır, ancak en taze hazırlanmış olabilir. ısı etmeyin.
- Permeabilization tampon hazırlayın. Triton X-100 ile seyreltilirPBS +% 0.2 h / v.
Not: permeabilizasyon tamponu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. - İsteğe bağlı olarak, Mowiol montaj orta hazırlayın. 2,4 g Mowiol, 6 gr gliserol ve 6 ml ultra saf H, oda sıcaklığında, bir döndürücü 3 saat boyunca 2 O Karışım birleştirin. 12 mL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) eklenir. 10 dakika boyunca 50 ° C'de karıştırılarak inkübe edilir.
- 15 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüje çözünmeyen malzeme peletlendi. Anti-ağartma maddesi, örneğin,% 2.5 DABCO ekleyin. -20 ° C'de 500 uL alikot saklayın.
- Sferoidlerin İmmünfloresan boyama (Şekil 5)
NOT: Yavaş yavaş odacık slayt sıvıları eklemek veya kaldırmak için bir pipet kullanın. Bu kollajen tabakasını bozabilir gibi bir aspiratör kullanmaktan kaçının.- parçacıklarının hazırlanması ve 2 'ye kadar 1 de tarif edildiği gibi, kollajen dolu oda slaytlar yerleştirin.
NOT: Kollajen otofloresansı ince tabakalar veya c küçük hacimli kullanılarak minimize edilebilirollagen. - Her bölme slayt mümkün olduğunca kültür ortamı çıkarın.
- Kısaca artık orta kaldırmak için 500 uL PBS + yıkama tamponu ile kollajen tabakası durulayın.
- Her bir oyuğa 500 ul taze bir PBS + yıkama tamponu ilave edin ve sferoidler yıkamak için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. İki kez tekrarlayın.
- 500 uL NBF tespit tamponu ile PBS + yıkama tamponu değiştirin. 25 dakika - 20, oda sıcaklığında inkübe edilir.
- NBF tespit tamponu çıkarın ve 500 uL PBS + yıkama tamponu ile durulayın. Taze PBS + 5 dakika boyunca 3 kez yıka en az yıkama tamponu.
Not: Sabit sferoidler için birkaç gün taze PBS + yıkama tamponu içinde 4 ° C de muhafaza edilebilir. % 0.01 sodyum azid depolama esnasında mikrobiyel gelişmeyi engelleyecek kadar yıkama tamponu ilave edilebilir. - PBS + 500 uL permeabilizasyon tamponu yıkama tamponu değiştirin. 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- İsteğe bağlı olarak, BSA engelleme tampon kaldırmak. neşter veya makas, tüketim parçacıklarının ve kollajen tabakası çevreleyen 3 mm x 3 mm alanını kullanarak. Geniş delik P1000 ucu kullanarak, taze BSA engelleme tamponu ile hafifçe durulama kollajenin eksize bloğu yerinden. 1.5 ml tüp kollajen blok aktarın.
- 2 dakika süreyle 2000 xg'de Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. Tüp dikkatle aşırı sıvı uzak fitil temiz kağıt havlu üzerine ters olabilir.
- parçacıklarının hazırlanması ve 2 'ye kadar 1 de tarif edildiği gibi, kollajen dolu oda slaytlar yerleştirin.
- sferoidler birincil antikor ekleyin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Tüm kollajen tabakası eşit şekilde daldırılmış, öyle ki birincil antikor yeterli hacim. Yukarıdaki isteğe bağlı adımlar (5.6.8.1-5.6.8.2), tipik olarak antikorun küçük hacimlerde kullanımına izin verir.
- En az 10 ml PBS + yıkama buf ile bir kapta odası slayt Batmak10 dakika için fer yıkamak. İki kez en az tekrarlayın.
- Sferoidler önce kollajen tabakası (Aşama 5.6.8.1) kesilip eğer isteğe bağlı, 1.5 ml tüp tampon hafifçe ajite yıkama 1 mL PBS + en az ekleyin. 10 dakika en az bekletin.
- Mümkün olduğu kadar PBS + yıkama tamponunu çıkarın ve iki kez az yıkama tamponu PBS + ile yıkama tekrarlayın. Birkaç dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin kolajen blok pelet.
