Introduction
As células T CD4 + são orquestradoras cruciais da resposta imunitária adaptativa. As células T CD4 + naive são capazes de se desenvolver em várias células T efectoras diferentes (por exemplo, Th1, Th2, Th17, etc), cada um com o seu próprio conjunto de citocinas característicos e factores de transcrição, dependendo do microambiente local 1. As decisões da linhagem que as células T fazem são fundamentais tanto para a imunidade protetora e tolerância à auto. Culas Th17 são um subconjunto de células T conhecidos para combater bactérias extracelulares e fungos, mas as suas respostas erradas também está implicado na patogénese de várias doenças auto-imunes e inflamatórias tais como esclerose múltipla e psoríase 2, 3. Culas Th17 humanos podem ser geradas a partir de células naive T CD4 + in vitro, proporcionando-lhes um ambiente de polarização apropriado 4. Vario us combinações das citocinas IL-1β, IL-23, TGF-p e IL-6 foram utilizados para o desenvolvimento de células humanas Th17. Culas Th17 humano expressar CCR6, um receptor de quimiocina que é comumente utilizada para identificar esta população de células e são definidos pela expressão do seu principal factor de transcrição, RORγt (codificado por RORC) 5, 6. culas Th17 têm a capacidade de expressar várias citocinas, mas a IL-17A é a citocina efectora definidora de linhagem produzida por estas células. Foi examinada a expressão de todos os três marcadores associados-Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) para avaliar a robustez do nosso ensaio de diferenciação humano Th17 in vitro. Além disso, foi realizada cultura de células CD4 + T humanas em condições não polarizadores, onde não há citoquinas ou anticorpos bloqueadores foram adicionados ao meio de cultura a utilizar como controlo negativo uma vez que a expressão destes marcadores Th17 deve ser muito baixa ou ausente.
ve_content "> Uma forma de estudar o desenvolvimento normal humana de células T e biologia é manipular a expressão de genes durante o seu desenvolvimento. Curto-ARN interferente (siRNA) são pequenas moléculas de ARN sintéticos que têm como alvo ARNm de codificação de proteínas e podem ser utilizados para reduzir a expressão do gene específico . MicroRNAs (miARNs) são endógenos não codificantes pequenos RNAs conhecidos para modular a expressão do gene de pós-transcricionalmente. miARNs foram mostrados para desempenhar um papel importante em ambos murino e biologia de célula T humana, incluindo em culas Th17 7, 8, 9. É é crucial ter métodos fiáveis de manipulação de actividade de RNA pequeno em células T humanas de estudar os seus efeitos sobre a expressão do gene e, finalmente, sobre a biologia de célula T humana. Aqui, descrevemos um protocolo de fácil utilização, consistente e fiável que nós desenvolvido para introduzir pequenos RNAs sintéticos e ácidos nucleicos bloqueados (LNA, quimicamente modificado ácidos nucleicos com maior estabilidade)em células imunitárias e, especificamente, em células humanas Th17.Existem vários métodos alternativos de introdução de pequenos RNAs em células de mamíferos, os quais geralmente caem em categorias químicas, biológicas, físicas ou 10. métodos químicos normalmente utilizados, incluindo transfecções à base de lípidos e transfecções de fosfato de cálcio, confiaram na criação de complexos de ADN-químicas que são mais eficientemente absorvidos pelas células. Em geral, os métodos químicos não são tão eficazes para a transfecção de células T primárias. O método biológico mais comum é a utilização de um vector virai (por exemplo, retrovus ou lentivus), que insere directamente ARN estranho num hospedeiro como uma parte do seu ciclo de replicação natural. transdução virai tipicamente leva mais tempo para completar, especialmente quando um factores em tempo para a clonagem molecular de plasmeos provirais. Além disso, os vectores de transdução viral pode ser potencialmente prejudicial para os pesquisadores humanos. A electroporação é um m físicaétodo de induzir a permeabilização da membrana, sujeitando as células de impulsos