Summary
L'immunohistochimie à fluorescence multiparamètre peut être utilisée pour évaluer le nombre, la répartition relative et la localisation des populations de cellules immunitaires dans le micro-environnement de la tumeur. Ce manuscrit décrit l'utilisation de cette technique pour analyser les sous-populations de cellules T dans le cancer de l'oropharynx.
Abstract
La technique d'immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs (IHC) est une méthode pour quantifier les populations cellulaires d'intérêt tout en tenant compte de leur répartition relative et de leur localisation dans le tissu. Cette technique a été largement appliquée pour étudier l'infiltration immunitaire dans divers types de tumeurs. Le microenvironnement tumoral est infiltré par des cellules immunitaires attirées par le site de la tumeur. On a constaté que différentes populations de cellules immunitaires jouent différents rôles dans le microenvironnement de la tumeur et ont un impact différent sur le résultat de la maladie. Ce manuscrit décrit l'utilisation de la fluorescence multiparamétrique IHC sur le carcinome épidermoïde oropharyngé (OPSCC) à titre d'exemple. Cette technique peut être étendue à d'autres échantillons de tissus et types d'intérêt cellulaire. Dans l'étude présentée, nous avons analysé le compartiment intra-épithélial et stromal d'une grande cohorte OPSCC (n = 162). Nous nous sommes concentrés sur les lymphocytes T complets (CD3 + ), le régulateur immunosuppresseur(Tregs, c'est-à-dire FoxP3 + ) et T helper 17 (Th17) ( c'est -à- dire IL-17 + CD3 + ) en utilisant un contre-cutané nucléaire pour distinguer l'épithélium tumoral du stroma. Un nombre élevé de cellules T s'est révélé être corrélée avec une survie sans maladie améliorée chez les patients avec un faible nombre de lymphocytes non-T IL-17 + intratumoraux. Cela suggère que les lymphocytes non-T IL-17 + peuvent être corrélés avec une mauvaise réponse immunitaire dans l'OPSCC, ce qui correspond à la corrélation décrite entre IL-17 et une survie médiocre chez les patients cancéreux. Actuellement, de nouvelles techniques IHC de fluorescence multiparamètres sont développées en utilisant jusqu'à 7 différents fluorochromes et permettront une caractérisation et une localisation plus précises des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral.
Introduction
Les carcinomes à cellules squameuses opharyngées (OPSCC) sont un groupe hétérogène de cancers des cellules squameuses originaires de l'oropharynx. Les facteurs de risque pour l'OPSCC comprennent l'infection par le papillomavirus humain (VPH) et l'alcool et le tabagisme 1 , 2 . Le rôle de la réponse immunitaire et la façon de l'utiliser dans un contexte clinique commencent à être explorés. Le micro-environnement de la tumeur est infiltré par des cellules immunitaires qui sont attirées par le site du cancer. Bien qu'une fréquence cytotoxique élevée de lymphocytes T CD8 + ait été corrélée avec une survie améliorée chez les patients OPSCC 3 , le rôle d'autres sous-ensembles de cellules T, y compris les cellules Treg et Th17, n'est toujours pas clair 4 . Alors que les cellules Th1 et Th17 sont censées aider à la réponse immunitaire ciblant les cellules tumorales, les Treg sont bien connus pour leurs capacités à supprimer l'activité d'autres lymphocytes T 5 . Cependant, la présence de TOn a constaté que les regs étaient corrélés avec des réponses favorables et défavorables dans différents types de tumeurs 6 . Étant donné que toutes les cellules immunitaires présentes dans le sang infiltrent la tumeur dans la même mesure, l'étude du micro-environnement local de la tumeur fournit la mesure la plus fiable de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. L'objectif de cette étude est de déterminer la corrélation entre les nombres et les types de cellules immunitaires et les résultats cliniques. Nous avons utilisé l'imagerie IHC à fluorescence à quatre couleurs pour analyser le nombre et la localisation de diverses sous-populations de cellules T dans l'OPSCC humain.
