Summary
광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.
Abstract
붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum 발달 유전학 진화 발생 생물학에서 중요한 곤충 모델 생물이되었다. 광 시트 계 형광 현미경 Tribolium 태아의 관찰은 통상 위드와 공 초점 형광 현미경을 통해 여러 장점을 갖는다. 인해 광 시트 기반 현미경의 고유 특성에 살아있는 검체의 3 개 차원 이미지는 높은 신호대 잡음비로 기록 될 수 있고 상당히 여러 지속 기간 동안 광 탈색뿐만 아니라, 다 방향을 따라 광 독성 감소 일. 방법론 개발 및 지속적인 데이터 증가의 4 년 이상으로, 시간은 Tribolium 지역 사회에서 빛 시트 기술의 사용에 대한뿐만 아니라 곤충 사회에서 큰에서 표준 운영 절차를 수립하는 것이 적절 보인다. 이 프로토콜은 F 적합한 세 실장 기술을 설명또는 다른 목적은, 장기 라이브 영상에 적합한 두 개의 새로운 맞춤형 유전자 변형 Tribolium 라인을 제시 고정 배아의 세포 내 구조 레이블을 다섯 형광 염료를 제안하며, 기록 된 데이터의 적절한 평가를위한 데이터 후 처리에 대한 정보를 제공합니다. 대표 결과 장기 라이브 영상 광학 절편 복수 방향을 따라 동일한 태아의 관찰에 집중한다. 각 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 마지막으로, 프로토콜은 라이브 영상 분석, 전류 제한 및 다른 곤충 종에 설명 된 절차의 적용을위한 품질 관리에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 주로 표준 실험실 장비를 능가 이미징 솔루션을 추구 발달 생물 학자를위한 것입니다. 그것은 개발하고 마이크로을 수정 기술적으로 지향 실험실 / 지역 사회 사이의 격차를하기 위해 지속적인 시도를 촉진방법 론적으로 복사 및 기술 문제에 '플러그 앤 플레이'솔루션을 필요로 생명 과학 연구소 / 사회. 또한, 관심의 중심에 생물학적 질문을 움직이는 공리 접근 방식을 지원합니다.
Introduction
어둠 속에의 딱정벌레의 대가족 (Tenebrionidae)에 속하는 붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum는 농업 및 생명 과학에서 오랜 역사를 가지고와 과일에 이어 두 번째로 최고의 연구 모델 곤충 모델 생물은 노랑 초파리 비행입니다. 지난 사십 년 동안, 여러 가지 이유로 배아 형태 형성에서, 지난 20 년 동안, 진화 발생 생물학의 발달 유전학 강력하고 인기있는 곤충 모델 생물되었고 :
초파리와 Tribolium 모두는 Holometabola에 속하지만, 약 300 만 년 전 1, 2, 3, 4 분기. 높은 파생 초파리의 배아 발달이 일반적으로 생각하는 동안, Tribolium는 (STABLE)보다 조상 모드를 보여줍니다곤충 종 5, 6, 7, 8, 9의 상당히 큰 비율로 발견 클럽 봉사. 그 구기 및 안테나는 배아 10, 11, 12, 13, 14, 15 중 이미 출현 즉 첫째 Tribolium는 비 involuted 헤드 현상을 나타낸다. 둘째, Tribolium는 짧은 배아 발달, 즉 복부 세그먼트 germband 신도는 16, 17, 18, 19 중 후방 성장 구역으로부터 순차적으로 추가의 원리를 따른다. 셋째, Tribolium 개발하고 나중에 저하두 개의 별도의 배아 멤브레인은 복부를 커버 배아 양막, 완전히 20, 21, 22 배를 감싸고 장막을 즉. 두 막은 중요한 형태 발생 (23)뿐만 아니라 미생물 24, 25 및 탈수 (26)에 대한 보호 역할을한다. 넷째는 embryonically 개발 다리는 애벌레 삶의 단계에서 완벽하게 작동하며, 번데기 변태 27, 28, 29, 30, 31 중 성인 다리의 primordia 역할을합니다.
때문에 작은 크기와 겸손한 요구에, 실험실에서 Tribolium의 재배는 매우 간단합니다. 야생형의 문화 (WT) 균주 또는 형질 전환 라인들은 전형적으로 약 100-300 성인 구성 및 전체 그레인 밀 구성 성장 배지 서너 센티미터 (약 50g 충전 한 리터 유리 병 (발자국 80cm 2)) 내에서 유지 될 수있다 밀가루는 비활성 건조 효모와 보충. 물 공급이 필요하지 않습니다. 이 소형 또는 중간 크기 상업적으로 이용 가능한 곤충 인큐베이터 내에서 딱정벌레 문화의 수십 유지하기 위해 아주 작은 실험실을 할 수 있습니다. Tribolium 이후 발달 단계 (유충 후 약 네번째 령, 번데기 어른) 쉽게 체질하여 성장 배지로부터 분리된다. 동기화 배아 알을 낳는 매체 단기간 성인 배양함으로써 얻어진다. 재고 유지는 일반적으로 22 ~ 25 ℃에서 수행되는 동안 급속한 발전을 위해, 딱정벌레 문화가 32 ° C (세대 당 약 4 주)에 보관 (약 십주 세대 당).
지난 십 년간 내에서, 많은 표준 절반신흥 모델 생물 책 (32)에 요약 된 바와 같이 hniques 점차 적응 Tribolium 위해 최적화되었다. 매우 중요한 배아 (33) 유전 적 방법, 유충 34, 35 또는 부모 36, 37 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운, 어느 피기 38, 39 또는 미노스 40 트랜스 장치 및 CRISPR / Cas9 기반 게놈 생식선 변환 전진 엔지니어링 41. 또한, Tribolium 게놈은 10 년 전의 42 내지 약 서열화되었으며, 효율적인 게놈 전체의 식별 및 유전자 44 체계적 분석이 가능 조립체 (43)를 해제 게놈 번째 라운드에서 지금 (45), (46). 또한, 다른 네 coleopteran 종의 게놈 비교 유전자 접근법 47, 48, 49, 50 가능하다. 게놈 시퀀싱에 대응하여 두 개의 대규모 유전자 분석은 삽입 성 돌연변이 유발의 스크린 (51) 및 체계적 RNA 간섭 기반 유전자 녹다운 화면 (52), (53), 즉, 실행되었다.
위드, 촛점 또는 광 시트 기반 현미경 (LSFM)와 형광 라이브 영상 다차원 컨텍스트 (표 1)에서 시간의 함수 (즉, 형태 형성)로서 Tribolium 배아의 형태를 관찰 할 수있다. 위드와 공 초점 형광 현미경에서, excitATION과 출사 광은 동일한 대물 렌즈를 통해 안내된다. 두 접근법에서, 전체 시료마다 기록 된 2 차원 평면에 대해 조사된다. 따라서, 표본은 매우 높은 에너지 레벨을 실시한다. LSFM에서, 초점면에서 단지 형광 인해 두 개의 수직 배열 대물 렌즈 (도 1)를 이용하여 조명 및 검출 디커플링 기쁘게. 단일 평면 조명 현미경 (SPIM)와 디지털 스캔 레이저 광 시트 기반의 형광 현미경 (DSLM, 그림 2) - - LSFM 두 규범적인 구현으로 제공하고 기존의 방법에 비해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다 : (I) 고유의 광학 절편 기능, (ⅱ) 좋은 축 해상도, (Ⅲ) 광 표백 강하게 감소 레벨 (IV)의 매우 낮은 광 독성, (V)이 높은 신호대 잡음비 (VI)의 비교적 높은 수집 속도 (VII) 이미징 여러 방향 및 (VI 함께낮아서 개구 조사 대물 렌즈 (54), (55), (56)의 사용과 ⅱ) 깊은 조직 침투.
LSFM 이미 성공적으로 거의 전체 배아 형태 형성 57을 기록하고 지느러미 폐쇄 (23)의 시작 부분에 여분의 배아 막 파열의 원칙을 분석 Tribolium에 적용되었습니다. 현미경은 편의성 될 곳은 표준 운영 절차를 수립하고, 방법, 프로토콜과 수준으로 자원의 풀을 개선하기 위해 매우 중요하다의 Tribolium 지역 사회와 일반 곤충 과학에 대한 LSFM의 매력을 높이려면 발달 생물학 실험실에서 표준 도구를 -USE, 생물학적 질문 관심의 중심에있어.
