Summary
Multiparametre floresan immünohistokimyası, tümör mikro ortamındaki bağışık hücre popülasyonlarının sayısını, göreceli dağılımını ve lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu el yazması oropharyngeal kanserdeki T hücresi alt popülasyonlarını analiz etmek için bu tekniği tanımlamaktadır.
Abstract
Dört renk floresan immünohistokimya (IHC) tekniği, bağıl dağılımı ve dokudaki lokalizasyonu göz önüne alırken, ilgili hücre popülasyonlarını nicelleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik, çeşitli tümör tiplerinde bağışıklık sızıntısının araştırılması için yoğun bir şekilde uygulanmıştır. Tümör mikro-çevre, tümör bölgesine çekilen bağışıklık hücreleri tarafından sızdırılır. Farklı immün hücre popülasyonlarının tümör mikro ortamında farklı roller oynadığı ve hastalığın sonucunda farklı bir etkisi olduğu bulunmuştur. Bu el yazması örnek olarak orofaringeal skuamöz hücreli karsinomda (OPSCC) multiparametre floresans IHC'nin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik diğer doku örneklerine ve ilgi konusu hücre tiplerine kadar uzatılabilir. Sunulan çalışmada, büyük bir OPSCC kohortunun (n = 162) intraepitelyal ve stromal bölmesini analiz ettik. Toplam T lenfositleri (CD3 + ), immünosupresif düzenleyiciTümör epitelini stroma'dan ayırmak için bir nükleer kontrast lekesi kullanarak , ory T hücrelerinde (Tregler; yani FoxP3 + ) ve T yardımcı 17 (Th17) hücrelerinde ( yani, IL-17 + CD3 + ). Az sayıda intratümöral IL-17 + T olmayan hücreler bulunan hastalarda iyileştirilmiş hastalıksız sağkalım ile yüksek sayıda T hücresinin korelasyon gösterdiği bulundu. Bu, IL-17 + olmayan T hücrelerinin, kanser hastalarında IL-17 ve kötü sağkalım arasında tarif edilen korelasyonla uyuşan OPSCC'deki zayıf bir immün yanıt ile korele olabileceğini düşündürmektedir. Günümüzde, yeni multiparametre floresan IHC teknikleri 7 farklı florokrom kullanılarak geliştirilmektedir ve tümör mikro ortamında bağışık hücrelerin daha kesin karakterizasyonu ve lokalizasyonu sağlanacaktır.
Introduction
Orofaringeal skuamoz hücreli karsinomlar (OPSCC), orofarenks kaynaklı heterojen bir skuamöz hücreli kanser grubudur. OPSCC için risk faktörleri human papillomavirus (HPV) enfeksiyonu ve alkol ve tütün kullanımı 1 , 2'yi içerir . Bağışıklık tepkisinin rolü ve bunun klinik ortamda nasıl kullanılacağı henüz keşfedilmeye başlandı. Tümör mikro-çevre, kanser bölgesine çekici olan immün hücreler tarafından sızdırılır. Yüksek CD8 + sitotoksik T hücre frekansı OPSCC hastalarında 3 sağkalımın iyileşmesiyle korele olmasına rağmen, Tregs ve Th17 hücreleri de dahil olmak üzere diğer T hücre alt gruplarının rolü hala net değildir 4 . Th1 ve Th17 hücrelerinin tümör hücrelerini hedefleyen bağışıklık tepkisine yardımcı olması beklenirken, Treg'ler diğer T hücrelerinin aktivitesini bastırma kabiliyetleri açısından iyi bilinir 5 . Bununla birlikte, T varlığıRegların farklı tümör tiplerinde hem olumlu hem de olumsuz yanıtlarla korele olduğu bulunmuştur 6 . Kanda bulunan tüm immün hücreler aynı derecede tümöre nüfuz etmediğinden, lokal tümör mikro ortamının incelenmesi tümöre yöneltilen bağışıklık tepkisinin en güvenilir ölçümünü sağlar. Bu çalışmanın amacı immün hücrelerin sayı ve tipleri ile klinik sonuç arasındaki korelasyonun belirlenmesidir. İnsan OPSCC'sindeki çeşitli T hücresi alt popülasyonlarının sayısını ve lokalizasyonunu analiz etmek için dört renk flüoresan IHC görüntüleme kullandık.
