Summary
ट्यूमर माइक्रोएन्नेरमेंट में प्रतिदीप्ति प्रतिरक्षा सेल आबादी के नंबर, रिश्तेदार वितरण और स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए मल्टीपार्मेटर प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री का उपयोग किया जा सकता है। यह पांडुलिपि ऑओरोफेरीन्जियल कैंसर में टी-सेल उप-जनसंपर्क का विश्लेषण करने के लिए इस तकनीक के उपयोग का वर्णन करता है।
Abstract
चार-रंग की प्रतिदीप्ति इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) तकनीक एक ऐसी विधि है जो रुचि के सेल आबादी को मापने के तरीकों को अपने रिश्तेदार वितरण और ऊतक में उनके स्थानीयकरण को ध्यान में रखते हुए। इस तकनीक को विभिन्न ट्यूमर प्रकारों में प्रतिरक्षा घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया गया है। ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ की जाती है जो ट्यूमर साइट से आकर्षित होते हैं। विभिन्न प्रतिरक्षा सेल आबादी ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट में विभिन्न भूमिकाएं निभाने और रोग के नतीजे पर एक अलग प्रभाव पाने के लिए पाए गए हैं। यह पांडुलिपि एक उदाहरण के रूप में ओरोफरीन्गल स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ओपीएससीसी) पर मल्टीपरैमेटर फ्लोरोसेंस आईएचसी के उपयोग का वर्णन करता है। इस तकनीक को अन्य ऊतक नमूनों और सेल प्रकार के ब्याज के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रस्तुत अध्ययन में, हमने एक बड़े ओपीएससी काउहर्ट (एन = 162) के इंटरेपिटेलियल और स्ट्रॉम्मल डिब्बे का विश्लेषण किया। हम कुल टी लिम्फोसाइटों (सीडी 3 + ), इम्युनोस्पॉस्प्रेज़ विनियमन पर केंद्रित थेस्ट्रॉमा से ट्यूमर एपिथेलियम को अलग करने के लिए परमाणु काउंटरस्टेन का इस्तेमाल करते हुए ओरी टी कोशिकाएं (टीग्स; यानी, फॉक्स पी 3 + ), और टी हेल्पर 17 (ते 17) कोशिकाओं ( यानी, आईएल -17 + सीडी 3 + ) इंट्राटमोलॉलिक आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाओं की कम संख्या वाले रोगियों में बीमारियों से मुक्त रहने के साथ टी कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सहसंबद्ध होना पाया गया था। यह पता चलता है कि आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाएं ओपीएससीसी में एक खराब प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ सहसंबद्ध हो सकती हैं, जो आईएल -17 और कैंसर के रोगियों में गरीबों के अस्तित्व के बीच वर्णित सहसंबंध के साथ एक समझौता है। वर्तमान में, उपन्यास multiparameter प्रतिदीप्ति आईएचसी तकनीकों 7 अलग fluorochromes तक का उपयोग कर विकसित किया जा रहा है और ट्यूमर microenvironment में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अधिक सटीक लक्षण वर्णन और स्थानीयकरण सक्षम हो जाएगा।
Introduction
ऑरोफरीनजील स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (ओपीएससीसी) ओरोफरीनक्स में होने वाली स्क्वैमस सेल कैंसर के एक विषम समूह हैं। ओपीएससीसी के लिए जोखिम कारक में मानव पपिलोमावायरस (एचपीवी) संक्रमण और शराब और तंबाकू का उपयोग 1 , 2 शामिल हैं । प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की भूमिका और यह कैसे एक नैदानिक सेटिंग में उपयोग करने के लिए बस का पता लगाया जा रहा है। ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ की जाती है जो कैंसर साइट से आकर्षित होते हैं। हालांकि एक उच्च CD8 + साइटोटोक्सिक टी सेल आवृत्ति OPSCC रोगियों 3 में बेहतर अस्तित्व के साथ जोड़ा गया है Tregs और Th17 कोशिकाओं सहित अन्य टी सेल सबसेट,, की भूमिका अभी स्पष्ट नहीं 4 है। जबकि टी 1 और थिए 17 कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सहायता करने के लिए माना जाता है, Tregs अन्य टी कोशिकाओं 5 की गतिविधि को दबाने के लिए उनकी क्षमताओं के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। हालांकि, टी की उपस्थितिविभिन्न ट्यूमर प्रकार 6 में