Introduction
תאי CD4 + T הם Orchestrators חיוני של התגובה החיסונית אדפטיבית. תאים נאיבי CD4 + T המסוגלים להתפתח לתאי T מפעיל שונים (למשל Th1, Th2, TH17, וכו '), כל אחד עם סט משלו של ציטוקינים מאפיין גורמי שעתוק, תלוי במיקרו-סביבה מקומיים 1. החלטות השושלת תאי T להפוך הן קריטיות עבור שני החסינויות וסובלנות עצמיות. תאי TH17 הם תת-קבוצה אחת של תאי T הידועים להילחם חיידקים ופטריות תאיים, אבל התגובות הפסולות שלהם הן מעורבות גם בפתוגנזה של מחלות מרובות אוטואימוניות ודלקתיות כגון טרשת נפוצה ופסוריאזיס 2, 3. ניתן להפיק תאי TH17 אדם מתאי נאיבית CD4 + T במבחנה על ידי מתן אותם עם סביבת מקטב מתאימה 4. Vario לנו שילובים של ציטוקינים IL-1β, IL-23, TGFβ, ו- IL-6 שימשו לפיתוח תאי TH17 האנושי. תאי האדם TH17 להביע CCR6, קולטן chemokine כי הוא נפוץ לזהות אוכלוסיית התא הזה ומוגדרים על ידי הביטוי של גורם השעתוק העיקרי שלהם, RORγt (המקודדים על ידי RORC) 5, 6. יש TH17 התאים את היכולת להביע ציטוקינים מרובים, אך IL-17A הוא ציטוקין מפעיל-המגדיר בשושלת מיוצר על ידי תאים אלה. בחנו את הביטוי של כל שלושת הסמנים הקשורים TH17 (CCR6, RORγt, IL-17A) כדי להעריך את החוסן של assay בידול במבחנה ב TH17 האנושי שלנו. בנוסף, אנו בתרבית תאים מסוג CD4 + T אנושיים בתנאים בלתי-מקטב, שבו אין ציטוקינים או נוגדנים חוסמים נוספו התקשורת והתרבות להשתמש כביקורת שלילית מאז הביטוי של סמנים TH17 אלה צריכים להיות מאוד נמוך או נעדר.
ve_content "> דרך אחת ללמוד פיתוח T תא אנושי נורמלי ביולוגיה היא לתפעל ביטוי גנים במהלך ההתפתחות שלהם. קצר מפריעים RNA (siRNA) הם מולקולות רנ"א קטנות כי למקד תעתיקי המקודדים חלבונים והוא יכול להיות מנוצל כדי להפחית ביטוי גנים ספציפיים . מיקרו RNA (miRNAs) הוא אנדוגניים ללא קידוד RNA הקטן הידוע לווסת ביטוי גנים לאחר תעתיק. miRNAs הוכח לשחק תפקיד חשוב הן בעכברי ביולוגיה של תא T אנושי, לרבות TH17 תא 7, 8, 9. זה חשוב לי שיטות אמינות של מניפולצית פעילות RNA קטנה תא T אנושי ללמוד והשפיע על ביטוי גנים, ובסופו של דבר על הביולוגיה של תאי T אנושי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קל לשימוש, עקבי ואמין שפתחנו עבור החדרה RNAs סינטטי קטן וחומצות גרעין נעול (LNAs, שינוי כימי חומצות גרעין עם יציבות מוגברת)לתוך תאי מערכת חיסון, ובאופן ספציפי לתאי TH17 אנושיים.ישנן מספר שיטות חלופיות של החדרת RNA הקטן לתוך תאי יונקים, אשר בדרך כלל מתחלקים לקטגוריות כימיות, ביולוגיות, או פיסיות 10. בשימוש נפוץ שיטות כימיות, כולל transfections שומנים מבוססי transfections וסידן-פוספט, להסתמך על יצירת מתחמים הכימי-DNA, כי הם יותר נלקחים ביעילות על ידי תאים. באופן כללי, שיטות כימיות אינן יעילות כמו עבור transfection של תאי T העיקריים. השיטה הביולוגית הנפוצה ביותר היא להשתמש וקטור ויראלי (רטרו-וירוס למשל או lentivirus), אשר מוסיף RNA זרות ישירות לתוך שורה כחלק מחזור השכפול הטבעי שלה. תמרת ויראלי בדרך כלל לוקחת יותר זמן כדי להשלים, במיוחד כאשר אחד גורמים בזמן שיבוט מולקולרי של פלסמידים proviral. בנוסף, וקטורי תמרת ויראלי יכולים להיות מזיקים חוקרים אנושי. Electroporation הוא מ פיזיתethod של גרימת הקרום permeabilization ידי העמדה לתאים פולסי מתח גבוה, המאפשרת