Toplam T lenfositlerine (CD3 + ), Th17 hücrelerine ve immünsüpresif FoxP3 + Treg'lere odaklandık ve farklılaşma yolu Th17 hücreleriyle yakından ilişkiliydi. Th17 hücreleri CD3 ve IL-17 kombinasyonu ile karakterize edilir. Sitokin IL-17, aynı zamanda T olmayan hücreler tarafından üretilebilir 7 . İntra epitop dağılımını saptadıkHelial ve stromal T hücreleri, Tregs, Th17 ve IL-17 + T olmayan hücrelerden oluşan gruptan seçildi ve hasta sağkalımı ile olan korelasyonlarını analiz etti. Bir DAPI karşıt lekesi ile kombinasyon halinde CD3, Foxp3 ve IL-17 ekspresyonunu tanımlamak için çok renkli floresans IHC kullanıldı. Bu tahlil, her iki tümör hücresinin (DAPI nükleer boyaması kullanılarak) kolaylıkla ve net bir şekilde tanımlanmasına ve sızma T hücresi popülasyonlarının (farklı markörlerin bir kombinasyonu kullanılarak) tespit edilmesine izin verdi. Örnek hazırlama ve boyamayı takiben, kullanılan flüoresan renkleri ayırmak ve hem tümör epitelyumunda hem de tümör ilişkili stromada bulunan hücre sayısını ve türünü belirlemek için bir floresan mikroskopu ve görüntüleme yazılımı kullanıldı.
Bağışıklık hücre popülasyonlarının sayısallaştırılması ve fenotiplenmesi için alternatif bir analiz, tümörün veya periferik örneklerin ( örn., Kan veya asit) uçuş zamanına (CyTOF) göre akış sitometrisi analizi veya sitometridir. Bunu kullanarakTekniği ile lokalizasyon ve farklı hücre tiplerinin göreceli dağılımı ile ilgili tüm bilgiler kaybolur. Periferik örneklerin kullanımı ve analizi, hangi hücrelerin tümörün mikro ortamına sızabildiğiyle ilgili bilgi sağlamamaktadır. Kan ve asitle immün hücre analizleri tümör dokusunda 8, 9 bağışık hücre içi filtrasyonundan fenotip ve sıklığını yansıtacak şekilde gösterilmemiştir edilmiştir.
Başka bir alternatif parlak alan mikroskobu kullanımıdır. Bu tekniğin flüoresan görüntüleme üzerindeki avantajı, doku otofloresansının bulunmamasıdır. Bazı örneklerde daha otofloresans, özellikle eritrositler, ancak nötrofilik granülositler de dahil olmak üzere diğer hücre türleri de bulunmakla birlikte, bu bölgeler hemen hemen tüm numunelerin analizinde kolayca alınabilir. İmmünofloresans, hedeflenen flüoresan panelini kullanarak bir örnekteki birden fazla işaretçiyi analiz etme avantajını sunarNt dalga boyları. Bu, belirli bir antijen için yeterli sayıda etiketin ve piyasada mevcut olan antikor izotiplerinin olmaması nedeniyle parlak alan mikroskopisi için aynı ölçüde mümkün değildir.
Burada tarif edilen çok renkli floresan IHC tekniği, insan lökosit antijenler (HLA) ve PD-L1 10, 11 gibi farklı immün hücre popülasyonları, hem de tümör hücresi-tanımlı molekülleri, çalışma kanser türleri ve antikor kombinasyonları bir çok farklı kullanılmıştır 12 . Protokol, birçok farklı örnek ve antikor çeşidi kullanılarak kurulmuş ve onaylanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hasta örnekleri, Hollanda Biyomedikal Bilim Toplulukları Federasyonu İnsan Doku'nun Doğru İkincil Kullanımı Davranış Kurallarında (www.federa.org) açıklanan tıbbi etik yönergelere göre ele alınmıştır.
1. Slayt Hazırlayın
- Rezeke edilen materyali kullanma tıbbi etik komite iznini aldıktan sonra bir patoloji bölümünden rezeke edilen doku materyalini (her türlü doku) elde edin.