NOT: yıkama tamponu dalarken önce% 70 etanol ile silerek odasının slayt temizleyin dış yüzeyleri.
- Adımları tekrarlayın 5.6.9-5.6.10 uygun ikincil antikor kullanılarak.
NOT: Sferoidler görüntüleme kabında doğrudan lekeli ise, 5.6.13 adıma geçin. - İsteğe bağlı, sferoidler (5.6.8.1 Aşama) daha önce kolajen tabakadan kesilmiş eğer, temiz bir cam slaytlar ve% 70 etanol ile konfokal mikroskopi ile uyumlu lamelleri.
- O. monte etmeden önce bu adımı hemen gerçekleştirin ultra saf H 2 kollajen blok ve tekrar süspansiyon mümkün olduğunca çok yıkama tamponu çıkarın. Su iliklerine lekeli bloklar bırakmayın.
- ince uçlu forseps kullanarak, kollajen blok ve cam slayt transfer kenarını kavramak.
- forseps kullanarak emin doğrudan kolajen dokunmamaya dikkat ederek, kollajen bloktan fazla sıvıyı fitil için temiz bir pamuklu bir bez kullanın, yerinde kollajen tutun.
NOT: kolajen pamuklu çubukla hafifçe ya forseps kullanılarak kaldırılabilir yapışmış hale gelirse, ya da suda daldırarak.
- Ters pipetleme tekniği kullanarak, numune üzerinde kollajen blok ve yer lamel üzerine 100 uL Mowiol montaj orta dağıtmak.
- lamel altında aşırı Mowiol montaj orta ve suyu fitil bir pamuklu bir bez veya kağıt havlu kullanın.
- Mowiol montaj orta 4 ° gecede sertleşmesini bekleyinizoje ile lamel C. Seal kenarları.
- Konfokal veya floresan mikroskobu kullanarak görüntü lekeli sferoidler ilgi, invaziv yapıların oluşumu, vb (Şekil 5B, 5C) proteinlerin yerelleştirme gözlemlemek.
Not: Boyanan sferoidler photobleaching önlemek için ışıktan korunmalıdır.
6. Anoikis Deneyi
Not: sfero oluşumu protokolü kolay hücre tiplerinin çeşitli ankrajdan bağımsız büyüme ve anoikis direnci ölçmek için adapte edilir.
- Anoikis deneyi için tohum hücreleri (Şekil 6)
- Bölüm 1.4 küremsi üretimi için talimatları izleyin, ama sferoid formasyonu orta hazırlamak için, 30 mg / ml metil selüloz, en az kullanın.
NOT: ısıtıldı zaman, 30 mg / ml metil selüloz süspansiyonu hücreleri tutan kalın bir jel oluşturmak. - haftaya ve birkaç gün boyunca inkübe hücreleriBir mikroskop kullanılarak 10x büyütme düzenli bir tek-. anoikis karşı Hücreler çoğalmaya ve koloniler oluşturmalıdır.
- her bir oluşan kolonilerin sayısı ve büyüklüğü ölçülerek anoikis ölçmek.
Not: koloniler oluşturulmuştur sonra, metil selüloz çıkarmak için yıkanabilir ve tarif edildiği gibi küremsi bazlı deneyler için de kullanılır.
- Bölüm 1.4 küremsi üretimi için talimatları izleyin, ama sferoid formasyonu orta hazırlamak için, 30 mg / ml metil selüloz, en az kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu hücre itici plakaları ve MC ile takviye sferoid formasyonu ortamını kullanarak ayn sferoidler oluşturmak için esnek ve etkili bir yöntem tarif eder. MC ve serum uygun koşullar altında, tek tek hücreler yerleşmek ve de alt az vermeden parçacıklarının oluşturulması için iyi merkezine bir araya yapışır. Bu protokol kullanılarak, küremsi hücre çizgileri, çeşitli (Şekil 2B) elde edilmiştir. MC ve serum titrasyonu tek bir küremsi parçalamadan manipülasyon sağlamak için yeterince sağlam, meydana gelen en uygun koşulları belirlemek için her bir hücre hattı için gereklidir. En uygun olarak, sferoidler çapı 200 ile 500 um arasında ve en az hücre artıkları ile sıkıca yapışan hücreler oluşmuştur. Küremsi bunları toplanmış ve testler, çok çeşitli kullanılmak üzere izin zarar vermeden hassas taşıma hayatta kaldı.