חומצות גרעין להיכנס לתוך התא זמני שבו הם יכולים לפעול על היעד שלהם. מכשירי electroporation מסורתיים היו לא יעילים עבור transfecting לימפוציטים העיקרי. עם זאת, electroporation הדור הבא אופטימיזציה הוכיח להיות מסוגל transfecting תאי T ביעילות גבוהה מאוד, במיוחד כאשר החומר להיות transfected הוא RNA הקטן. הדור הבא המונח משמש באופן רופף להבדיל שני הפלטפורמות החדשות יותר (למשל, הניאון, Amaxa) ממכונות electroporation מסורתיות. בנוסף, שיטה זו היא להרחבה בקלות עבור מסכי תפוקה מתונים עם עד כ 120 RNA הקטנים בניסוי אחד, לעתים קרובות באמצעות ריאגנטים סינטטיים תוקף. חשוב לציין, ניתן להשיג transfections מוצלח קטן כמו 16 שעות לאחר הפעלת תא T. החסרון של שיטה זו, לעומת זאת, הוא שזה לא לגרום incorporati גנומי יציבעל, ולכן הוא חולף. לפיכך, זה שווה את המאמץ הנוסף כדי ליצור מבנה ביטוי יציב שיכול להיות ארוז לתוך וקטור ויראלי והביע בהצלחה בתאי T במקרים בם ביטוי לטווח הארוך של RNA קטנה נדרש.
השתמשנו transfection הדור הבא (למשל, ניאון) כדי לספק כלי RNA או LNA oligonucleotide יחידים או פעמים התקועות סינטטיים מגוונים למטרות שונות 11, 12, 13. התערבות RNA יעילה יכולה להיגרם עכבר עיקרי ותא T אנושי באמצעות RNA דו-גדילים קצרי מפריעים (siRNA). פרוטוקול זה מתאר מצבים מותאמים לשימוש בטכניקה זו בתאי TH17 אנושיים. בנוסף siRNAs, מחק מירנה סינטתית זמינה מסחרי מעכבים יכולים לשמש כדי ללמוד רווח מירנה ואובדן התפקוד. מחקה מירנה הן מולקולות RNA דו-גדילים דומות מאוד siRNAs, אבל designeד עם רצף של miRNAs בוגרת אנדוגניים. מעכבי מירנה הם כימית-modified RNA ו / או LNA מבוסס oligonucleotides תקועים אחד אשר נקלטות על ידי miRNAs יליד להרגיז את תפקידם. מצאנו כי כל הכלים האלה יכולים לשמש ביעילות לימפוציטים מסוג T העיקרי מתורבתים, לרבות אך לא רק תאי TH17 אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות של UCSF לאתיקת מחקר אנושי.
1. הכנת תרבית תאי T, הבידוד של תאים מסוג CD4 + T, ואת קיטוב TH17
- ביום 0, צלחות תרבות מעיל רקמה 6-היטב עם 1.5 מ"ל לכל טוב של CD3 אנטי אנושי (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C.
- לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm.
- הכן את התאים mononuclear דם טבורי (CBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות לפי הוראות היצרן.
זהירות: עבוד בזהירות ולוודא ציוד מגן אישי מתאים (PPE) הוא משוחק בעת טיפול דם אנושי כדי למנוע כל סיכון של חשיפה לפתוגנים שמקורן בדם. - ברגע שתאי mononuclear בודדו ורחץ, לבצע בידוד תא אנושי CD4 + T על ידי Sele גודל שליליction באמצעות ערכת תא מסחרית האנוש CD4 + T.
הערה: אם יש זיהום תא דם אדום לאחר בידוד תא mononuclear, הגידול ימס כדוריות דם אדום אופציונאלי עשויות להתבצע לפני צעדי בידוד תא CD4 + T. Resuspend התאים mononuclear ב 1 מ"ל של חיץ בידוד (2% FBS ב PBS). מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת lysing 1x. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 5 מ"ל של חיץ צנטריפוגות בידוד XG 300 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.- Resuspend התאים mononuclear בצפיפות של 50 x 10 6 לכל 500 μL במאגר הבידוד בצינור 5 מ"ל חדש.