अनुकूल और प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं के साथ सहसंबंध होना पाया गया है चूंकि खून में मौजूद सभी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में ट्यूमर में घुसपैठ नहीं होती है, इसलिए स्थानीय ट्यूमर माइक्रोएनरिवेशन का अध्ययन करते हुए ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का सबसे विश्वसनीय उपाय प्रदान करता है। इस अध्ययन का उद्देश्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्याओं और प्रकारों और नैदानिक परिणामों के बीच के संबंधों को निर्धारित करना है। मानव OPSCC में विभिन्न टी-सेल उप-जनसंख्याओं की संख्या और स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए हमने चार-रंग प्रतिदीप्ति आईएचसी इमेजिंग का इस्तेमाल किया।
हम कुल टी लिम्फोसाइट्स (CD3 +), Th17 कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा को दबाने वाली Foxp3 + Tregs, जिसका भेदभाव मार्ग बारीकी Th17 कोशिकाओं से संबंधित है पर जोर दिया। Th17 कोशिकाओं को सीडी 3 और आईएल -17 के संयोजन के अनुसार दिखाया गया है। गैर-टी कोशिकाओं 7 द्वारा साइटोकिन आईएल -17 का भी उत्पादन किया जा सकता है। हमने इंट्रा-एपिट का वितरण निर्धारित किया हैओएलएससीसी मामलों की एक बड़ी श्रृंखला में हेलियल और स्ट्रॉमल टी कोशिकाएं, टे्रग्स, थिय 17 और आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाएं और रोगी के अस्तित्व के साथ सहसंबंधों का विश्लेषण किया। मल्टीकोलोर फ्लोरोसेंस आईएचसी का उपयोग सीडी 3, फॉक्सपॉ, और आईएल -17 की अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए किया गया था, जिसमें डीएपीआई काउंटरस्टेन के साथ संयोजन किया गया था। इस परख दोनों ट्यूमर कोशिकाओं (डीएपीआई परमाणु धुंधला होकर) और घुसपैठ कर टी सेल आबादी (विभिन्न मार्करों के संयोजन का उपयोग करके) की आसान और स्पष्ट पहचान के लिए अनुमति दी गई है। नमूना तैयार करने और धुंधला होने के बाद, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों को अलग करने के लिए किया गया था और ट्यूमर एपिथेलियम और ट्यूमर से जुड़े स्ट्रोडा दोनों में मौजूद संख्या और प्रकार के कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था।
ट्यूमर या परिधीय नमूनों ( यानी रक्त या जलोदरियों) की उड़ान (सीआईटीओएफ) के विश्लेषण के समय प्रवाह cytometry विश्लेषण या cytometry, प्रतिदीप्ति सेल आबादी का मात्रामान और phenotype करने के लिए एक वैकल्पिक परख है। इसका उपयोग करनातकनीक, विभिन्न सेल प्रकारों के स्थानीयकरण और रिश्तेदार वितरण के बारे में सभी जानकारी खो जाती है। परिधीय नमूनों का उपयोग और विश्लेषण भी जानकारी प्रदान नहीं करता है कि किस कोशिका के ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट को घुसपैठ करने में सक्षम हैं। रक्त और ऊपरी प्रतिरक्षा-कोशिका के विश्लेषण को ट्यूमर के ऊतक 8 , 9 के प्रसूति सेल घुसपैठ के phenotype और आवृत्ति को प्रतिबिंबित नहीं किया गया है।
एक अन्य विकल्प उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग होता है प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर इस तकनीक का एक फायदा ऊतक autofluorescence की अनुपस्थिति है। हालांकि कुछ नमूनों में अधिक autofluorescence- विशेष रूप से एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, लेकिन न्युट्रोफिलिक ग्रैन्यूलोसाइट्स सहित अन्य सेल प्रकार, इन क्षेत्रों को आसानी से लगभग सभी नमूनों के विश्लेषण में हटाया जा सकता है। Immunofluorescence लक्षित प्रतिदीप्ति के एक पैनल का उपयोग करके एक नमूने में कई मार्करों का विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करता हैएनटी तरंग दैर्ध्य यह एक विशिष्ट एंटीजन के लिए पर्याप्त मात्रा में लेबलों की कमी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी आइसोटाइप की कमी के कारण उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए एक ही हद तक वर्तमान में असंभव है।
