Summary
Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.
Abstract
Filopodia são protrusões celulares dinâmicas, semelhantes a dedos, associadas à migração e à comunicação célula-célula. Para entender melhor os complexos mecanismos de sinalização subjacentes à iniciação filopodial, alongamento e posterior estabilização ou retração, é crucial determinar a atividade da proteína espaço-temporal nessas estruturas dinâmicas. Para analisar a função de proteína em filopodia, desenvolvemos recentemente um algoritmo de rastreamento semi-automatizado que se adapta às mudanças de forma filopodial, permitindo análises paralelas da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteína ao longo de todo o comprimento filopodial. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para otimizar o gerenciamento de células, a aquisição de imagens e a análise de software. Além disso, fornecemos instruções para o uso de recursos opcionais durante a análise de imagem e representação de dados, bem como diretrizes de solução de problemas para todos os passos críticos ao longo do caminho. Finalmente, também incluímos uma comparação do dEscreveu software de análise de imagem com outros programas disponíveis para quantificação de filopodia. Juntos, o protocolo apresentado fornece uma estrutura para análise precisa da dinâmica de proteínas em protrusões filopodiais usando software de análise de imagem.
Introduction
O controle espaço-temporal das proteínas reguladoras da actina está associado à dinâmica do filopodium 1 , 2 . O rastreamento da concentração de proteína resolvida espacialmente ao longo do comprimento todo filopodial através do tempo é, portanto, crucial para avançar a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à iniciação, alongamento, estabilização ou colapso dessas estruturas dinâmicas 3 , 4 . Ao contrário da análise de proteínas no citossolo, onde muitas mudanças de formas de células ocorrem em uma escala maior, filopodia são micro estruturas dinâmicas que constantemente se curvam 5 e se dobram, impedindo a análise usando uma abordagem simples, como uma varredura de linha.
Diferentes soluções de software para rastrear a forma filopodial estão disponíveis 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, software para o rastreamento ratiométrico da dinâmica das proteínas dentro do corpo celular foi desenvolvido 10 , 11 . Para combinar o rastreamento automatizado da forma filopodial e da análise da proteína espaço-temporal, recentemente desenvolvemos um software de análise de imagem baseado no algoritmo convexo-casco 12 . Este novo método de análise, que é operado através de uma interface de usuário gráfica (GUI), combina pela primeira vez, a concentração relativa de proteína ao longo do comprimento filopodial e da velocidade de crescimento, permitindo assim a medição precisa da distribuição da proteína espaço-temporal independente do movimento desses Estruturas dinâmicas 12 .
A idéia por trás do software (o código fonte está disponível gratuitamente, veja abaixo) é que um dos vértices do casco convexo coincidirá com a ponta do filopodium ( Figura 1A ). Ao olhar para o quadro subsequente paraO vértice mais próximo do casco convexo, a dica móvel pode ser rastreada em todo o filme. Uma vez que a ponta é detectada em cada quadro, sua posição é usada para desenhar um eixo juntando a ponta com um ponto de referência na base do filopodium ( Figura 1B ). Finalmente, o uso de pontos nodais equidistantes, cujas posições são determinadas pelo pixel médio com intensidade máxima ao longo da linha ortogonal ao eixo, são usados para determinar uma espinha dorsal que segue a forma filopodial. Aproveitando esse backbone adaptativo, é gerado um kymograph para rastrear o crescimento filopodial e as concentrações de proteína para até três canais ao longo do comprimento filopodial ( Figura 1C ).
Figura 1: Princípio de Trabalho do Software de Análise de Imagem. ( A ) O algoritmo por tráso software. No Passo 1, o usuário especifica a referência (base) e o vértice (a ponta) do filopodium. Na Etapa 2-1, a espinha dorsal do filopodium é obtida usando o pixel médio com valor de intensidade máxima. Na Etapa 3, a espinha dorsal é usada para o perfil de intensidade da proteína espacial. Na Etapa 2-2, o software acompanha automaticamente a ponta no quadro subseqüente. Todo o procedimento itera. ( B ) Instantâneo do algoritmo com filopodium real que apresenta elementos importantes, como o casco convexo que está sendo usado para o rastreamento. ( C ) Visão geral dos parâmetros que podem ser medidos com o algoritmo. Esta figura foi modificada a partir da referência 12 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
O software de análise de imagem é operado no Matlab (conhecido como software de programação) por meio de um uso gráficoR interface. Para maximizar a flexibilidade e a robustez para a configuração experimental particular, o usuário pode ajustar uma série de parâmetros de rastreamento ( por exemplo, ângulo de flexão permitido e movimento entre moldura) e também fazer algumas correções nos filmes ( por exemplo , corte, rotação, remoção de objetos indesejados) ( Figura 2A e Tabela 1) .