- הוספת 100 μL של FBS ו 100 μL של מיקס נוגדן לכל צינור דגירה אז כל צינור בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על שייקר מסלולית לערבב היטב.
- לאחר דגירה, להוסיף 3-4 מ"ל של חיץ בידוד לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים XG 300 8 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. בזהירות לשאוב Supernatant.
- במהלך ספין זו, טרום לשטוף את החרוזים המגנטיים. מעביר את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים לתוך צינור חדש (בשימוש ב- 1: 1 עם התאים) ולהוסיף נפח שווה של חיץ בידוד כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים היטב באמצעות micropipette מ"ל 1 ולאחר מכן למקם את הצינורית שואבת דק 1 לפחות. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend החרוזים המגנטיים בהיקף הזהה הועבר בתחילה לפני הכביסה.
- Resuspend התאים בצינור אחד עם 500 μL של חיץ בידוד ולהוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים מראש שטף.
- דגירה התאים עם חרוזים מגנטיים עבור 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) לערבב היטב.
- לאחר דגירה, ביסודיות pipet התאים באמצעות micropipette 1 מ"ל לפחות 10 פעמים. ואז להוסיף 3-4 מיליליטר של חיץ בידוד ומקום כל צינורית השואבת 2 דקות.
- להעביר בזהירות את התאים באופן שלילי שנבחרו CD4 + T הנמצאיםאת supernatant לצינור חדש.
- לאחר CD4 + T בידוד תא יושלם, לספור את התאים עם hemocytometer ולשמור תאים על קרח.
- לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 1.5 מ"ל של 2x תערובת של TH17-מקטב התקשורת היטב כל: אנטי-אנושי IFNγ (20 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי אנושי IL-4 (20 מיקרוגרם / מ"ל), TGFβ אדם (10 ng / mL), אדם IL-1β (40 ng / mL), אדם IL-23 (40 ng / mL), IL-6 אדם (50 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol).
הערה: Transfection והפרעה RNA עושה עבודה בתקשורת סרום המכיל. מטרת השימוש בסרום ללא מדיה עם פרוטוקול זה היא להשיג ייצור IL-17A טוב יותר. - צנטריפוגה תאי CD4 + T האנושיים XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת תאים. בזהירות לשאוב supernatנְמָלָה. ואז resuspend התאים בתקשורת בסיס סרום ללא צלחת התאים בצפיפות של 3 x 10 6 ב 1.5 מ"ל לכל היטב כך נפח הסופי הוא 3 מ"ל לכל טוב וציטוקינים מקטב כיום בריכוז סופי 1x.
- מניחים את הצלחות ב 5% 2 CO, 37 ° C חממה במשך יומיים.
2. Electroporation של במבחנת תאי TH17 אנוש Polarized
- ביום 2, צלחות תרבות 48-היטב רקמות מעיל עם 250 μL לכל טוב של אנטי אנושי CD3 (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C.
- לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm.
- כן RNA הקטן עבור transfection. במשך כל transfection, aliquot 1 μL של פתרון המניות 5 מיקרומטר של siRNA לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. כלול contr RNA קטן כימית בהתאמה המתאימהol. שמור את כל הצינורות על קרח.
- לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 500 μL של 1X TH17-מקטב התקשורת היטב כל: IFNγ האנטי-אנושית (10 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי אנושי IL-4 (10 מיקרוגרם / מ"ל), אדם TGFβ (5 ng / mL), אדם אִי- 1β (20 ng / mL), אדם IL-23 (20 ng / mL), IL-6 אדם (25 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol).
- לאחר הצלחות תרבות ריאגנטים transfection מוכנים, להשעות את התאים עם pipetting 1 מ"ל micropipette, בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. פינת התאים לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °.