वर्णित बहुरंगा प्रतिदीप्ति आईएचसी तकनीक का उपयोग विभिन्न प्रतिरक्षा सेल आबादी, साथ ही ट्यूमर सेल-व्यक्त किए गए अणुओं जैसे मानव लैकोसाइट एंटीजन (एचएलए) और पीडी-एल 1 10 , 11 , के अध्ययन के लिए कई अलग-अलग कैंसर प्रकारों और एंटीबॉडी संयोजनों में किया गया है । 12 कई विभिन्न प्रकार के नमूनों और एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटोकॉल स्थापित और मान्य किया गया है।
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Protocol
रोगी के नमूनों को डच फेडरेशन ऑफ बायोमेडिकल साइंटिक सोसायटीज (www.federa.org) के मानव टिशू के उचित माध्यमिक प्रयोग के लिए आचार संहिता में वर्णित चिकित्सा नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया।
1. स्लाइड तैयार करें
- मेडिकल नैतिक समिति प्राप्त करने के बाद एक पैथोलॉजी विभाग से शोधित ऊतक सामग्री (ऊतक के किसी भी प्रकार) को प्राप्त करें।
नोट: वर्तमान प्रयोग के लिए, 1 9 70 और 2011 के बीच नीदरलैंड विश्वविद्यालय के लीडेन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर, लीडेन, में निदान प्राथमिक ऑओफरींजल ट्यूमर से पहले प्रीटैरेमेंट ट्यूमर के नमूने प्राप्त किए गए थे (एन = 162) 13 से पहले वर्णित के रूप में। ऊतक का आकार ट्यूमर के अंदर ही 4 सूक्ष्म चित्रों को मज़बूती से लेने के लिए पर्याप्त मात्रा में ट्यूमर के ऊतकों के लिए आवश्यकता से सीमित था। - कम से कम 12 घंटे के लिए 4% बफर फॉम्ररीन में ऊतक को ठीक करें एसी में ऊतक को निर्जलीकरणइथेनॉल की कण श्रृंखला इसे एक्सलीन में धो लें और इसे एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग करके पैराफिन मोम में एम्बेड करें।
- माइक्रोटम का उपयोग करते हुए कांच की स्लाइड्स पर 4 माइक्रोन-मोटी सामान्य फर्म, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक अनुभाग कट करें। मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए माइक्रोटोन ऊतक धारक में ऊतक ब्लॉक को रखें।
- ऊतक के रिबन को काटें और उन्हें 45 डिग्री सेल्सियस पर पानी से युक्त पानी युक्त पानी की सतह पर रख दें। धारा के नीचे सीधे पानी में स्लाइड डालकर एक अनुभाग को निकालने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिक धुंधला के लिए उपयुक्त स्लाइड का उपयोग करें। स्लाइड को एक कोण पर ले जाएं, अनुभाग को पानी से बाहर निकालना और उसे स्लाइड पर चिपकाएं।
- कल रात 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड करें
- एफएफपीई स्लाइड्स को पूरी तरह से ताज़ा 100% xylene में डुबोकर 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार छोड़ दें। स्लाइड्स को दोबारा ताजा 100% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और 50% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए दो बार डालें।।
2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें
- 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में स्लाइड्स धो लें
- माइक्रोवेव का उपयोग करते हुए उबलते तापमान के लिए प्रीहेट ट्रिस-एथिलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) बफर (10 एमएम ट्रिस प्लस 1 एमएम ईडीटीए, पीएच 9.0) प्रीइएटेड ईडीएए बफर में स्लाइड्स को डुबकी करके और माइक्रोवेव में 10 मिनट के लिए बफर को इस तापमान पर रखने से एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें।
नोट: 900 W की शक्ति के साथ कोई माइक्रोवेव इस्तेमाल किया जा सकता है। - स्लाइड को 2 घंटे के लिए बफर में शांत करने दें
3. दाग ऊतक स्लाइड्स
- फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ दो बार प्रत्येक 5 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें।
- पतला एंटीबॉडी को स्लाइड से फैलाने से रोकने के लिए ऊतक के चारों ओर एक चक्र को एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ खींचना एक बार पीबीएस के साथ धोएं; यह वैकल्पिक है