이 프로토콜은 Tribolium의 기초 <시작/ EM> 재배, 즉 유지 보수, 복제 및 배아 수집. 다음으로, 두 실험 전략들이 도시되어있다 : (I) 라이브 주문품 제닉 라인 화상 및 형광 염료 (표 2)으로 염색 하였다 고정 배아 (II) 촬상. (I) 아가로 오스 컬럼 (II) 아가 반구 및 (iii) 신규 거미줄 보유자 :이어서, 약간 다른 목적 세 실장 기술 상세 (도 3 및 표 3)에 설명되어있다. 이 프로토콜은 다음 LSFM와 데이터 수집 절차를 설명합니다. 이미징 양식 및 주요 고려 사항이 설명되어 있습니다. 마지막으로, 배아 검색 설명한다 기본 데이터 처리를위한 제안을 제공한다. 대표적인 결과, 라이브 영상 데이터 개의 신규 주문 제작 및 글 리아 블루 58 개 트랜스 제닉 라인이 도시되어 있고, 각 촬상 데이터 세트는 다운로드 가능한 자원으로 제공된다. 또한, 이미지형광 염료의 다양한 염색 고정 배아의 데이터가 표시된다. 토론은 품질 관리, 라이브 이미징 방식의 전류 제한 및 다른 종의 프로토콜의 적응에 초점을 맞추고 있습니다.
프로토콜은 샘플 챔버 통상적 직경 금속, 플라스틱 또는 유리로 만들어진 원통형 요소 표준 시료 홀더 (54), (59), (60)에 대해 회전 가능한 클램프기구가 장착되어 광 시트 계 형광 현미경 작성된 밀리미터 범위이다. 이 프로토콜은 두 규범적인 구현 예 및 SPIM DSLM뿐만 아니라 둘 이상의 조명 및 검출 아암 (61) (62) (63)에 대한 설정에 적합하다. 대표적인 결과는 두 채널의 스펙트럼 데이터를 표시, 녹색 (IL488 nm의 레이저 검출 관통 필터 대역 통과 70분의 607 관통 필터)와 레드 (a 561 nm의 레이저로 조명 검출 대역 통과 50분의 525)하지만, 프로토콜 lumination 서너 스펙트럼 채널로 확장 될 수있다.
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Protocol
Tribolium 문화의 1. 축산
주 : 표준 조건 / 12 시간 다크 사이클 밝은 12 시간에서 25 ° C 및 상대 습도 70 %의 항온 처리 온도로 정의된다. Tribolium 사육에 대한 자세한 내용은 각각의 가이드 라인은 64 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 kg의 양으로 제조하고 몇 달 동안 저장 될 수있는 두 개의 서로 다른 밀가루 기반 미디어가 필요합니다.
- 이전 밀가루와 비활성 건조 효모와 협력, 24 시간 동안 -20 ° C에서 개봉 패키지를 저장 한 다음 실온으로 가온 수 있습니다. 이 절차는 잠재적 인 병원균을 제거합니다.
- 710 ㎛의 메쉬 크기의 체를 통해 전체 곡물 밀가루 및 비활성 건조 효모를 통과 한 후 비활성 건조 효모를 체질 (w / w)의 5 %로 체질 전체 곡물 가루를 보충하여 증식 배지를 준비한다.
- 250 & #와 체를 통해 405 고급 밀가루와 비활성 건조 효모 전달181; m 메쉬 크기는 다음 비활성 건조 효모를 체질 (w / w)의 5 %로 체질하여 405 미세 소맥분을 보충하여 알을 낳는 매체를 준비한다.
- 을 통해 각각의 Tribolium 문화 전달 와 체 800 μm의 메쉬 크기입니다. 남은 성장 매체를 폐기하십시오. 큰 유리 접시에 유충, 번데기 및 성인을 전송합니다.
- 더 자손 문화가없는 경우, 새로운 자손 문화를 정착하기 위해 새로운 유리 병에 약 80 유충 및 / 또는 번데기를 전송합니다. 더 유충 및 / 또는 번데기가없는 경우는, 대신에 40 성인을. 성장 매체의 50g을 추가하고 표준 조건 하에서 배양한다.
- 촬상 문화를 정착하기 위해 다른 새로운 유리 병에서 300 성인 (500-700 mg)을 수집한다. 성장 매체의 50g을 추가하고 표준 조건 하에서 배양한다. 이미징 문화 배아 수집하기 전에 신선한 성장 매체에 최소 24 시간 동안 정착을 허용합니다.
- 이미징 문화 적어도 매 2 우리의 성장 매체를 교체배아 수집과 함께 수행 될 수 EKS (3.2 참조). 이 3 개월 후, 자손 문화의 새로운 성인 완전히 영상 문화를 대체합니다.
- 비 동형 접합 유전자 변형 라인을 사용하는 경우, 비 형질 전환 동물을 제거하여 자주 자손 문화를 보좌 신부. 각 트랜스 치명적인없는 경우 또는 무균 양쪽 염색체 상에 존재하는 경우가 발생 이상적으로, 동형 접합 라인을 생성한다. 동형 배양은 전형적으로 높은 평균 형광 수준이 단지 하나의 유전자형이 존재하기 때문에 전체 실험 조건은 좁다.
2. 현미경 설정 및 교정
참고 : Tribolium 배아가 약 600-660 μm의의 전후방 길이 약 300-330 ㎛의 횡단 직경을 가지고있다. 대부분의 현대의 CCD 카메라는 약 9mm 365 mm의 센서 칩의 크기가 11.4 ㎛의 직경, 및 6.45 ㎛의 화소의 화소, 즉 거리.배율 10 배의 대물 렌즈와 결합하면, 배아는 0.645 ㎛의 화소 피치 토토에 이미징 될 수있다. 대부분의 현대 sCMOS 카메라는 21.3 ㎛의 직경 즉, 약 16mm X 14mm의 큰 센서 칩의 크기, 및 6.5 ㎛의 화소 픽셀의 거리를 갖는다. 배율 20 배의 대물 렌즈와 결합하면, 배아는 0.325 ㎛의 화소 피치 토토에 이미징 될 수있다.
- 현미경으로 조명 및 검출 대물 렌즈를 부착. 레이저와 형광 필터는 형광 흡수 및 방출 스펙트럼 매우 잘 일치하는지 확인합니다.
- 현미경으로 샘플 챔버를 연결합니다. PBS pH를 7.4 또는 임의의 다른 적절한 이미지 버퍼와 샘플 챔버를 채운다.
- 에 전환하고 현미경을 교정. 종합 교정 (더 구체적으로 DSLM 구현을위한) 맞춤형 라이트 시트 기반의 현미경에 대한 루틴 및 문제 해결 가이드 라인 홍보를 발표되었다eviously 65. 상업 장치의 경우, 매우 신중 제조업체의 지침을 따르십시오. 매체의 샘플 실을 고갈 및 악기뿐만 아니라 시편에 혼란이 발생할 수 있습니다 잘못 취급.
형질 전환 또는 WT 배아의 3 컬렉션
- 800 ㎛의 메쉬 크기의 체를 통해 촬상 콜로니 합격. 새로운 유리 병에 성인 딱정벌레를 수집하고 알을 낳는 매체의 10g을 추가합니다. 빛이 1 ~ 25 ° C에서의 H 및 70 %의 상대 습도에 대한 알을 낳는 문화 인큐베이션.
- 약 30-100 배아를 포함하는 알을 낳는 매체로부터 분리 성인 800 ㎛의 메쉬 크기의 체를 통해 알을 낳는 배양 합격. 새로운 유리 병에 성인을 전송하고 신선한 성장 매체의 이전 또는 50g 중 하나를 추가 할 수 있습니다.
- 관찰 균일 배반 엽 단계 (예를 들어, 데이터 세트 DS0002)에서 시작하는 경우는, 25 ° C, 70 % 상대 습도에서 15 시간 동안 달걀 누워 배양 배지. 티O germband 후퇴 (예를 들어 데이터 집합 DS0001 및 DS0003)의 처음부터 시작, 32 ° C, 70 % 상대 습도에서 23 시간 동안 배양 배아. 다른 발달 단계가 요구되는 경우, 각 문헌 64, 65를 참조하여 필요한 배양 시간 및 / 또는 온도를 적용.