Nous nous sommes concentrés sur les lymphocytes T totaux (CD3 + ), les cellules Th17 et les Tregs FoxP3 + immunosuppressifs, dont la voie de différenciation est étroitement liée aux cellules Th17. Les cellules Th17 se caractérisent par la combinaison de CD3 et d'IL-17. La cytokine IL-17 peut également être produite par des cellules non T 7 . Nous avons déterminé la distribution de l'intra-epitLes lymphocytes T de l'hélium et du stromal, les cellules non T Tregs, Th17 et IL-17 + dans une grande série de cas OPSCC et ont analysé les corrélations avec la survie du patient. La fluorescence multicouche IHC a été utilisée pour identifier l'expression de CD3, Foxp3 et IL-17, en combinaison avec un contre-tassement DAPI. Ce dosage a permis d'identifier facilement et clairement les cellules tumorales (en utilisant la coloration nucléaire DAPI) et les populations de cellules T infiltrantes (en utilisant une combinaison de marqueurs différents). Après la préparation et la coloration des échantillons, un microscope fluorescent et un logiciel d'imagerie ont été utilisés pour séparer les différentes couleurs fluorescentes utilisées et pour déterminer le nombre et le type de cellules présentes à la fois dans l'épithélium tumoral et dans le stroma associé à la tumeur.
Un autre essai pour quantifier et phénotype des populations de cellules immunitaires est l'analyse de cytométrie de flux, ou la cytométrie par analyse de temps de vol (CyTOF), d'échantillons de tumeurs ou de périphériques ( c.-à-d., Le sang ou l'ascite). En utilisant ceciTechnique, toutes les informations sur la localisation et la répartition relative des différents types de cellules sont perdues. L'utilisation et l'analyse des échantillons périphériques ne fournissent pas non plus d'informations sur les cellules susceptibles d'infiltrer le micro-environnement de la tumeur. Les analyses de cellules immunitaires de sang et d'ascite ont été montrées pour ne pas refléter le phénotype et la fréquence d'infiltration de cellules immunitaires du tissu tumoral 8 , 9 .
Une autre alternative est l'utilisation de microscopie à champ brillant. Un avantage de cette technique par rapport à l'imagerie par fluorescence est l'absence d'autofluorescence tissulaire. Bien que certains échantillons contiennent plus d'autofluorescence, en particulier les érythrocytes, mais aussi d'autres types de cellules, y compris les granulocytes neutrophiles, ces zones peuvent facilement être éliminées lors de l'analyse de presque tous les échantillons. L'immunofluorescence offre l'avantage d'analyser des marqueurs multiples dans un échantillon en utilisant un panel de fluorescence cibléeNt longueur d'onde. Ceci est actuellement impossible dans la même mesure pour le microscope à champ brillant en raison de l'absence d'un nombre suffisant d'étiquettes et d'isotypes d'anticorps disponibles dans le commerce pour un antigène particulier.
La technique de fluorescence multicouche IHC décrite ici a été utilisée dans de nombreux types de cancer différents et des combinaisons d'anticorps pour étudier différentes populations de cellules immunitaires, ainsi que des molécules exprimées par des cellules tumorales, telles que des antigènes de leucocytes humains (HLA) et PD-L1 10 , 11 , 12 . Le protocole a été établi et validé à l'aide de différents types d'échantillons et d'anticorps.
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Protocol
Les échantillons de patients ont été traités conformément aux directives éthiques médicales décrites dans le Code de conduite pour une utilisation secondaire appropriée du tissu humain de la Fédération néerlandaise des sociétés scientifiques biomédicales (www.federa.org).
1. Préparez des diapositives
- Obtenir des tissus réséqués (tout type de tissu) d'un département de pathologie après avoir obtenu l'autorisation d'un comité d'éthique médicale pour utiliser le matériel réséqué.