de alta tensão, permitindo que os ácidos nucleicos de introduzir transitoriamente para dentro da célula, onde podem actuar sobre o alvo. instrumentos eletroporação tradicionais não foram eficazes para a transfecção de linfócitos primários. No entanto, a electroporação optimizado próxima geração tem provado ser capaz de transfectar células T na eficiência muito elevada, especialmente quando o material a ser transfectada é ARN pequeno. O termo próxima geração é livremente utilizado para diferenciar as duas plataformas mais recentes (por exemplo, néon, Amaxa) a partir de máquinas de electroporação tradicionais. Além disso, este método é facilmente escalável para telas rendimento moderado com um máximo de cerca de 120 pequenos RNAs de uma única experiência, muitas vezes utilizando reagentes sintéticos validados. Importante, as transfeces de sucesso pode ser conseguida em menos de 16 horas após a activação de células T. A desvantagem deste método, no entanto, é que não resulta em incorpor genómico estável, e é, portanto, transitórios. Por isso, é importante o esforço extra para criar uma construção de expressão estável, que pode ser embalado num vector virai e expresso com sucesso em células T em casos em que é necessária a expressão de longo prazo de um ARN pequeno.
Usámos uma próxima geração de transfecção (por exemplo, de néon) para proporcionar diversas ferramentas sintéticos simples ou de cadeia dupla de RNA ou de oligonucleidos de LNA para diferentes fins de 11, 12, 13. interferência de ARN eficiente pode ser induzida no primário do rato e células T humanas utilizando ARN curta interferente de cadeia dupla (ARNip). Este protocolo descreve condições optimizadas para a utilização desta técnica em culas Th17 humanos. Além de siRNAs, disponíveis comercialmente imita miARN sintéticos e inibidores podem ser usados para estudar o ganho de miARN e perda de função. imita miARN são moléculas de cadeia dupla de RNA muito semelhantes para os siRNAs, mas designed, com a sequência de miARNs maduros endógenos. inibidores de miARN são quimicamente modificados individuais oligonucleótidos de cadeia de ARN e / ou de LNA base que se ligam a miARNs nativas e antagonizam a sua função. Descobrimos que todas estas ferramentas podem ser usadas de forma eficaz em linfócitos T primárias cultivadas, incluindo mas não limitado a células Th17 humanos.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes da UCSF de Ética em Pesquisa humanos.
1. Preparação de Culturas de Células T, Isolamento de células T CD4 +, e Th17 Polarização
- No Dia 0, revestimento 6-se placas de cultura de tecido com 1,5 mL por po de anticorpo anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C.
- Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme.
- Preparar as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMCs) por centrifugação em gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante.
CUIDADO: Trabalhar com cuidado e garantir equipamentos de proteção individual (EPI) é usado quando manusear sangue humano para evitar qualquer risco de exposição a patógenos sanguíneos. - Uma vez que as células mononucleares foram isoladas e lavadas, efectuar o isolamento de células CD4 + T humanas por sele negativocção, utilizando um kit comercial de células CD4 + T humana.
NOTA: Se há contaminação de glóbulos vermelhos após o isolamento de células mononucleares, uma lise de células de sangue vermelho opcional pode ser realizado antes das etapas de isolamento de células T CD4 +. Ressuspender as células mononucleares em 1 ml de tampão de isolamento (2% de FBS em PBS). Adicionar 5 ml de solução de lise 1x. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionam-se 5 mL de tampão de isolamento e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células.- Ressuspender as células mononucleares a uma densidade de 50 x 10 6 por 500 uL no tampão de isolamento em um novo tubo de 5 ml.
- Adicionar 100 uL de SBF e 100 mL da mistura do Anticorpo por tubo, em seguida, incuba cada tubo a 4 ° C durante 20 min num agitador orbital, para misturar bem.
