Introduction
CD4 + T hücreleri adaptif bağışıklık tepkisinin önemli Orkestraya bulunmaktadır. Naif CD4 + T hücreleri, birkaç farklı efektör T hücrelerinin (örneğin Th 1, Th2 Th17, vs.) halinde gelişme yetisine sahip olan, yerel mikro 1 bağlı olarak karakteristik bir sitokinler ve transkripsiyon faktörleri, kendi seti, her biri. T hücreleri yapmak soy kararları kendine hem koruyucu bağışıklığın ve hoşgörü için önemlidir. Th17 hücreleri hücre-dışı bakteriler ve mantarlar ile mücadele için bilinen T hücrelerinin bir alt kümesi, ancak bunların uygun olmayan tepkiler aynı zamanda, mültipl skleroz ve psoriasisin 2, 3 gibi çok otoimmün ve inflamatuar hastalıkların patogeneziyle edilir. İnsan Th17 hücreleri uygun bir polarizasyon çevre 4 sağlayarak, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir. Vario sitokinlerin bize kombinasyonları, IL-1β, IL-23, TGFp, ve IL-6, insan Th17 hücrelerinin gelişimi için kullanılmıştır. İnsan Th17 hücreleri CCR6 yaygın olarak bu hücre popülasyonu tespit etmek için kullanılır ve esas transkripsiyon faktörü (RORC tarafından kodlanan) RORγt 5, 6 ekspresyonu ile tanımlanır bir kemokin reseptörünü eksprese eder. Th17 hücreler birden fazla sitokinleri ifade etme yeteneğine sahiptir, ancak, IL-17A, bu hücreler tarafından üretilen soy tanımlayan efektör sitokindir. Biz, insan Th17 in vitro farklılaşma deneyinde sağlamlığını belirlemek için her üç Th17-ilişkili markörler (CCR6, RORγt IL-17A) ifadesini inceledi. Buna ek olarak, bu, Th17 markerlerin ekspresyonu çok düşük ya da sıfır olması gerektiği için hiçbir sitokinler ya da bloke edici antikorlar, bir negatif kontrol olarak kullanmak için, kültür ortamına ilave edildi olmayan polarizasyon koşulları altında, insan CD4 + T hücrelerinin kültive edilmiştir.
ve_content "> normal insan T hücresi gelişimini ve biyolojisi okumak için bir yolu, gelişimi esnasında gen ekspresyonunu değiştirmek için. Kısa müdahale RNA (siRNA) protein kodlayıcı mRNA'ları hedefleyebilir ve spesifik gen ekspresyonunu azaltmak için kullanılabilir sentetik küçük RNA molekülleridir . MikroRNA'lar (miRNA'lar) post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu modüle etmek için bilinen bir endojen kodlayıcı olmayan küçük RNA'larıdır. miRNA'lann Th17 hücreleri 7, 8, 9, de dahil olmak üzere, murin ve insan T hücresi biyolojisi hem de önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu gen ifadesi ve nihayetinde insan T hücre biyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için insan T hücrelerinde küçük RNA aktivitesini manipüle güvenilir yöntemler olması çok önemlidir. Burada, biz tanıştırmak için geliştirilen bir, kullanımı kolay, tutarlı ve güvenilir protokol açıklar küçük sentetik RNA ve kilitli nükleik asitleri (LNA'lar, kimyasal stabilite artışı olan modifiye edilmiş nükleik asitleri)bağışıklık hücrelerine ve özellikle insan Th17 hücrelerine.Genel olarak, kimyasal, biyolojik veya fiziksel kategoriye 10 girer memeli hücrelerine dahil etmek küçük RNA'ların sokulması çeşitli alternatif yöntemler vardır. lipid bazlı transfeksiyonları ve kalsiyum fosfat transfeksiyonlar dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan kimyasal metotlar, daha etkili bir şekilde hücreler tarafından alınır kimyasal DNA kompleksleri temel almaktadır. Genel olarak, kimyasal yöntemler, birincil T