| GUI | Não. | Obrigatório | Descrição | Nome (em GUI) | ||||
| # 1 | 1a | Y | Carregando o arquivo .tiff empilhado que representa o corpo da célula (com caixa marcada) ou crie o corpo celular sobreposto a partir de canais | Corpo celular | ||||
| # 1 | 1b | Y | Proteína 1 | |||||
| # 1 | 1c | Y | Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 2 | Proteína 2 | ||||
| # 1 | 1d | Y | Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 3 | Proteína 3 | ||||
| # 1 | 1e | N | Redefine tudo para arquivos de imagem empilhados pré-carregados | Restabelecer | ||||
| # 1 | 2a | Y | Barra de rolagem para determinar a moldura inicial para análise na janela GUI # 2 | N / D | ||||
| # 1 | 2b | Y | Barra de rolagem para determinar o quadro final para análise na janela GUI # 2 | N / D | ||||
| # 1 | 2c | Y | Barra de rolagem representando curdaQuadro nt | N / D | ||||
| # 1 | 2d | N | O valor cinza dos pixels abaixo do qual todos os pixels serão definidos como zero | N / D | ||||
| # 1 | 2e | N | O valor cinza dos pixels acima do qual todos os pixels serão definidos como valores máximos | N / D | ||||
| # 1 | 2f | N | Defina os valores de intensidade dos pixels especificados em <2e> & <2f> | Conjunto | ||||
| # 1 | 2g | N | Jogue o filme ajustado pela intensidade | Toque | ||||
| # 1 | 2h | N | Cortar imagem | Colheita | ||||
| # 1 | 2i | N | Girar imagem | Girar | ||||
| # 1 | 2j | N | Eliminar regiões na pilha inteira | Eliminar regiões | ||||
| # 1 | 3a | Y | Clique para abrir a 'Janela de análise' (janela GUI # 2) | Janela de rastreamento | ||||
| # 1 | 3b | Y | Digite o tamanho de um pixel em microns | Digite o tamanho do pixel | ||||
| # 2 | 4 | Y | Clique para gerar a imagem limite / borda do corpo celular sobreposto | fronteira | ||||
| # 2 | 5 | Y | Clique para selecionar a base e a ponta do filopodia | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | Y | Digite o número de segmentos ou nós | Número de segmentos | ||||
| # 2 | 6b | Y | Digite o comprimento da varredura (perpendicular ao eixo) | Largura de digitalização | ||||
| # 2 | 6c | Y | Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar | Precise Meas after | ||||
| # 2 | 6d | Y | Digite o raio do círculo de detecção da ponta (ou seja, a área onde o vértice pode ser localizado no próximo quadro) | Radius of tip detection | ||||
| # 2 | 6e | Y | Insira o ângulo máximo que o filopodium pode dobrar do eixo vertical | Limiar de ângulo | ||||
| # 2 | 6f | N | Adicione pontos de referência para a base e a dica para esse quadro específico | Selecione referência | ||||
| # 2 | 6 g | N | Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar esse quadro específico | Precise Meas after | ||||
| # 2 | <Td> 6hN | Digite o raio do círculo de detecção para esse quadro específico | Radius of tip detection | |||||
| # 2 | 6i | N | Depois de inserir todos os parâmetros para o quadro específico, clique para armazenar os valores na memória e no arquivo para referência adicional | Adicionar | ||||
| # 2 | 6j | N | Clique para excluir os parâmetros manualmente configurados para essa moldura | Excluir | ||||
| # 2 | 6k | N | Clique para excluir todos os parâmetros armazenados manualmente usando o "painel de recursos opcionais" para todos os quadros | Restabelecer | ||||
| # 2 | 6l | N | Verifique antes de rastrear para armazenar todos os resultados de rastreamento na memória para futuras referências | Traço de história | ||||
| # 2 | 7 | Y | Clique para iniciar o rastreamento | Acompanhar e Analisar | ||||
| # 2 | 8a | N | Clique para iniciar o rastreamento da intensidade do canal protéico | Analisar Intensidades de Proteínas | ||||
| # 2 | 8b | N | Verifique para rastrear a intensidade do canal protéico ao longo do comprimento filopodial | Filopodias inteiras | ||||
| # 2 | 8c | N | Verifique o rastreamento da proteína de referência ou proteína A | ProteinA | ||||
| # 2 | 8d | N | Verifique o rastreamento da proteína B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | N | Verifique o rastreamento da proteína C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8f | N | Cheque para rastrear a intensidade média da proteína naE dica | Ponta principal | ||||
| # 2 | 8g | N | Digite o comprimento da dica | Comprimento da ponta | ||||