- Após a incubação, adicionar 3-4 mL de tampão de isolamento para lavar as células. Centrifugar as células a 300 xg durante 8 min a 4 ° C para sedimentar as células. Aspirar cuidadosamente a supernatant.
- Durante esta rotação, pré-lavar as esferas magnéticas. Transferir a quantidade desejada de esferas magnéticas para um novo tubo (utilizada a 1: 1 com as células) e adicionar um volume igual de tampão de isolamento para lavar as contas. Misturar bem utilizando uma micropipeta 1 ml e, em seguida, colocar o tubo no íman durante pelo menos 1 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as esferas magnéticas no mesmo volume inicialmente transferida antes da lavagem.
- Ressuspender as células em cada tubo com 500 ul de tampão de isolamento e adicionar 500 uL de pérolas magnéticas pré-lavadas.
- Incubar as células com as pérolas magnéticas durante 15 min num agitador orbital à temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para misturar bem.
- Após a incubação, as células completamente pipeta usando uma micropipeta 1 ml, pelo menos, 10 vezes. Em seguida, adicionar 3-4 mL de tampão de isolamento e colocar cada tubo no íman durante 2 min.
- Transferir cuidadosamente as células T CD4 + negativamente seleccionadas que estão emo sobrenadante para um novo tubo.
- Uma vez que o isolamento de células T CD4 + está concluída, a contagem das células com um hemocitómetro e manter as células em gelo.
- Lavam-se as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 1,5 mL de 2x mistura de meios Th17-polarização a cada poço: IFNy anti-humano (20 ug / ml), anti-IL-4 humana (20 ug / mL), TGF-p humano (10 ng / mL), humano IL-1β (40 ng / mL), IL-23 (40 ng / mL), IL-6 humana (50 ng / mL) diluídos em um meio de base livre de soro (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 100? M de 2-mercaptoetanol).
NOTA: Transfecção e interferência de ARN funciona em meios contendo soro. A finalidade da utilização de meios isentos de soro com este protocolo é conseguir uma melhor produção de IL-17A. - Centrifugar as células T CD4 + humanas a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células. Aspirar cuidadosamente o Supernatformiga. Em seguida, voltar a suspender as células em meios de base livre de soro e placa as células a uma densidade de 3 x 10 6 em 1,5 mL por poço, de modo que o volume final é de 3 mL por cavidade e citocinas polarizadoras estão agora a uma concentração final de 1x.
- Colocar as placas em 5% de CO2, 37 ° C incubador durante dois dias.
2. Células de electroporação in vitro polarizada Th17 Humana
- No Dia 2, revestimento de 48 placas de cultura de tecidos com 250 por po de anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C.
- Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme.
- Preparar pequenos RNAs para transfecção. Para cada transfecção, alíquota de 1 mL de uma solução stock de 5? M de siARN para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incluir apropriado pequena contr RNA-correspondida químicaol. Mantenha todos os tubos no gelo.
- Lavam-se as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 500 mL de 1X Th17-polarizando meios de comunicação a cada poço: IFNy anti-humano (10 ug / ml), anti-IL-4 humana (10 ug / mL), TGF-p humano (5 ng / mL), IL-humano 1β (20 ng / mL), IL-23 (20 ng / mL), IL-6 humana (25 ng / mL) diluídos em um meio de base livre de soro (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 100? M de 2-mercaptoetanol).