hücrelerinin transfeksiyonu için etkili değildir. En yaygın biyolojik yöntem doğrudan doğal replikasyon döngüsünün bir parçası olarak bir konakçıya yabancı RNA ekler bir viral vektör (örneğin, retrovirüs veya lentivirüs) kullanmaktır. Viral transdüksiyon tipik olarak bir proviral plazmid moleküler klonlanması için zaman dahil edilen, özellikle tamamlamak için daha uzun sürer. Buna ek olarak, virüs transdüksiyon vektörleri, insan araştırmacılar için zararlı olabilir. Elektroporasyon fiziksel mNükleik asitler, geçici olarak kendi hedef üzerinde hareket edebilir hücre içine girmesine izin verir, yüksek voltaj darbeleri hücreleri tabi tutulması ile membran geçirgenliği indükleme bu yöntemde. Geleneksel elektroporasyon araçlar primer lenfositler transfekte etmek için etkili değildi. Bununla birlikte, optimum nesil elektroporasyon malzeme küçük RNA'dır Transfekte edilecek, özellikle de çok yüksek bir verimle, T hücrelerini transfekte edebilen olduğu kanıtlanmıştır. Terimi, yeni nesil gevşek geleneksel elektroporasyon makineleri ile iki yeni platformları (örneğin, neon, Amaxa) ayırt etmek için kullanılır. Buna ek olarak, bu yöntem tek bir deneyde yaklaşık 120 küçük RNA, kadar, genellikle geçerli sentetik reaktif maddeler kullanılarak orta derecede verimli taramalara kolayca ölçeklendirilebilir. Önemli olarak, başarılı bir şekilde transfeksiyon, T hücresi aktivasyonundan sonra az 16 olarak saat içinde elde edilebilir. Bu yöntemin dezavantajı, ancak stabil genomik incorporati neden olmamasıdırüzerinde ve dolayısıyla geçicidir. Bu nedenle, bu şekilde bir viral vektör içine paketlenmiş ve başarılı bir şekilde küçük bir RNA uzun süreli ekspresyonu gereken durumlarda T-hücrelerinde ifade edilebilir dengeli bir ifade yapısı oluşturmak için ilave çaba değerdir.
Farklı amaçlarla 11, 12, 13 için çeşitli sentetik tek veya çift-sarmallı RNA ya da LNA oligonükleotid araçlar sağlamak için, yeni nesil bir transfeksiyon (örneğin, neon) kullandık. Etkin RNA interferans çift sarmallı kısa karışan RNA (siRNA) kullanılarak primer fare ve insan T-hücrelerinde indüklenebilir. Bu protokol, insan Th17 hücrelerinde bu tekniği kullanarak için optimize koşulları açıklar. siRNA'lar ek olarak, ticari olarak temin edilebilen sentetik MiRNA taklit ve inhibitörler MiRNA kazanç ve fonksiyon kaybı incelemek için kullanılabilir. MiRNA taklit siRNA'lar çok benzer iki-şeritli RNA molekülü, ancak designeEndojen olgun miRNA'lann dizisi ile d. MiRNA inhibitörleri doğal miRNA'lara bağlanan ve fonksiyonunu antagonize RNA ve / veya LNA göre tek zincirli oligonükleotidler kimyasal olarak modifiye edilir. Biz bu araçların tümü dahil, kültürlü birincil T lenfositler etkin kullanılan ancak insan Th17 hücreleri ile sınırlı değildir edilebileceğini bulmuşlardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, insan araştırma etiği için UCSF yönergelerine uyar.
T Hücre Kültürü, CD4 + T hücrelerinin elde edilmesi, ve, Th17 polarizasyon hazırlanması 1.
- Gün 0, CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 1.5 mL ile kat 6 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C.
- Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C'de plakalar. parafilm plakaları sarın.
- üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyan santrifüjü ile kordon kan mononükleer hücreleri (CBMCs) hazırlayın.