4. 배아 Dechorionation
주 : 융모막의 껍질의 외부 층과 단백질 및 다당류로 구성된다. 또한 강하게 흡수하지만 적절한 광 발전하지 필수적이며, 따라서 화학적으로 제거 될 수있다.
- 300 μm의 메쉬 크기의 체를 통해 알을 낳는 매체를 전달합니다. 100 ㎛의 메쉬 크기를 갖는 셀 스트레이너의 배아를 수집하고 남은 알을 낳는 매체 버린다.
- 다음과 같이 6 개의 웰 플레이트를 제조 : 10 ㎖의 PBS pH 7.4의 PBS 용액 9와 B1 및 B2 웰으로 A1, A2, A3 및 B3 웰 채운다. 그런 다음 조심스럽게 추가B1 및 B2에 1 mL의 차아 염소산 나트륨. 단계 스테레오 현미경 4.8-4.3의 진행 상황을 관찰한다. 주의 차아 염소산 나트륨은 부식성.
- 잘 A1 (PBS pH를 7.4)로 셀 스트레이너를 넣고 부드럽게 교반하면서 1 분 동안 배아 씻는다. 큰 밀가루 입자는 배아에서 분리해야합니다.
- (PBS pH를 7.4 차아 염소산 나트륨)을 B1 웰에 셀 스트레이너로 이동하고 30 초 동안 격렬하게 흔들어 판. 나머지 밀가루 입자는 배아에서 완전히 분리해야한다.
- 잘 A2 (PBS pH를 7.4)로 셀 스트레이너 전송 부드러운 교반하에 1 분 동안 배아 씻는다.
- dechorionation 들어 (PBS pH를 7.4 차아 염소산 나트륨)가 B2 웰에 셀 스트레이너 옮긴다. 융모막 파열 될 때까지 적극적으로 판을 흔들어 배아에서 분리합니다. dechorionated 배아가 일반 실루엣이 동안 융모막은 찢어 가장자리와 얇은 반투명 막처럼 보인다.
- 전송 일즉 셀 잘 A3에 스트레이너 (PBS pH를 7.4), 온화한 교반하에 1 분 동안 배아 씻는다. 어떤 융모막 단편 여전히 세척 후 배아에 부착하는 경우 단계 46를 반복한다.
- B3를 잘 (PBS 산도 7.4)에서 배아를 보관합니다. 몇 시간 동안 스토리지 배아를 해 있지만, 개발이 계속 마음에 보관하지 않습니다.
- 비 동형 접합체 형질 전환 라인, 비 형광 배아 가능한 한 제거. 고정 및 WT 또는 유전자 변형 배아의 염색의 경우, 6 단계를 계속, 유전자 변형 배아의 라이브 영상을 위해 5 단계를 계속합니다.
5. 난황 막 Permeabilization, 고정 및 염색
주 : 난황 막은 껍질의 내층. 이 형광 염료 통하지 따라서 화학적 염색 전에 투과성이되어야한다.
- 고정 / permeabilization 용액 (1.5 mL의 4 % (PBS 산도를 6.9에서 w / v)의 파라 포름 알데히드와 섬광 바이알 채우기ND 1.5 ㎖의 n- 헵탄). 유리 병에 붓으로 배아를 전송합니다. 알루미늄 호일로 커버 튜브는 형광 광으로부터 보호 분당 50 회전으로 요동 플랫폼에서 30 분 동안 배양. 주의 파라 포름 알데히드는 독성과 부식성, n- 헵탄은 가연성 및 독성.
- 용액을 1 %가 고정 용액을 제거하고 3에서 15 분 동안이어서 한번 PBS pH 7.4의 3 mL의 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100의 15 분 동안 배아 세 번 처리하고 (v / v) 트리톤 X-100 분당 50 회전에 락 플랫폼에서 PBS 산도 7.4. 주의 트리톤 X-100은 부식성이.
- permeabilization 용액을 제거하고, 바이알에 0.5 mL의 염색 액을 추가한다. 예시 염색 용액은 표 2에 제공된다. 분당 50 회전의 요동 플랫폼상에서 밤새 4 ℃에서 염색 배아. 표 2에서 제안 된 염료를 들어, 세척이 필요하지 않습니다.
아가 실장 6. 제조
- 추가 1g 낮은 용융입자가 완전히 용해 될 때까지 아가 100 ㎖ PBS pH를 7.4로 작은 아가 입자가 여전히 존재하면 800 W.에서 마이크로파 오븐에서 2-3 분 동안 혼합물을 가열, 30 개 초 간격으로, 가열 처리를 반복한다. 장착 아가 전술로 오스 고형화 가열하여 재 액화 될 수 있으며, 새롭게마다 준비 할 필요가 없다. 이 과정은 너무 많은 물이 증발하기 전에 5 ~ 6 회 반복 할 수 있습니다.
- 아가로 오스는 아가로 가열 한 다음 두 개의 1.5 mL를 반응 튜브를 채우기 약 40-45 ℃로 냉각하고 thermoblock 35 ° C에서 그 튜브를 유지하도록 허용.
7. 배아 샘플 챔버에 장착 및 삽입
- 옵션 1 : 아가로 오스 컬럼 (도 3A-C, 첫 번째 열 표 3 번째 열)
- 증류수 1.0 ml 주사기 채우고 작은 고무 호스를 사용하여 유리 모세관의 한쪽 개구에 부착.증류수로 모세관 절반을 채 웁니다.
- 붓으로 배아를 선택하고, 다른 유리 모세관 개구의 내측에 배치. 배아 밖으로 건조하기 전에 다음 단계로 신속하게 진행합니다.
- 액체 아가로 오스에 모세관 스틱 천천히 모세관에 배아과 함께 액체 아가로 오스의 몇 μL를 그립니다. 그런 다음 신속하게 배아가 아가로 오스와 함께 드래그되도록 그리기 힘을 증가시킨다. 결국, 아가로 오스의 몇 μL 위 및 배아 이하이어야한다. 몇 분 동안 옆 모세관을 설정하고 아가로 오스 응고 수 있습니다.
- 약 5 mm의 길이에 다이아몬드 유리 커터와 모세관을 줄이십시오. 나머지 단편은 아가 로스를 완전히 충전되어야하며 배아 제 분위수이어야한다.
- 샘플 챔버 내로 핀을 강철 실린더를 넣고 핀 위에 모세관 단편 스틱. 아가로 오스 컬럼으로 몇 밀리미터 F 돌출한다배아를 포함하는 부분과 모세관 단편 ROM.
- 옵션 2 : 아가 반구 (도 3A-C, 두 번째 열 표 3 번째 열)
- 하단 개구의 반구 형태까지 아가 로스 상단에서 강관을 채울 후, 1.0 mL의 주사기에 액체 오스 200 μL를 그린다. 반구 직경 파이프 직경과 동일해야한다. 아가로 오스가 응고 될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
- 붓으로 배아를 선택하고 앞쪽 끝이 접근되도록 브러시의 끝 부분에 그것을 재 배열. 얇은 필름을 덮도록 액체 아가로 오스 반구 찍어.
- 똑바로 아가로 오스 반구의 기둥에의 앞쪽 끝이 배아를 놓습니다. 주위의 강관을 켜고 브러시와 배아의 위치를 수정합니다. 필요한 경우, 배아 / 반구 테두리로 오스 2 μL를 첨가하여 태아를 안정. 이상LY는 배아 표면의 절반 미만 아가 로스에 덮여되어야하며, 측면은 가능한 가파른한다.
- 천천히 샘플 챔버에 반구 배아와 강관을 삽입한다.
- 옵션 3 : 거미줄 홀더 (도 3A-C, 세 번째 열, 표 3, 네 번째 열)
- 붓과 배아를 선택하고 옆에 놓습니다.
- 5-8 μL 액체 아가 로스 거미줄 홀더의 슬롯 형 구멍을 커버 만 얇은 막을 아가 아가까지 유지의 대부분을 제거한다.
- 아가로 오스 필름에 배아를 놓고 위치를 조정합니다. 조심스럽게 슬롯 구멍의 x 축 중심으로 배를 이동하고, 슬롯 구멍의 긴 축과 그 연장 전후방 축 정렬.
