Summary
Multiparameterfluorescensimmunhistokemi kan användas för att bedöma antalet, relativ fördelning och lokalisering av immuncellpopulationer i tumörmikromiljö. Detta manuskript beskriver användningen av denna teknik för att analysera T-cell subpopulationer i orofaryngealkreft.
Abstract
Den fyrafärgade fluorescensimmunhistokemitekniken (IHC) -tekniken är en metod för att kvantifiera cellpopulationer av intresse med beaktande av deras relativa fördelning och lokalisering i vävnaden. Denna teknik har applicerats i stor utsträckning för att studera immuninfiltratet i olika tumortyper. Tumörmiljömiljön infiltreras av immunceller som lockas till tumörplatsen. Olika immuncellpopulationer har visat sig spela olika roller i tumörmiljömiljön och att ha en annan inverkan på sjukdomsutfallet. Detta manuskript beskriver användningen av multiparameterfluorescens IHC på orofarynge-plättcellcellkarcinom (OPSCC) som ett exempel. Denna teknik kan utvidgas till andra vävnadsprover och celltyper av intresse. I den presenterade studien analyserade vi det intraepiteliala och stromala facket i en stor OPSCC-kohort (n = 162). Vi fokuserade på totala T-lymfocyter (CD3 + ), immunosuppressiva regulatOry-T-celler (Tregs, dvs FoxP3 + ) och T helper 17 (Th17) -celler ( dvs. IL-17 + CD3 + ) med användning av ett nukleärt motstånd för att skilja tumörepitel från stroma. Ett stort antal T-celler befanns vara korrelerade med förbättrad sjukdomsfri överlevnad hos patienter med ett lågt antal intratumorala IL-17 + icke-T-celler. Detta föreslår att IL-17 + icke-T-celler kan korreleras med ett dåligt immunsvar i OPSCC, vilket överensstämmer med korrelationen som beskrivs mellan IL-17 och dålig överlevnad hos cancerpatienter. För närvarande utvecklas nya multiparameterfluorescens IHC-tekniker med upp till 7 olika fluorokrom och möjliggör en mer exakt karakterisering och lokalisering av immunceller i tumörmikro-miljön.
Introduction
Oropharyngeal squamous cell carcinom (OPSCCs) är en heterogen grupp av skivkörtelcancercancer med ursprung i orofarynxen. Riskfaktorer för OPSCC inkluderar humant papillomavirus (HPV) infektion och alkohol- och tobaksbruk 1 , 2 . Immunsvarets roll och hur man använder det i en klinisk miljö börjar bara undersökas. Tumörmiljömiljön infiltreras av immunceller som lockas till cancerplatsen. Fastän en hög CD8 + cytotoxisk T-cellfrekvens har korrelerats med förbättrad överlevnad hos OPSCC-patienter 3 , är rollen för andra T-cellsubsatser, inklusive Tregs och Th17-celler, fortfarande oklart 4 . Medan Th1 och Th17-celler är avsedda att hjälpa till i immunresponsmålande tumörceller är Tregs välkända för deras förmåga att undertrycka aktiviteten hos andra T-celler 5 . Men närvaron av TRegs har visat sig korrelera med både gynnsamma och ogynnsamma svar i olika tumortyper 6 . Eftersom inte alla immunceller som är närvarande i blodet infiltrerar tumören i samma utsträckning, tillhandahåller den lokala tumörmikromiljön den mest tillförlitliga åtgärden av immunsvaret riktat mot tumören. Syftet med denna studie är att bestämma korrelationen mellan antal och typer av immunceller och det kliniska resultatet. Vi använde fyrfärgsfluorescens IHC-bildbehandling för att analysera antal och lokalisering av olika T-cell-subpopulationer i humant OPSCC.