NOT: Mevcut deney için, 1970 ve 2011 yılları arasında Leiden, Leiden'de Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi'nde teşhis edilen primer orofaringeal tümörlerden ön tedavi tümörü örnekleri daha önce tarif edildiği gibi seçilmiştir (n = 162) 13 . Doku büyüklüğü, tümörün içinde 4 mikroskopik görüntü elde etmek için yeterli miktarda tümör dokusu gereksinimi ile sınırlıydı. - Dokuyu% 4 tamponlu formalinde en az 12 saat sabitleyin. Dokuyu ag içinde kurutunTasarlanmış etanol serisi. Ksilen içinde yıkayın ve otomatik bir doku işlemcisi kullanarak parafin mumu içine katıştırın.
- Cam kapaklar üzerinde 4 μm kalınlığındaki formaline sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerini bir mikrotome kullanarak kesin. Standart prosedürler kullanarak doku bloğunu mikro tonlu doku tutucusuna yerleştirin.
- Kurdele şeritleri kesin ve 45 ° C'de deiyonize su içeren bir su banyosu yüzeyine koyun. İmmunohistokimyasal boyama için uygun bir slayt kullanarak, slaydı doğrudan bölümün altındaki suya yerleştirerek bir bölüme balık tutun. Parçayı suyun dışına çıkararak ve slayt üzerine yapıştırarak, slaydı dikkatli bir açıyla yukarıya doğru hareket ettirin.
- Slaytlar gece boyunca 37 ° C'de kurumaya bırakılsın.
- FFPE slaytlarını, her biri 5 dakika süreyle üç kez tamamen taze% 100 ksilende daldırmak suretiyle deparafinize hale getirin. Slaytları, her biri 5 dakika boyunca taze% 100 etanol,% 70 etanol ve% 50 etanol içine iki kez batırarak yeniden su haline getirin.
2. Antigen Alımı gerçekleştir
- Slaytları deiyonize suda 5 dakika boyunca yıkayın.
- Bir mikrodalga kullanarak kaynar sıcaklığa kadar Tris-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponunu (10 mM Tris artı 1 mM EDTA, pH 9.0) önceden ısıtın. Sürgüleri önceden ısıtılmış EDTA tamponuna batırarak ve tamponu mikrodalgada 10 dakika boyunca bu sıcaklıkta tutarak antijen alımını gerçekleştirin.
NOT: 900 W gücünde herhangi bir mikrodalga kullanılabilir. - Slaytları tamponda 2 saat boyunca soğutun.
3. Leke Doku Sunumları
- Slaytları her biri 5 dakika süreyle fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
- Seyreltilmiş antikorların slayttan dökülmesini önlemek için hidrofobik bir kalemle doku etrafında bir daire çizin. PBS ile bir kez daha yıkayın; Bu isteğe bağlıdır.
- % 1 a / a sığır serumu a içinde seyreltilmiş birincil antikorlar (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 ve anti-IL-17 1:50) ile dokuyu inkübe edin.Lbümin (BSA) ile gece boyunca oda sıcaklığında PBS içerisinde karıştırılır.
NOT: Slayt başına hacim dokunun boyutuna bağlıdır, ancak genellikle 50 - 150 μL'dir. CD3, CD8 ve FoxP3 antikorları ( yani, tavşan Ig izotip kontrol antikoru, fare IgG1 izotip kontrol antikoru ve keçi ile aynı seyreltmede negatif kontrol slaytları için bilinmeyen bir özgüllük ile birincil antikorları aynı izotip sınıfının antikorları ile değiştirin IgG izotip kontrol antikoru). - Slaytları her biri için 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
- Doku, seyreltilmiş birincil antikor türünü ve / veya izotiplerini ( yani, 1: 200 eşek anti-keçi IgG Alexa 488, eşek anti-tavşan IgG A546 ve eşek anti-fare A647) hedef alan floresan etiketli sekonder antikorların bir kombinasyonu ile inkübe edin 1% BSA, PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle.
NOT: Slayt başına hacim, dokunun boyutuna bağlıdır, ancak genellikle 50 - 150 μL'dir.- SonraIkincil antikoru ekleyerek, slaytları karanlık bir kutuya koyarak veya kutuyu alüminyum folyo ile sararak mümkün olduğunca ışıktan koruyun.
4. Doku Saydamlarını Yerleştirme ve Karşıtın Bakım
- Slaytları her biri için 5 dakika boyunca PBS içinde üç kez yıkayın.