- 천천히 샘플 챔버 내로 탑재 된 배아와 거미줄 홀더를 삽입한다. 그것은 여기 및 방출에 방해가되지 않도록 거미줄 홀더를 배치광, X 축 및 Z 축에 대하여 예 45.
8. 광 시트 계 형광 현미경
- 배아는 몇 군데되어야하는 방향 (와 함께 방향)에 따라 결정합니다. 네 방향 (방위 0 °, 90 °, 180 ° 및 270 °를 따라)은 일반적으로 좋은 트레이드 오프에 따르면, 에너지 부하 사이를 제공한다.
- 형광 채널의 수를 설정합니다. 각 채널에 대한 주요 파라미터는 레이저 선, 형광 필터, 레이저 파워 및 노출 시간이다. 장기 라이브 영상의 경우, 집단 에너지 부하가 배아의 허용 오차를 초과하지 않는 것이 중요합니다. (100) 300 μW 사이에 레이저 파워는 배아의 생존에 영향을 미치지 않습니다 동안 25-50 MS의 노출 시간이 빠른 영상을 보장합니다. 고정 된 샘플의 노출 시간과 레이저 출력하기위한 적어도 두 배가 될 수있다.
- 라이브 영상 분석의 경우, 시간 경과를 구성합니다. 완Tribolium의 LETE의 배아 실온 (23 ± 1 °의 C)와 32 ~ 35 °에서 덜 세 이상 64 일 C에서 7 일 정도 걸린다. 관찰되어야 형태 발생 이벤트에 따른 시간 간격을 정의한다. 짧은 시간 간격을 위해, 노출 시간 및 레이저 파워 (8.2 참조) 낮추.
- 레이저에 노출시키지 않고 시야의 중심으로 X 축 및 Y 축을 따라 투과광 모드에서 배아를 배치. 설치 과정에서 발생했을 수있는 손상 배아를 검사하는 90 단계에서 360 °로 배아를 돌립니다.
- 현미경은 Z 축과 dorsoventral 축, 즉, 예를 들면, x 축과 가로 축과 축 배아 축 정렬 Y 축 주위에 적절히 회전 배아. 거미줄 홀더 기술을 사용하는 경우, 정렬이 가능하지 않을 수 있습니다.
- 형광 모드에서, FO는 Z 스택을 정의각 방향 r에. 앞의 버퍼 공간 및 배아 뒤 25-50 μm의 추가. 버퍼를 포함하여 통상적 인 Z-스택은 Tribolium 배아 동안 주위 350-400 μm의 커버. 또한 4 번 좌우 간격이어야 Z-간격을 정의하는 X 방향을 따라 간격을, 즉, 66-Y는 축.
- 두 개 이상의 배아를 병렬로 이미지화하는 경우, 다음 배아와 8.4에서 다시 시작합니다.
- 장기 이미징, 샘플 챔버는 충분한 PBS pH를 7.4 또는 다른 촬상 버퍼 충전되도록. 또한 샘플 챔버 개구 커버.
- 이미징 프로세스를 시작합니다. 장기 라이브 영상의 경우, 모든 배아에 대한 모든 채널에서 모든 방향에 따라 올바른 인수를 모니터링 할 수 있습니다. 때때로 배아가 살아 있고 적절한 위치에있는 그 다음 일 동안 확인.
9. 배아 검색 및 품질 관리
- 이미지가 완료되면, 시료 홀더를 제거시료 챔버로부터 배아. 라이브 영상 분석에서 단 배아를 검색해야합니다. 고정 및 스테인드 배아는 폐기 될 수있다.
- 라이브 영상 분석을 수행 한 경우, 오브젝트 슬라이드 배아 옮긴다. 아가 로스 컬럼 방식의 경우, 메스, 마이크로 칼 면도날 아가 주변에서 배아를 추출한다. 아가 반구 기술에서, 객체 슬라이드 평탄면 반구 옮긴다. 배아 제거가 필요하지 않습니다. 거미줄 홀더 기술에서 부드럽게 붓 아가 막 배아를 분리. 유충이 부화까지 표준 조건 하에서 포화 습도 환경에서 작은 유리 접시 오브젝트 슬라이드 인큐베이션.
- 부화 한 후, 24 웰 플레이트의 각각의 웰에 애벌레를 전송하고 각 웰에 성장 배지 500mg을 추가. 표준 조건 하에서 품어. 비 군데 WT 및 유전자 변형 larv에 몇 군데 유충의 총 개발 시간과 형태를 비교AE (토론 참조). WT 개발의 특성을 분석에서, 명백한 형태 수차가 이상적으로 눈에 띄는 없어야합니다.
- 유충되면, 건강한 성인에 개발 같은 배경 변형의 적절한 WT 파트너를 제공합니다. 이주 후, 자손 생산을 확인합니다. 또한 PARES 그들이 간 교배에 의해 자손의 출산을 확인하는 것이 좋습니다. 영상화 된 배아는 비옥 한 자손을 생산하는 비옥 한 성인으로 발전 할 경우에만, 이미징 절차는 비 침습적으로 간주 될 수있다.
10. 이미지 데이터 처리
주 : 화상 데이터 처리를 위해 오픈 소스 화상 처리 소프트웨어 ImageJ에 67 또는 그 유도체 피지 68 권장된다. 두 버전뿐만 아니라 포괄적 인 문서는 www.imagej.net에서 찾을 수 있습니다. LSFM 데이터에 대한 표준 파일 형식은 태그가 지정된 이미지 파일 형식 (TIFF)입니다. 고유 컨테이너 옵션은 STO 수 있습니다이러한 Z-스택 또는 드래그 - 앤 - 드롭을 통해 또는 피지 ImageJ에 개방 될 수있는 단일 파일 내의 Z 최대 돌기 시계열 같은 이미지 스택 분노.
- 필요한 경우, Y 축 (이 이미지 → → 회전 변환)와 배아의 전후방 축을 정렬하는 Z 축 회전 스택. 회전 매개 변수가 아니라 시간 경과와 형광 채널, 각 방향에 대해 개별적으로 설정 될 필요가 있습니다.
- 따라서, Z 스택 자르 최소한의 배경이되도록 X, Y 및 Z 축 (20 - X 축 및 Y 축을 따라 40 픽셀, 5 - z 축을 따라 10면)은 x의 (유지 - 축 및 y 축, 직사각형 선택 도구, 자르기 → 다음 이미지를 사용하여, 슬라이스 키퍼 → 스택 → 도구) → z 축을 사용 이미지를. 자르기 매개 변수는 각 방향에 대해 개별적으로 설정 될 필요가 있습니다,하지만 시간 포인트와 형광 채널하시기 바랍니다.
- 각각의 Z-Z 스택에 대한 최대 투영 계산(스택 → Z 프로젝트 → 이미지, 최대 강도를 선택). 휘도 투영 계산은 하나 개의 공간 차원을 제거 데이터 단순화 절차이다.
- 장기 라이브 영상 데이터의 경우, 처리가 10.1 모든 방향, 모든 시점과 모든 형광 채널 65 10.3 단계를 수행하는 ImageJ에 또는 피지 스크립트를 사용하는 것이 좋습니다. 이상적으로, 채널 방향마다 모든 Z 최대 돌기을 연결 한 TIFF 컨테이너 시계열로 저장. 대안 피지위한 BigDataViewer 69 플러그인 테라 바이트 대용량 데이터를 탐색 할 수있다.
- 트랜스 제닉 라인과 촬상 양상에 따라, 시간 스택의 동적 강도를 조절 인해 광 표백 및 / 또는 형광 발현 변동에 따라 바람직 할 수있다. ImageJ- 또는 피지 - 고유 블리치 보정 기능 중 하나 (이미지 → 히스토그램 매칭 선택 → 블리치 보정을 조정) 또는 dedica테드 소프트웨어 (65)는 제안된다.
- 배아가 / 또는 채널 병합, 방향의 수평 결합 (스택 → 도구 → 결합 → 이미지) 여러 방향을 따라 다수의 형광 채널에서 기록 된 경우 (이미지 → 컬러 → 병합 채널)을 권장합니다.