NOTE: Pour l'expérience actuelle, des échantillons de tumeurs de prétraitement ont été obtenus à partir de tumeurs oropharyngées primaires diagnostiquées dans le Leiden University Medical Center, Leiden, Pays-Bas entre 1970 et 2011, sélectionnées comme décrit précédemment (n = 162) 13 . La taille du tissu n'était limitée que par l'exigence d'une quantité suffisante de tissu tumoral pour prendre de manière fiable 4 images microscopiques à l'intérieur de la tumeur. - Fixer le tissu dans du formol tamponné à 4% pendant au moins 12 h. Déshydrate le tissu en agSérie d'éthanol radié. Lavez-le dans du xylène et incorporez-le dans de la paraffine à l'aide d'un processeur automatisé de tissu.
- Découpez des sections de tissu à 4 μm d'épaisseur fixées au formol et à la paraffine (FFPE) sur des lames de verre à l'aide d'un microtome. Placez le bloc de tissu dans le support de tissu microtone en utilisant des procédures standard.
- Couper les rubans de tissu et les poser sur la surface d'un bain-marie contenant de l'eau désionisée à 45 ° C. Utilisez un coulissant adapté pour la coloration immunohistochimique pour pêcher une section en plaçant la glissière dans l'eau directement sous la section. Déplacez soigneusement la glissière vers le haut dans un angle, enlevant la section de l'eau et en la collant sur la glissière.
- Laissez les glissières sécher pendant une nuit à 37 ° C.
- Déparaffinez les diapositives FFPE en les immergeant complètement dans 100% de xylene frais, trois fois pendant 5 min chacun. Réhydratez les diapositives en les immergeant deux fois dans de l'éthanol 100% frais, 70% d'éthanol et 50% d'éthanol pendant 5 min chacun.
2. Effectuer la récupération de l'antigène
- Laver les lames dans de l'eau désionisée pendant 5 min.
- Préchauffer le tampon d'acide Tris-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (Tris 10 mM plus EDTA 1 mM, pH 9,0) jusqu'à la température d'ébullition en utilisant un micro-ondes. Effectuer la récupération de l'antigène en immergeant les diapositives dans le tampon EDTA préchauffé et en gardant le tampon à cette température pendant 10 minutes au micro-ondes.
REMARQUE: Tout micro-ondes d'une puissance de 900 W peut être utilisé. - Laissez les glissières refroidir dans le tampon pendant 2 h.
3. Diapositives sur les taches
- Lavez les diapositives deux fois avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 minutes chacune.
- Dessinez un cercle autour du tissu avec un stylo hydrophobe pour empêcher les anticorps dilués de renverser la glissière. Laver encore une fois avec le PBS; Ceci est facultatif.
- Incuber le tissu avec des anticorps primaires (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 et anti-IL-17 1:50) dilué dans du sérum bovin à 1% p / v aLbumin (BSA) dans du PBS à température ambiante pendant une nuit.
REMARQUE: Le volume par diapositive dépend de la taille du tissu, mais il est typiquement de 50 à 150 μL. Remplacer les anticorps primaires par des anticorps de la même classe d'isotype avec une spécificité inconnue pour les diapositives de contrôle négatives à la même dilution que les anticorps CD3, CD8 et FoxP3 ( c.-à-d. Anticorps anti - isotypes Ig de lapin, anticorps anti-isotypes IgG1 de souris et chèvre Anticorps anti-isotypes IgG). - Lavez les diapositives trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
- Incuber le tissu avec une combinaison d'anticorps secondaires marqués par fluorescence ciblant les espèces et / ou les isotypes d'anticorps primaires ( c. -à-d. IgG Alexa 488 à 1: 200 anti-chèvre, IgG A546 anti-lapin d'âne et A647 anti-souris d'âne) dilué dans 1% de BSA dans du PBS à température ambiante pendant 1 h.
NOTE: Le volume par diapositive dépend de la taille du tissu, mais il est typiquement de 50 à 150 μL.- AprèsEn ajoutant l'anticorps secondaire, gardez les diapositives protégées contre la lumière autant que possible en les stockant dans une boîte noire ou en enroulant la boîte en papier d'aluminium.