- Slaytları, nükleer kontrast içeren sulu bir anti-solmaya dayanıklı montaj malzemesi ( ör . DAPI) kullanarak monte edin. Slaytları mümkün olan en kısa sürede (iki hafta içinde) bir flüoresan mikroskop kullanarak analiz edin. Analiz edilinceye kadar slaytları 4 ° C'de karanlıkta saklayın.
5. Lekeli Doku Saydamlarını Analiz Edin
- Her slaytta dört resim elde etmek için, 20 - 25X'lik bir objektifle donatılmış bir floresans mikroskopu kullanın. Tümörün temsil eden bir bölümünü yakalamak için slaytta bulunan toplam tümör alanı boyunca rastgele yerlerde görüntü alın.
NOT: 250X standart bir büyütme kullanılmalıdır. Herhangi bir floresan oKullanılan florokromları görselleştirmek için gerekli olan filtreler ve lazerler varsa r tarayıcı mikroskop kullanılabilir.- Alexa 488'in görselleştirilmesi için, maksimum 490 uyarma ve 525 emisyon maksimum kullanın; Alexa 546'yı görselleştirmek için maksimum uyarı mıknatısı 556 ve maksimum emisyon 573 kullanın; Alexa 647'yi görselleştirmek için, maksimum 650 uyarı ve maksimum emisyon 665 kullanın; Ve DAPI'nın görselleştirilmesi için, maksimum uyarı mıknatısı 358 ve maksimum emisyon 461 kullanın.
- Görüntüleri, kullanıcıya sunulan yazılımda görüntü dosyaları ( örn., Jpeg ve tiff) olarak kaydedin.
- Bir patoloğa danıştıktan sonra tümör epitelyumuna karşı stromal hücrelerin nükleer ve hücresel şekillerine dayalı olarak tümör epiteli ve tümör stroması alanlarını ayırt edin.
- Toplam stromal yüzey alanını belirlemek için, stromal hücreler (tümör hücreleri yerine) tarafından işgal edilen tüm alanların etrafında bir çizgi çizin ve yeniden çizinMikroskop imalatçısı tarafından sağlanan görüntü analiz yazılımını kullanarak yüzey alanı.
- Resmin altındaki "Döşeme" sekmesini tıklayın; "Kapalı Poli-çizgi" şeklini seçin ve üzerine tıklayın. Alanın çevresine tıklayarak tümör epitelial ve stromal alanlar arasındaki sınırı yeniden ilk noktaya ulaşana kadar sınırlayın .; Bu alan için bir önlem sağlar.
NOT: şekil kapandıktan sonra, seçilen görüntünün yüzey alanını çevreleyen şeklin yanında bir sayı görünür (A = x μm 2 ).
- Resmin altındaki "Döşeme" sekmesini tıklayın; "Kapalı Poli-çizgi" şeklini seçin ve üzerine tıklayın. Alanın çevresine tıklayarak tümör epitelial ve stromal alanlar arasındaki sınırı yeniden ilk noktaya ulaşana kadar sınırlayın .; Bu alan için bir önlem sağlar.
- Epitel yüzey alanını hesaplamak için bu yüzey alanını (görüntü özelliklerinde sağlanan) toplam görüntü yüzey alanından çıkarın. Vasküler, nekrotik ve otofloresan alanları, etrafında bir çizgi çizerek, verilen alanın büyüklüğünü kaydedin ve bunu epitel yüzey alanından çıkararak hariç tutun.
- Ortalama yüzey alanlarını hesaplamak için tüm yüzey alanı numaralarını bir elektronik tablo dosyasına kaydedin veSlayt başına hücre sayıları.
- Görüntü analiz yazılımını kullanarak, dört kanalın floresansını kontrol ederek hücrelerin tek, çift veya üçlü pozitif olup olmadığını belirleyin.
- ImageJ kullanarak her bir resimdeki tek, çift ve üçlü pozitif hücreleri sayın.
- İndir ImageJ. "Dosya" ve "Aç" ı tıklayıp analiz edilecek resmi seçerek bir resim açın. "Nokta Aracı" (dört çizginin ortasındaki kırmızı bir kar) sağ tıklayın ve "Çok Nokta Aracı" nı seçin. "Çok Nokta Araç" ı çift tıklayın ve her hücre türüne göre farklı bir sayaç numarası seçerek, resimdeki farklı hücre türlerinin sayısını hesaplayın.