| # 2 | 8h | N | Digite a distância mínima da base acima da qual a ponta começa a formar | limite | ||||
| # 2 | 8i | N | Clique para salvar os resultados da análise de ponta líder para arquivar | Botão de apertar | ||||
| # 2 | 9a | N | Clique para iniciar a análise da proteína ratiométrica | Comparar | ||||
| # 2 | 9b | N | Verifique para comparar a proteína B com respeito a A | Log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | N | Verifique para comparar a proteína C em relação a A | Log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <Td> 9dN | Verifique para comparar a proteína B com respeito a A na ponta | Log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | Verifique para comparar a proteína C com respeito a A na ponta | Log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | N | Escolha outro mapa de cores (padrão: Jetplot) | Mapa de cores | ||||
| # 2 | 10b | N | Edite o mapa de cores | Editar o mapa de cores | ||||
Tabela 1: Visão geral de todas as funções presentes na GUI Windows # 1 e # 2.
Uma vez que isso é realizado, o programa cria um casco convexo e rastreia automaticamente a dica ao longo do filme. Parâmetros extraídos do filme, como um kymograph ratiométrico, velocidade de crescimento e comprimento filopodial aÉ exibido e também armazenado na pasta de trabalho como imagens e como arquivos de dados. Outros parâmetros, tais como vida útil filopodial, taxa de crescimento e taxa de retração, podem então ser extraídos e analisados a partir dos arquivos de dados armazenados ( Figura 2B ).
Figura 2: Interface gráfica do usuário para usar o software de análise de imagem. ( A ) GUI Janela # 1 é usada para carregar e processar imagens. O programa pode carregar até 3 canais de proteína, pelo que 2 canais são comparados em par. A janela vem com características obrigatórias (azuis) e opcionais (verde) para pré-processamento das imagens antes do rastreamento ( B ) GUI A Janela # 2 é usada para rastrear análises de proteínas filopodium e spatio-temporais e métricas. Novamente, os recursos opcionais estão marcados em verde. Esta figura foi modificadaDa referência 12 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para preparação de amostras e manipulação de software. Começamos com instruções detalhadas sobre cultura de células e aquisição de filmes otimizados para análise de imagens. Esta seção sobre aquisição de dados é seguida por uma descrição detalhada para operar o software de análise de imagem. Ao longo do protocolo, apresentamos etapas críticas e recursos opcionais que devem ser considerados ao coletar e processar dados. Finalmente, analisamos filopodia de sistemas modelo diferentes com o software de análise de imagem, antes de fechar com uma comparação do software de análise de imagem descrito com outros programas disponíveis para quantificação filopodial e uma discussão sobre limitações e direção futura.
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Protocol
1. Cultura celular
- Cultura HeLa ou células COS no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose, L-alanina-L-glutamina dipeptídico, piruvato, 10% de soro bovino fetal e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Os neurônios culturais em meios culturais sem L-glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, suplementados com 0,5-diperptídeo L-alanina-L-glutamina, suplementos neuronais sem soro e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina.
- Uma vez que se alcança 40% de confluência, transfira células com construções de escolha usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as células transfectadas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 15-18 h.
- Para reduzir as alterações no pH e na osmolaridade (devido à evaporação) durante a aquisição da imagem, encha as câmaras de cultura de células (antes da imagem) até 90% com meio pré aquecido a 37 ° C contendo 20% de 4- (2-hidroxietil) -1 -piperazino-etossulfónico (HEPES). SelarNa tampa, aplique uma fina camada de graxa de vácuo no interior da tampa e pressione-a suavemente sobre a câmara de cultura que contém as células transfectadas.
2. Aquisição de imagens
NOTA: O comprimento do filopodia varia de 2-10 μm 13 . Filopodia cresce a uma velocidade média de 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 .