DİKKAT: dikkatle çalışın ve kan yoluyla bulaşan patojenlere maruz kalma riskini önlemek için insan kanı tutarken aşınmış uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) sağlamak. - Tek çekirdekli hücreler izole edilmiş ve yıkanmış sonra, negatif sele insan CD4 + T hücresi izolasyon yerinection ticari bir insan CD4 + T hücre kiti kullanılarak.
Not: mononükleer hücre izole edildikten sonra, kırmızı kan hücresi kontaminasyon olması durumunda, isteğe bağlı bir kırmızı kan hücre parçalama, CD4 + T hücresi izolasyon adımları önce gerçekleştirilebilir. yalıtım tamponu (PBS içinde% 2 FBS) 1 mL mononükleer hücrelerin tekrar. 1x yokedici çözeltisi 5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra pelet hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de izole tamponu ve santrifüj 5 ml.- Yeni 5 mL'lik bir tüp içerisinde izolasyon tamponunda 500 uL başına 50 x 10 6 yoğunluğunda tek çekirdekli hücreleri tekrar.
- FBS, 100 uL ve sonra iyice karışana kadar bir orbital çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca 4 ° C 'de, her tüp inkübe tüp başına Antikor Mix 100 uL ekleyin.
- İnkübasyondan sonra, Hücreleri yıkamak için izolasyon tamponunda 3-4 ml. pelet hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 300 x g'de hücreleri santrifüjleyin. Dikkatle supe aspirernatant.
- Bu dönüş sırasında, manyetik boncuk önceden yıkayın. (1 kullanılmıştır: hücreler ile 1), yeni bir tüp içine manyetik boncuk istenilen miktarda aktarın ve boncuk yıkamak için izolasyon tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin. 1 ml mikropipet kullanılarak İyice karıştırın ve daha sonra en az 1 dakika için mıknatıs tüp yerleştirin. Dikkatle süpernatant aspire. ilk yıkama öncesinde transfer aynı hacimde manyetik boncukları süspanse.
- izolasyon tamponunda 500 ul her bir tüp içinde hücrelerin tekrar ve önceden yıkanmış manyetik boncuk 500 uL ekleyin.
- iyice karıştırmak için oda sıcaklığında (25 ° C, 18 ° C) bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca manyetik boncuklarla inkübe hücreleri.
- İnkübasyondan sonra, iyice 1 ml mikropipet en az 10 kez kullanarak hücreleri pipetleyin. Daha sonra yalıtım tamponu 3-4 ml ilave edilir ve 2 dakika süre ile mıknatıs her tüp yerleştirin.
- Dikkatle içindedir olumsuz seçilen CD4 + T hücreleri transferiyeni bir tüpe yüzer.
- CD4 + T hücre izolasyonu tamamlandıktan sonra, hemositometre ile hücrelerin sayısı ve buz üzerinde hücreleri tutun.
- PBS ile antikor kaplı plakalar iki kez yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa, Th17-polarize edici ortam 1.5 mL 2x karışımı ekleyin: Anti-insan IFN-y (20 ug / ml), anti-insan IL-4 (20 ng / ml), insan TGF (10 ng / ml), insan IL-1β (40 ng / ml) insan IL-23 (40 ng / ml) insan IL-6 (50ng / ml) her 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş serumsuz bir baz ortam (seyreltilmiş 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat ve 100 uM 2-merkaptoetanol).
Not: Transfeksiyon ve RNA interferans serum ihtiva eden ortam içinde çalışır. Bu protokol ile serumsuz ortam kullanılarak amacı daha, IL-17A üretimini sağlamaktır. - Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de insan CD4 + T hücreleri, topak hücrelere. Dikkatle supernat aspirekarınca. Daha sonra nihai hacim oyuk başına 3 ml ve polarize sitokinler 1x nihai konsantrasyonda şimdi de o kadar başına 1.5 mL içinde 3 x 10 6 bir yoğunlukta hücreler serumsuz baz ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve plaka.
- % 5 CO2, iki gün boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin.
2. Elektroporasyon in vitro Polarize İnsan Th17 Hücreleri
- 2. günde CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 250 uL ile kat 48 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C.
- Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C'de plakalar. parafilm plakaları sarın.
- Transfeksiyon için küçük RNA'lar hazırlayın. Her transfeksiyon için, bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine bir siRNA 5 uM stok çözeltisi alikosu 1 uL. Uygun kimyasal eşlemeli küçük RNA Contr dahilol. buz üzerinde tüm tüpleri tutun.
- PBS ile antikor kaplı plakalar iki kez yıkayın. İnsan TGF (5 ng / ml) insan IL-anti-insan IFN-y (10 ug / ml), anti-insan IL-4 (10 ng / ml): O 500 uL 1X her bir oyuğa ortamı Th17-polarize ekleyin 1β (20 ng / ml) insan IL-23 (20 ng / ml) insan IL-6 (25 ng / ml) her 2 mM L-glutamin, 100 U ile takviye edilmiş serumsuz bir baz ortamında (seyreltildi / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum piruvat ve 100 uM 2-merkaptoetanol).
- kültür plakaları ve transfeksiyon reaktifleri hazırlandıktan sonra, 1 ml mikropipet, pipetle hücreler yavaşça ama tüm hücreler kuyularının tabanından ayrılmış sağlamaktan yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri havuzda toplayın.
NOT: Burada sunulan dört günlük protokolü daha uzun kültür dönemleri için hücreler bu aynı protokolü kullanan her 3 günde yaklaşık transfekte edilmelidir. Adım 2Farklı küçük RNA ile tedavi edilen hücreler toplanmış olmamalıdır çünkü .4 ancak modifiye edilmelidir. test edilen durumların hepsi toplanmış, sayılmış ve ayrıca transfekte edilmesi gerekir. - Dikkatle süpernatanı havalandırın, ve daha sonra yıkama PBS en az 1 mL hücreleri tekrar süspansiyon. Ve daha sonra bir mikro santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak (canlılığını değerlendirmek için Tripan Mavi dışlama kullanarak hemositometre ile örneğin) canlı Th17 hücre sayımı.
- pelet hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin.
- Dikkatle süpernatanı havalandırın, ve daha sonra mL başına 2.5-4 x 10 7 hücre yoğunluğunda transfeksiyon sistemi 10 uL kit temin yeniden süspansiyon tamponu kullanılarak tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında hücreleri tutun.
NOT: Bir kural olarak, 30 dakika içinde transfekte edilebilir olarak sadece kadar çok hücreler hazırlamak deneyin. Çoklu toplu karşılaştırılabilir. - Her microC küçük RNA'nın 1 uL hücre 9 uL ekleyinentrifuge tüpü. Pipet sonra bir kez verilen pipet elektrot ucu yüklemek hücreler transfeksiyon için ve küçük RNA'ların karıştırın.
Not: Genellikle, transfeksiyondan önce pipeti elektrot ucu kabarcıklar oluşturmak önlemek için karışımın yeterli olduğundan emin olmak için, hücre süspansiyonunun 9.5 uL ekleyin. - Oda sıcaklığında Elektrolitik Tampon E İlan 3 mL pipet istasyon içinde küvet sahip küveti doldurun ve sonra küvet içindeki bir konumda içine pipet yerleştirin.
- Hemen aşağıdaki parametreler kullanılarak hücreler ve küçük RNA her biri 10 uL karışımı electroporate: Darbe gerilimi 1,500-1,550 V, nabız 10 ms genişlik ve 3 bakliyat transfeksiyon cihazda toplam.
- elektroporasyon işlemi tamamlandıktan sonra, doğrudan doğruya 1X bir kültür plakasının hazırlanmış kuyu ortamı Th17-polarize 500 uL hücre karışımı ekleyin. % 5 CO2, iki gün boyunca 37 ° C inkübatör içinde bir yer plakalar.
NOT: pipetleme pipet elektrot ucu yıkayınyukarı ve aşağı PBS içinde her bir transfeksiyon arasında.