Vi fokuserade på totala T-lymfocyter (CD3 + ), Th17-celler och immunosuppressiva FoxP3 + Tregs, vars differentieringsväg är nära besläktad med Th17-celler. Th17-celler kännetecknas av kombinationen av CD3 och IL-17. Cytokinet IL-17 kan också produceras av icke-T-celler 7 . Vi bestämde fördelningen av intraepitHelial och strom T-celler, Tregs, Th17 och IL-17 + icke-T-celler i en stor serie OPSCC-fall och analyserade korrelationerna med patientöverlevnad. Multicolor fluorescens IHC användes för att identifiera uttrycket av CD3, Foxp3 och IL-17 i kombination med ett DAPI-motstånd. Denna analys möjliggjorde enkel och tydlig identifiering av båda tumörcellerna (med användning av DAPI-nukleär färgning) och infiltrerande T-cellpopulationer (med användning av en kombination av olika markörer). Efter provberedning och färgning användes ett fluorescerande mikroskop och bildhanteringsprogram för att skilja de olika fluorescerande färgerna som användes och för att bestämma antalet och typen av celler som finns närvarande i både tumörepitelet och det tumörassocierade stromen.
En alternativ analys för att kvantifiera och fenotypa immuncellpopulationer är flödescytometrianalys eller cytometri vid tidpunkt för flygning (CyTOF) -analys av tumör eller perifera prov ( dvs. blod eller ascites). Använda dettaTeknik, förloras all information om lokalisering och relativ fördelning av de olika celltyperna. Användningen och analysen av perifera prover ger inte heller information om vilka celler som kan infiltrera tumörmiljömiljön. Blod- och asciteimmun-cellanalyser har visat sig inte återspegla fenotypen och frekvensen av immuncellinfiltrering av tumörvävnaden 8 , 9 .
Ett annat alternativ är användningen av ljusfältmikroskopi. En fördel med denna teknik över fluorescensavbildning är avsaknaden av vävnadsautofluorescens. Även om vissa prover innehåller mer autofluorescens, särskilt erytrocyter, men även andra celltyper, inklusive neutrofila granulocyter, kan dessa områden lätt avlägsnas i analysen av nästan alla prover. Immunofluorescens erbjuder fördelen att analysera flera markörer i ett prov genom att använda en panel med målinriktad fluoresceNt våglängder. Detta är för närvarande omöjligt i samma utsträckning för ljusfältmikroskopi på grund av bristen på ett tillräckligt antal etiketter och kommersiellt tillgängliga antikroppsisotyper för ett visst antigen.
Den mångfärgade fluorescens IHC-tekniken som beskrivits här har använts i många olika cancertyper och antikroppskombinationer för att studera olika immuncellpopulationer, liksom tumörcellsuttryckta molekyler, såsom humana leukocytantigener (HLA) och PD-L1 10 , 11 , 12 . Protokollet har upprättats och validerats med många olika typer av prover och antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientprover hanterades enligt de medicinska etiska riktlinjerna som beskrivs i uppförandekoden för korrekt sekundär användning av humant vävnad från den nederländska federationen av biomedicinska vetenskapliga föreningar (www.federa.org).
1. Förbereda bilder
- Skaffa resekterat vävnadsmaterial (någon form av vävnad) från en patologiska avdelningen efter att ha fått medicinskt etisk utskott tillåtelse att använda resekterat material.
ANMÄRKNING: För det aktuella experimentet erhölls förbehandlingstumprover från primära orofaryngeala tumörer som diagnostiserades i Leiden University Medical Centre, Leiden, Nederländerna mellan 1970 och 2011, valda som beskrivits tidigare (n = 162) 13 . Storleken på vävnaden begränsades endast av kravet på en tillräcklig mängd tumörvävnad för att på ett tillförlitligt sätt ta 4 mikroskopiska bilder inuti tumören. - Fixa vävnaden i 4% buffrad formalin i minst 12 timmar. Dehydrera vävnaden i agRaded serie etanol. Tvätta den i xylen och lägg den i paraffinvax med hjälp av en automatiserad mjukpappersprocessor.
- Skär 4 μm tjocka formalinfasta, paraffin-inbäddade (FFPE) vävnadssnitt på glasskivor med hjälp av en mikrotom. Placera vävnadsblocket i mikrotonvävnadshållaren med hjälp av standardprocedurer.
- Klipp bandband av vävnad och lägg dem på ytan av ett vattenbad innehållande avjoniserat vatten vid 45 ºC. Använd en glida som lämpar sig för immunohistokemisk färgning för att fiska ut en sektion genom att placera gliden i vattnet direkt under avsnittet. Förskjut försiktigt glidbanan uppåt i vinkel, ta avsnittet ur vattnet och klistra det på gliden.
- Låt glidorna torka över natten vid 37 ° C.