- Depois das placas de cultura e reagentes de transfecção são preparados, ressuspender as células com uma micropipeta 1 ml, pipetando suavemente, mas garantindo que todas as células são destacadas do fundo dos poços. Reunir as células num tubo cónico e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
NOTA: Para os períodos de cultura mais longos do que o protocolo de quatro dias aqui apresentado, as culas devem ser transfectadas aproximadamente a cada 3 dias usando o mesmo protocolo. Passo 20,4 deve ser modificado no entanto uma vez que as células tratadas com diferentes pequenos RNAs não devem ser recolhidas. Todas as condições a ser testada deve ser recolhidas, contadas, e transfectados separadamente. - Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, e, em seguida, voltar a suspender as células em pelo menos 1 ml de PBS para lavagem. Contar as células Th17 vivo (por exemplo, com um hemocitetro utilizando a exclusão de azul de tripano para avaliar a viabilidade) e, em seguida, transferir as culas para um tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar as células.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender as células utilizando o tampão de ressuspensão fornecida a partir do kit de sistema de transfecção de 10 mL a uma densidade de 2,5-4 x 10 7 culas por ml. Manter as células à temperatura ambiente.
NOTA: Como linha de orientação, tentar preparar apenas como muitas células como pode ser transfectado em 30 min. Vários lotes podem ser comparados. - Adicionar 9 uL de células para 1 L de ARN pequeno em cada MicroCentrifuge tubo. Pipetar uma vez para misturar as células e pequenos RNAs para transfecção, em seguida, carregar para a ponta do eléctrodo da pipeta fornecida.
NOTA: Tipicamente, adicionar 9,5 mL de suspensão de células para garantir que há suficiente da mistura para impedir a criação de bolhas na ponta do eléctrodo da pipeta antes da transfecção. - Encher a tina fornecida com 3 mL de temperatura ambiente electrolico de Tampão E. Coloque a cuvete dentro da estação de pipeta e, em seguida, colocar a pipeta em posição no interior da cuvete.
- electroporate imediatamente cada 10 uL de mistura de células e pequenos RNA usando os seguintes parâmetros: tensão de impulso 1,500-1,550 V, largura de impulso de 10 ms, e 3 impulsos total do dispositivo de transfecção.
- Após a electroporação é completa, adicionar directamente a mistura de células a 500 mL de 1X Th17-polarizando meios em recipientes preparados de uma placa de cultura. Placas lugar em um 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante mais dois dias.
NOTA: Lava-se a ponta do eléctrodo da pipeta por pipetagemcima e para baixo em PBS entre cada transfecção.
3. Células de colheita Th17 Humana
- Ressuspender as células em meio de cultura com uma micropipeta, pipetando suavemente mas garantindo que todas as células são destacadas do fundo dos poços. Preparar as células para ensaios de expressão funcionais e / ou de genes.
NOTA: Rotineiramente, células suficientes são produzidos a partir de um único poço de células Th17 transfectadas para ser utilizado para análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície e de citocina e factor de transcrição ou de coloração intracelular para a preparação de ARN para a análise da expressão do gene.
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Representative Results
O primeiro passo para o desenvolvimento de um sistema fiável de electroporating com sucesso células Th17 humanos era robusta para gerar in vitro diferenciadas culturas de culas Th17 humanos. As células T cultivadas sob condições polarizantes Th17-expressa o receptor de quimiocina CCR6 e o factor de transcrição RORγt (figura 1A, esquerda). Estes marcadores não foram expressas quando as células T foram cultivadas sob condições não polarizadores (THN) (figura 1A, direita). As células T cultivadas sob condições Th17-polarização também produziu IL-17A sobre a re-estimulação (Figura 1B, esquerda), mas não em condições THN (Figura 1B, à direita). Diferenciação Th17 ainda ocorre após a transfecção com pequenos RNAs mas em algumas experiências, não é observada uma redução na frequência da produção de IL-17A (Figura 1C). O efeito de transfecção de ARN pequeno sobre a produção de citoquinas demonstra a importância de ter um pequeno ARN de controlo combinando-química para a comparação dentro de cada experiência. Importante, a viabilidade é mantida após a transfecção com pequenos RNAs e é tipicamente maior do que 70% (Figura 1D).