(Şekil 3A), sayesinde bertaraf edilebilir. ele alındığında toz veya diğer elyaf kirlenme, çoklu veya sadece zayıf toplu oluşmuş düzensiz şekilli hücre kümeleri, ve ortaya çıkan küremsi varlığında kolayca parçalandı. Sfero oluşumu sfero oluşumu ortamı (Şekil 3B) suboptimal MC konsantrasyonları veya serum etkilenmiştir. Testlerde, çok sayıda hücre çizgileri MC, yokluğunda, veya düşük konsantrasyonlarda hücre itici plakalara yapışmaya mümkün ve hücre tek (Şekil 3B-II) ile çevrelenmiş bir küremsi oluşumu ile sonuçlanmıştır. optimal MC koşullarında BxPc-3 hücre büyümesini bir örnek olarak gösterilmektedir. Genel olarak, MC daha yüksek konsantrasyonlarda oyuk yapışan hücreler engelledi ancak MC çok yüksek bir konsantrasyonu, hücre-hücre yapışması ve önlenebilir hücreleri azaltılmışGevşek agrega ve çok sayıda uydu parçacıklarının (Şekil 3B-i) 'nin oluşumu ile sonuçlanır, kuyunun dibine çökelme. serum konsantrasyonu, hücre hayatta kalma ve hücre-hücre ve hücre-plastik yapışmasını etkilemiştir ve farklı hücre hatları için optimize edilmiş olması gerekiyordu. Bu HCT-116 ve Panc-1 gibi hücre hatları için, çok yüksek bir serum konsantrasyonu, aşırı hücre çoğalması ve kolay bir şekilde işleme zarar veya iyi plastik hücre yapışmasını teşvik edildi boy parçacıklarının üretim ve bir tek tabaka oluşumu (sonuçlandı Şekil 3B-iii). İlginç bir şekilde, yeterli serum etkileri hücre hatları arasında farklı. HCT-116 hücre hayatta kalması indirgenir ve oluşturulur sferoidler, düşük serum ölü hücrelerin büyük bir oranını ihtiva eden, küçük edildi. Bunun aksine, Panc-1 hücreleri, serum olmadan uygulanabilir, ancak daha yapışkan hale geldi ve birden çok agrega gibi bir hücre tekli tabakası oluşturan (Şekil 3B-IV, V).
tek tek hücreler daha yüksek bir konsantrasyon MC içerisinde süspanse edilir (30 mg / ml) anoikis direnci izlemek için kullanılabilecek tarif sferoid formasyonu protokolünün bir modifikasyonu. Bu MC konsantrasyonlarda, ortam hala 37 ° C 'de katı jele soğuk ise pipetle aktarılır, fakat esas itibarıyla kalınlaştırılmış olabilir. Bu ortam içine yeniden süspansiyon haline Anoikis-dirençli hücreler süspansiyon kaldı ve farklı boyutlarda (Şekil 6B) süspansiyon haline sferoidler oluşturan 2-4 haftalık bir süre boyunca çoğaldı. Ankraja bağımlı hücreler bu koşullar altında parçacıklarının oluşturmazlar. Biz uyuşmuş sayarak anoikis direncini ölçmek için başardıksferoidlerin er her bir meydana.
