Summary
ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフローを記述しています。
Abstract
細胞はしばしば突然の環境変化によって挑戦される。ストレス条件に曝露された細胞内で形成される細胞質リボ核タンパク質複合体であるストレス顆粒（SG）は、細胞代謝および生存の様々な局面に関与している。 SGは、細胞シグナル伝達経路、転写後遺伝子発現およびストレス応答プログラムを調節する。これらのmRNA含有顆粒の形成は細胞翻訳に直接関連する。 SGアセンブリは阻害された翻訳開始によって誘発され、SG分解は翻訳活性化または阻害された翻訳伸長によって促進される。この関係は、SGの構成によってさらに強調される。コアSG成分は、失われた翻訳開始前複合体、mRNA、および選択されたRNA結合タンパク質（RBP）である。 SGアセンブリーの目的は、ストレス応答タンパク質の翻訳の促進を可能にし、翻訳停止したハウスキーピングmRNAを隔離することによって細胞エネルギーを保存することである。アドイティ失われた翻訳予備開始複合体のような核構成要素には、SGは他のタンパク質およびシグナル伝達分子の過剰を含む。 SG形成における欠陥は、ストレスに対する細胞の適応を損ない、細胞死を促進する可能性がある。 SGおよび類似のRNA含有顆粒は、神経変性障害および癌を含む多くのヒト疾患に関連しており、最近RNA顆粒亜型の分類および定義に関心が高まっている。このプロトコールは、哺乳動物SGを特徴づけ、定量するためのアッセイを記載する。
Introduction
細胞はストレスに応答するために多くのメカニズムを使用します。いくつかの応答は、転写後レベルで起こり、mRNA翻訳および/または安定性を調節することを含む1,2 。ストレス調節されたmRNAの翻訳停止および分解は、特異的な非膜性細胞巣の形成に関連しており、最もよく特徴づけられているのはストレス顆粒（SGs） 3である。 SGは、ストレス（ 例えば、酸化、熱ショック、栄養飢餓、ウイルス感染）に応答して、翻訳拘束細胞に非翻訳mRNPを集中させる細胞質病巣である4 。非翻訳mRNAに加えて、SGは翻訳開始因子、RNA結合タンパク質、および様々なシグナル伝達タンパク質を含む5 。 SGは阻害されたタンパク質翻訳および改変されたRNA代謝のバイオマーカーであり、細胞生存およびアポトーシス、シグナル伝達経路に関連しているs、核プロセス5 。
SGは動的エンティティであり、それらの形成は細胞翻訳6の状態に密接に関連している。一見しっかりした外見にもかかわらず、ほとんどのSGタンパク質成分は、滞留時間が秒で急速に出入りする。 SGは数分から数時間持続しますが、その構成要素のほとんどは急速に変化しています。翻訳開始の阻害およびそれに伴う翻訳ポリソームの解体は、SGの形成を促進する。したがって、SGは翻訳ポリソームと平衡状態にある。このポリソーム/ SG平衡は、 真の SGを他のストレス誘導病巣から区別するための鍵である6,7。
停止開始停止は、mRNA、翻訳開始因子（eIF）、および40Sリボソームサブユニットを含む翻訳コンピテントな開始前複合体の変換を伴う （いわゆる48S *複合体）に翻訳し、SGs 4,6に融合することができる。 SGSは、48S複合体形成の上流の2つの異なる段階で翻訳停止が促進される：キャップ結合eIF4F複合体（ 例えば、そのeIF4Aサブユニットを標的とする）の機能への干渉または翻訳開始因子eIF2のαサブユニットのリン酸化4つのeIF2キナーゼのうちの1つ以上を阻害する。停止した48S複合体（ すなわち、 40Sリボソームサブユニットおよび選択された翻訳開始因子）の存在は、SGs8,9の特徴である。
SGは、ウイルス感染、神経変性、自己免疫、および癌3,10,11,12などの様々な病的状態に関連している。ss = "xref"> 12,13。いくつかのSG成分の変異型は、ニューロンがニューロン死に積極的な役割を果たす細胞内病理学的封入体を示す神経変性疾患（ 例えば、筋萎縮性側索硬化症）と関連している13 。いくつかのウイルスはSG成分をハイジャックしてSGの形成を阻害し、ウイルス複製を増強する14 。最近の研究はまた、化学療法および放射線療法の治療10,16,17,18,19,20の下で、SGを癌15および癌細胞の生存と関連付ける。このような発見はSG生物学に大きな関心を刺激したが、公開された報告の多くは、 真の SGの形成を他のストレス誘発病巣と区別するための重要なコントロールがない。