- Deparaffinize FFPE-objektglasen genom att nedsänka dem helt i färsk 100% xylen, tre gånger i 5 minuter vardera. Rehydrera glidbanorna genom att nedsänka dem två gånger i färsk 100% etanol, 70% etanol och 50% etanol i 5 minuter vardera.
2. Utför antigenhämtning
- Tvätta glidbanorna i avjoniserat vatten i 5 minuter.
- Förvärmning av Tris-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) -buffert (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) till kokningstemperatur med användning av en mikrovågsugn. Utför antigenhämtning genom att sänka skivorna i den förvärmda EDTA-bufferten och hålla bufferten vid denna temperatur i 10 minuter i mikrovågsugnen.
OBS: Alla mikrovågor med en effekt på 900 W kan användas. - Låt glidarna svalna i bufferten i 2 timmar.
3. Stain Tissue Slides
- Tvätta glidglasen två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 5 min vardera.
- Rita en cirkel runt vävnaden med en hydrofob penna för att förhindra att de utspädda antikropparna slår av gliden. Tvätta en gång till med PBS; Detta är valfritt.
- Inkubera vävnaden med primära antikroppar (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 och anti-IL-17 1:50) utspätt i 1% vikt / volvt bovint serum aLbumin (BSA) i PBS vid rumstemperatur över natten.
OBS: Volymen per bildruta beror på vävnadens storlek, men det är normalt 50 - 150 μl. Ersätt de primära antikropparna med antikroppar av samma isotypklass med en okänd specificitet för de negativa kontrollglasen vid samma utspädning som CD3-, CD8- och FoxP3-antikropparna ( dvs. kanin Ig-isotypkontrollantikropp, mus IgG1-isotypkontrollantikropp och get IgG-isotypkontrollantikropp). - Tvätta bilderna tre gånger med PBS i 5 min vardera.
- Inkubera vävnaden med en kombination av fluorescensmärkta sekundära antikroppar som riktar sig mot de primära antikroppsartiklarna och / eller isotyperna ( dvs 1: 200 åsna-anti-goat IgG Alexa 488, åsna-anti-kanin IgG A546 och åsna-anti-mus A647) utspätt i 1% BSA i PBS vid rumstemperatur i 1 timme.
OBS: Volymen per bildruta beror på vävnadens storlek men är vanligtvis 50-150 μl.- EfterLägg till den sekundära antikroppen, håll skydden skyddad mot ljus så mycket som möjligt genom att lagra dem i en mörk låda eller genom att förpacka lådan i aluminiumfolie.
4. Montera och motverka vävnaderna
- Tvätta bilderna tre gånger i PBS i 5 minuter vardera.
- Montera glidbanorna med hjälp av ett vattenbaserat anti-fade monteringsmedium som innehåller en nukleär motstånd ( t.ex. DAPI). Analysera diabilden med ett fluorescerande mikroskop så snart som möjligt (inom två veckor). Förvara glidbanorna i mörkret vid 4 ° C tills analysen är klar.
5. Analysera färgade vävnader
- Skaffa fyra bilder av varje bild med ett fluorescensmikroskop utrustad med ett 20 - 25X objektiv. Ta bilder på slumpmässiga platser i hela det totala tumörområdet som ingår i bilden för att fånga en representativ fraktion av tumören.
OBS! En standardförstoring av 250X ska användas. Alla fluorescerande oR laserskanningsmikroskop kan användas, förutsatt att det har de filter och lasrar som behövs för att visualisera de använda fluorokromerna.- För visualisering av Alexa 488, använd ett exciteringsgräns på 490 och ett utsläppsgräns på 525; För visualisering av Alexa 546, använd ett exciterings maximalt 556 och ett utsläpp högst 573; För visualisering av Alexa 647, använd ett exciteringsgräns på 650 och ett utsläppsgräns på 665; Och för visualisering av DAPI, använd ett exciteringsgräns på 358 och ett utsläppsgräns på 461.
- Spara bilderna som bildfiler ( dvs. jpeg och tiff) i den programvara som är tillgänglig för användaren.
- Diskriminera mellan tumörepitel och tumörstromområden baserat på kärn- och cellulära former av tumörepitel jämfört med stromceller efter samråd med en patolog.
- För att bestämma den totala stromala ytan, dra en linje runt alla områden som upptas av stromala celler (i stället för tumörceller) och recorD ytan med hjälp av bildanalysprogrammet som tillhandahålls av mikroskoptillverkaren.