4. Glisser les diapositives de montage et de rechapage
- Lavez les diapositives trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacune.
- Monter les glissières à l'aide d'un support aqueux anti-décoloration contenant un contre-durcisseur nucléaire ( p. Ex., DAPI). Analyser les diapositives à l'aide d'un microscope fluorescent dès que possible (dans les deux semaines). Rangez les diapositives dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à l'analyse.
5. Analyser les diapositives de tissus tachés
- Obtenez quatre images de chaque diapositive à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'un objectif 20-25. Prenez des images à des endroits aléatoires dans toute la zone tumorale totale incluse dans la diapositive pour capturer une fraction représentative de la tumeur.
REMARQUE: un grossissement standard de 250X devrait être utilisé. Tout fluorescent oR peut être utilisé, à condition qu'il ait les filtres et les lasers nécessaires pour visualiser les fluorochromes utilisés.- Pour la visualisation d'Alexa 488, utilisez un maximum d'excitation de 490 et un maximum d'émission de 525; Pour la visualisation d'Alexa 546, utilisez un maximum d'excitation de 556 et un maximum d'émission de 573; Pour la visualisation d'Alexa 647, utilisez un maximum d'excitation de 650 et un maximum d'émission de 665; Et pour la visualisation de DAPI, utilisez un maximum d'excitation de 358 et un maximum d'émission de 461.
- Enregistrez les images sous forme de fichiers d'image ( c.-à-d. Jpeg et tiff) dans le logiciel disponible pour l'utilisateur.
- Discrimination entre l'épithélium tumoral et les zones de stroma tumorales en fonction des formes nucléaires et cellulaires des cellules épithéliales tumorales contre les cellules stromales après consultation d'un pathologiste.
- Pour déterminer la surface totale de la stomie, tracez une ligne autour de toutes les zones occupées par les cellules stromales (plutôt que les cellules tumorales) et le recorD la surface en utilisant le logiciel d'analyse d'image fourni par le fabricant du microscope.
- Cliquez sur l'onglet "Superposition" sous l'image; Choisissez la forme "Closed Poly-line" et cliquez dessus. Démarquez la limite entre les champs épithélium tumoral et les champs stromal en cliquant autour de la zone jusqu'à ce que le premier point soit rétabli. Cela fournit une mesure pour cette zone.
REMARQUE: une fois que la forme est fermée, un nombre apparaîtra à côté de la forme entourant la surface de l'image sélectionnée (A = x μm 2 ).
- Cliquez sur l'onglet "Superposition" sous l'image; Choisissez la forme "Closed Poly-line" et cliquez dessus. Démarquez la limite entre les champs épithélium tumoral et les champs stromal en cliquant autour de la zone jusqu'à ce que le premier point soit rétabli. Cela fournit une mesure pour cette zone.
- Soustrayez cette surface de la surface totale de l'image (fournie dans les propriétés de l'image) pour calculer la surface de la surface épithéliale. Exclure les zones vasculaires, nécrotiques et autofluorescentes en dessinant une ligne autour d'elles, en enregistrant la taille de la zone fournie et en soustrayant celle de la surface épithéliale.
- Enregistrez tous les numéros de surface dans un fichier de tableur pour calculer les surfaces moyennes etNuméros de cellule par diapositive.
- En utilisant le logiciel d'analyse d'image, déterminez si les cellules sont simples, doubles ou triples en vérifiant la fluorescence des quatre canaux.
- Comptez les cellules à simple, double et triple positif dans chaque image en utilisant ImageJ.
- Télécharger ImageJ. Ouvrez une image en cliquant sur "Fichier" et "Ouvrir" et en sélectionnant l'image à analyser. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur "Point Tool" (un carré rouge au milieu de quatre lignes) et sélectionnez "Multi-Point Tool". Double-cliquez sur «Multi-Point Tool» et comptez le nombre de différents types de cellules dans l'image en sélectionnant un numéro de compteur différent pour chaque type de cellule.