Şekil 1: 3D Sfero Oluşumu Protokol bakış. tek tabakalı kültür içinde büyüyen hücrelerin, ayrışmış sayılır, topak ve metil selüloz (MC) ve serum (I-IV) ile desteklenmiş küremsi formasyonu ortamı içinde yeniden süspanse edilir. süspansiyon, arzulanan boyutta (V) parçacıklarının oluşumuna izin vermek için istenilen yoğunlukta bir U tabanlı hücre itici plaka içine ekilir ve plaka her bir (VI) olarak, tek ve hücre sfero üretilmesi için inkübe edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Optimize Sfero Oluşumu Koşulları.(A), SH-SY5Y hücreleri için en iyi şartlar altında küre formasyonu. % 5 serumu ve 1 mg ile takviye edilmiş ortam içinde U-alt hücre itici plakalara ekilmiş 1.000 hücre / ml MC 24 saat içinde küçük parçacıklarının halinde toplanır. (B) Tablo 1'de gösterilmiştir optimal koşullar altında çeşitli hücre hatları oluşturduğu sferoidler Temsilcisi görüntüler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Suboptimal Koşullarında Sferoid oluşumu. (A), sferoidler kirletici varlığında oluşturulur. Mikrobiyal kontaminasyon hücre ölümü ve gevşek toplanmış küresellerde sonuçlandı. toz veya fiberler, bu malzemelerin yapışmış hücreler gibi çözünmeyen yabancı maddelerden, varlığında ve aggreg yoktuyemek yedi. Bırakıyorsa sfero oluşumu ortamında (B) Sferoid oluşumu. II (fazla MC mevcudiyetinde tohumlandı BxPc-3 hücreleri (10 mg / ml), bir çok uydu sferoidler (I) 'in oluşturduğu yetersiz MC ise (0 mg / mL) de taban yapıştırılır ve bir tek tabaka oluşturulmuştur hücre agrega ile sonuçlanmıştır ). Benzer sonuçlar, diğer test edilen hücre hatları için gözlenmiştir (gösterilmemiştir). Aşırı serumu (% 20) artmıştır HCT-116 hücre çoğalması ve tek tabaka formasyonu (III) ile sonuçlanmıştır. Yetersiz serumu (% 0) hücre ölümünden HCT-116 arasında değişen hücre çizgisi özgü etkiye sahip (IV) 'PANC-1 uydu sferoidler oluşumuna (h). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: küremsilerin kullanılması Yayılması deneyindeki. (A), Ovküremsi işgal tahlil erview. Görüntüleme kabı nötralize kollajen tabakası ile önceden kaplandı ve kollajen (I-II) polimerize etmek için inkübe edilir. Önceden oluşturulmuş sferoidler 1.5 ml tüpler içinde toplanmış ve nötralize kolajen (III-VI) içinde tekrar süspanse edilir. sfero-kollajen karışımı kolajen taban katmanı üzerine kaplanmış ve kolajen (vii-viii) polimerize inkübe edilir. istenen bileşikleri içeren büyüme ortamı daha sonra polimerize küremsi-kollajen tabaka üzerine kaplanmış ve hücre istilasını (IX-X) izin vermek için inkübe edilir. Bir kimyasal çekici varlığında (B) hücreler, belirtilen zaman noktalarında gömülü Panc-1 sfero çevreleyen kollajen matrisi içine işgal gösterilmiştir. Her panel 10X objektif kullanılarak elde edilen bir faz kontrast görüntü gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Kolajen gömülü sferoitlerin İmmünofloresan Boyama. Sferoidlerin immünofloresan boyama için protokol (A) genel bakış. Gömülü sferoidler doğrudan görüntüleme kabında, yıkanmış (NBF) sabit ve (BSA) engellenir. Küremsi doğrudan lekeli veya kesilmiş ve bir 1.5 mL tüp gibi, daha küçük bir hacimde boyanmış olabilir. Sferoidler arka floresan en aza indirmek için her bir leke Aşağıdaki fazla tampon ile yıkanmalıdır. Lekeli sferoidler kap içinde, doğrudan görüntü verilen ya da görüntü ve depolama için lamel altına monte edilebilir. Bir TPC-1 hücre sfero kollajen gömülü