- Adquira imagens usando um microscópio com objetivo 60X ou 100X e sem binário de pixels (aqui, um microscópio confocal de disco giratório). Use taxas de aquisição superiores a 1 Hertz (Hz) para rastrear a dinâmica filopodial. Para minimizar os artefatos fora de foco, imagens filopodia perto da membrana basal ( ou seja , superfície do substrato).
- Para garantir um rastreamento suave, ajuste o tempo de exposição da câmera e a intensidade do laser, de modo que a relação sinal / ruído (SNR) seja maior que 4. Evite a saturação de canais individuais ( ou seja, valores de pixels de255 para imagens de 8 bits e 65,535 para imagens de 16 bits), pois isso impedirá a análise de imagem subseqüente.
- Para evitar o sangramento, use apenas etiquetas de fluorescência compatíveis com linhas laser e filtros do microscópio (para detalhes veja a referência 15 ).
3. Pré-processamento de imagem
NOTA: Use ImageJ ou outro software disponível para pré-processar imagens 16 , 17 .
- Se a amostra estiver em movimento, corrija a deriva lateral usando o software disponível ( por exemplo, https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) antes da análise. Exclua filmes com deriva axial (ou seja, movimento em direção z).
- Fundo correto ( ou seja, valores de cinza de áreas fora da célula), branqueamento ( ou seja, perda contínua, se a intensidade de fluorescência devido ao dano a proteínas de fluorescência) e possíveis cortes de sangramento ( ou seja, sinal de uma gripeSonda de orescência nos dois canais) usando o software disponível ( por exemplo, http://imagej.net/Category:Plugins e 16 , 17 ).
Nota: as intensidades de fluorescência dos canais individuais não são alteradas pelo software. - Para garantir a análise de imagem subsequente, guarde os filmes correspondentes a canais específicos de proteínas em escala de cinza como formato de arquivo empilhado '.tiff' na pasta de trabalho.
NOTA: As dimensões (tamanho, comprimento) das pilhas devem ser iguais para todos os canais.
4. Análise de imagem - Etapa 1: carregar imagens
NOTA: O software descrito aqui foi escrito em Matlab (conhecido como software de programação) e será executado somente com este programa.
- Baixe a pasta compactada contendo todos os arquivos necessários para análise de imagens a partir do seguinte site: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwestamos/. Descompacte e copie arquivos na pasta de trabalho.
- Uma vez instalado, abra o software de programação e execute 'filopodiaAnalysisM3.fig'. GUI Window # 1 irá abrir como mostrado na Figura 2A .
- Carregue os arquivos ".tiff" empilhados salvos correspondentes a uma proteína específica de interesse na GUI Window # 1 usando os botões <1b> para a proteína A, <1c> para a proteína B, <1d> para a proteína C. Veja a Figura 2 e a Tabela 1 para detalhes.
NOTA: A Proteína A mostrada na GUI A Janela # 1 atua como o canal de referência para a análise ratiométrica final. - Crie uma imagem superpuesta da célula a partir dos canais de proteína clicando em <1a>.
- Clique em <2a> para atribuir o primeiro quadro e <2b> para o último quadro usado para análise.
- Opcionalmente, coloque a região de interesse (ROI) contendo o filopodium de interesse usando o botão <2h>, gire a imagem.Toque o botão <2i> ou elimine regiões indesejadas usando a ferramenta de desenho de mão livre <2j>.
NOTA: Para simplificar a análise de imagens, recomenda-se isolar o ROI ( isto é , cortar, girar, excluir) juntamente com as outras etapas de pré-processamento (resta, correção de branqueamento, etc.) usando o ImageJ. - Mova o controle deslizante <2c> para cada quadro para controle de qualidade e verifique se o filopodium permanece claramente visível durante todo o filme.
5. Análise de imagem - Etapa 2: gerar rastreamento
- Clique no botão <3a> na Janela GUI # 1 para abrir a janela GUI # 2 (veja a Figura 2B ).
- Clique no botão <4> na Janela GUI # 2 para gerar a máscara do corpo celular sobreposto (gerado na Janela GUI # 1 depois de clicar em <1a>). O programa também gera o limite da máscara, onde o casco convexo é implementado para obter os vértices.
- CliBotão ck <5>; Um cursor aparecerá. Use o cursor para selecionar a base (de onde a distância da ponta filopodial é medida) seguida pela ponta do filopodia no quadro onde aparece pela primeira vez. Para fazer isso, mova o controle deslizante na janela # 2).