הערה: עבור תקופות תרבות יותר מאשר פרוטוקול ארבעה ימים המוצגת כאן, התאים צריכים להיות טרנספקציה בערך כל 3 ימים באמצעות בפרוטוקול הזה. שלב 20.4 מן ראוי לשנות זאת מאז התאים שטופלו RNA הקטן שונה לא צריכים להיות ונקווה. כל התנאים הנבדקים יש לאסוף, נספר בנפרד טרנספקציה. - בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים לפחות 1 מ"ל של PBS לשטוף. ספירת תאי TH17 החיים (למשל עם hemocytometer באמצעות הרחקה הכחולה Trypan להעריך כדאיות) ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור microcentrifuge.
- צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
- בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים באמצעות חיץ resuspension סיפק מן ערכת מערכת transfection 10 μL בצפיפות של 2.5-4 x 10 7 תאים לכל מ"ל. שמור תאים בטמפרטורת החדר.
הערה: ככלל מנחה, ולנסות להכין רק כמו תאים רבים ככל שניתן טרנספקציה בתוך 30 דקות. ניתן להשוות קבוצות מרובות. - להוסיף 9 μL של תאים 1 μL של RNA קטנים בכל microcצינור entrifuge. Pipet פעם לערבב את התאים RNA קטנים עבור transfection מכן לטעון לתוך קצה האלקטרודה פיפטה המסופקים.
הערה: בדרך כלל, להוסיף 9.5 μL של ההשעיה התא כדי להבטיח שיש מספיק מהתערובת על מנת למנוע יצירת בועות קצה האלקטרודה pipet לפני transfection. - מלאו קובט מסופק עם 3 מ"ל של E. חוצץ אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר מקום קובט בתוך תחנת פיפטה ואז למקם את פיפטה לתוך העמדה בתוך קובט.
- מייד electroporate כל תמהיל 10 μL של תאים ו- RNA הקטן באמצעות הפרמטרים הבאים: מתח דופק 1,500-1,550 V, רוחב דופק 10 ms, ו 3 פולסים הכוללים במכשיר transfection.
- לאחר electroporation יושלם, ישירות מוסיף את תערובת תא 500 μL של 1X TH17-מקטב תקשורת בארות מוכנות של צלחת תרבות. צלחות מקום בתוך CO 5% 2, 37 ° C חממה במשך יומיים נוספים.
הערה: לשטוף את קצה האלקטרודה פיפטה ידי pipettingמעלה ומטה PBS בין כל transfection.
3. תאי קציר האנוש TH17
- Resuspend התאים התקשורת והתרבות עם micropipette, pipetting בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. הכן את התאים עבור מבחני ביטוי תפקודיים ו / או גן.
הערה: שגרה, מספיק תאי ניב מבאר אחת של תאי TH17 טרנספקציה לשמש לניתוח הזרימה cytometric של סמן משטח גורם ציטוקינים ותמלול תאיים מכתים או להכנה של RNA עבור ניתוח ביטוי גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעד הראשון כדי לפתח מערכת אמינה של electroporating בהצלחת תאים אנושיים TH17 היה לייצר חזק בתרביות תאי TH17 אנושיות המובחן במבחנה. תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 הביע את הקולטן chemokine CCR6 ואת גורם שעתוק RORγt (איור 1A, שמאל). סמנים אלה לא באו לידי ביטוי כאשר תאי T היו בתרבית בתנאים הלא-מקטב (thn) (איור 1A, מימין). תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 מיוצר גם IL-17A על restimulation (איור 1B, משמאל), אך לא בתנאים thn (1B איור, מימין). בידול TH17 עדיין מתרחשת לאחר transfection עם RNA קטנים אך בניסויים מסוימים, קיימת ירידה שנצפתה תדירות ייצור IL-17A (איור 1C). השפעת transfection RNA הקטן על ייצור ציטוקינים מדגימה את importance של בעל שליטת RNA קטנה בהתאמה כימיה להשוואה בתוך כל ניסוי. חשוב לציין, כדאיות נשמרת לאחר transfection עם RNA קטנים והוא בדרך כלל יותר מ 70% (איור 1D).