- 등록 결국 컨벌루션 (71)와 조합하여, 복수의 방향 (70)을 따라 얻은 Z-스택 융합 균일 한 품질 및 해상도 등방성 우수한 3 차원 영상의 계산을 허용한다. 두 플러그인을 오픈 소스와 피지에 미리 설치되어 있지만, 그들은 시편 주변의 랜드 마크의 존재 (형광 마이크로 스피어, 예를 들면 구슬)이 필요합니다.
- 대규모의 정량적 데이터 추출 및 분석을 위해 오픈 소스 프레임 워크 소프트웨어도 사용할 세포핵 72 또는 CEL의 분할 및 추적을 위해, 예를 들어L 자형 인식 (73).
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Representative Results
이 프로토콜은 생활의 형광 이미징 또는 LSFM와 고정 및 스테인드 Tribolium 배아에 대한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 인해 광 표백 광 독성, 그 단면 광학 성능의 직접적인 결과의 낮은 수준으로, LSFM 장기 라이브 영상에 특히 적합하다.
신규 AGOC {} mEmerald ATub'H2B-1 형질 전환 라인은 알파 - 튜 불린 1 촉진제 (74)의 제어하에 histone2B-mEmerald 융합 단백질을 표현한다. 형광 신호는 주로 장막, 난황 여러 신경 세포 클러스터로부터 획득되기 때문에, 그것은, 인핸서 같은 발현 트랩 패턴 (51)을 도시한다. 이 라인을 사용하여, 실온 (23 ± 1 °의 C)에서 배아 발달의 66 시간은 germband 후퇴 및 등쪽 클로저 (보충 영화 1)을 덮고, 기록 하였다. 이라인 헤드의 부속물 (도 4a)과 등쪽 폐쇄 (도 4b) 장막 중에 이주의 역학 내의 신경 클러스터를 시각화 할 수있다. 신규 AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 행은 4 번 행과 같은 형질 전환 유전자를 운반하지만, 다른 게놈 위치. 이것은 명백한 인핸서 트랩 패턴을 보여주지 않지만,이 프로모터 74 전술 한 바와 같이, 형광 신호가 시공간으로 보편적으로 검출된다. 이 라인은 두 깊이 레벨 (도 4c)의 단면의 광학 기능을 설명하기 위해 신장 germband 낭배의 전환에 묘화 하였다. 또 다른 특징은, 특히 실시간 이미징 발달 생물학에서 사용 LSFM 셋업 용 표준 샘플의 회전을 통해 여러 방향을 따라, Z 스택을 획득한다. 예를 들어, 글 리아 - 블루 (58) 라인, 샘플 회전 모든따라서 상기 복부 신경 코드뿐만 아니라 동일한 배아 만 등쪽 사이트에서 제대로 볼 수있는 좌측 머리 로브의 증식 역학 (도 4d 보충 영화 2) 주위 신경교 세포 재구성 관찰 유수 분리기. 이 연구와 관련된 라이브 영상 데이터 세트가 다운로드 가능한 자원, 메타 및 액세스 정보로 제공되는이 보충 표 1에서 발견된다.
라이브 이미징을위한 형질 전환 계통의 선택은 여전히 제한되어 있기 때문에, 작은 형광 염료는 특히 세포 내 구조 레이블을 사용할 수 있습니다. SYTOX 그린 YOYO-1 BOBO -3- 요오드화 핵막 결합 및 녹색 또는 적색 채널 각각 (도 5a)에서 가시화 될 수있는 반면, 핵 셀 및 녹색 채널에 가시화 될 수 결합한다. 이 염료는 특정 배아 구조체를 강조하는 데 사용할 수 있습니다그러한 장막 흉터 (도 5B, 첫 번째 열), 후방 복부 장막 세포 (도 5B, 두 번째 열) 또는 장막 창의 개폐시에 나오는 장막-양막-germband 조직 트라이 층으로서 URES (도 5B, THIRD 다섯 번째 열). 이중 색 얼룩이 알렉사 형석 공역 Phalloidin의 염료로 염색 될 수 액틴 세포 골격과 함께 예를 들면, 핵막을 동일한 두 개의 배아 세포 구조의 시각화를 허용한다. BOBO Phalloidin의-3 (488) (도 5d)와 결합 될 수있는 예를 들어, YOYO-1 요오드화 Phalloidin의 (546) (도 5C)와 결합 될 수있다.
고정 절차는 고유 fluorescenc을 소멸하기 때문에, 수정하고 이미 특정 형광 단백질을 발현 유전자 변형 배아를 얼룩도 편리합니다전자 신호 미미한. 예를 들어, AGOC 핵은 녹색 채널에서 검출되는 {ATub'H2B-mEmerald} # 4 트랜스 제닉 라인에서 배아 Phalloidin의 546 그래서 액틴 세포 골격 적색 채널에 가시가되도록 (도 6으로 염색 할 수있다 ).
도 1 : 기존 위드, 공 초점 레이저 스캐닝 및 광 시트 계 형광 현미경의 비교. 종래 위드 에피 형광 현미경 적절한 필터 또는 광원으로 발광 다이오드의 고출력 광 크세논 아크 / 수은등을 사용한다. 취득한 각 2 차원 영상의 경우, 전체 시료 비 회절 제한된 광 콘으로 조명된다. 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에서, 회절 제한 가우시안 레이저 빔 인 SC시험편을 anned 형광은 코히 런트 포인트 별을 검출한다. 마찬가지로 종래의 위드 에피 형광 현미경으로 전체 시료가 각각 취득한 2 차원 영상에 대한 조명된다. 광 시트 계 형광 현미경에서, 회절 제한 가우시안 레이저 광 검출 축에 수직하게 시편을 조명한다. 형광 검출 중 어느 하나에 의해 평탄면 또는 행 단위이다. 2 차원 화상의 취득 중에, 검출 목적의 초점 평면을 중심으로 단지 작은 볼륨은 여기 광의 영향을 경험한다. 시편의 나머지 볼륨이 사진 독성으로 고생하지 않고, 밖으로의 초점 흐림에 기여하지 않는, 조명되지 인해 사진 표백에 형광 물질을 잃지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : 가벼운 시트 기반의 형광 현미경의 원리. LSFM에서, 조명 및 검출은 적어도 두 개의 광로로 분할한다. 적어도 하나의 검출 아암이 적절한 필터 및 형광 신호 (녹색)의 병렬 검출하는 카메라가 장착되는 동안, 적어도 하나의 조명 아암은 상기 광 시트 (시안)를 생성하는데 사용된다. LSFM 두 규범적인 구현은 하나 (또는 선택)면 조명 현미경 (청색 배경) 디지털 스캐닝 레이저 광 시트 현미경 (적색 배경)을 갖는다. 시험편 서로 광 시트를 이동함으로써, 3 차원 영상을 취득한다. 여러 경로를 따라 정보를 우선적으로 중력에 따라 배향되고, Y 축 주위를 회전 시료로 수집한다.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 라이트 시트 기반의 형광 현미경과 Tribolium의 배아 개발의 녹음에 사용되는 세 가지 다른 장착 기술. (A) 아가로 오스 컬럼은 배아 유리 모세관에서, 내장 된 아가로 오스 컬럼을 푸시 핀 작은 강철 실린더를 말한다. 아가로 오스는 반구 강관에 장착된다. 배아 아가 로스 소량의 반구의 폴에 부착된다. 거미줄 홀더 스틸 실린더의 상부에 장착 된 슬롯 형 구멍 금속 시트이다. 배아는 t에 걸쳐 아가 얇은 필름에 접착되고그는 구멍 슬롯. 밝은 장 현미경 안에서 세 실장 기술 (B) 도식. (C)가인가 DSLM 내에 세 실장 방법. (D) 세 실장 기술로 기록 된 글 리아 블루 제닉 라인 배아 예시 이미지. germband 철회의 발병에있는 배아는 전송 빛의 이미지에 맞게 상단을 향해 지향 자신의 뒤쪽 끝으로 표시됩니다. FM, 형광 모드; ZA, 강도 조정과 Z 최대 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Tribolium 태아의 라이브 영상. (A <등쪽에 고정 germband 후퇴의 전환에 AGOC {} mEmerald ATub'H2B-1 라인의 배아)> / 강한. 이 라인은 증강 트랩 발현 패턴을 나타낸다. 형광 신호는 주로 장막, 난황 및 몇몇 신경 세포 클러스터에서 발견된다. 배아 5 시간의 간격으로 15 시간에 걸쳐 도시한다. 상세 이미지 헤드에 부속 셀 클러스터를 도시한다. 