Para determinar a eficiência deste protocolo, utilizou-se RNA de interferência. O antigénio CD45 é codificada pelo PTPRC (proteína tirosina fosfatase, do receptor de tipo C) do gene. CD45 é expresso em todas as células hematopoiéticas e células Th17, por conseguinte, deve humanos robustamente expressar este marcador de superfície. A transfecção de células Th17 humanos no dia 2 com uma piscina de siRNA alvejando PTPRC reduziu fortemente a expressão de CD45 em comparação com uma química combinado ARNsi de controlo (Figura 2A). Esta mudança população unimodal na expressão de CD45 indica perto de 100% de eficácia de transfecção, típico deste protocolo para pequenos RNAs. Assim, esta é uma importante ferramenta que pode ser usada para avaliar a transfecção efficiency durante optimizações protocolo. RORC codifica RORγt, o factor de transcrição predominante de células Th17 humanos, que regula directamente a produção de IL-17A. Transfeco de culas Th17 humanos em desenvolvimento com uma piscina ARNsi contra RORC reduziu fortemente a expressão RORγt como esperado (Figura 2B). Reduzindo expressão RORγt por RNAi teve um efeito funcional, uma vez que estas células exibiram redução da produção de IL-17A (Figura 2C) em comparação com células transfectadas com um ARNsi de controlo. As células T CD4 + não polarizados não deve expressar qualquer RORγt ou IL-17A e são apresentados como um controlo negativo nesta figura.
Figura 1: in vitro células diferenciadas Th17 humano expresso CCR6, RORγt, e IL-17A. As células T CD4 + humanas T isoladas do sangue do cordão umbilical foram cultivadas undecondições r Th17 (IL-1β, IL-23, IL-6, e TGF-p) ou em condições de não polarizadores (THN) (apenas meios de comunicação, não há citocinas polarizadoras ou anticorpos bloqueadores adicionados) in vitro e analisadas no dia 4 para Th17 marcador expressão por citometria de fluxo: (A) CCR6 superfície de exibição gráficos de contorno representativas e co-colorao RORγt intracelular de culas T CD4 +. Os números nos quadrantes indicam a percentagem CCR6 e / ou células RORγt-positivo vivo singuleto CD4 +. (B) IL-17A e produção de IFNy após re-estimulação com PMA / ionomicina. Os números nos quadrantes indicam a percentagem de IL-17A e / ou singuleto vivo IFN-positivas CD4 + células. (C), representativo de contorno da trama exibe superfície CCR6 e co-colorao RORγt intracelular de culas T CD4 + após a transfecção com ARN de controlo pequena. Os números nos quadrantes indicam a percentagem CCR6 e / ou células RORγt-positivo vivo singuleto CD4 + (esquerda). Representatraçado de contorno tiva exibe IL-17A e produção de IFNy após re-estimulação com PMA / ionomicina de pós-transfecção com ARN de controlo pequena. Os números nos quadrantes indicam a percentagem de IL-17A e / ou singlet vivo IFN-positivas CD4 + células (direita). (D) traçado de contorno representativas mostra a viabilidade de células CD4 + após a transfecção com ARN de controlo pequena. Número indica a percentagem de células CD4 + singlet vivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Interferência de ARN em células primárias Th17 humano. As células T CD4 + humanas de sangue de cordão umbilical cultivadas sob condições Th17 foram transfectadas no dia 2 com um ARNsi de controlo nontargeting (siNeg Ctl) ou piscina direccionamento contra PTPRC (Si PTPRC) ou RORC (Si RORC) compreendendo 4 siRNAs individuais. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo no dia 4: expressão de (A) de CD45 de superfície mostrada em um histograma representativa após transfecção com Si PTPRC (matiz cinzento) ou siNeg CTL (linha preta). Expressão (B) intracelular RORγt é mostrado em um histograma representativa após transfecção com Si RORC (matiz cinzento) ou siNeg CTL (linha preta). (C) apresentar gráficos de contorno representativos de superfície CD4 e o co-coloração RORγt intracelular de culas T CD4 + (painel superior) ou IL-17A e a produção de IFNy após re-estimulação com PMA / ionomicina (painel inferior). Os números nos quadrantes indicam a percentagem de células CD4 + RORγt + ou IL-17A e / ou IFN-positivas células singlet vivo sob condições THN ou Th17 transfectadas com siNeg Ctl ou Si RORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo fornece um método melhorado para a entrega de pequenos RNAs em células Th17 humanos. Embora as células Th17 humanos foram usadas aqui, este método de electroporação com pequenos RNAs pode ser utilizado com outros subconjuntos auxiliar humano primário de T, tais como Th1, Th2, e Tregs. Não tem funcionado bem para as células T CD4 + naive então as células devem ser activadas em cultura antes da transfecção. Para este protocolo, que primeiro optimizado o sistema in vitro de cultura de uma melhor produção de IL-17A. O fator mais importante foi a mídia de base. Descobrimos que meios isentos de soro era superior a culas Th17 humanos meios para melhor induo de IL-17A produzindo contendo soro tradicionais. Uma vez que as células Th17 pode ser gerado com subconjuntos das citoquinas TGF-p, IL-1, IL-23, e IL-6, testou-se diferentes combinações de citoquinas. Neste estudo, foram alcançados mais robusta de produção de IL-17A, quando todas as quatro citocinas polarizadoras foram incluídos. Além disso, optimizado o encurtamento do comprimento dea cultura para garantir que apenas um de transfecção foi necessário durante o período de cultura. Embora este protocolo de quatro dias permite que os resultados sejam gerados mais rapidamente e requer apenas uma transfecção, comprimento de cultura poderia ser aumentado para aumentar ainda mais a produção de IL-17A. Um período de cultura mais longo pode até ser necessário para alcançar a diferenciação óptima de outros subconjuntos de células T primárias. Uma vez que estes transfecções são transitórios, vários transfecções podem ser necessárias ao longo do tempo por períodos de cultura longas. Sugerimos reabastecer reagentes de ARN pequenos após aproximadamente 3 dias de re-electroporating as células com o reagente para impedir a diluição ao longo de várias divisões celulares. Temos feito rotineiramente isso para rato células T CD4 +. Embora seja tecnicamente mais exigente desde que as células em cada condição devem ser recolhidos e contados separadamente, a transfecção é bem sucedido e há efeitos mínimos sobre a viabilidade celular.
Nesses experimentos, as células Th17 humanos,re gerado por meio da cultura in vitro de sangue do cordão umbilical humano. Importante, uma opção alternativa para este ensaio de diferenciação seria a utilização de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Para ambos os CBMCs e PBMC, é necessário para isolar as células T CD4 + antes do início da cultura. Nós apresentamos aqui o nosso método para purificar as células T CD4 + por seleção negativa, o que rendeu a eficiência de transfecção robusta, mas esperamos que outros métodos de preparação de células T CD4 + humanas primárias funcionaria igualmente bem. Tentámos vários kits que utilizam selecção positiva ou negativa para o isolamento de rato células T CD4 + e ambos os métodos têm resultado em eficiência de transfecção similares. Uma consideração adicional é a importância da utilização de células T naive, a fim de diferenciar de forma óptima em células Th17. Usando sangue de cordão humano é vantajoso, por esta razão, pois já tem uma proporção mais elevada de células T ingénuos pressentir-se e, portanto, não é necessário para classificar ou pré-enriquecimento em células T naive antes do início da cultura. No entanto, uma clara desvantagem desta abordagem é a disponibilidade limitada de sangue do cordão umbilical. Em alternativa, a triagem de células T naive a partir de PBMC de 14 pode ser realizada antes da cultura uma vez que este recurso é mais prontamente disponível, embora as grandes quantidades teria de ser obtido.