NOTA: Para minimizar erros na saída de dados, coloque o ponto base verticalmente abaixo da ponta filopodial ao longo do eixo. Posicionar o ponto base em outros locais ( por exemplo, deslocados lateralmente) pode introduzir uma polarização direcional em valores de fluorescência dentro do corpo da célula. - Selecione o comprimento do limiar (acima do qual o filopodia se dobrará) usando <6c>.
Nota: Este comprimento é definido como a distância entre o ponto base (selecionado usando <5>) e o limite do corpo da célula ( ou seja, a região de onde o filopodia começa a crescer). A distância é medida é em pixels. - Especifique o número de segmentos usados para aproximar a forma do filopodia na caixa <6a>.
NOTA: o mO número mínimo de segmentos depende do comprimento máximo alcançado pelo filopodium, mas também como o filopodium se dobra. Não selecione um número de segmentos maiores do que o número de pixels entre a base e a ponta ( ou seja, o comprimento do limiar). Selecionando mais segmentos do que o limite definido na etapa 5.4. ( Ou seja, o número de pixels entre a base e a ponta) resultará em uma superestimação do comprimento do filopodium. - Especifique a largura da varredura, que atua como scanner horizontal para colocar os nós, em <6b>.
NOTA: Estes nós são usados pelo programa para ajustar a linha que une a base e a ponta com o corpo do filopodium ( ou seja, para criar a espinha dorsal). Como ponto de partida, coloque um valor em pixels igual ao comprimento máximo multiplicado por um fator de
. - Especifique o raio de varredura (em pixels) na caixa <6d>. Use um valor que é aproximadamente 50% maior do que o obServido deslocamento da ponta entre moldura.
NOTA: Usar um raio de varredura muito grande pode pegar os pontos do casco convexo indesejados em quadros onde não existe uma dica filopodial real ( por exemplo , movimento fora do plano ou SNR baixo). - Especifique o ângulo de flexão na caixa <6e>.
NOTA: O limiar de ângulo é determinado pelo ângulo máximo que o filopodium está dobrando durante toda a análise. Especificar o limite de ângulo ajuda o software a excluir o rastreamento de estruturas indesejadas que crescem do lado da filopodia quando o filopodia se dobra em direção ao corpo celular. O programa funciona de forma confiável para filopodia com ângulos basculantes inferiores a 45 graus do eixo vertical. - Para iniciar o rastreamento, clique no botão <Seguir e analisar> na janela GUI # 2. Clique na caixa "Histórico rastreio" na GUI Janela # 2 para salvar todo o protocolo de rastreamento para futuras referências.
NOTA: Após o procedimento de rastreamento ser concluído, o comprimento do filopodium em cada quadro é armazenado emA folha chamada 'length_vel' de 'dynamics.xlsx' para futuras referências. Da mesma forma, todos os outros parâmetros de rastreamento são armazenados na folha denominada 'parameters' de 'dynamics.xlsx'. - Opcionalmente, se o filopodia não for detectado automaticamente em todos os quadros, use as seguintes etapas para corrigi-lo manualmente.
- Visite o respectivo quadro usando o controle deslizante na Janela # 2 e selecione manualmente a ponta do filopodium.
Nota: Os quadros, onde nenhum ponto convexo do casco são detectados, serão representados por uma região azul na janela de rastreamento da janela GUI # 2. É obrigatório verificar o botão 'Histórico rastreio' antes que o programa de rastreamento fosse iniciado para acessar as coordenadas nodais nesse quadro. - Selecione os pontos de referência (base seguido de dica) usando <6f> na janela da GUI # 2. Especifique os outros parâmetros, como "comprimento da varredura", "Medição precisa após" e "ângulo de flexão máximo"; Para esse quadro como descrito nos passos 5.4-5.8.
- Clique no botão <6i> para salvar os novos parâmetros (específicos desse quadro). As etapas devem ser repetidas para todos os quadros indicados pela região azul.
- Quando terminar, reinicialize o procedimento de rastreamento usando <7>.
NOTA: Esta correção também pode ser usada se o programa mudar repentinamente de um filopodial para outro dentro de um filme. Como alternativa, considere cortar filmes que contenham filopodios múltiplos.
- Visite o respectivo quadro usando o controle deslizante na Janela # 2 e selecione manualmente a ponta do filopodium.
. 6. Análise de Imagem - Passo 3: Análise de Proteínas Spatio-temporais
- Para a análise espaço-temporal, selecione a caixa representada por <8b> seguida do canal de proteína de interesse (<8c> e / ou <8d> e / ou <8e>).