- Klicka på fliken "Överlagring" under bilden; Välj "Closed Poly-line" -formen och klicka på den. Avgränsa gränsen mellan tumörepitel- och stromfält genom att klicka runt området tills du når den första punkten igen. Detta ger en åtgärd för det området.
OBS! När formen är stängd visas ett nummer bredvid formen som omger ytan på den valda bilden (A = x μm 2 ).
- Klicka på fliken "Överlagring" under bilden; Välj "Closed Poly-line" -formen och klicka på den. Avgränsa gränsen mellan tumörepitel- och stromfält genom att klicka runt området tills du når den första punkten igen. Detta ger en åtgärd för det området.
- Subtrahera denna yta från den totala bildytans yta (som finns i bildegenskaper) för att beräkna epitelytan. Exkludera vaskulära, nekrotiska och autofluorescerande områden genom att dra en linje runt dem, registrera storleken på det ifyllda området och subtrahera det från epitelytan.
- Spara alla ytnummer i en kalkylarkfil för att beräkna de genomsnittliga ytarea ochCellnummer per bild.
- Med hjälp av bildanalysprogrammet bestämmer du om cellerna är enkla, dubbla eller tredubbla positiva genom att kontrollera fluorescensen hos alla fyra kanalerna.
- Räkna de enkla, dubbla och tredubbla positiva cellerna i varje bild med hjälp av ImageJ.
- Hämta ImageJ. Öppna en bild genom att klicka på "Arkiv" och "Öppna" och välj bilden som ska analyseras. Högerklicka på "Point Tool" (en röd fyrkant i mitten av fyra rader) och välj "Multi Point Tool". Dubbelklicka på "Multi-Point Tool" och räkna antalet olika celltyper i bilden genom att välja ett annat tellernummer för varje celltyp.
OBS: Räkna alla celler av varje annorlunda celltyp, som identifierats av närvaron av en, två eller alla tre fluorescerande färger. Uteslut DAPI, eftersom detta kärnvärde är närvarande i alla celler och används för att diskriminera tumörceller från immunceller. Varje celltyp räknasAnvänder ett annat räknarnummer. Räkna cellnumren för varje celltyp separat i tumörepitel- och stromområdena genom att välja ett annat räknarnummer varje gång. Tala inte celler i blodkärl och i stort sett autofluorescerande områden. - Notera antalet celler som analyseras i varje räckvidd för varje bild i en kalkylarkfil.
- Dela det totala antalet celler för varje celltyp över den totala ytarean av tumörepitel och analyserad tumörstroma.
- Hämta ImageJ. Öppna en bild genom att klicka på "Arkiv" och "Öppna" och välj bilden som ska analyseras. Högerklicka på "Point Tool" (en röd fyrkant i mitten av fyra rader) och välj "Multi Point Tool". Dubbelklicka på "Multi-Point Tool" och räkna antalet olika celltyper i bilden genom att välja ett annat tellernummer för varje celltyp.
- Räkna de enkla, dubbla och tredubbla positiva cellerna i varje bild med hjälp av ImageJ.
- För att bestämma den totala stromala ytan, dra en linje runt alla områden som upptas av stromala celler (i stället för tumörceller) och recorD ytan med hjälp av bildanalysprogrammet som tillhandahålls av mikroskoptillverkaren.
6. Statistisk analys
OBS: Alla statistiska analyser bör diskuteras med en statistiker för att säkerställa datakvaliteten. För allmän statistik, använd någon medicinsk statistikguide 14 .
- Testa korrelationerna mellan cellfrekvenser med hjälp av ett Spearmans rankkorrelations-rho-test.
- Testa de statistiska skillnaderna i antalet positiva cellerLs mellan patientgrupper med användning av testet Wilcoxon Mann-Whitney.
- Testa korrelationerna mellan cellnummer och sjukdomsfri överlevnad ( dvs. tid från diagnos till lokal eller avlägsen återkommande dödsfall eller sjukdom) genom att dividera patienterna i grupper baserat på ett avbrutet antal celler med användning av Kaplan-Meier-kurvproduktion och logg Ranganalys 15 .