כדי לקבוע את היעילות של פרוטוקול זה, השתמשנו התערבות RNA. האנטיגן CD45 מקודד על ידי PTPRC (phosphatase החלבון טירוזין, C סוג קולטן) הגן. CD45 מתבטא על כל תאי hematopoietic ולכן תאי TH17 אדם צריכים וחסונים להביע סמן משטח זה. Transfection של תאי TH17 אדם ביום 2 עם ברכת siRNA מיקוד PTPRC בחריפות מופחת הביטוי של CD45 לעומת כימיה המתאים siRNA שליטה (איור 2 א). משמרת אוכלוסיית unimodal זה ביטוי CD45 מציינת ליד יעילות transfection 100%, טיפוסית של פרוטוקול זה עבור RNA הקטן. לפיכך, זהו כלי חשוב שיכול לשמש כדי להעריך EFF transfectioniciency במהלך אופטימיזציות פרוטוקול. RORC מקודד RORγt, גורם שעתוק השולט של תאי TH17 אנושיים, אשר מסדיר באופן ישיר ייצור IL-17A. Transfecting תאי TH17 האנושי המתפתח עם בריכה siRNA נגד RORC מופחת בתוקף ביטוי RORγt כצפוי (איור 2B). היה צמצום ביטוי RORγt ידי RNAi השפעה תפקודית, כמו תאים אלה הציגו מופחת ייצור IL-17A (איור 2 ג) לעומת תאי transfected עם שלט siRNA. ללא מקוטב תאים מסוג CD4 + T אסור להביע שום RORγt או IL-17A ו מוצגים כביקורת שלילית בנתון זה.
איור 1: בתאים TH17 הבדיל האדם במבחנה CCR6 אקספרס, RORγt, ו- IL-17A. האדם CD4 + T תאים מבודדים מדם טבורי היו בתרבית undeתנאי r TH17 (IL-1β, IL-23, IL-6, ו TGFβ) או אי-מקטב (thn) תנאים (מדיה בלבד, ללא ציטוקינים מקטב או חסימת נוגדנים הוסיפו) במבחנה ונתח ביום 4 עבור סמן TH17 ביטוי ידי cytometry זרימה: (א) CCR6 משטח תצוגה מגרש קונטור נציג ו-מכתימים שיתוף RORγt התאי של תאי CD4 + T. מספרי הרביעים מצביעים CCR6 אחוזים ו / או RORγt חיוב תאים מסוג CD4 + גופייה החייה. (ב) IL-17A ו IFNγ הייצור לאחר restimulation עם PMA / ionomycin. מספרי הרביעים מצביעים אחוז IL-17A ו / או IFNγ חיוב גופייה חייה CD4 + תאים. (ג) מציג נציג קונטור עלילת משטח CCR6 ו RORγt תאי שיתוף צביעת תאים מסוג CD4 + T-transfection פוסט עם שליטת RNA קטנה. מספרי הרביעים מצביעים CCR6 אחוזים ו / או RORγt חיוב תאים מסוג CD4 + גופיית חיה (משמאל). Representaעלילה מתארים מגני אוזניים מציגה IL-17A ו IFNγ ייצור לאחר restimulation עם PMA / ionomycin-transfection פוסט עם שליטת RNA קטנה. מספרי הרביעים מצביעים אחוז IL-17A ו / או IFNγ חיוב גופייה חייה CD4 + תאים (מימין). (ד) עלילה מתארים נציג מציג יכולת קיום של CD4 + תאים שלאחר transfection עם שליטת RNA קטנה. המספר מציין CD4 + אחוז תאי גופיה חי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: התערבות RNA בתאים TH17 אדם מן המעלה הראשונה. CD4 + T תאים אנושיים מדם טבורי בתרבית בתנאים TH17 היו transfected ביום 2 עם פקד nontargeting siRNA (siNeg CTL) או מיקוד בריכת נגד PTPRC (סי PTPRC) או RORC (סי RORC) הכולל 4 siRNAs הפרט. תאים נותחו לאחר מכן על ידי זרימת cytometry ביום 4: (א) ביטוי CD45 Surface המוצג היסטוגרמה נציג לאחר transfection עם סי PTPRC (גוון אפור) או siNeg CTL (הקו השחור). (ב) ביטוי התאי RORγt מוצג היסטוגרמה נציג לאחר transfection עם סי RORC (גוון אפור) או siNeg CTL (קו שחור). (ג) מגרש קונטור יציג להציג משטח CD4 ושיתוף מכתים RORγt התאי של תאי CD4 + T (פנל עליון) או IL-17A