Nota: É obrigatório selecionar Proteína A antes da análise ratiométrica (<9a>, <9b> e / ou <9c>), pois a Proteína A é usada como referência. - Clique em <8a>Para iniciar o rastreamento de proteínas ao longo do comprimento filopodial usando o traço gerado no passo 5.9.
7. Análise de imagem - Etapa 4: análise de proteína métrica
- Marque a caixa <9b> ou <9c> e clique no botão <9a> para obter o gráfico ratiométrico espaço-temporal.
NOTA: Para evitar a falsa representação da concentração relativa de proteína, a imagem ratiométrica não é plotada como X / Y, mas como log (X / Y). Para uso futuro, o gráfico ratiométrico é exportado em arquivos de formato '.png' e '.fig', e os dados do gráfico em bruto são armazenados no arquivo 'dynamics.xlsx'.
8. Análise da imagem - Passo 5: Análise de ponta filopodial
- Marque a caixa <8f> e especifique o comprimento da ponta e o comprimento do limiar da base usando <8g> e <8h>. Clique em <botão pressionar> para salvar dados no arquivo 'dynamics.xlsx'. Clique em <Analisar Intensidades de Proteínas> para gerar oRastro de intensidades de proteína da ponta filopodial e para economizar para análise ratiométrica.
NOTA: O comprimento da ponta determina o número de pixels na ponta utilizada para a análise. O software retornará o valor de intensidade média dos pixels na ponta sobre cada quadro. O comprimento do limiar determina a distância mínima da base à ponta acima da qual o filopodium (ponta filopodial) começa a crescer (e quando o programa começa a rastrear o valor da intensidade da ponta). Portanto, o comprimento da ponta deve ser menor do que o comprimento do limiar. - Clique na proporção desejada a ser analisada usando <9d> ou <9e>.
- Clique no botão de comparação <9a> para gerar os dados ratiométricos.
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Representative Results
Usando células COS transfectadas com um marcador para a actina filamentosa (f-tractin 18 , vermelho) e uma referência citosólica (verde), encontramos protrusões filopodiais ricas em actina ( Figura 3A , painel superior). As séries temporais mostraram que os filopodios se estendiam e retraíam rapidamente ( Figura 3A , painel do meio). Usando o software de análise de imagem, então rastreamos filopodias individuais. A comparação do comprimento filopodial medido por mão versus o software de análise de imagem mostrou um valor de correlação cruzada Pearson de 0.947 argumentando que o software rastreou de forma confiável a extensão 12 filopodial. Além das taxas de crescimento e retração de um filopodia individual, os cimogramas na parte inferior da Figura 3A também representam intensidades de fluorescência da actina (topo), a referência citosólica (meio) e a concentração relativa de actina normalizada para o citoReferência pública (inferior). Juntos, essas experiências fornecem evidências de que o programa mede de forma confiável a dinâmica do crescimento, bem como a concentração relativa da proteína relativa espacialmente durante todo o ciclo de vida de um filopodium individual em células COS.
Em seguida, investigamos a dinâmica de filopodia em neurônios de hipocampo de rato cultivados ( Figura 3B , painel superior). Para isso, os neurônios foram transfectados no dia in vitro (DIV) 8 com f-tractina (vermelho) e uma referência citosólica (verde) ( Figura 3B , painel do meio). Como no experimento anterior, os cimogramas que descrevem as intensidades de fluorescência da actina e da referência citosólica mostraram que o enriquecimento relativo da actina precedeu a formação de filopodias dendríticas exploratórias ( Figura 3B , painel inferior). Essas descobertas estão em linha com o trabalho publicado, descrevendo a formação de manchas ricas em actina antes do filopodialAlongamento 3 , 19 , 20 .