- ऊतक को प्राथमिक एंटीबॉडी (एन्टी-सीडी 3 1:50, एंटी-फॉक्स पी 3 1: 200, और एंटी-आईएल-1 1: 1) से 1% से 1% वाइड / वी गोजातीय सीरम में पतला।पीबीएस में एलबीआईमिन (बीएसए) कमरे के तापमान पर रात भर।
नोट: प्रति स्लाइड मात्रा ऊतक के आकार पर निर्भर करता है, लेकिन यह आम तौर पर 50 - 150 μL है। सीडी 3, सीडी 8, और फॉक्स पी 3 एंटीबॉडी ( यानी, खरगोश आईजी इज़्योटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी, माउस आईजीजी 1 आइसोटाइप एंटीबॉडी, और बकरी के रूप में एक ही कमजोर पड़ने पर नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड के लिए अज्ञात विशिष्टता वाले एक एंटीबॉडी के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को स्थानापन्न करें आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी)। - 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ तीन बार स्लाइड्स धो लें।
- प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजातियों और / या आइसोटाइप ( यानी 1: 200 गधा विरोधी बकरी आईजीजी एलेक्सा 488, गधा विरोधी खरगोश आईजीजी ए 546, और गधा विरोधी माउस ए 647) को निशाना बनाने वाले फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन से ऊतक को सेते हैं। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 1% बीएसए
नोट: प्रति स्लाइड मात्रा ऊतक के आकार पर निर्भर करता है लेकिन आमतौर पर 50 - 150 μL है।- बादमाध्यमिक एंटीबॉडी को जोड़ने, एक अंधेरे बॉक्स में या एल्यूमीनियम पन्नी में बॉक्स लपेटकर स्लाइड्स को रोशनी से जितना संभव हो सके रखें।
4. माउंट और काउंटरस्टेन टिशू स्लाइड्स
- 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड्स धो लें
- एक परमाणु काउंटरस्टैन ( जैसे, डीएपीआई) युक्त जलीय विरोधी-फीका माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके स्लाइड्स को माउंट करें। जितनी जल्दी हो सके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (दो सप्ताह के भीतर) का उपयोग करके स्लाइड्स का विश्लेषण करें। स्लाइड पर 4 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण अंधेरे में स्टोर करें।
5. सना हुआ टिशू स्लाइड्स का विश्लेषण करें
- 20 - 25 एक्स उद्देश्य से लैस प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके प्रत्येक स्लाइड के चार चित्र प्राप्त करें। ट्यूमर के प्रतिनिधि अंश को कैप्चर करने के लिए स्लाइड में शामिल कुल ट्यूमर क्षेत्र में यादृच्छिक स्थानों पर चित्र लें।
नोट: 250 एक्स के मानक आवर्धन का उपयोग किया जाना चाहिए। कोई फ्लोरोसेंट ओआर लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन का उपयोग किया जा सकता है, बशर्ते कि इसके उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोरेम्रेम्स को देखने के लिए आवश्यक फिल्टर और पराबैंगनीकिरण है।- एलेक्सा 488 के दृश्य के लिए, एक उत्तेजना अधिकतम 490 का उपयोग करें और एक उत्सर्जन अधिकतम 525; एलेक्सा 546 के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, अधिकतम उत्तेजना 556 और एक उत्सर्जन अधिकतम 573 का उपयोग करें; एलेक्सा 647 के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, अधिकतम उत्तेजना 650 और एक उत्सर्जन अधिकतम 665; और डीएपीआई के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, अधिकतम उत्तेजना 358 और उत्सर्जन अधिकतम 461 का उपयोग करें।
- छवियों के रूप में छवियों को सहेजें ( यानी, जेपीजी और झगड़ा) जो उपयोगकर्ता के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर में है।
- पैथोलॉजिस्ट से सलाह लेने के बाद ट्यूमर एपिथेलियल बनाम स्ट्रोमल सेल के परमाणु और सेलुलर आकृतियों पर आधारित ट्यूमर एपिथेलियम और ट्यूमर स्ट्रोमा क्षेत्रों के बीच भेदभाव।
- कुल stromal सतह क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, stromal कोशिकाओं (ट्यूमर कोशिकाओं के बजाय) द्वारा कब्जा कर लिया सभी क्षेत्र (ओं) के आसपास एक रेखा खींचें और पुनःमाइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा प्रदान की गई छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सतह क्षेत्र घ।