REMARQUE: comptez toutes les cellules de chaque type de cellule différente, identifiées par la présence d'une, deux ou toutes les trois couleurs fluorescentes. Exclure DAPI, car ce contre-durcissement nucléaire est présent dans toutes les cellules et est utilisé pour discriminer les cellules tumorales des cellules immunitaires. Chaque type de cellule est comptéEn utilisant un numéro de compteur différent. Comptez les nombres de cellules de chaque type de cellule séparément dans les zones épithéliales et stromales de la tumeur en choisissant chaque fois un numéro de compteur différent. Ne comptez pas les cellules dans les vaisseaux sanguins et les zones largement autofluorescentes. - Enregistrez le nombre de cellules analysées dans chaque conteneur pour chaque image dans un fichier de tableur.
- Diviser le nombre total de cellules pour chaque type de cellule sur la surface totale de l'épithélium tumoral et le stroma tumoral analysé.
- Télécharger ImageJ. Ouvrez une image en cliquant sur "Fichier" et "Ouvrir" et en sélectionnant l'image à analyser. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur "Point Tool" (un carré rouge au milieu de quatre lignes) et sélectionnez "Multi-Point Tool". Double-cliquez sur «Multi-Point Tool» et comptez le nombre de différents types de cellules dans l'image en sélectionnant un numéro de compteur différent pour chaque type de cellule.
- Comptez les cellules à simple, double et triple positif dans chaque image en utilisant ImageJ.
- Pour déterminer la surface totale de la stomie, tracez une ligne autour de toutes les zones occupées par les cellules stromales (plutôt que les cellules tumorales) et le recorD la surface en utilisant le logiciel d'analyse d'image fourni par le fabricant du microscope.
6. Analyse statistique
NOTE: Toutes les analyses statistiques doivent être discutées avec un statisticien pour assurer la qualité des données. Pour les statistiques générales, utilisez un guide de statistiques médicales 14 .
- Testez les corrélations entre les fréquences cellulaires en utilisant un test de Rho de corrélation de rang de Spearman.
- Testez les différences statistiques dans le nombre de cellules positivesEntre les groupes de patients en utilisant le test de Wilcoxon Mann-Whitney.
- Testez les corrélations entre le nombre de cellules et la survie sans maladie ( c.-à-d., Le délai entre le diagnostic et la récidive locale ou distante de la mort ou de la maladie) en divisant les patients en groupes en fonction d'un nombre de cellules coupées utilisant la génération de courbes de Kaplan-Meier et le journal Analyse de rang 15 .
- Effectuer des analyses multivariées à l'aide de l'analyse de régression par risque proportionnel de Cox.
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Representative Results
Une série d'échantillons de tumeurs de prétraitement FFPE obtenues à partir de tumeurs oropharyngées primaires diagnostiquées dans le Centre médical de l'Université de Leiden, à Leiden, aux Pays-Bas entre 1970 et 2011, sélectionnées comme décrit précédemment (n = 162), ont été colorées selon le protocole décrit 13 . Une ou quatre images aléatoires de chaque diapositive ont été analysées ( figure 1 ). Certaines cellules autofluorescentes sont indiquées, ce qui peut être clairement distingué par leur apparence jaune complète. Les cellules sont vraiment positives à double ou à triple positif, positives pour un anticorps particulier à la localisation prévue, qui est à la membrane cellulaire ou au noyau, dans ce cas. Les diapositives de contrôle négatif n'ont montré aucune coloration spécifique au-dessus de l'autofluorescence tissulaire de fond ( Figure 2 et Figure 4 ), confirmant que tout signal est spécifique aux cibles reconnues par le primaireLes anticorps. Tous les échantillons de tumeurs ont été infiltrés par des lymphocytes T CD3 + à des degrés différents. FoxP3 + Tregs ont toujours exprimé CD3 et étaient l'une des principales populations infiltrantes de cellules T. Les cellules CD3 exprimant l'IL-17 (cellules Th17) étaient une population mineure des cellules T infiltrantes. IL-17 exprimée par CD3 - cellules était une autre population de cellules infiltrant abondante. Les cellules IL-17 + FoxP3 + ne comprenaient pas plus de 0,01% de toutes les cellules FoxP3 + .