Figura 3: Exemplos de Filopodia Analisados pelo Software. ( A ) Visão geral (painel superior) e séries temporais (painel central) de células COS transfectadas com f-tractina (vermelho) e marcador citosólico (verde). Abaixo, mostram-se gráficos que descrevem a análise da dinâmica de crescimento filopodial e a concentração relativa de f-tractina ao longo do filopodium (painéis inferiores). ( B ) Visão geral do neurônio do hipocampo transfectado com marcador citosólico (topo) e séries temporais de neurônio transfectado com f-tractina (vermelho) e marcador citosólico (verde) (painel do meio), bem como análise da representação gráfica da dinâmica do crescimento filopodial dendrítico E concentração relativa de f-tractina ao longo da protrusão (painéis inferiores).( C ) imagem SEM (painel esquerdo) e séries temporais de células HeLa transfectadas com f-tractin (painel direito). Note flutuações na intensidade de fluorescência devido ao flambio filopodial. Barras de escala = 20 μm (A, superior), 50 μm (B, topo), 10 μm (C, topo). Esta figura foi modificada a partir da referência 12 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Finalmente, buscamos desafiar o software monitorando filopodia em células HeLa. Filopodia em células HeLa são longas ( Figura 3C , painel esquerdo) e altamente dinâmicas, muitas vezes deixando o plano de aquisição. Intriguingly, ao se concentrar na membrana basal, observamos uma sub-fração de filopodia para se submeter a torção helicoidal ( Figura 3C , painel superior direito), pelo que partes do filopodium transDeixa o plano focal. Consequentemente, os cimogramas que representam a intensidade de fluorescência absoluta da f-tractina mostraram mudanças de onda na intensidade de fluorescência ao longo do tempo ( Figura 3C , painel inferior direito). Esse comportamento é uma reminiscência de flambagem filopodial, um mecanismo recentemente descrito para ser usado por filopodia para exercer forças de tração 5 .
Em resumo, essas experiências fornecem evidências de que o software rastreia de forma confiável a concentração de proteínas e dinâmicas de crescimento de filopodias de várias origens.
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para rastrear a dinâmica do crescimento filopodial e a análise das concentrações relativas de proteína nessas estruturas dinâmicas através do algoritmo convexo-casco. Usando o software, até 3 canais podem ser comparados por pares em uma única execução, pelo que as concentrações relativas de dois canais ( ou seja, proteínas) são determinadas ao longo do ciclo de extensão / retração e armazenadas como arquivos de imagem e dados em pastas separadas. Além das operações de rotina, o software também fornece uma série de parâmetros que podem ser modificados para otimizar a análise para a experiência respectiva. Uma descrição detalhada dessas modificações e a solução de problemas podem ser encontradas na seção de protocolo e na Tabela 1 .
A análise de imagens não se limita a um tipo específico de microscópio, mas sim pela qualidade da imagem das séries temporais. Considerando sua relevância, a qualidade da imagem deve, portanto, ser otimizada para eDurante a aquisição. Nossos experimentos mostram que o algoritmo funciona melhor para filopodia com SNR> 4 adquirido a 1 Hz usando um objetivo com ampliação acima de 40X e sem binário de pixels. Claro, isso aplica-se apenas enquanto os fluoróforos são compatíveis com as configurações do filtro ( ou seja, sem sangramento, veja a seção de protocolo 2 para detalhes). Considerando que as intensidades relativas são comparadas uma contra a outra, a análise não é sensível a pequenas diferenças nas intensidades absolutas de sinal de fluorescência entre células individuais. Portanto, para deduzir dados significativos, um canal de referência bem definido ( eg marcador citosólico) é de grande importância. No entanto, mesmo que a qualidade da imagem seja boa, existem algumas limitações biológicas. Por exemplo, não é adequado para analisar estruturas que se ramificam, inclinando mais de 45 graus do eixo ortogonal para a superfície celular ou onde outros objetos estão atravessando a estrutura que está sendo investigada.
<P class = "jove_content"> Além dessas limitações experimentais, existem passos críticos no protocolo que precisam ser considerados ao operar o software, pois isso pode gerar mensagens de erro. Primeiro, os canais correspondentes a uma proteína específica devem ser da mesma dimensão e representar exatamente o mesmo ROI. Em segundo lugar, os arquivos empilhados devem estar no formato de arquivo '.tiff' em escala de cinza. Em terceiro lugar, os arquivos de imagem empilhados devem estar na pasta de trabalho. E, finalmente, os nomes dos arquivos de dados na pasta de trabalho não devem ser alterados, a menos que este seja corrigido no código.Como o script se compara a outros métodos existentes? Para apontar nosso software de análise de imagem, nós baixamos uma série de soluções de software recentemente publicadas que analisam as características filopodiais 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 , e testou tudo por uma série de critérios selecionados. Uma comparação detalhada é apresentada na Tabela 2 .