ve 24 saat boyunca işgal bırakıldı (B) İmmünofloresan ve görüntüler. Hücreleri sfero b içinde: faloidin lekeli hücreleri gösteren (C) Görüntüler B. belirtilen bölgelerin tipik Her panel 20 mikron Z-projeksiyon (0.2 mikron adım) 60X objektif kullanılarak elde edilen gösterirODY yaklaşık 20 um yüzeyinden (1), kolajen (2) çıkıntı yapan hücreleri ve kollajen ile hücreleri istila (3). Ölçek çubukları 25 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: küre formasyonu Anoikis Deneyi. Anoikis test protokolüne (A) genel bakış. Hücreler, Şekil 1 'de tarif edildiği gibi hazırlanır, ancak hücre toplama (I-II) süspansiyonuna tek tek hücrelerin tutun ve önlenmesi için kalın bir tabaka oluşturur 30 mg / ml MC en az içeren sferoid formasyonu ortamı içinde yeniden süspanse edilir. Hücre süspansiyonu U tabanlı hücre itici plakalara ekilmiş ve (III-IV) inkübe edilir. süspansiyon hücreleri anoikis direnç gösteren çoğalması küremsi oluşumu için izlenir. (
| Hücre çizgisi | MC (mg / mL) | Serum (%) | yaklaşık inkübasyon zaman |
| SH-SY5Y | 1 | 5 | 24 saat |
| BxPc-3 | 5 | 5 | 3-5 gün |
| PANC-1 | 5 | 5 | 5-7 gün |
| HCT-116 | 3 | 10 | 2-4 gün |
| TT | 1 | 10 | 7-10 gün |
| TPC-1 | 3 | 5 | 1-2 gün |
Onaylanmış Hücre Hatları için en uygun Sferoid Formasyonu Orta Kompozisyon ve Kuluçka Times: Tablo 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz ucuz ve yaygın olarak kullanılan reaktifler kullanılarak in vivo dokuların mimarisi model 3D hücre parçacıklarının üretilmesi için hızlı ve esnek bir yöntem mevcut. Bizim protokol MC 8, 9 sitotoksik olmayan yapışkanlık arttırıcı özellikleri hücre toplama aracılık etmek ve hücre tekli-tabakası oluşumunu en aza indirmek için patlatır. hayvansal kaynaklardan izole edilmiş protein bazlı matrisler farklı olarak, MC, inert olan herhangi bir büyüme faktörlerini içerir ve kolay bir kalıntı matris olmadan da çeşitli uygulamalarda kullanılmak için parçacıklarının izolasyonuna izin yıkanarak uzaklaştırılır. Bizim protokol çeşitli deneysel koşullar altında yetiştirilen sferoitlerin doğrudan karşılaştırmalar izin homojen büyüklükte sferoidler oluşturmak için tutarlı hücre sayıları hızla toplanmasını kullanır. Bu yöntem, (çoklu tümör-ilişkili hücre tiplerinin sabit sayıda birleştirerek in vivo tümör büyümesinde model Karışık kültürler için uyarlanabilirörneğin fibroblastlar, lökositler, stromal hücreler) daha doğru tümör ortamını temsil etmek.
MC yüksek konsantrasyonlarda tohumlandı protokol kullanılarak hücrelerin değişiklikler süspansiyonuna prolifere mümkün hücrelerinin ankrajdan bağımsız büyüme izlemek için yapılabilir ve tespit veya hücre dönüşümü ölçmek için bir anoikis tahlilinde (Bölüm 6) olarak kullanılabilir. Bizim protokol tarafından oluşturulan sferoidler tedavi koşulları arasındaki hücre büyüme, metabolizma, hayatta kalma ve invaziv karşılaştırılması sağlayan bu tür ilaç taraması gibi uygulamalar için idealdir. İzole sferoidler değerlendirmek ve 3D-mikro (Bölüm 2.2, Şekil 4) hücre istilası ölçmek için, kolajen gibi, hücre dışı bir matris içine gömülü olabilir in vivo tümör büyümesi daha doğru modelleri. Bundan başka, protokol u sağlayan bir protein veya bir RNA hazırlanmasına yönelik MC matris parçacıklarının büyük miktarlarda izole etmek için de kullanılabilirsers tedavi veya büyüme koşulları karşısında hücre sinyal veya gen ifadesi değişikliklerini tespit etmektir.