Tous les tests statistiques étaient à deux faces et les valeurs p inférieures à 0,05 étaient considérées comme significatives 14 . Les corrélations entre le nombre de cellules intra-épithéliales ou totales et la survie sont présentées, car les corrélations entre le nombre de cellules stromales ou totales et la survie des patients étaient similaires. Un nombre élevé de lymphocytes T CD3 + infiltrants ont montré une tendance à une corrélation avec une survie sans maladie améliorée (0,086, figure 5A ) par rapport à un faible nombre de cellules T ( c'est-à-dire le quartile le plus bas). Lorsqu'on étudie spécifiquement les patients avec un faible nombre de cellules IL-17 + , un nombre élevé de lymphocytes T infiltrant total a été corrélé avec une survie sans maladie améliorée (p = 0,012, figure 5B ). L'effet pronostique des cellules T infiltrantes par la tumeur a été perdu dans le groupe des patients avec un nombre élevé de cellules IL-17 + infiltrantes par tumeur (données non présentées). Ainsi, l'effet des lymphocytes T infiltrant les tumeurs dans OPSCC peut être lié au faible nombre de cellules IL-17 + présentes.
Figure 1: Tissu de cancer de l'oropharyngée FFPE taché par fluorescence à quatre couleurs IHC. Image représentative d'une tache immunofluorescente pour CD3 ( A , rouge), IL-17 ( B Ong>, vert) et FoxP3 ( C , bleu), ainsi que l'image fusionnée combinée avec DAPI (gris) ( D ). Deux cellules autofluorescentes sont indiquées par les flèches. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Contrôle négatif pour CD3. Image représentative du tissu de cancer de l'oropharynx FFPE, coloré comme décrit dans le protocole, en remplaçant l'anticorps anti-CD3 par un anticorps anti-isotypes d'Ig de lapin avec une spécificité inconnue. Aucune coloration pour Ig de lapin ( A , rouge) combinée à une coloration pour IL-17 ( B , vert), FoxP3 ( C , bleu) et DAPI ( D , gris) est affichée.2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Contrôle négatif pour IL-17. Image représentative du tissu de cancer de l'oropharynx de FFPE, colorée comme décrit dans le protocole, en remplaçant l'anticorps anti-IL-17 par un anticorps témoin d'isotype Ig de chèvre avec une spécificité inconnue. Aucune coloration pour Ig de chèvre ( B , vert) combinée à une coloration pour CD3 ( A , rouge), FoxP3 ( C , bleu) et DAPI ( D , gris) est affichée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
FFigure 4: Contrôle négatif pour FoxP3. Image représentative du tissu de cancer de l'oropharynx de FFPE, coloré comme décrit dans le protocole, en remplaçant l'anticorps anti-FoxP3 par un anticorps anti-isotype IgG1 de souris avec une spécificité inconnue. Aucune coloration pour IgG1 de souris ( C , bleu) combinée à une coloration pour CD3 ( A , rouge), IL-17 ( B , vert) et DAPI ( D , gris) est affichée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Courbes de survie de Kaplan-Meier. Pour les patients atteints d'un nombre inférieur à la médiane de cellules IL-17 + / mm 2 , les courbes de survie sans maladie sont affichées pour un très faible ( c'est-à-dire le quartile le plus bas) par rapport à un nombre élevé de totaL cellules T ( A ) et une faible ( c'est-à-dire inférieure à la médiane) par rapport au nombre élevé de lymphocytes T ( B ) dans la zone tumorale totale. Reproduit avec la permission du Cancer Immunology Immunotherapy journal 13 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Pour le protocole décrit, l'une des étapes les plus critiques est de déterminer la dilution correcte des anticorps primaires utilisés. La dilution des anticorps secondaires marqués était de 1: 200, comme recommandé par le fabricant de ces anticorps spécifiques à l'Alexa. La dilution des anticorps primaires devrait ensuite être déterminée par une dilution en série, de préférence en utilisant deux échantillons différents du type de tissu souhaité (dans ce cas, OPSCC). La dilution de travail optimale est la dilution à laquelle un