SGは、T細胞細胞内抗原1（TIA-1）およびポリA結合タンパク質（PABP）を含む、選択されたmRNA結合タンパク質（RBP）からなる非膜性細胞質病巣として最初に記載された。翻訳開始因子;ポリアデニル化mRNA;小型リボソームサブユニット4,6,21,22。伝統的に、それらの組成は、免疫染色および蛍光標識されたタンパク質の異所性発現のような技術によって決定されている23,24。それらの非常に動的な性質のため、SGタンパク質および/またはmRNAの免疫局在化は、SG23,24を検出するための決定的な方法論のままである。今日まで、多くのRBPおよび他のタンパク質（120以上の異なるタンパク質）がSG構成要素11として記載されている。多くのSG-局在タンパク質は、ストレス依存性および独立性の両方でそれらの局在を変化させ、他の細胞内区画および病巣に蓄積することができるので、SGマーカーを選択し、SGを他のタイプのストレス誘発フォーカス。 真正の SGは、mRNA、翻訳開始因子、および小リボソームサブユニットを含み、翻訳と動的平衡にある。
この単純なワークフローは、ストレス誘発病巣が真正 SGであるかどうかを判断するために設計されています。このワークフローには、SGsを研究するために一般的に使用される細胞であるU2OS細胞を使用したいくつかの実験的アプローチが含まれています。これらの細胞は、大きな細胞質を有し、比較的平坦でガラスカバースリップに強く付着するので、理想的である。 SGを研究するために他の細胞タイプを使用することができますが、SG核生成タンパク質のタイミング、薬物濃度、および存在量の違いが動態および成分を変化させることがあることに注意することが重要ですsition。さらに、いくつかの細胞は、細胞表面のブレブを形成することによってパラホルムアルデヒド固定に応答し、次いで、いくつかのSGマーカーの点状局在を引き起こすぎざぎざのような外観を与える。注意深く分析することなく、これらはSGとして誤って分類される可能性があります。これは、ストレス誘発病巣を真正 SGとして同定するために必要なすべての基準を評価する必要性を強調する。 SG22を促進する癌治療薬であるVinorelbine（VRB）と、強固で特徴の良いSG誘導物質であるSodium Arsenite（SA）は、このプロトコルの実験のストレスとして使用されます。
標準的なSGは、細胞質フォーカスにおいて共局在する複数のSGマーカー（タンパク質およびmRNAの両方）を含む。このプロトコルは、タンパク質マーカーおよびポリアデニル化mRNA 22のそれぞれの局在を検出するために、免疫蛍光および蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の両方を使用する。簡単に説明すると、間接免疫蛍光法は、抗体（すなわち、e。一次抗体）を細胞内で検出することができる。次いで、蛍光色素に結合した二次抗体（通常は種特異的）が一次抗体を認識し、標的タンパク質の局在を明らかにする。蛍光顕微鏡法を用いて、細胞内の局在化シグナルを検出する。異なる種で産生された抗体を使用し、異なった色の二次抗体を用いてそれらを検出することにより、複数の抗体の共局在の検出が可能になり、それらのタンパク質標的が同じ場所にあることが示される。 真正 SGで共局在することが確認されているマーカーを選択することが重要です。
FISHは、特定のRNAまたはDNA配列に塩基対合する標識プローブを使用します25 。 mRNAを検出するために、このプロトコールは、mRNAのポリA尾部にハイブリダイズする（または塩基対を形成する）ビオチン化オリゴ（dT） 40プローブ（ すなわち、ポリA FISH）。次いで、ストレプトアビジンはビオチンに対して高い親和性を有するので、ビオチン化プローブは蛍光共役ストレプトアビジンを用いて検出される。 SGを評価する場合、真正SGと同様に、ポリAアフィニティを免疫蛍光法と結合させることが重要であり、両シグナルは共局在すべきである。