- छवि के नीचे "ओवरले" टैब पर क्लिक करें; "बंद पाली-रेखा" आकार चुनें और उस पर क्लिक करें पहले बिंदु पर फिर तक पहुंचने तक क्षेत्र के आसपास क्लिक करके ट्यूमर एपीथेलियल और स्ट्रॉम्मल फ़ील्ड के बीच की सीमा को निर्धारित करें .; यह उस क्षेत्र के लिए एक उपाय प्रदान करता है
नोट: एक बार आकृति बंद हो जाने के बाद, एक संख्या चयनित छवि (A = x μm 2 ) के सतह क्षेत्र को घेरकर आकृति के बगल में दिखाई देगी।
- छवि के नीचे "ओवरले" टैब पर क्लिक करें; "बंद पाली-रेखा" आकार चुनें और उस पर क्लिक करें पहले बिंदु पर फिर तक पहुंचने तक क्षेत्र के आसपास क्लिक करके ट्यूमर एपीथेलियल और स्ट्रॉम्मल फ़ील्ड के बीच की सीमा को निर्धारित करें .; यह उस क्षेत्र के लिए एक उपाय प्रदान करता है
- उपकला सतह क्षेत्र की गणना करने के लिए कुल छवि सतह क्षेत्र (छवि गुणों में प्रदान की गई) से यह सतह क्षेत्र घटाना संवहनी, नेक्रोटिक, और ऑटोफ्लोरोरेसेंट क्षेत्रों को उनके चारों ओर एक रेखा खींचकर, प्रदान किए गए क्षेत्र के आकार की रिकॉर्डिंग और उपकला सतह क्षेत्र से घटाना।
- औसत सतह क्षेत्रों की गणना करने के लिए और सभी स्प्रैडशीट फ़ाइल में सभी सतह क्षेत्र संख्या सहेजेंस्लाइड प्रति सेल संख्या
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना, यह निर्धारित करें कि क्या कोशिकाएं सभी चार चैनलों की प्रतिदीप्ति जांच कर एकल, डबल, या ट्रिपल पॉजिटिव हैं।
- ImageJ का उपयोग कर प्रत्येक छवि में एकल, डबल, और ट्रिपल पॉजिटिव कक्षों को गिनें।
- ImageJ डाउनलोड करें "फ़ाइल" और "ओपन" पर क्लिक करके और छवि का विश्लेषण करने के लिए छवि को खोलें। "प्वाइंट टूल" (चार पंक्तियों के मध्य में एक लाल वर्ग) पर राइट-क्लिक करें और "मल्टी-पॉइंट टूल" चुनें। "मल्टी-प्वाइंट टूल" पर डबल क्लिक करें और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए एक अलग काउंटर नंबर चुनकर छवि में विभिन्न सेल प्रकार की संख्या की गणना करें।
नोट: एक, दो, या तीन फ्लोरोसेंट रंगों की उपस्थिति के रूप में पहचान के अनुसार, प्रत्येक अलग सेल प्रकार की सभी कोशिकाओं की गणना करें डीएपीआई को छोड़ दें, क्योंकि यह परमाणु प्रतिबाधा सभी कोशिकाओं में मौजूद है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं से ट्यूमर कोशिकाओं को भेदभाव करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक सेल प्रकार की गणना की जाती हैएक अलग काउंटर नंबर का उपयोग कर हर बार एक अलग काउंटर नंबर का चयन करके ट्यूमर एपीथेलियल और स्ट्रोमल क्षेत्रों में अलग-अलग प्रत्येक सेल प्रकार की सेल संख्या की गणना करें। रक्त वाहिकाओं और बड़े पैमाने पर autofluorescent क्षेत्रों में कोशिकाओं की गणना नहीं करते हैं। - स्प्रेडशीट फ़ाइल में प्रत्येक छवि के प्रत्येक काउंटर बिन में विश्लेषण किए गए कोशिकाओं की संख्या को रिकॉर्ड करें।
- ट्यूमर एपिथेलियम और ट्यूमर स्ट्रोमा के कुल सतह क्षेत्र में प्रत्येक सेल प्रकार के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या को विभाजित करें।
- ImageJ डाउनलोड करें "फ़ाइल" और "ओपन" पर क्लिक करके और छवि का विश्लेषण करने के लिए छवि को खोलें। "प्वाइंट टूल" (चार पंक्तियों के मध्य में एक लाल वर्ग) पर राइट-क्लिक करें और "मल्टी-पॉइंट टूल" चुनें। "मल्टी-प्वाइंट टूल" पर डबल क्लिक करें और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए एक अलग काउंटर नंबर चुनकर छवि में विभिन्न सेल प्रकार की संख्या की गणना करें।
- ImageJ का उपयोग कर प्रत्येक छवि में एकल, डबल, और ट्रिपल पॉजिटिव कक्षों को गिनें।
- कुल stromal सतह क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, stromal कोशिकाओं (ट्यूमर कोशिकाओं के बजाय) द्वारा कब्जा कर लिया सभी क्षेत्र (ओं) के आसपास एक रेखा खींचें और पुनःमाइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा प्रदान की गई छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सतह क्षेत्र घ।