| Tsygankov et al. | Barry et al. | Nilufar et al. | Fanti et al. | Constantino et al. | Hendri- Cusdottir et al. | Tarnok et al. | Saha et al. | |
| DOI de papel | 10.1083 / jcb.201306067 | 10.1083 / jcb.201501081 | 10.1186 / 1752-0509-7-66 | 10.1002 / dneu.20866 | 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10.1002 / cyto.a.22569 | 10.1091 / mbc. E16-06-0406 |
| Software (link de download) | Http: //www.hahnlab. Com / tools / A Página de software. Html | Http: // jcb-dataviewer. Rupress.org/jcb/ Navegar / 9059 / | Http: //www.perkinslab .ca / pubs / NMLP20XX. Html | Http: //www.ifc. Unam.mx/ Ffm / download.html | Http: // fournierlab. Mcgill.ca/ Style-7 / fTracker.html | Https: // fdynamics. Wordpress.com/ | Http: // cnblab. Elte.hu/dfma | Https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| Tipo de programa | Matlab | ImageJ | Matlab | ImageJ | Matlab | Matlab | ImageJ | Matlab |
| Operação | Automatizado | Automatizado | Automatizado | Semi automatizado | Semi automatizado | Semi automatizado | Semi automatizado | Semi automatizado |
| Análise única versus análise por lotes | ambos | ambos | solteiro | solteiro | solteiro | solteiro | solteiro | solteiro |
| Análise de células inteiras versus sub-regiões | todo | todo | ambos | ambos | ambos | sub | sub | sub |
| Filopodias múltiplas versus individuais | múltiplo | múltiplo | múltiplo | múltiplo | múltiplo | Ind | Ind | Ind |
| Identificação filopodial e inspeção visual possível | sim | sim | não | sim | sim | sim | sim | |
| Processamento de imagem possível | não | não | não | sim | não | não | não | sim |
| Comprimento filopodial | sim | sim | sim | sim | sim | sim | sim | sim |
| Dinâmica de crescimento filopodial | sim | sim | não | sim | sim | sim | sim | sim |
| Tempo de vida filopodial | sim | sim | não | sim | sim | sim | sim | sim |
| Análise ratiométrica em filopodia | não | não | não | não | não | não | não | Sim </ Td> |
| Formato de saída / armazenamento | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados | Imagens / arquivo de dados |
Tabela 2: Visão geral das soluções de análise de imagem assistida por software para quantificação Filopodia.
Das oito soluções de software de análise testadas, cinco foram operadas via Matlab, enquanto os restantes três usavam o ImageJ. Duas soluções de software ( Tabela 2 , à esquerda) foram totalmente automatizadas e otimizadas para a análise por lotes do comprimento, vida e dinâmica do filopodia em células inteiras. Das seis soluções de software restantes, cinco necessitaram de entrada manual adicional ( ou seja, semi-automáticas), enquanto uma estava totalmente automatizada. No entanto, apenasAs soluções semi-automatizadas fornecem informações detalhadas sobre dinâmicas de crescimento de filopodia, vida e identidade. Entre estes cinco restantes, três foram otimizados para análise subcelular de filopodias individuais, enquanto dois poderiam processar múltiplos filopodios em paralelo. Importante, a partir de todas as oito soluções de software testadas, apenas uma abordagem permitiu combinar informações sobre a dinâmica de crescimento filopodial com a localização da proteína ratiométrica dentro dessas estruturas semelhantes a do dedo ( Tabela 2 , à direita).
Embora o nosso software de análise de imagem não seja adequado para análises automáticas de lote ou células inteiras, a quantificação de uma filopodia isolada leva apenas alguns minutos. Assim, nós imaginamos que a quantificação da dinâmica de proteínas em 40-50 filopodia é viável dentro de um único dia com o software atual. Em contraste, as telas de alto débito podem exigir novas alterações ao código para agilizar a entrada e o armazenamento de milhares de filopodias individuais em um sistema automatizadomaneira. Com base nos parâmetros que são necessários, outras soluções de software existentes podem, portanto, ser mais adequadas para essa abordagem. Mantendo essas limitações em mente, o software fornece uma plataforma confiável para investigar a concentração de proteína espaço-temporal em estruturas de protrusão nas células. Considerando que as filopodas não são as únicas estruturas celulares de dedo, é plausível imaginar que o software de análise de imagem apresentado também possa ser adequado para estudar a dinâmica de proteínas em outros processos biológicos ( por exemplo , neurites, cílios primários).
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o financiamento do DFG (EXC-1003 a MG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
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