3. Hasat İnsan Th17 Hücreleri
- hafifçe pipetleme ancak tüm hücreler kuyularının tabanından ayrılmış sağlamak, bir mikropipet ile kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. işlevsel ve / veya gen ekspresyonu deneyleri için hücreler hazırlayın.
Not: Rutin olarak, yeterli miktarda hücrelerin transfekte Th17 hücreleri tek bir kuyudan elde edilir yüzey işaretleyici ve hücre içi sitokin ve transkripsiyon faktör boyama akış sitometri analizi için veya gen ekspresyon analizi için RNA hazırlanması için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir şekilde insan Th17 hücrelerini elektroporat güvenilir bir sistem geliştirmek için ilk adım nitro farklılaşmış insan Th17 hücre kültürlerinde sağlam oluşturmak oldu. Th17-polarize koşullar altında kültür T hücreleri kemokin reseptörü CCR6 ve transkripsiyon faktörü RORγt (Şekil 1A, sol) olarak ifade edilmiştir. T hücreleri (sağ Şekil 1A) olmayan polarizasyon (THN) koşullar altında kültüre edildiği zaman Bu işaretleyiciler olarak ifade edilmedi. Th17-polarize koşullar altında kültür T hücreleri de tekrar uyarım üzerine, IL-17A üretilen ama THN koşullarında (Şekil 1B, sağ) (sol Şekil 1B). Th17 farklılaşma hala küçük RNA'ların ile transfeksiyondan sonra ortaya çıkar, ancak bazı deneylerde, IL-17A üretim sıklığı (Şekil 1C) içinde gözlemlenen bir azalma vardır. sitokin üretimi ile ilgili küçük RNA transfeksiyonun etkisi, zayıf olmakla birlikte baskı göstermektedirHer deney içinde karşılaştırma için bir kimya eşlemeli küçük RNA kontrol sahip tance. Önemli olarak, canlılığı küçük RNA ile transfeksiyondan sonra muhafaza edilir ve tipik olarak% 70'den daha fazla (Şekil 1D) olup.
Bu protokolün etkinliğini belirlemek için, RNA girişimi kullanılır. CD45 antijeni (protein tirozin fosfataz, reseptör tip C) geni PTPRC tarafından kodlanır. CD45 bütün hematopoietik hücreler üzerinde eksprese edilir ve bu nedenle insan Th17 hücreleri sağlam bu yüzey işaretleyici ifade etmelidir. PTPRC hedefleyen bir siRNA ile günde 2 insan Th17 hücrelerinin transfeksiyonu güçlü bir kimya ile karşılaştırıldığında CD45 ekspresyonunun kontrol siRNA'yı (Şekil 2A) eşleşen azalttı. CD45 ekspresyonu bu tek modlu nüfus kayma küçük RNA için bu protokolün tipik% 100 transfeksiyon verimi, yakın gösterir. Böylece, bu transfeksiyon eff değerlendirmek için kullanılabilecek önemli bir araçtırprotokol optimizasyonlar sırasında nasıl etkin. RORC RORγt,, IL-17A üretimini regüle eden insan Th17 hücreleri baskın transkripsiyon faktörünü kodlar. (Şekil 2B), beklendiği gibi RORC karşı bir siRNA ile gelişen insan Th17 hücrelerin transfekte güçlü RORγt ekspresyonu azalır. Sergiledi, bu hücreler, bir kontrol siRNA ile transfekte edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında, IL-17A üretimini (Şekil 2C), düşük olarak RNAi tarafından azaltılması RORγt ifadesi, bir fonksiyonel etkisi vardı. Polarize olmayan CD4 + T hücrelerinin bir RORγt ya da IL-17A ifade olmamalıdır ve bu şekilde bir negatif kontrol olarak gösterilmektedir.