초기에, 클러스터가 여전히 장막 파단시 장막 셀 (제 1 열)에 의해 덮여 있으며, 셀은 헤드의 회전 운동과 함께 따른다. (B) 0시 반 시간 간격으로 1시 반 시간 동안 지느러미 폐쇄 중에 도시 같은 배아. 세부 이미지는 난황을 통해 파열 장막의 이동을 보여줍니다. (C) 위쪽 행 : 낭배의 전환에 AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 라인의 배아 신장 germband합니다. 중간 및 하부 행 : 단일 평면 1:30의 간격 10시 반 시간에 걸쳐 두 깊이에 나타낸다시간. (D) 7시 반 시간 간격으로 50:30 시간의 기간에 걸쳐 도시 germband 후퇴시 글 리아 청색 라인의 배아. 상세 이미지 좌 헤드 로브에서 신경교 세포의 형태 형성의 재구성을 나타낸다. ZA, 강도 조정과 Z 최대 투영; 강도 조정과 PA 단일 비행기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 고정, 염색 및 Iimaging Germband 신장 동안 WT 배아의. 즉 어느 SYTOX 녹색으로 염색 (A) 배아 퍼지 핵 염색이나 YOYO-1 요오드화 BOBO-3 요오다 이드, 즉 두 핵막 얼룩. (B) YOYO-1 요오드 염색 엠브리영형. 상세 장막 흉터 (제 1 열), 큰 후방 - 복부 장막 세포의 핵막 (제 칼럼) 또는 장막의 3 층 티슈 조직 양막과 (제 3 다섯 번째 열까지) 실제 배아 조직을 나타낸다. (C) YOYO-1 요오드화 Phalloidin의 546 (D) (488) 및 Phalloidin의 BOBO -3- 요오드화 이중 색 얼룩 듀얼 색 얼룩. ZA, 강도 조정과 Z 최대 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 : AGOC {ATub 'H2B-mEmerald} 1 행에서 고정 염색 형질 전환 배아 이미지. 이 형질 전환 라인은 mEmerald 라벨을 표현전 배아 발달에 걸쳐 보편적으로 핵 / 염색질 마크 알파 - 튜 불린 1 프로모터의 제어하에 ED histone2B (H2B). 배아는 상기 액틴 세포 골격 / F 액틴 라벨 렉 형석 Phalloidin의 546으로 염색 하였다. ZA, 강도 조정과 Z 최대 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표준 | 형광 현미경의 종류 | ||
| 기존의 넓은 필드 | 공 초점 레이저 스캐닝 | 광 시트 기반 | |
| 대물 렌즈 설정 | 하나 개의 대물 렌즈와, 매체 높은 NA | 두 개의 수직으로 배치 된 대물 렌즈, 조명 : 낮은 NA, 검출 : 높은 NA | |
| 조명 광원 | 백색 광원 및 적절한 필터 (예를 들어 수은 쇼트 아크 램프) 또는 청소 필터 LED 기반 | 청소 필터 레이저 (예를 들어 다이오드 또는 레이저 DPPS) | 청소 필터 레이저 (예를 들어 다이오드 또는 레이저 DPPS) |
| 2 차원 화상마다 조명 | 전체 샘플 | 전체 샘플 (일반적으로 이차원 가우시안 빔 주사) | 에만 초점면 (DSLM 하나 차원 가우시안 빔 주사) |
| 발각 | 평행 (일반적으로 CCD 카메라 또는 sCMOS) | 잇달아 일어나는 (광전자 증 배관) | 평행 (일반적으로 CCD 또는 SCMOS 카메라) |
| 이미징 속도 | 빠른 (이미지 당 밀리 초) | 느린 (이미지 당 초) | 빠른 (이미지 당 밀리 초) |
| 아웃 초점 형광 | 차별없는 | 핀홀에 의해 거의 완전히 차단 (제거 효율이 직경에 따라) | 거의 존재하지 않는 (단 분산에 의한) |
| 공간 차원 | 이 (X / Y) | 삼 (X / Y / z) | 삼 (X / Y / z) |
| 자유의 추가도 | 이 (시간, 형광 채널) | 이 (시간, 형광 채널) | 삼 (시간, 형광 채널 방향) |
| 수평 해상도 | 아르 자형 (0.6 λ / NA) | 0.66 R (0.4λ / NA) | 아르 자형 (0.6 λ / NA) |
| 광학 절편 기능 | 아니 | 예 (검출 경로 차별) | 예 (조명 통로 (75)를 차별) |
| 가용성 및 가격 | 주로 상업, 저렴한 비용 | 주로 상업, 비싼 | 상업, 비싼 고객의 주문에 따라 만들 수있는, 적당한 54,59,60,75 |
| Tribolium 배아를 커버하는 라이브 영상 간행물 | 여섯 44,76,77,78,79,80 | 일곱 23,77,79,81,82,81 (회전 디스크 공 초점) 83,84,85 | 네 23,57,65,86 |
표 1 - 형광의 특성Tribolium에 사용되는 후부 현미경 기술은 이미징을 살고 있습니다.
| 물든 색 | 더럽히는 것 | 노동 희석 |
| SYTOX 그린 | 핵 (퍼지) | 1 : 10,000 (1 : 2 O DDH 100 및 1 : 1 %에서 100 (PBS에서 w / v)의 BSA) |
| 유유-1 요오드 | 핵 봉투 | 1 : 10,000 (1 : 2 O DDH 100 및 1 : 1 %에서 100 (PBS에서 w / v)의 BSA) |
| 보보 - 3 요오드 | 핵 봉투 | 1 : 10,000 (1 : 2 O DDH 100 및 1 : 1 %에서 100 (PBS에서 w / v)의 BSA) |
| 알렉사 플 루어 488 Phalloidin의 | 액틴 세포 골격 | 1 : 100 (1 % (PBS에서 w / v)의 BSA)에서 |
| 알렉사 플 루어 546 Phalloidin의 | 액틴 세포 골격 |
표 2 - 솔루션을 염색.
| 아가 로스 칼럼 (옵션 1) | 반구 (옵션 2) | 거미줄 홀더 (옵션 3) | |
| 이론적 해석 | 배아 모세관 밖으로 밀려 아가 로스 컬럼에 포함 | 배아의 뒤쪽 끝은 아가로 오스 반구의 극에 붙어있다 | 배아는 슬롯 구멍에 걸쳐 아가 얇은 필름에 접착되고 |
| 샘플 홀더 | 핀 강철 실린더 | 쇠 파이프 | 강철 실린더 슬롯 구멍 |
| 무제한 (모든) | 무제한 (모든) | 네 (0 °, 90 °, 180 °, 270 °) | |
| 필요한 기술 수준 | 보통의 | 높은 | 낮은 |
| 배아 주위에 아가로 오스 | 높은 | 낮은 | 보통의 |
| 세션 당 배아의 수 | 최대 세 | 하나 | 최대 6 |
| 배아 검색 | 교활한 | 쉬운 | 쉬운 |
| 일회용 장비 | 유리 모세관 | - | - |
| 권장 | 단기 라이브 영상, 스테인드 배아 | 장기 라이브 영상 | 장기 라이브 영상, 스테인드 배아 |
| <strong>을 참조 | 세 23,87,88 | 두 57,65 | 이 책 |
표 3 - 방법의 장점과 단점을 장착.
| 수차 표현형 유도 | 이론적 해석 | 단계 | 참조 (방법론) |
| 배아 RNA 간섭 | 이중 가닥 RNA는 넉다운 하나 이상의 특정 유전자를 세포 융합 배반 엽 단계에서 배아에 주입 | 단계 480 후 배아를 주입. | 두 33,81 |
| 부모의 RNA 간섭 | 이중 가닥 RNA는 FEMA에 좌우 주입자손에서 유전자 녹다운 리드 복부 세그먼트 (3, 4) 사이 르 번데기, | 단계 1.5에서 번데기을. | 두 36,37 |
| 열성 배아 치명적인 돌연변이 라인 | 25 % 동형 접합체 돌연변이 자손에 대한 열성 배아 치명적인 돌연변이 이형 수율을 수행 알을 낳는 문화 | 단계 1.5 동안 이미지 라인에 돌연변이 선을 넘어. | 세 39,51,89 |
| 외부 요인의 적용 | 특정 생체 활성 또는 독성 인자 extrinsically 촬상 버퍼에 추가하여 배아에 적용 | 단계 2.2 화상 중에 버퍼에 인자를 추가한다. | 두 83,85 |
표 4 - 수차 표현형의 LSFM 라이브 영상
보충 표 1 - 장기 라이브 이미징 데이터 집합 DS0001-0003에 대한 메타 데이터 및 매개 변수. 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 - 1 AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 형질 전환 라인에서 Tribolium 배아의 라이브 영상.