- Utför multivariata analyser med hjälp av Cox proportionell riskregressionsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En serie av FFPE-förbehandlingstumpelprover erhållna från primära orofaryngeala tumörer som diagnostiserades i Leiden University Medical Center, Leiden, Nederländerna mellan 1970 och 2011, valdes såsom beskrivits tidigare (n = 162), färgades med användning av det beskrivna protokollet 13 . En till fyra slumpmässiga bilder av varje bilddiagram analyserades ( Figur 1 ). Vissa autofluorescerande celler indikeras, vilka tydligt kan särskiljas av deras fullständiga gula utseende. Celler som verkligen är dubbel- eller trippel-positiva är endast fläckpositiva för en viss antikropp vid den förväntade lokaliseringen, som ligger vid cellmembranet eller kärnan, i detta fall. Negativa kontrollrutor visade inte någon specifik färgning över bakgrundsvävsautofluorescens ( Figur 2 och Figur 4 ), vilket bekräftar att all signal är specifik för de mål som erkänts av primärtantikroppar. Alla tumörprover befanns infiltreras av CD3 + T-celler i varierande omfattning. FoxP3 + Tregs uttryckte alltid CD3 och var en av de stora infiltrerande T-cellpopulationerna. CD3-celler som uttrycker IL-17 (Th17-celler) var en mindre population av de infiltrerande T-cellerna. IL-17 som uttrycks av CD3 - celler var en annan riklig infiltrerande cellpopulation. IL-17 + FoxP3 + -celler omfattade inte mer än 0,01% av alla FoxP3 + -celler.
Alla statistiska tester var tvåsidiga och p-värden under 0,05 ansågs signifikanta 14 . Korrelationerna mellan intraepitel- eller totalt cellantal och överlevnad presenteras, eftersom korrelationerna mellan stromala eller totala cellantal och patientöverlevnad var liknande. Ett stort antal infiltrerade totala CD3 + T-celler visade en trend mot en korrelation med förbättrad sjukdomsfri överlevnad (0,086, Figur 5A ) jämfört med ett lågt antal T-celler ( dvs lägsta kvartil). När man specifikt studerade patienter med ett lågt antal IL-17 + -celler korrelerades ett högt antal totala infiltrerande T-celler med förbättrad sjukdomsfri överlevnad (p = 0,012, Figur 5B ). Den prognostiska effekten av tumörinfiltrerande T-celler försvann i gruppen patienter med ett stort antal tumörinfiltrerande IL-17 + -celler (data ej visad). Således kan effekten av tumörinfiltrerande T-celler i OPSCC relateras till det låga antalet närvarande IL-17 + -celler.
Figur 1: FFPE-orofaryngeal cancervävnad färgad av fyrafärgsfluorescens IHC. Representativ bild av en immunofluorescerande fläck för CD3 ( A , röd), IL-17 ( B Ong>, green) och FoxP3 ( C , blue), liksom den sammanslagna bilden kombinerad med DAPI (grå) ( D ). Två autofluorescerande celler indikeras med pilarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Negativ kontroll för CD3. Representativ bild av FFPE orofaryngeal cancervävnad, färgad såsom beskrivits i protokollet, ersätter anti-CD3-antikroppen med en kanin Ig-isotypkontrollantikropp med okänd specificitet. Ingen färgning för kanin Ig ( A , röd) kombinerad med färgning för IL-17 ( B , grön), FoxP3 ( C , blå) och DAPI ( D , grå) visas.2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Negativ kontroll för IL-17. Representativ bild av FFPE-orofaryngeal cancervävnad, färgad såsom beskrivits i protokollet, varvid anti-IL-17-antikroppen ersätts med en is-Ig-isotypkontrollantikropp med getter med okänd specificitet. Ingen färgning för get-Ig ( B , grön) kombinerad med färgning för CD3 ( A , röd), FoxP3 ( C , blå) och DAPI ( D , grå) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
FIgur 4: Negativ kontroll för FoxP3. Representativ bild av FFPE orofaryngeal cancervävnad, färgad såsom beskrivits i protokollet, ersätter anti-FoxP3-antikroppen med en mus-IgGl-isotypkontrollantikropp med okänd specificitet. Ingen färgning för mus IgG1 ( C , blå) kombinerad med färgning för CD3 ( A , röd), IL-17 ( B , grön) och DAPI ( D , grå) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kaplan-Meier Survival Curves. För patienter med ett mediantal av IL-17 + celler / mm 2 visas sjukdomsfria överlevnadskurvor för en mycket låg ( dvs. lägsta kvartil) mot högt antal totaL-celler ( A ) och en låg ( dvs. undermedian) mot högt antal totala