Şekil 1: nitro, iyi farklılaştırılmış insan Th17 Hücreleri Hızlı CCR6, RORγt ve IL-17A olarak. Göbek kordonu kanından izole insan CD4 + T hücreleri unde kültürlendir, Th17 koşulları (IL-1β, IL-23, IL-6 ve TGFP) ya da olmayan polarizasyon (THN) koşullarında (ortam, yalnızca polarizasyon sitokinler ya da ilave antikorların engelleme) in vitro ve in Th17 marker için günde 4 üzerinde analiz akış sitometrisi ile ifadesi: (A) Örnek kontur planlarıdır ekran yüzeyi CCR6 ve CD4 + T hücrelerinin, hücre içi RORγt ko-boyama. Kadranlarda Sayılar yüzde CCR6 ve / veya RORγt pozitif canlı tekli CD4 + hücreler gösterir. (B), PMA / iyonomisin ile yeniden güdülemeden sonra, IL-17A ve IFNy üretimi. Kadranlarda Sayılar yüzde IL-17A ve / veya IFN-y-pozitif canlı tekli CD4 + hücreleri göstermektedir. (C), Örnek sınır grafiğidir görüntüler küçük RNA kontrolü ile CCR6 ve CD4 + T hücrelerinin, hücre içi RORγt ko-boyama sonrası transfeksiyon yüzey. Kadranlarda Sayılar yüzde CCR6 işaret ve / veya RORγt pozitif canlı tekli CD4 + hücreleri (solda). representative sınır grafiğidir küçük RNA kontrolü sonrası transfeksiyon iyonomisin PMA / ile yeniden güdülemeden sonra, IL-17A ve IFN-y üretimini göstermektedir. Kadranlarda Sayılar yüzde IL-17A ve / veya IFN-y-pozitif canlı tekli CD4 + hücreleri (sağda) gösterir. (D) Örnek sınır grafiğidir CD4 + hücrelerinin canlılığı küçük RNA kontrolü ile transfeksiyondan gösterir. Numara yüzde CD4 + canlı tekli hücrelere işaret eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: Primer insan Th17 Hücrelerinde RNA Interference. Th17 koşullar altında kültür göbek kordonu kanı İnsan CD4 + T hücrelerinin bir siRNA nontargeting kontrol (siNeg CTL) ya da hedefleme havuz karşı ile 2 gün transfekte edilmiştir PTPRC (si PTPRC) ya da RORC (si RORC) 4 ayrı siRNA'ları içermektedir. Si PTPRC (gri ton) veya siNeg CTL (siyah çizgi) ile transfeksiyondan sonra temsili bir histogramda gösterilen (A), yüzey CD45 ekspresyonu: Hücreler daha sonra sitometrisi 4. günde akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (B) Hücre içi RORγt sentezleme si RORC (gri ton) veya siNeg CTL (siyah çizgi) ile transfeksiyondan sonra temsili bir histogramı gösterilmektedir. (C), Örnek kontur planlarıdır PMA / iyonomisin (alt panel) ile yeniden güdülemeden sonra yüzey CD4 ve CD4 + T hücrelerinin, hücre içi RORγt ko-lekeleme (üst panel) ya da IL-17A ve IFN-y üretimini gösterir. Kadranlarda sayılar siNeg CTL veya si RORC ile transfekte THN veya Th17 koşullar altında yüzde CD4 + RORγt + ya da IL-17A ve / veya IFN-y-pozitif canlı tekli hücreleri gösterir.fig2large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, insan Th17 hücrelerine küçük RNA verilmesi için geliştirilmiş bir yöntemi temin etmektedir. İnsan Th17 hücreleri burada kullanılmış olsa da, küçük RNA ile elektroporasyon bu yöntem, Th1, Th2 ve Tregs gibi primer insan T yardımcı alt grupları, birlikte kullanılabilir. Hücreler transfeksiyondan önce kültür içinde etkinleştirilmiş olmalıdır böylece saf CD4 + T hücreleri için, iyi sonuçlar vermemiştir. Bu protokol için, ilk olarak daha iyi bir IL-17A üretimi için in vitro kültür sistemi optimize edilmiştir. En büyük etken baz medya oldu. O serumsuz ortam geleneksel serum içeren üretilmesi, IL-17A daha indüksiyonu için ortam, insan Th17 hücrelerine daha üstün olduğunu gördük. Th17 hücreler, sitokinlerin TGF IL-1β, IL-23 ve IL-6'nın alt grupları ile oluşturulabilir için, farklı sitokin karışımları test edilmiştir. Dört polarizasyon sitokinler