6. सांख्यिकी विश्लेषण
नोट: आंकड़ों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषकों के साथ सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों पर चर्चा की जानी चाहिए। सामान्य आंकड़ों के लिए, किसी भी मेडिकल सांख्यिकी गाइड 14 का उपयोग करें
- स्पीयरमेन के रैंक सहसंबंध रोटो टेस्ट का उपयोग करके सेल आवृत्तियों के बीच के संबंधों का परीक्षण करें।
- सकारात्मक cel की संख्या में सांख्यिकीय अंतर का परीक्षण करेंविलकॉक्सन मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग कर रोगियों के समूह के बीच एलएस।
- कैप्लन-मीयर वक्र पीढ़ी और लॉग इन का उपयोग कर एक कट-ऑफ सेल की संख्या के आधार पर समूहों में रोगियों को विभाजित करके सेल नंबर और बीमारी रहित जीवित रहने के बीच के संबंधों का परीक्षण करें ( यानी, मौत या बीमारी के स्थानीय या दूर के पुनरुद्धार तक निदान से समय) रैंक विश्लेषण 15
- कॉक्स आनुपातिक खतरा प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके बहुभिन्नरूपी विश्लेषण करें।
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Representative Results
1 9 70 और 2011 के बीच नीदरलैंड के लीडेन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर, लीडेन, में निदान प्राथमिक ऑओफरीन्जियल ट्यूमर से प्राप्त एफएफपीई प्रीटाएटमेन्ट ट्यूमर के नमूने, (एन = 162) से पहले वर्णित चुना गया था, प्रोटोकॉल 13 का वर्णन करते हुए दाग गया था। प्रत्येक स्लाइड के एक से चार यादृच्छिक छवियों का विश्लेषण किया गया ( चित्रा 1 )। कुछ ऑटोफ्लोरोसेंट कोशिकाओं का संकेत दिया जाता है, जिन्हें स्पष्ट रूप से उनके पूर्ण पीले रंग के रूप में अलग किया जा सकता है। सेल वास्तव में डबल- या ट्रिपल-पॉजिटिव है, इस मामले में सेल थरथाना या न्यूक्लियस पर होने वाले उम्मीद के स्थानीयकरण पर एक विशेष एंटीबॉडी के लिए केवल सकारात्मक धब्बा है। नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड पृष्ठभूमि ऊतक autofluorescence ( चित्रा 2 और चित्रा 4 ) के ऊपर किसी भी विशिष्ट धुंधला नहीं दिखाती, यह पुष्टि करते हुए कि सभी संकेत प्राथमिक द्वारा मान्यता प्राप्त लक्ष्य के लिए विशिष्ट हैएंटीबॉडी। सभी ट्यूमर के नमूने सीडी 3 + टी कोशिकाओं द्वारा अलग-अलग विस्तार के लिए घुसपैठ किए गए थे। FoxP3 + Tregs हमेशा सीडी 3 व्यक्त की और प्रमुख घुसपैठ टी सेल आबादी में से एक थे। आईएल -17 (थ 17 कोशिकाओं) को व्यक्त करते हुए सीडी 3 कोशिकाओं में घुसपैठ की टी कोशिकाओं की एक छोटी संख्या थी। आईएल 17 CD3 द्वारा व्यक्त की - कोशिकाओं एक और प्रचुर मात्रा में घुसपैठ सेल आबादी थी। आईएल -17 + फॉक्सपी 3 + कोशिकाओं में सभी फ़ॉक्स पी 3 + कोशिकाओं की 0.01% से अधिक नहीं थी।
सभी सांख्यिकीय परीक्षण दो तरफ़ थे, और 0.05 के नीचे पी-वैल्यू महत्वपूर्ण 14 माना जाता था। अंतर-उपकला या कुल सेल संख्या और अस्तित्व के बीच संबंध प्रस्तुत किए जाते हैं, क्योंकि स्ट्रॉमल या कुल सेल नंबर और रोगी के अस्तित्व के बीच के संबंध समान थे। कुल सीडी 3 + टी कोशिकाओं में घुसपैठ की एक उच्च संख्या में बीमारी मुक्त जीवनशैली में सुधार (0.086, चित्रा 5 ए ) के रूप में टी कोशिकाओं ( यानी, सबसे कम चतुर्थांश) की कम संख्या की तुलना में। जब आईएल -17 + कोशिकाओं की कम संख्या वाले रोगियों का विशेष रूप से अध्ययन किया जाता है, तो कुल घुसपैठ की टी कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में बीमारी मुक्त जीवनसाथी (पी = 0.012, चित्रा 5 बी ) के साथ संबंध था। ट्यूमर-घुसपैठ की टी कोशिकाओं का पूर्वकोनिक प्रभाव, उच्चतर ट्यूमर-घुसपैठ आईएल -17 + कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया) वाले रोगियों के समूह में खो गया था। इस प्रकार, ओपीएससी में ट्यूमर-घुसपैठ की टी कोशिकाओं का असर आईएल -17 + कोशिकाओं की कम संख्या से संबंधित हो सकता है।