NOT: Bir, iki veya üç floresan renginin varlığıyla tanımlandığı gibi, farklı her hücre türünün tüm hücrelerini sayın. Bu nükleer karşıtın her hücrede mevcut olduğu ve tümör hücrelerini bağışıklık hücrelerinden ayırt etmek için kullanıldığı için DAPI'yı hariç tutun. Her hücre türü sayılırFarklı bir sayaç numarası kullanarak. Her seferinde farklı bir sayaç seçerek tümör epitelyal ve stromal bölgelerinde her hücre türünün hücre sayılarını ayrı olarak sayın. Kan damarları içinde hücreleri saymayın ve büyük oranda otofloresan alanlar. - Analiz edilen hücrelerin sayısını, her bir resim için her kutu bölmesinde bir elektronik tablo dosyasına kaydedin.
- Analiz edilen tümör epiteli ve tümör stromasının toplam yüzey alanı boyunca her bir hücre tipi için toplam hücre sayısını bölün.
- İndir ImageJ. "Dosya" ve "Aç" ı tıklayıp analiz edilecek resmi seçerek bir resim açın. "Nokta Aracı" (dört çizginin ortasındaki kırmızı bir kar) sağ tıklayın ve "Çok Nokta Aracı" nı seçin. "Çok Nokta Araç" ı çift tıklayın ve her hücre türüne göre farklı bir sayaç numarası seçerek, resimdeki farklı hücre türlerinin sayısını hesaplayın.
- ImageJ kullanarak her bir resimdeki tek, çift ve üçlü pozitif hücreleri sayın.
- Toplam stromal yüzey alanını belirlemek için, stromal hücreler (tümör hücreleri yerine) tarafından işgal edilen tüm alanların etrafında bir çizgi çizin ve yeniden çizinMikroskop imalatçısı tarafından sağlanan görüntü analiz yazılımını kullanarak yüzey alanı.
6. İstatistiksel Analiz
NOT: Verilerin kalitesini sağlamak için tüm istatistiksel analizler bir istatistikçi ile tartışılmalıdır. Genel istatistikler için herhangi bir tıbbi istatistik rehberi 14 kullanın .
- Bir Spearman sıra korelasyonu rho testi kullanarak hücre frekansları arasındaki korelasyonları test edin.
- Olumlu cel sayısındaki istatistiksel farklılıkları test edinWilcoxon Mann-Whitney testini kullanarak hasta grupları arasındaki mesafe.
- Kaplan-Meier eğrisi üretimi ve günlüğü kullanarak, kesilen hücre sayısına dayalı gruplardaki hastaları bölerek, hücre sayıları ile hastalıksız sağkalım arasındaki ( yani tanıdan , yerel veya uzak tekrar nüksetme veya hastalığa kadar geçen süre arasındaki korelasyonları test edin) test edin Sıralama analizi 15 .
- Cox orantısal tehlike regresyon analizini kullanarak çok değişkenli analizler yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolü kullanılarak boyanmıştır (n = 162), daha önce tarif edildiği 13 tarif edildiği gibi Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi, Leiden, 1970 ve 2011 arasında, Hollanda'da bulunan teşhis konmuş primer orofaringeal tümörlerden elde edilen FFPE ön tümör örneğinden oluşan bir seri, seçilen. Her slaydın bir ila dört rasgele görüntüsü analiz edildi ( Şekil 1 ). Bazı otofloresan hücreler gösterilir, bu da tamamen sarı görünümüyle ayırt edilebilir. Gerçekten iki veya üçlü pozitif hücreler, bu durumda hücre zarı veya çekirdeğinde beklenen lokalizasyondaki belirli bir antikor için leke pozitiftir. Negatif kontrol slaytları, arka plan dokusu otofloresansının üzerinde herhangi bir spesifik boyama göstermemiştir ( Şekil 2 ve Şekil 4 ), tüm sinyalin birincil tarafından tanınan hedeflere özgü olduğunu teyit ederantikorlar. Tüm tümör numunelerinin CD3 + T hücreleri tarafından çeşitli oranlara sızdığı bulundu. FoxP3 + Tregs her zaman CD3 ekspresyonunu gösterir ve en önemli sızıntı T hücre popülasyonlarından biridir. IL-17 (Th17 hücreleri) eksprese eden CD3 hücreleri infiltrasyon yapan T hücrelerinin küçük bir popülasyonudur. CD3 ile ifade IL-17 - hücreleri bir başka bol infiltre hücre popülasyonu oldu. IL-17 + FoxP3 + hücreleri, tüm FoxP3 + hücrelerinin% 0.01'den fazlasını içermezdi.