וייצור IFNγ לאחר restimulation עם PMA / ionomycin (פנל תחתון). מספרי הרביעים מצביעים אחוז CD4 + RORγt + או IL-17A ו / או IFNγ חיוב תאי גופייה חייה בתנאי thn או TH17 טרנספקציה עם siNeg CTL או RORC סי.fig2large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור המשלוח של RNA הקטן לתוך תאי TH17 אנושיים. למרות תאים אנושיים TH17 שימשו כאן, שיטה זו של electroporation עם RNA קטנים יכולים לשמש עם תת T מסייעים האנושי העיקרי אחרים, כגון Th1, Th2, ו Tregs. זה לא עבד היטב עבור תאים נאיביים CD4 + T כך התאים חייב להיות מופעל בתרבות לפני transfection. עבור פרוטוקול זה, אנחנו ראשונים מותאמים למערכת התרבות חוץ גופייה לייצור IL-17A טוב יותר. הגורם הגדול ביותר היה בסיס מדיה. מצאנו כי סרום ללא מדיה הייתה מעולה למדיה סרום המכיל מסורתיים לזירוז טוב יותר של IL-17A לייצר תאי TH17 אנושיים. מכיוון שתאי TH17 יכול להיווצר עם תת של ציטוקינים TGFβ, IL-1β, IL-23, IL-6, בדקנו תערובות ציטוקינים שונים. במחקר זה, השגנו ייצור IL-17A חזק יותר כאשר כל ארבעת ציטוקינים המקטבים נכללו. בנוסף, אנו עברנו אופטימיזציה לקצר את המשךהתרבות כדי להבטיח רק transfection אחד היה צורך בתקופת התרבות. בעוד פרוטוקול ארבעה ימים זה מאפשר תוצאות להיווצר מהר מצריך רק transfection אחד, אורך תרבות יכול להתארך כדי להגדיל עוד יותר IL-17A הייצור. תקופת התרבות כבר יכולה להיות אפילו הכרחית כדי להשיג בידול אופטימלי של תת תאי T העיקרי אחרים. מאז transfections אלה הם ארעיים, transfections המרובה עשוי להידרש לאורך זמן לתקופות תרבות ממושכות. אנו ממליצים חידוש ריאגנטים RNA קטנים לאחר כ 3 ימים על ידי מחדש electroporating התאים עם ריאגנט כדי למנוע דילול בשל חילוקי דעות תאים מרובים. עשינו זאת באופן שגרתי עבור העכבר CD4 + T תאים. למרות זאת הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית שכן התאים בכל מצב יש לאסוף נספרים בנפרד, את transfection הוא מוצלח ויש תופעות מינימלית על כדאיות התא.
בניסויים אלה, תאי TH17 אנושיים שאנומחדש שנוצר באמצעות במבחנה תרבות של דם טבורי אנושי. חשוב לציין, אופציה חלופית עבור assay בידול זה יהיה להשתמש בתאי דם היקפיים mononuclear האנושי (PBMCs). עבור שניהם CBMCs ו PBMCs, יש צורך לבודד תאי CD4 + T לפני תחילת התרבות. אנו מציגים כאן השיטה שלנו לטיהור תאי CD4 + T על ידי סלקציה שלילית, אשר הניבה יעילויות transfection חזקות, אבל אנחנו מצפים שיטות אחרות של הכנת תאים + T CD4 אנושיים עיקריים יעבוד בצורה טובה. ניסינו כמה ערכות שעושות שימוש בשתי סלקציה חיובית או שלילית עבור הבידוד של תאי עכבר CD4 + T שני השיטות גרמו יעילות transfection דומה. שיקול נוסף הוא החשיבות של שימוש בתאי T נאיבי כדי לבדל בצורה אופטימלית לתאי TH17. באמצעות דם טבורי אנושי הוא יתרון מסיבה זו, כי זה כבר יש אחוז גבוה יותר של p תאי T נאיבילהתרעם ולכן אין צורך למיין או טרום להעשיר עבור תאים נאיביים T לפני תחילת התרבות. עם זאת, חיסרון ברור של גישה זו היא הזמינות המוגבלת של דם חבל הטבור. לחלופין, מיון של תאי T הנאיביים מ PBMCs 14 יכול להתבצע לפני בתרבות מאז משאב זה הוא זמין יותר, אם כי בכמויות גדולות תצטרכנה לקבל.