이 라인은 증강 트랩 발현 패턴을 나타낸다. 형광 신호는 주로 장막, 난황 및 신경 세포의 서브 세트에서 발견된다. 배아는 시점 간 0시 반 시간 간격으로 66:00 00:00 H H에서 4 방향을 따라 도시되어있다. 영화는 germband 철회의 시작 부분에서 시작 등의 폐쇄가 완료되면 종료됩니다. 프레임 속도는 초당 다섯 개 프레임입니다. ZA,강도 조정과 Z 최대 투영. 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 2 - 글 리아 - 블루 형질 전환 라인에서 Tribolium 배아의 라이브 영상.
배아는 시점 간 0시 반 시간 간격으로 66:00 00:00 H H에서 4 방향을 따라 도시되어있다. 영화는 germband 철회의 시작 부분에서 시작 등의 폐쇄가 완료되면 종료됩니다. 프레임 속도는 초당 다섯 개 프레임입니다. ZA, 강도 조정과 Z 최대 투영. 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
품질 관리
라이브 영상 분석에서, 준비 및 녹음 과정은 기계적 및 화학적 처리 (샘플 홀더에 장착 수집, dechorionation)도 관찰 기간 동안 집단 에너지 부하도, 즉 표본의 생존에 영향을해야, 비 침습적해야합니다. WT 개발의 특성을 연구 들어, 배아가 성공적으로 검색되고, 녹음 과정을 생존하고 건강한 성인으로 발전하는 실험에서만 사용 데이터를 권장합니다. 성인은 비옥해야한다, 어떤 형태 수차를 안되며, 그 자손은 비옥해야합니다. 특히 장기간의 라이브 영상 분석 낮은 생존율에 대한 세 가지 주요 이유가 있습니다 :
우선, 배아 표면 아마도 이온과 가스 교환을 방해하고, 배아를 수축 mechan 7 단계 동안 아가 광범위 덮었다전신적. 영향을받는 배아는 초기 배 발생 동안 몇 군데 특히, 일반적으로 몇 시간 동안 눈에 띄지 않게 개발 갑자기 체포하고 신속하게 자신의 형광 신호를 잃게됩니다. 표면 점유율 절반 매우 얇은 아가 층으로 덮여에서 약간의 경험, 반구 기술을 사용하여 아가 로스에 포함되는 표면 분율 반면 거미줄 홀더 기법, 1/3 이하로 유지 될 수있다. 둘째, 배아에 적용되는 통합 에너지 부하는 허용 오차를 초과합니다. 단계 8.2에서 주어진 값은 엄지 손가락의 규칙 역할을하지만, 다음과 같은 기준을 고려하여야한다 : 초기 배아 개발하는 동안 (내가) 배아가 늦게 배아 개발하는 동안 배아뿐만 아니라 (II)하지만 통합 된 에너지를 레이저 조사를 견딜 수없는 낮은 노출 시간 또는 더 긴 시간 간격 중 하나와 부하가 동일 할 수도, 더 높은 레이저 파워가 높은 노광 시간 이하의 시간 간격으로 낮은 레이저 파워보다 더 스트레스를 보인다형광 발현 강도가 레이저 조사 내성에 반비례하는 것으로 보인다 반면, (ⅲ)보다 높은 파장은, 일반적으로 더 내약성 및 (ⅳ) 형질 전환 라인에 대해, 허용 한계 라인 구체적으로 표시된다. 또한, 융합 단백질의 설계 및 / 또는 세포 내 현지화는 역할을한다. 셋째, 배아는 설치 과정 중에 손상되었습니다. 여기서 가장 중요한 요소는 차아 염소산 나트륨 용액에서 배양 시간이 완전히 융모막을 제거하는 데 필요한만큼 짧은 것입니다. 긴 배양 시간은 태아에 손상을 줄 수있는. 케어도에 구멍이나 브러시로 배아를 압착하고, 주위 온도에서 아가로 오스 설치 유지하지 않도록주의해야한다. 손상된 배아는 실제 이미징 프로세스 전 단계 8.4 동안 식별 할 수 있습니다 손상된 배아가 가능한 것들로 대체 할 수 있도록 시작한다.
엠브리의 그 지침에 따라, 일반적으로 약 85~90%으로OS는 라이브 영상 절차 및 해치 살아남. 부화 된 배아의 약 90 %가 건강하고 비옥 한 성인으로 발전. 생존 비율은 온도 이미징 (아가 로스 컬럼하게는 절반보다 하루 이미징 동안 사용되는 경우) 기술을 장착 독립적으로 보이지만 경미 레이저 조도의 상승 된 수준으로 감소한다. 특히 형광 라이브 영상 또는 포괄적 인 실험 순서의 전구체로서 위상을 확립 프레임 워크에 대한 맞춤형 유전자 변형 라인의 초기 특성 동안 추가 제어로서, 몇 군데에 병렬로 비 군데 WT 및 유전자 변형 배아를 실행하는 것이 좋습니다 이들 개발 시간 및 형태 65 영상화 된 배아와 동일한 온도에서 배양 한 배아 비교된다.
또한, 라이브 영상을 통해 수차 표현형 (표 4)의 특성 연구는 또한 영향을받지 않는 C를 실행해야합니다병렬 조작부 배아. 최대한 유사 모두 배아의 치료를 유지하는 것이 좋습니다,하지만 각 실험 전략에 대해 개별적으로 고려되어야한다 :
녹다운 RNA 간섭을 통해.
배아 RNA 간섭 (33), (81) 같은 알을 낳는 배양 물로부터 유도 된 배아는 하나 또는 제어 기능의 이중 가닥 RNA를 주입한다. 상이 주입 배아는 아가 로스 컬럼 또는 거미줄 홀더 기술을 사용하여 동일한 LSFM 동시에 이미징한다. 부모 RNA 간섭 36, 37, 촬상 개의 계대 배양으로 분할한다. 다른 배양 제어가 이중 가닥 RNA를 주입해야하는 동안 배양 한 암 번데기는 기능의 이중 가닥 RNA를 주입한다. 배아 콜ection 병렬로 수행 한 실험 및 제어 배아 아가 열 또는 거미줄 홀더 기술을 이용하여 동일한 현미경 동시에 묘화 될 수 모두한다.
열성 배아 치명적인 돌연변이 라인.
열성 배아 치사 변이체 39, 89, 91, 92, 93로 작업 할 때, 정상 표현형 띄지있는 이형 돌연변이, 수율 이론적으로 25 % 동형 접합성 돌연변이 자손의 알을 낳는 배양 (실제 처리 때로는 이하 기인하지만 89를 발행) 및 표현형 띄지 자손 (50 % 돌연변이 이형 25 % WTS)의 75 %. 같은 알을 낳는 문화에서 여러 개의 배아를 마운트 거미줄 홀더 기술을 사용하는 것이 좋습니다. 동형 접합 돌연변이 난을 할 수 있습니다정상적으로 개발 배아 컨트롤 역할을하면서, 표현형의 발현에 의해 영상의 과정을 통해 dentified. 이미징 품질 제어가 완료되면 이미지화 시험편의 유전자형을 결정할 수있다.
외부 요인의 적용.
촬상 버퍼 (83), (85), 예를 들어 동일한 LSFM하여 제어 태아와 함께 생체 활성 또는 독성 물질의 개발이 검토되어 상, 병렬 자기 공명 영상 내의 외적 요인의 영향은 일반적으로 가능하지 않은 경우. 따라서, 촬상을 순차적으로 실행되어야한다. 최적으로, 후속 실험 사이의 시간을 최소화하고, 배아 같은 촬상 배양액으로부터 도출. 대안으로, 두개는 동일하게 구성되고 작동 LSFMs 사용할 수있다. 이 경우, 같은 알을 낳는 시대의 배아를 사용해야하지만, 토륨 매우 중요하다이미징 특성을 비교할 수 있도록 모두 현미경의 전자 교정 신중하게 수행한다. 거미줄 홀더 기술을 이용하여, 각 조건에 대해 여러 배아 한번에 이미징 될 수있다. 아가로 오스 열 기법으로, 외부 요인 배아에 도달 방해 될 수 있습니다.