dahil edilmiştir, bu çalışmada, daha sağlam, IL-17A üretimini sağlamıştır. Ayrıca, kısaltılmasının optimizeKültür tek transfeksiyon kültür süresi boyunca gerekli sağlamak. Bu dört günlük protokol sonuçları daha hızlı üretilir ve tek bir transfeksiyon gerektirir sağlar iken, kültür uzunluğu ayrıca IL-17A üretimini artırmak için değişmeyecektir. Daha uzun bir kültür döneminde, hatta diğer primer T hücre alt optimal farklılaşma elde etmek için gerekli olabilir. Bu transfeksiyon, geçici olduğu, birden fazla transfeksiyon uzun kültür dönemleri için zaman içinde gerekli olabilir. Birden fazla hücre bölünmesi üzerinden seyreltme önlemek için reaktif ile hücrelerin yeniden electroporating yaklaşık 3 gün sonra küçük RNA reaktifler ilave etme öneriyoruz. Biz rutin olarak fare CD4 + T hücreleri için yaptım bunu. Her durumda hücreler ayrı ayrı toplanır ve sayılmalıdır beri daha teknik açıdan zor olsa da, transfeksiyon başarılıdır ve hücre canlılığı üzerinde minimal etkileri vardır.
Bu deneylerde, insan Th17 hücreleri bizinsan göbek kordonu kanı in vitro kültürü yoluyla üretilen yeniden. Önemli olarak, bu farklılaşma deneyinde için alternatif bir seçenek, insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) kullanmak olacaktır. Her iki CBMCs ve PBMC'ler için, kültür başlangıcından önce CD4 + T hücreleri izole etmek için gereklidir. Bu sağlam bir transfeksiyon verimi vermiştir negatif seçim ile CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması için burada yöntem mevcut, ancak aynı derecede iyi çalışır primer insan CD4 + T hücreleri hazırlamak için olan diğer yöntemler bekliyoruz. Biz benzer bir transfeksiyon verimi ile sonuçlanmıştır fare CD4 + T hücreleri ve her iki yöntem izolasyonu için pozitif ya da negatif seçim kullanan birkaç kit çalıştılar. Başka bir değerlendirme optimal Th17 hücrelerine dönüştürmek amacıyla saf T hücreleri kullanılarak önemidir. İnsan göbek kordonu zaten naif T hücreleri p daha yüksek bir oran, çünkü bu nedenle avantajlıdırtepki gösterir ve bu nedenle, sıralamak ya da kültür başlangıcından önce saf T hücreleri için önceden zenginleştirmek için gerekli değildir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın bir dezavantajı, açık göbek kordonu kanı sınırlı mevcudiyetidir. Bu kaynak daha kolay elde edilebilir, çünkü büyük miktarlarda elde edilmesi gerekir, ancak alternatif olarak, PBMC 14 saf T hücrelerinin sıralama, kültür öncesinde gerçekleştirilebilir.
Memeli hücrelerini transfekte etmek için birden çok yöntem vardır, ancak birincil T hücreleri transfekte etmek için daha zor bir hücre tipi olma eğilimindedir. Yeni nesil elektroporasyon gerçekleştirmek için teknik olarak kolay ve tekrarlanabilir bir geçici transfekte T hücrelerinin başarılı bir fiziksel bir yöntemdir. optimize sonra,% 100'e küçük RNA için transfeksiyon çok yüksek bir etkinliğe sahiptir. Bu durum Şekil 2'de görülebileceği CD45 + hücreleri (Şekil 2A) ve po tüm tek modlu nüfusdaha düşük bir ekspresyon düzeyine RORγt (Şekil 2B) kayma ifade eden tüm hücrelerin pulation. Önemli olan, küçük RNA'lar ile optimize transfeksiyon hücre canlılığını ödün vermez. Rutin olarak küçük RNA (Şekil 1D) ile% 70'den daha fazla canlılık sonrası transfeksiyon izleyin. canlılığı Bu protokol, sitokin üretimi ve diğer T hücresi özellikleri, biyolojisi ile ilgili bir sorun olmamakla birlikte, küçük RNA ile transfeksiyondan sonra etkilenebilir. Bu nedenle, her deneyde bir kimya eşleştirilmiş küçük RNA kontrolünü kullanmak son derece önemli.