चित्रा 1: चार रंग प्रतिदीप्ति आईएचसी द्वारा सना हुआ एफएफपीई ओरोफरीन्जियल कैंसर टिश्यू सीडी 3 ( ए , रेड), आईएल -17 ( बी ) के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंट दाग की प्रतिनिधि छवि ओजी>, हरा), और फॉक्स पी 3 ( सी , नीला), साथ ही विलीन हुई छवि डीएपीआई (ग्रे) ( डी ) के साथ मिलती है। दो autofluorescent कोशिकाओं तीर से संकेत कर रहे हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: सीडी 3 के लिए नकारात्मक नियंत्रण एफएफपीई ऑओफरीएनजी कैंसर के ऊतक की प्रतिनिधि छवि, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सना हुआ, अज्ञात विशिष्टता वाले खरगोश आईजी रस्सीपोट एंटीबॉडी के साथ एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी को प्रतिस्थापित करते हैं। खरगोश आईजी ( ए , लाल) के लिए कोई धुंधला नहीं आईएल -17 ( बी , हरा), फॉक्स पी 3 ( सी , नीला), और डीएपीआई ( डी , ग्रे) के लिए धुंधला हो गया है।2large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: आईएल -17 के लिए नकारात्मक नियंत्रण एफएफपीई ऑओफरीएनजी कैंसर के ऊतक की प्रतिनिधि छवि, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में दाग, अज्ञात विशिष्टता के साथ एक बकरी आईग सस्तिइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ एंटी-आईएल -17 एंटीबॉडी को प्रतिस्थापित करते हैं। सीडी 3 ( ए , लाल), फॉक्स पी 3 ( सी , नीला), और डीएपीआई ( डी , ग्रे) के लिए धुंधला के साथ बकरी आईग ( बी , हरा) के लिए कोई धुंधला नहीं दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
एफIigure 4: FoxP3 के लिए नकारात्मक नियंत्रण एफएफपीई ऑओफरीएनजी कैंसर के ऊतक की प्रतिनिधि छवि, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में दाग, अज्ञात विशिष्टता वाले माउस आईजीजी 1 आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ एंटी-फॉक्स पी 3 एंटीबॉडी को प्रतिस्थापित करते हैं। सीडी 3 ( ए , रेड), आईएल -17 ( बी , ग्रीन), और डीएपीआई ( डी , ग्रे) के लिए धुंधला के साथ संयुक्त माउस आईजीजी 1 ( सी , ब्लू) के लिए कोई धुंधला नहीं दिखाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: कैप्लन-मीयर जीवन रक्षा के घटता आईएल -17 + कोशिका / मिमी 2 की एक न्यूनतम मध्य संख्या वाले रोगियों के लिए, रोग रहित जीवित रहने के घटता बहुत कम ( यानी, सबसे कम चतुर्थक) के लिए दिखाए जाते हैं, जो कि उच्च संख्या में अधिक हैकुल ट्यूमर क्षेत्र में कुल टी कोशिकाओं ( बी ) की उच्च संख्या बनाम एल टी कोशिकाएं ( ए ) और एक कम ( यानी, नीचे औसत)। कैंसर इम्यूनोलॉजी इम्यूनोरेपी पत्रिका 13 से अनुमति के साथ पुन: प्रजनन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
प्रोटोकॉल के लिए वर्णित है, सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक में इस्तेमाल किया गया प्राथमिक एंटीबॉडी का सही कमजोर पड़ने का निर्धारण करना है। इन विशिष्ट एलेक्सा-लेबल एंटीबॉडी के निर्माता द्वारा सुझाए गए लेबलिंग माध्यमिक एंटीबॉडी का कमांड्यूशन 1: 200 था। प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने को तब क्रमिक कमजोर पड़ने से निर्धारित किया जाना चाहिए, अधिमानतः इच्छित टिशू प्रकार (इस मामले में, ओपीएससीसी) के दो अलग-अलग नमूनों का उपयोग कर रहा है। इष्टतम कामकाज कमजोर पड़ने वाले कमजोर पड़ने पर पृष्ठभूमि के शोर के बिना एक स्पष्ट संकेत प्राप्त किया जाता है और एक ही एकाग्रता पर नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक संकेत के अभाव में। उपलब्ध माइक्रोस्कोप के प्रकार और शोधकर्ता की प्राथमिकता के आधार पर उपयोग किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी और माउंटिंग माध्यम के प्रकार के संबंध में संशोधन किया जा सकता है। यदि इच्छित परिणाम हासिल नहीं किए जाते हैं, तो हम सलाह देते हैं कि वे इस्तेमाल किए जाने वाले ग्लास स्लाइड्स के प्रकार की तलाश करें, क्योंकि कुछ पृष्ठभूमि