Tüm istatistiksel testler iki taraflı ve p değerlerinin 0,05'in altında olması anlamlı 14 olarak kabul edildi. Stromal veya toplam hücre sayıları ile hasta sağkalımı arasındaki korelasyonlar benzer olduğu için, intra-epitel veya toplam hücre sayıları ile sağkalım arasındaki korelasyonlar ortaya konmuştur. Çok sayıda sızıntı yapan toplam CD3 + T hücresi, hastalıksız sağkalım düzeyi ile korelasyon eğilimi gösterdi (0.086, Şekil 5A ), düşük sayıda T hücresi ( yani, en düşük dörtlü) ile karşılaştırılmıştır. Özellikle düşük sayıda IL-17 + hücresi bulunan hastalar üzerinde çalışıldığında, yüksek sayıda infiltre edici T hücresi hastalıksız sağkalım düzeyi ile ilişkili bulunmuştur (p = 0.012, Şekil 5B ). Tümör infiltre eden T hücrelerinin prognostik etkisi, çok sayıda tümör infiltre eden IL-17 + hücresi olan hastalarda kaybolmuştur (veriler gösterilmemiştir). Dolayısıyla, OPSCC'de tümör sızdıran T hücrelerinin etkisi mevcut düşük IL-17 + hücresi sayısıyla ilişkili olabilir.
Şekil 1: Dört Renkli Floresan IHC ile Lekelenen FFPE Orofarengeal Kanser Doku. CD3 ( A , kırmızı), IL-17 için bir immünofloresan lekenin temsili görüntüsü ( B Ong>, yeşil) ve FoxP3 ( C , mavi) yanı sıra DAPI (gri) ( D ) ile birleştirilen birleştirilmiş resim. İki otofloresan hücre oklarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: CD3 için Negatif Kontrol. FFPE oropharyngeal kanser dokusunun, anti-CD3 antikorunun, spesifikliği bilinmeyen bir tavşan Ig izotip kontrol antikoru ile değiştirildiği şekilde boyanmış temsili görüntüsü. IL-17 ( B , yeşil), FoxP3 ( C , mavi) ve DAPI ( D , gri) lekelenmesi ile birlikte tavşan Ig ( A , kırmızı) için herhangi bir boyanma gösterilmez.2large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: IL-17 için Negatif Kontrol. Protokolde tarif edildiği gibi lekelenmiş FFPE orofaringeal kanser dokusunun temsili imgesi, anti-IL-17 antikorunun, spesifikliği bilinmeyen bir keçi Ig izotip kontrol antikoru ile ikame edilmesi. CD3 ( A , kırmızı), FoxP3 ( C , mavi) ve DAPI ( D , gri) lekelenmesi ile birlikte keçi Ig ( B , yeşil) için boyanma gösterilmez. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
FŞekil 4: FoxP3 için Negatif Kontrol. Protokolde tarif edildiği gibi lekelenmiş FFPE orofaringeal kanser dokusunun temsili imgesi, anti-FoxP3 antikorunun, spesifikliği bilinmeyen bir fare IgGl izotip kontrol antikoru ile ikame edilmesi. CD3 ( A , kırmızı), IL-17 ( B , yeşil) ve DAPI ( D , gri) lekelenmesi ile birlikte fare IgG1 ( C , mavi) için herhangi bir boyanma gösterilmemiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Kaplan-Meier Hayatta Kalma Eğrileri. Bir aşağıda ortalama sayısına olan hastalar için, IL-17 / mm2 hücreleri hastalıksız sağkalım eğrileri tota yüksek sayısına karşı (diğer bir deyişle, düşük dörtte) çok düşük için gösterilmiştir +L T hücrelerinde ( A ) ve toplam tümör alanında yüksek sayıdaki toplam T hücresi ( B ) için düşük ( yani, medyanın altında). Kanser İmmünolojisi İmmünoterapi Dergisi'nin izni ile çoğaltılmıştır 13 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokol için en kritik adımlardan biri, kullanılan primer antikorların doğru seyreltilmesini belirlemektir. Etiketli sekonder antikorların seyreltilmesi, bu spesifik Alexa etiketli antikorların imalatçısı tarafından tavsiye edildiği gibi 1: 200 idi. Birincil antikorların seyreltilmesi, daha sonra tercihen amaçlanan doku türünün iki farklı numunesi (bu durumda OPSCC) kullanılarak bir seri