Biz hücre ölümünü minimize ve transfeksiyon etkinliğini maksimize etmek için, iki elektroporasyon parametreleri, nabız ve gerilim optimize. Yüksek gerilimler transfeksiyon sırasında hücre ölümünü artırır. Diğer bazı teknik hususlar hücre ölümünü önlemek ve başarılı transfeksiyon kullanılan sentetik reaktiflerin miktarının en aza indirilmesi ve zaman betwee sınırlayıcı içerir sağlamak n, hücre hazırlama ve elektroporasyon. Sentetik transfeksiyon reaktifleri için gerekli minimum konsantrasyon her zaman potansiyel T hücre toksisitesi ve hedef dışı etkileri önlemek için kullanılmalıdır. Oda sıcaklığı önemlidir ve gerektiğinde, toplu olarak hücrelerin hazırlanması ile elde edilebilir transfeksiyon öncesinde hücre hazırlama süresini azaltma transfeksiyon tamponunda hücrelerin zamanı en aza indirmek.
Şu anda, iki ticari olarak temin edilebilen yeni nesil elektroporasyon araçlar vardır. Bu sistemlerin her ikisi de etkili bir şekilde birincil T hücreleri transfekte edilebilir. Bu protokol neon transfeksiyon sistemi kullanılarak optimize edildi. Bu transfeksiyon sistemi daha uygun maliyetli olmakla birlikte, Amaxa sistemi benzersiz yüksek hacimli uygulamalar için elektroporasyon için 96 kuyu adaptörü sunuyor. Biz ek ticari gelişmeler en azından maliyetini tutarken, bu transfeksiyon sistemlerinin verimini ve etkinliğini arttırmaya devam edeceğini umuyoruz.
Bu protokol hem de MiRNA taklit eder ya da önleyici olarak örneklendirilen, "İnsan T hücrelerinin> Sonraki elektroporasyon etkili bir ilgi konusu hedef genlere karşı siRNA'lar dahil olmak üzere küçük RNA'ların neden olabilir. yüksek verim gereksiz neredeyse her hücre olduğu transfeksiyon markerleri kullanımı kolaylaştırır küçük RNA ile transfekte edildi. Bu, tipik plazmid transfeksiyon plazmid artan miktarları ile artar% 50'den fazla toksisite ile işaretleyici genin sadece% 20-30 ekspresyonu ile sonuçlanır, DNA plazmidleri ile primer T hücrelerinin transfeksiyonu için zıttır. tanıtılması Bu yöntemi kullanarak, sentetik taklit genlerin onlarca moleküler klonlama, 12, 13 için herhangi bir ihtiyaç olmaksızın paralel olarak, T hücre biyolojisinde fonksiyonu için elenecek yapılmasına izin vermektedir. Ayrıca 11 paralel olarak T hücreleri tarafından ifade edilen tüm miRNA'lann fonksiyonu için test sağladı 13. Bu protokol ileOrta verimli taramalar bu tür insan T hücreleri için de geçerlidir. Özellikle, bu teknik, son genom düzenleme 15 Primer insan T hücrelerine küçük RNA (gRNA) -Cas9 ribonükleoprotein kompleksleri tatbik etmek için kullanılmıştır. Bunlar çeşitli uygulamalar T Hücre Biyolojisi eğitimi isteyen immünolojistler için önemli bir araç olarak burada sunulan protokol yarar, esneklik ve güç vurgulayın.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x | BD biosciences | 555899 | Must make 1x solution with distilled water prior to use |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K.
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