Embora existam vários métodos para a transfecção de células de mamífero, células T primárias tendem a ser um tipo de célula mais difíceis de transfectar. geração eletroporação próxima é um método físico bem sucedida de células T transitoriamente de transfecção que é tecnicamente fácil de executar e é reproduzível. Uma vez optimizado, tem uma muito alta eficiência de transfecção para pequenos RNAs que se aproxima de 100%. Isto pode ser visto na Figura 2, onde toda a população unimodal de células CD45 + (Figura 2A) e o population de todas as células que expressam RORγt deslocamento (Figura 2B) para um nel de express mais baixo. Importante ainda, a transfeco optimizada com pequenos RNAs não compromete a viabilidade celular. Rotineiramente observar maior do que 70% de viabilidade pós-transfecção com ARN pequenos (Figura 1D). Embora viabilidade não é um problema com este protocolo, a biologia de outras características de células T, tais como produção de citocinas, podem ser afectados após transfecção com pequenos RNAs. Por esta razão, é criticamente importante usar um controlo de RNA pequeno correspondeu-química em cada experiência.
Nós optimizado a dois parâmetros de electroporação, pulso e tensão, para minimizar a morte celular e maximizar a eficiência da transfecção. Tensões mais elevadas aumentam a morte celular durante a transfecção. Algumas outras considerações técnicas para prevenir a morte celular e assegurar a transfecção bem sucedida incluem minimizando a quantidade de reagentes sintéticos utilizados e limitando o tempo de entr preparação de células n e electroporação. As concentrações mínimas necessárias para os reagentes de transfecção sintéticas devem ser sempre usadas para prevenir a toxicidade potencial de células T e os efeitos fora do alvo. Reduzindo o tempo de preparação de células antes da transfecção para minimizar o tempo de células em tampão de transfecção, a temperatura ambiente é crucial e pode ser alcançado através da preparação de células em lotes, se necessário.
Atualmente, existem dois instrumentos eletroporação próxima geração disponíveis no mercado. Ambos os sistemas podem eficientemente transferir células T primárias. Este protocolo foi optimizado utilizando o sistema de transfeco de néon. Embora este sistema de transfecção é mais rentável, o sistema oferece Amaxa exclusivamente um adaptador de 96 poços para electroporação para aplicações rendimento mais elevados. Esperamos que os avanços comerciais adicionais continuarão a aumentar o rendimento e eficiência destes sistemas de transfecção, mantendo custos no mínimo.
"> Geração electroporação Próximo das células T humanas pode eficientemente introduzir pequenos RNAs incluindo os siRNAs contra genes alvo de interesse, tal como exemplificado no presente protocolo, bem como mímicos de miARN ou inibidores. A eficiência elevada faz com que seja desnecessário o uso de marcadores de transfecção uma vez que quase todas as células é transfectadas com pequenos RNAs. Isto está em contraste com a transfecção de células T primárias com plasmídeos de ADN em que as transfecções de plasmídeos típicos resultam em apenas 20-30% de expressão do gene marcador com uma toxicidade superior a 50% que aumenta com quantidades crescentes de plasmeo. Introduzindo imita sintéticas usando este método tem permitido para dúzias de genes a serem pesquisados para a função na biologia das células T em paralelo, sem qualquer necessidade de clonagem molecular 12, 13. É também permitiu testes para a função de todos os miARNs expresso por células T em paralelo 11 , 13. Com este protocolo, Estes tipos de telas rendimento moderado são aplicáveis a células T humanas. Notavelmente, esta técnica foi recentemente utilizada para introduzir ARN pequenos (gRNA) complexos de ribonucleoproteína -Cas9 em células T humanas primárias para edição genoma 15. Estas aplicações diversas destacar a utilidade, flexibilidade e potência do protocolo aqui apresentado como uma ferramenta importante para imunologistas procuram para estudar biologia celular T.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x | BD biosciences | 555899 | Must make 1x solution with distilled water prior to use |
References
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