संकेतों के साथ समस्या पैदा करने के लिए जाने जाते हैं विशेष प्रकार के धुंधला समाधान ( उदाहरण के लिए, पर्मा ब्लू) दूसरा, कुछ एंटीजन गर्मी प्रेरित टक्कर बहाली के इस्तेमाल से बाधित हो सकते हैं। उस मामले में, शोधकर्ता बफर के गर्म कदम को अन्य तकनीकों के साथ बदल सकता है, जैसे कि एंजाइम-प्रेरित संधि पुनर्प्राप्ति। तीसरा, यदि हाइड्रोफोबिक कलम का उपयोग करना है, तो अंकन ऊतक के करीब नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह धुंधला हो जाना समाधान को ठीक से काम करने से रोक देगा। नमूना प्रति वर्गों की संख्या और प्रति खंड की आवश्यक संख्याओं के बारे में, शोधकर्ता और विशिष्ट शोध प्रश्न पर निर्भर है कि पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति के साथ अनुसंधान प्रश्न का उत्तर देने के लिए आवश्यक संख्या निर्धारित करने के लिए। हमारे विश्लेषण के लिए, हम एक प्रति अनुभाग प्रति अनुभाग और प्रति अनुभाग चार छवियों का इस्तेमाल किया। अंत में, जब immunofluorescent धुंधला इस्तेमाल करते हैं, तो कवर स्लिप को सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करते समय ध्यान रखना चाहिए, क्योंकि नेल पॉलिश समाधान में मौजूद शराब फ्लोरोसेंट सिग्नल को प्रभावित कर सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण शामिल नहीं है। हमने इस कदम को स्वचालित करने की कोशिश की है, लेकिन सेलुलर आकार और आकृति विज्ञान के व्यक्तिपरक व्याख्या समय पर उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल के साथ विश्लेषण के स्वचालन को जटिल बनाते हैं। और धुंधला हो जाना बहुत हद तक स्वचालित किया जा सकता है, कोशिकाओं की गिनती मैन्युअल रूप से की गई थी।हम वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए घुसपैठित टी-सेल सबसेट्स और नैदानिक परिणाम के बीच के संबंधों का अध्ययन करने में सक्षम थे। इंट्राटमोलॉलिक आईएल -17 + गैर-टी कोशिकाओं की कम संख्या वाले रोगियों में बीमारियों से मुक्त रहने के साथ टी कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सहसंबद्ध होना पाया गया था। यह पता चलता है कि आईएल 17 + गैर-टी कोशिकाओं OPSCC में एक गरीब प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो सहसंबंध कैंसर रोगियों 16 में आईएल -17 और गरीब अस्तित्व के बीच वर्णित के साथ समझौते में है से संबंधित हो सकता।
इंप्रेशनओवेड सॉफ्टवेयर प्रोग्राम अब इस चरण को स्वचालित बनाने के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं और वर्तमान में मैन्युअल सेल अवलोकन और गिनती की जगह ले रहे हैं, जिससे अधिक विश्वसनीय, उद्देश्य, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और तेज़ परिणाम निकलेगा।
इसके अलावा, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल मार्करों के बहुसंकेतन के लिए वाणिज्यिक किटों की उपलब्धता वर्तमान में बढ़ रही है 17 । इससे परमाणु काउंटरस्टैन के साथ संयोजन में 7 विभिन्न प्रतिरक्षा मार्करों / बायोमार्कर के मल्टीप्लेक्सिंग की अनुमति होगी। हालांकि, हम मानते हैं कि यहां रिपोर्ट की गई प्रोटोकॉल अभी भी कुशलतापूर्वक और प्रयोगशालाओं में जटिल और महंगी बुनियादी ढांचे, सूक्ष्मदर्शी, और बहुपद्वति स्टेनेस विश्लेषण के लिए सॉफ़्टवेयर पैकेज की कमी में लागू होंगे।
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Disclosures
लेखकों ने ब्याज की कोई व्यावसायिक या वित्तीय संघर्ष नहीं घोषित किया है।
Acknowledgments
सिमोन पंट को डच कैंसर सोसायटी से UL2010-4801 अनुदान का समर्थन किया गया था। हम मूल पत्र के सभी सह-लेखक को धन्यवाद देना चाहेंगे कि यह जॉव प्रोटोकॉल निम्न पर आधारित है: एमिली ए। द्रोणकर, मारीज जेपी वेल्टर, रीन्सेक गोमेडेन्स, सेनदा कोलजेनोविक, एलिजाबेथ ब्लोमेना, पीटर जे एफ स्निज्डर्स, अरको गॉर्टर, और एसजोर्ड वैन डेर बर्ग
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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