LSFM 라이브 이미징 방식의 전류 제한
LSFM 여러 다양한 스케일 치수 비 침습적 배아 형태 형성을 분석 할 수있는 강력한 도구이다. 표준 운영 절차는,이 프로토콜의 제안으로, 발생 생물학의 표준 도구로 빛 시트 기술을 확립하는 과정을 지원합니다. 그러나, 접근 방식은 다양한 실험과 조직 수준에 대한 여러 가지 요인에 의해 제한된다 :
처음 LSFM은 한 번에 하나 개의 시료를 분석하기 위해 개발되었다. 모든 전류는 같은 현미경 B 두 개 이상의 배아 동시에 해당 이미지에 접근 Y '스택'아가 열의 Y 축 또는 거미줄 홀더 주소 만 어느 정도이 문제에 따라 시험편. 멀티 웰 플레이트 - 및 coverslip에 기반 설정은 94, 95, 96 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 감소 이미지 품질 고통과 같은 여러 방향을 따라 이미징 LSFM에서 필수적인 혜택의 일부를 희생. 현재, 가장 좋은 방법은 레이저와 같은 고가의 구성 요소, (60)을 공유 할 때 합리적으로 가능하게 병렬로 여러 현미경으로 작업하는 것입니다.
EFA-nGFP 57, 65, 84의 FNL (86)의 머리가 좋은 58, 86은 AGOC {ATub'H2B mEmerald-1}은 {AGOC ATub'H2B mEmerald} - # 4 및 글 리아 블루= "외부 참조"> (58), 장기 라이브 영상에 적합한 경우에만 여섯 맞춤형 유전자 변형 라인은 현재 사용할 수 있습니다. 또한 HC079 (양막)는, G12424 (장막) 및 G04609 (심장) 인핸서 트랩 라인 51 LSFM 23 특성화되었다. 대안 적으로, 형광 배아도 81 mRNA를 생성 또는 주입 염색 (79) 될 수 있고, 이러한 방법은 비교적 간단하지만,도 86의 한계 겪는다. 몇 가지 더 표준은 여전히 특정 비 유비쿼터스 발기인에서 형광 물질이 특정 장기 나 조직을 관찰 표현, cytoskeletal- organelle- 및 막 표지 선이나 선 등이 필요합니다. 이상적으로, 그 라인은 서로 다른 형광 단백질을 사용할 수 있습니다.
또 다른 과제는 LSFM 의해 생성되는 데이터 양이다. 때문에 세 개의 공간 차원과 적어도 세 푸 정보의 취득자유 (시간, 방향, 형광 채널)의 rther도는 라이브 영상 데이터 세트의 크기는 쉽게 몇 테라 바이트에 많은 기가 바이트에 도달 할 수 있습니다. 심지어 입체 자르기 및 TIFF 용기 ZIP 기반 압축 한 후, 본 연구와 관련된 세 개의 예시적인 데이터 세트는 31.6, 12.6 및 45.1 기가 바이트, 즉 총 89.3 기가 바이트의 크기를 가진다. LSFM 작업을 할 때, 데이터 저장 및 처리 (88), (97)에 대한 각각의 인프라가 필요하다.
최고 화질 태아의 표면에서 수득되지만 깊이가 증가함에 따라, 형광 신호가 더 흐리게된다. 예를 들어, germband의 후방 단부 낭배 동안 난황 배 적용되고 적절하게 해결 될 수 없다 (도 4C, 제 1 내지 제 5 컬럼). 여러 방향에 따라 이미지는 적어도 일부에서이 문제를 해결합니다ially - 모든 배아 주위의 표면에서 고품질의 정보를 사용할 수 있지만 내부 영역이 퍼지 남아있다. 현재, 만족스러운 솔루션을 사용할 수 없지만, 장기적으로, 적외선 형광 단백질 (98), 적응 광학 (100)와 유전 적 접근 방법 99 또는 현미경 설정이 고려 될 수있다.
다른 종에 대한 적응
지금까지, LSFM는 과일, 즉, 61, 62, 101 melanogaster의 초파리를 비행 (102)와 붉은 가루 딱정벌레 Tribolium의 castaneum 57 abdita Megaselia 비행 스커틀, 세 가지 곤충 종의 배아 발달을 문서화하는 데 사용되었습니다. 실험 프레임 워크, 여기 말아야 기술 표준 운영 절차 및 장착 기술다른 곤충 종에 쉽게 적응할 수있을 거라고. 다양한 계층에 속하는 많은 곤충 생식선 전이 프로토콜은 꿀벌 104 경제적 및 / 또는 의학적 중요성 종 여러 lepidopterans 105, 106 또는 다수의 모기 종 (107), (108), (109)을 포함하여, 103 있습니다. 형광 실시간 영상에 적합한 각각의 형질 전환 라인, 곤충의 형태 형성은 배아 계통 진화 및 / 또는 생태적 지위를 고려하여 특성화 될 수있다. 약 백만 곤충 종은 설명하고 추가 천만 곤충 종은 대부분 발전이 이상 4억년을 포함, 110 존재한다. 만 비교 방식은 정보를 생성 할 차례 있습니다 provi에단일 종의 발달 원리를 연구함으로써 얻을 수없는 데 통찰력.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
저자 공헌
FS 및 EHKS는 연구를 잉태. FS는 유전자 변형 AGOC 라인을 생성. 광 시트 계 형광 이미징 FS 및 SK에 의해 수행되었다. FS 및 EHKS는 SK의 의견으로 원고를 썼다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원 스벤 플래스합니다. 글 리아 - 블루 형질 전환 라인은 그레고르 버처 (괴팅겐, 독일)에서 일종의 선물이었다. 이 연구는 괴테의 Buchmann 분자 생명 과학 연구소 (BMLS, 감독 엔리코 슐레이프)에서 EHKS 부분적으로 부여 Macromolecular의 단지 (CEF-MC, EXC (115), 스피커 폴커 도이치)에 대한 암마 우수 프랑크푸르트의 클러스터에 의해 투자되었다 Universität 프랑크푸르트 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 홈페이지입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| full grain wheat flour | Demeter e.V. | 1.13E+08 | US: whole wheat flour, UK: whole meal flour |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | 1.13E+08 | US: pastry flour, UK: soft flour |
| inactive dry yeast | Flystuff / Genesee Scientific | 62-106 | |
| Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| sodium hypochlorite, ~12% active Cl | Sigma Aldrich | 425044-250ML | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| low-melting agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | |
| glass capillaries, internal Ø 0.46 mm | Brand GmbH + Co KG | 7087 09 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | 57020 | Staining solution preparation is explained in Table 2 |
| YOYO-1 Iodide | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | Staining solution preparation is explained in Table 2 |
| BOBO-3 Iodide | Thermo Fisher Scientific | B3586 | Staining solution preparation is explained in Table 2 |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Staining solution preparation is explained in Table 2 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22283 | Staining solution preparation is explained in Table 2 |
| sieve, 800 µm mesh size | VWR International | 200.025.222-051 | |
| sieve, 710 µm mesh size | VWR International | 200.025.222-050 | for growth medium preparation (step 1.1) |
| sieve, 300 µm mesh size | VWR International | 200.025.222-040 | |
| sieve, 250 µm mesh size | VWR International | 200.025.222-038 | for egg laying medium preparation (step 1.2) |
| glass dish, Ø 100 mm × 20 mm | Sigma Aldrich | CLS70165102 | |
| cell strainer, 100 µm mesh size | BD Biosciences | 352360 | |
| paint brush, head Ø 2 mm | VWR International | 149-2121 | |
| syringe, 1.0 mL | B. Braun Medical AG | 9166017V | |
| scintillation vials | Sigma Aldrich | M1152-1000EA | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 158127 | Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive |
| n-heptane ≥99% | Carl Roth | 8654.1 | Caution: n-heptane is flammable and toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Caution: Trition X-100 is corrosive |
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