אמנם יש מספר שיטות transfecting בתאי יונקים, תאי T עיקריים נוטים להיות סוג תא קשה יותר כדי transfect. electroporation הדור הבא הוא שיטה גופנית מוצלחת של תאי T transfecting זמני כי הוא קל מבחינה טכנית לבצע ו ניתנת לשחזור. אופטימיזציה פעם, יש לו יעילות גבוהה מאוד של transfection עבור RNA הקטן המתקרב 100%. ניתן לראות זאת באיור 2 שבו האוכלוסייה unimodal כולו של CD45 + תאים (איור 2 א) ואת POpulation של כל תאי מבטאי RORγt (איור 2B) משמרת לרמת ביטוי נמוכה. חשוב לציין, transfection מותאם עם RNA קטנים לא להתפשר כדאיות התא. אנו צופים שיגרתי יותר מ 70% כדאיים שלאחר transfection עם RNA הקטן (איור 1D). למרות הכדאיות אינה בעיה עם הפרוטוקול הזה, הביולוגיה של מאפייני תא T אחרים, כגון ייצור ציטוקינים, עשוי להיות מושפע לאחר transfection עם RNA הקטן. מסיבה זו, יש חשיבות קריטית להשתמש בשלט RNA הקטנה בהתאמה כימיה בכל ניסוי.
אנחנו מותאמים שני פרמטרי electroporation, דופק ואת המתח, עבור מזעור מוות תאי ולמקסם יעיל transfection. מתח גבוה להגדיל מוות של תאים במהלך transfection. הנה כמה שיקולים טכניים אחרים כדי למנוע מוות של תאים ולהבטיח transfection המוצלח כולל צמצום כמות ריאגנטים סינטטיים המשמשים והגבלת הזמן betwee הכנת electroporation תא n. ריכוזים מינימאליים דרושים ריאגנטים transfection סינטטיים תמיד צריכים לשמש כדי למנוע רעילות לתא T פוטנציאל ואפקטים מחוץ היעד. צמצום תאי זמן כנה לפני transfection כדי למזער את הזמן של תאי חיץ transfection בטמפרטורת החדר היא קריטית ויכולה להיות מושגת על ידי הכנת תאים בקבוצות, במידת צורך.
נכון לעכשיו, יש שני זמין מסחרי מכשירי electroporation הדור הבא. שתי המערכות הללו יכולים ביעילות transfect תאי T עיקריים. פרוטוקול זה מותאם באמצעות מערכת transfection נאון. בעוד מערכת transfection זה יותר חסכוני, מערכת Amaxa ייחודית מציעה מתאם 96-היטב עבור electroporation עבור יישומי תפוקה גבוהים יותר. אנו מקווים כי פיתוחים מסחריים נוספים ימשיכו להגדיל את התפוקה ויעילות של מערכות transfection אלה, תוך שמירה על העלות לכל הפחות.
"> Electroporation הדור הבא של תאי T האנושיים יכול להציג RNA הקטן ביעילות כולל siRNAs נגד גני המטרה של עניין כפי שהודגם בפרוטוקול זה, כמו גם מחק מירנה או מעכבים. היעילות הגבוהה מייתרת את הצורך להשתמש סמנים של transfection מאז כמעט כל תא הוא טרנספקציה עם RNA הקטן. זהו בניגוד transfection של תאי T הראשוניים עם פלסמידים DNA שבו transfections פלסמיד הטיפוסי לגרום רק ביטוי 20-30% של הגן סמן עם רעילות יותר מ 50% מגביר עם כמויות גדלות והולכות של הפלסמיד. היכרות מחקה סינטתית בשיטה זו אפשרה עבור עשרות גנים שיוקרו עבור פונקציה בביולוגיה של תא T במקביל ללא צורך השיבוט מולקולרי 12, 13. כמו כן אפשרה בדיקות לתפקוד של כל miRNAs הביע ידי תאי T במקביל 11 13,. עם פרוטוקול זה, סוגים אלה של מסכי תפוקה מתונים החלות על תאי T אנושיים. יש לציין, טכניקה זו שימשה לאחרונה להציג RNA קטנים (gRNA) מתחמי ribonucleoprotein -Cas9 לתאי T אנושיים ראשוניים לעריכה בגנום 15. יישומים מגוונים אלו מדגישים את השירות, גמישות וכוח של הפרוטוקול המובא כאן ככלי חשוב אימונולוגים המבקשים ללמוד ביולוגיה של תא T.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μL Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x | BD biosciences | 555899 | Must make 1x solution with distilled water prior to use |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K.
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