signal clair est obtenu, sans bruit de fond et en l'absence de signal pour le contrôle négatif à la même concentration. Des modifications peuvent être apportées en ce qui concerne le type d'anticorps secondaires et le support utilisé, selon le type de microscope disponible et la préférence du chercheur. Si les résultats escomptés ne sont pas réalisés, nous vous recommandons d'examiner le type de diapositives en verre utilisé, car certains sont connus pour causer des problèmes avec les signaux de fond Pour des types particuliers de solutions de coloration ( p. Ex., Perma Blue). Deuxièmement, certains antigènes peuvent être perturbés par l'utilisation de la récupération d'un epitope induit par la chaleur. Dans ce cas, le chercheur peut remplacer l'étape de chauffage du tampon par d'autres techniques, telles que la récupération d'un epitope induite par une enzyme. Troisièmement, si vous utilisez le stylo hydrophobe, le marquage ne doit pas être trop proche du tissu, car cela empêchera la solution de coloration de fonctionner correctement. En ce qui concerne le nombre de sections par échantillon et le nombre d'images requis par section, il incombe au chercheur et à la question de recherche spécifique de déterminer le nombre requis pour répondre à la question de recherche avec un pouvoir statistique suffisant. Pour notre analyse, nous avons utilisé une section par échantillon et quatre images par section. Enfin, lors de l'utilisation d'une coloration immunofluorescente, il faut prendre soin d'utiliser un vernis à ongles pour sceller les feuilles de couverture, car l'alcool présent dans la solution de vernis à ongles peut affecter le signal fluorescent.
Ve_content "> Le protocole décrit ici n'implique pas d'analyse à haut débit. Nous avons essayé d'automatiser cette étape, mais l'interprétation subjective de la taille et de la morphologie cellulaire complique l'automatisation de l'analyse avec les progiciels disponibles à l'époque. Bien que la préparation des tissus Et la coloration peut être automatisée dans une large mesure, le comptage des cellules a été effectué manuellement.Nous avons pu étudier les corrélations entre les sous-ensembles de lymphocytes T infiltrés étudiés et les résultats cliniques en utilisant le protocole décrit. Un nombre élevé de cellules T s'est révélé être corrélée avec une survie sans maladie améliorée chez les patients avec un faible nombre de lymphocytes non-T IL-17 + intratumoraux. Cela suggère que les lymphocytes non-T IL-17 + peuvent être liés à une mauvaise réponse immunitaire dans l'OPSCC, ce qui correspond à la corrélation décrite entre IL-17 et une survie médiocre chez les patients cancéreux 16 .
ImprLes logiciels existants sont maintenant disponibles dans le commerce pour automatiser cette étape et remplacent actuellement l'observation et le comptage de cellules manuelles, ce qui entraînera des résultats plus fiables, objectifs, reproductibles et plus rapides.
En outre, la disponibilité de kits commerciaux permettant le multiplexage des marqueurs immunohistochimiques fluorescents est actuellement à la hausse 17 . Cela permettra de multiplexer jusqu'à 7 marqueurs immunitaires / biomarqueurs différents en combinaison avec un contre-tannage nucléaire. Cependant, nous croyons que le protocole répertorié ici sera encore plus efficace et plus facilement appliqué dans les laboratoires qui ne disposent pas d'infrastructures, de microscopes et de logiciels complexes et coûteux pour l'analyse de coloration multispectrale.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts commercial ou financier.
Acknowledgments
Simone Punt a été soutenu par la licence UL2010-4801 de la Dutch Cancer Society. Nous tenons à remercier tous les coauteurs de l'article original selon lequel ce protocole JoVE est basé sur: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter et Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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