seyreltme ile belirlenmelidir. Optimal çalışma seyreltmesi, arka plan gürültüsü olmaksızın ve aynı konsantrasyonda negatif kontrol için bir sinyal olmadığında net bir sinyal elde edilen seyreltmedir. Kullanılabilir mikroskop türüne ve araştırmacının tercihine bağlı olarak, ikincil antikorların tipi ve kullanılan montaj ortamı ile ilgili değişiklikler yapılabilir. İstenen sonuçlara ulaşılamazsa, bazısının arka plandaki sinyallerde sorunlara neden olduğu bilinmekte olduğundan, kullanılan cam slaytlara bakmanızı öneririz Belirli boyarmaddeler ( örn . Perma Blue) için. İkincisi, bazı antijenler, ısıyla indüklenen epitop geri alımı kullanılarak bozulabilir. Bu durumda, araştırmacı tamponun ısıtma adımını, enzim kaynaklı epitop alınması gibi diğer tekniklerle değiştirebilir. Üçüncüsü, hidrofobik kalemi kullanırsanız, lekelenme solüsyonunun düzgün çalışmasını engelleyecek şekilde işaretleme dokuya çok yakın yapılmamalıdır. Her örnek için bölüm sayısına ve bölüm başına gerekli görüntü sayısına gelince, araştırma sorusuna yeterli istatistiksel güçle cevap vermek için gerekli olan sayıyı belirlemek, araştırmacıya ve spesifik araştırma sorusuna kalmıştır. Analizlerimiz için örnek başına bir bölüm ve bölüm başına dört resim kullandık. Son olarak, immünofloresan boyalar kullanırken, tırnak cilası solüsyonundaki alkol flüoresan sinyalini etkileyebileceğinden, kapak fişlerini kapatmak için oje uygularken dikkatli olunmalıdır.
Ve_content "> Burada açıklanan protokol, yüksek verimli analiz içermez.Bu adımın otomatikleştirilmesi için girişimde bulunduk, ancak hücresel boyut ve morfolojinin subjektif yorumu, analizin o anda mevcut olan yazılım paketleri ile otomasyonunu zorlaştırmaktadır. Doku hazırlama Ve lekelenme büyük oranda otomatikleştirilebilir, hücrelerin sayımı manuel olarak gerçekleştirilir.Açıklanan protokolü kullanarak, incelenen sızdıran T hücre alt grupları ile klinik sonuç arasındaki korelasyonları inceledik. Az sayıda intratümöral IL-17 + T olmayan hücreler bulunan hastalarda iyileştirilmiş hastalıksız sağkalım ile yüksek sayıda T hücresinin korelasyon gösterdiği bulundu. Bu, IL-17 + olmayan T hücrelerinin, kanser hastalarında IL-17 ile kötü sağkalım arasında tarif edilen korelasyonla uyumlu OPSCC'de zayıf bir immün yanıt ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir 16 .
GösterimOve yazılım programları şimdi bu adımı otomatikleştirmek için piyasaya sürülmüş ve daha güvenilir, objektif, tekrarlanabilir ve hızlı sonuçlara yol açacak elle hücre gözlem ve sayımının yerini alıyor.
Buna ek olarak, flüoresan immünhistokimyasal markörlerin çoğullaştırılmasına izin veren ticari kitlerin varlığı halen yükselmektedir 17 . Bu, 7 farklı immün belirteçlerin / biyolojik belirteçlerin çoğaltılmasının nükleer karşıt parlaklıkla kombine edilmesine olanak tanıyacak. Bununla birlikte, burada bildirilen protokolün, çoklu spektrumlu boyama analizi için karmaşık ve pahalı altyapı, mikroskoplar ve yazılım paketleri bulunmayan laboratuarlarda daha verimli ve kolay bir şekilde uygulanacağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ticari ya da finansal çıkar çatışması ilan etmez.
Acknowledgments
Simone Punt, Hollanda Kanser Derneği'nden hibe UL2010-4801 tarafından desteklendi. Bu JoVE protokolünün dayandığı orijinal makalenin tüm yazarlarına, Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter ve Sjoerd van'a teşekkür ederiz. Der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