T-celler ( B ) i det totala tumörområdet. Reproducerad med tillstånd från Cancer Immunology Immunotherapy journal 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För det beskrivna protokollet är ett av de mest kritiska stegen att bestämma den korrekta utspädningen av de använda primära antikropparna. Utspädningen av de märkta sekundära antikropparna var 1: 200, såsom rekommenderas av tillverkaren av dessa specifika Alexa-märkta antikroppar. Spädningen av de primära antikropparna bör sedan bestämmas genom en seriell utspädning, företrädesvis med användning av två olika prover av den avsedda vävnadstypen (i detta fall OPSCC). Den optimala arbetsspädningen är utspädningen vid vilken en klar signal erhålls, utan bakgrundsbrus och i avsaknad av en signal för negativ kontroll vid samma koncentration. Modifikationer kan göras med avseende på typen av sekundära antikroppar och monteringsmedium som används, beroende på vilken typ av mikroskop som är tillgängligt och forskarens preferens. Om de avsedda resultaten inte uppnås rekommenderar vi att du undersöker vilken typ av glasskivor som används, eftersom vissa är kända att orsaka problem med bakgrundssignaler För vissa typer av färglösningar ( t.ex. Perma Blue). För det andra kan några antigener störas genom användning av värmeinducerad epitopåtervinning. I det fallet kan forskaren ersätta buffertens uppvärmningssteg med andra tekniker, såsom enzyminducerad epitopåtervinning. För det tredje, om du använder den hydrofoba penna, bör märkningen inte göras för nära vävnaden, eftersom detta kommer att förhindra att färgningslösningen fungerar som den ska. När det gäller antalet sektioner per prov och det önskade antalet bilder per sektion är det upp till forskaren och den specifika forskningsfrågan att bestämma det antal som krävs för att svara på forskningsfrågan med tillräcklig statistisk effekt. För vår analys använde vi en sektion per prov och fyra bilder per sektion. Slutligen, när du använder immunofluorescerande färgning, bör du vara försiktig när du använder nagellack för att försegla locket, eftersom alkohol som finns i nagellacklösningen kan påverka fluorescerande signalen.
Ve_content "> Protokollet som beskrivs här inbegriper inte analys av hög genomströmning. Vi har försökt automatisera detta steg, men den subjektiva tolkningen av cellstorlek och morfologi komplicerar analysens automatisering med de tillgängliga mjukvarupaketen. Och färgning kan i stor utsträckning automatiseras, räkningen av cellerna utfördes manuellt.Vi kunde studera korrelationerna mellan de infiltrerande T-cellundergrupperna som studerades och kliniskt utfall med hjälp av det beskrivna protokollet. Ett stort antal T-celler befanns vara korrelerade med förbättrad sjukdomsfri överlevnad hos patienter med ett lågt antal intratumorala IL-17 + icke-T-celler. Detta föreslår att IL-17 + icke-T-celler kan vara relaterade till ett dåligt immunsvar i OPSCC, vilket överensstämmer med korrelationen som beskrivs mellan IL-17 och dålig överlevnad hos cancerpatienter 16 .
ImprOved programvara har nu blivit kommersiellt tillgängliga för att automatisera detta steg och ersätter för närvarande manuell cell observation och räkning, vilket leder till mer pålitliga, objektiva, reproducerbara och snabba resultat.
Dessutom är tillgängligheten av kommersiella kit som möjliggör multiplexeringen av fluorescerande immunohistokemiska markörer för närvarande på uppgången 17 . Detta kommer att möjliggöra multiplexering av upp till 7 olika immunmarkörer / biomarkörer i kombination med en nukleär motstorlek. Vi tror emellertid att protokollet som rapporteras här fortfarande kommer att bli effektivare och lättare att använda i laboratorier som saknar komplexa och dyra infrastrukturer, mikroskop och mjukvarupaket för multispektrisk färganalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen kommersiell eller ekonomisk intressekonflikt.
Acknowledgments
Simone Punt stöddes av UL2010-4801 från det nederländska cancerförbundet. Vi vill tacka alla medförfattare till det ursprungliga pappret som detta JoVE-protokoll bygger på: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter och Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