Bizim küremsi oluşumu protokolü serum ve MC konsantrasyonları, her bir hücre hattı için tohumlanmıştır hücre sayısının optimizasyon gerektirir. Bu hücre canlılığı, hücre-hücre ve hücre-plastik yapışkanlık gibi hücre hattı özgü özellikleri, belirgin sferoidler meydana getirilmesindeki kolaylığı etkileyebilir. Genel olarak, tek tabaka kültüründe zayıf canlılığı ile hücre hatları daha yüksek MC konsantrasyonları yüksek yapışkan hücre hatları için tercih ederken, sfero oluşumunu teşvik etmek için daha yüksek serum konsantrasyonları gerekli. Bu nedenle tek tabaka ve uydu sfero oluşumunu (MC konsantrasyon) en aza indirirken serum ve MC titrasyonlar, hücre sağkalım (serum konsantrasyonu) için en uygun koşulları belirlemek için yapılması önerilir. Bu koşullar, uydular olmayan oyuk başına tek bir ayrı sfero üretimi ile sonuçlanmalıdır. Optimal sfero boyutuAnaliz uygulamaya bağlıdır ve tohumlandı hücreleri ve serum konsantrasyonu (Aşama 1.4.7) sayısına göre etkilenir. Daha az hücrelerin ekim daha kolay homojen boyanmış küçük agrega üreten, ancak in vivo hücre-hücre ve hücre-mikroçevresinin etkileşimleri yeniden olmayabilir. Tohumlanmış hücrelerin sayısını arttırmak hücre davranışını etkileyen büyüme veya hayatta kalma tahlilleri yorumunu değiştirebilir fizyolojik Örnek hipoksik çekirdek 10 içerebilir büyük parçacıklarının oluşturur. Ancak, ne zaman çok büyük, sferoidler kırılgan olabilir ve kolayca birbirinden kopuk veya izolasyon sırasında hasar görmüş. Büyük sferoidler da optik kesit için özel görüntüleme platformları (örneğin ışık levha floresan mikroskop olmadan) veya gömme veya sfero 11'e kadar cryosectioning ve kesitlerin boyanması ile görselleştirmek için çok daha zordur. Biz esneklik 200-500 mikron bir hedef sfero boyutu tavsiye veBir çok uygulama için taşıma kolaylığı. Genel olarak, her iki hücre hattı spesifik ve uygulamaya özgü şekilde küremsi oluşturulması için koşulları optimize etmek için kritiktir.
Sfero üretim protokolleri toz ve diğer partiküllerin tarafından sferoidler kirlenmesini önlemek için özellikle dikkat gerektirir. Hücreler düzensiz şekilli sonuçlanan, toz ve diğer çözünmeyen kirleticiler uygun, gevşek yapışık hücre analizlerde kullanılmak (Şekil 3A) için uygun bir araya getirir. kontaminasyon kaynakları kullanılmadan hemen önce filtrelenmiş, aşırı saf su ile çok kanallı pipet rezervuarı (Aşama 1.4.1) ayrışma önce filtre ortamı ile hücre mono tabakasının durulama, 0.45 um'lik bir filtreden tüm çözümler geçen ve durulama ile en aza indirgenebilir (Aşama 1.4.6.1). Dahası, çözümler lifleri tutabilir pamuk filtreli serolojik pipetler, kaçınılmalıdır. kritik değildir, ancak, toz daha dissociat geçen azaltılabilirtohumlama (Adım 1.4.6) öncesinde 100 mikron hücre süzgecinden ed hücreleri. Ortamın Buharlaşma kaybı, özellikle, sferoid oluşumu (Tablo 1) ya da anoikis deneyleri (Bölüm 6) içinde belirli bir hücre çizgileri gerektirdiği gibi 1 hafta aşan inkübasyon süreleri için, ek bir teknik bir husustur. Buharlaştırma, çok oyuklu plakalar orta bölgesinde hücreleri kuyularda tohumlama, aşırı saf su ile kuyu çevre doldurulması ve gevşek plakanın kenarlarına sızdırmaz ya da nemli bir bölmede plaka içine en aza indirilebilir.
3D cep sferoidler normal ve tümör hücre davranış ve fizyolojisi çalışma için değerli modeller. Protokol deney ve uygulama yelpazesine de kullanılabilir tutarlı boyutlu 3D cep parçacıklarının oluşturulması için hızlı ve ekonomik bir yöntemdir. Bu sferoidler pr değerli tümör büyümesi ve mikroçevresinin etkileşimleri karakterizasyonu için araçlar yanı sıra modelleri temsilyeni tedavilerin eclinical değerlendirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS+ wash buffer; Do not autoclave PBS+ wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1 mg/mL; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | - | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
- Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
- Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
- Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4 (2007).
- Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
- Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).