このプロトコルを用いて、共局在化は複数の方法で評価される。マルチチャンネル（RGB：赤、緑、青）の画像では、共局在化によって重なった信号の色が変わります（ 例えば、共局在化された赤色と緑色は黄色に見えます）。さらに、各色の強度が所定のライン8,20にわたって測定されるラインスキャン分析を用いて、共局在化を図式的に定量化する。このプロトコルは、ImageJ26を使用する2つのラインスキャン分析手順を記述する。 1つの手順は手動であり、プロセス全体を処理します他のマクロは、マクロを使用するか、手動ステップを自動化する単純なプログラムを使用します。マクロプロシージャを理解するには、手動プログラムを実行することが重要です。
翻訳が抑制されている細胞ではSGが形成される。したがって、SGを有する細胞は、未処理細胞と比較して、全体的翻訳のレベルが低下しているはずである。実験的に、リボプロファイリングが用いられる。ピューロマイシンおよびエメチンは、固定前に短時間細胞に添加され、ピューロマイシンが積極的にポリペプチドを形成するように組み込み、終結を引き起こす27,28。再開始を防ぐには、エメチンによる治療が必要です29 。ピューロマイシンは、抗ピューロマイシン抗体を用いて検出することができ、能動的翻訳のスナップショットを与える。この方法は速く、特定のアミノ酸が欠けている培地でプレ飢餓させる必要がなく（潜在的に細胞にプレストレスをかける）ために使用され、タンパク質翻訳の細胞内局在化。特に、メチオニン類似体L-アジドホモマレイン（AHA）のような修飾アミノ酸類似体を「クリック - イット（click-it）」化学反応30と組み合わせて使用する他の方法を用いて、SGを含有する細胞が隣接細胞31よりもはるかに低い翻訳を示すことが示されている31 。しかし、この技術では、メチオニンの飢餓とそれに続く15〜30分間のパルス標識が必要です。メチオニン飢餓はさらなるストレスを構成する一方、長い標識時間（ すなわち 15〜30分）は進行中ではなく累積翻訳の測定をもたらし、また新しく合成されたタンパク質が合成部位から合成部位を最終部位に移動させる細胞。対照的に、リボプロマイシン酸化は非常に速く、グルコース飢餓によってSGを誘導するために使用されるグルコース不含培地などの任意の培地と適合する。
正規のSGは動的平衡状態にある積極的にポリソームを翻訳しています。これは、ポリソームを安定化または不安定化する薬剤でサンプルを処理することにより、SGとポリソーム23との間のバランスを変えることによって、実験的に評価することができる23 。シクロヘキシミド（または同様に作用するエメチン）は、リボソームをmRNA上に「凍結」することによって伸長をブロックし、SGを形成することができる利用可能な非ポリソームのmRNPのプールを減少させる。実験的には、これは2つの方法で使用することができます：ストレスの前にシクロヘキシミド（またはエメチン）を添加してSGの形成を防止するか、またはSGが形成された後にシクロヘキシミド（またはエメチン）予備初期化複合体はポリソーム画分にゆっくり取り込まれる。対照的に、ピューロマイシンは早期終了を引き起こし、ポリソーム分解を促進し、SGに組み立てることができる開始mRNAのプールを増加させる。実験的に、ピューロマイシン治療はSGの数を増加させるか、または閾値を低下させるこれらは、段階的なストレスまたは薬物投与量に応じて形成される。ピューロマイシンの効果を評価する際には、ピューロマイシンが薬剤の効果を増大させ、SGを提示する細胞の割合を増加させることが予想されるので、最大のレベル以下の薬剤を使用することが重要である。 /ストレスは、最初に細胞の100％においてSGを引き起こす。これは、シクロヘキシミド処置と対照的であり、SGを分解し、〜95％の細胞が最初にSGを表示して最大の可能な減少が観察され、正確に定量化されるときに最も効果的である。
このプロトコルは、哺乳動物細胞のSGを研究するための枠組みを提供する。方法は、（1）推定上のSGにおいて古典的なSG関連マーカーeIF4G、eIF3b、およびRas GTPアーゼ活性化タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）の共局在化を評価するための免疫蛍光染色およびImageJ分析; （2）ポリアデニル化mRNAを検出するためのオリゴ（dT）蛍光in situハイブリダイゼーション（polyA FISH）; （3）ストレス誘発病巣がポリソームと動的平衡状態にあるかどうかを決定するためのシクロヘキシミドおよびピューロマイシン処置; （4）推定上のSGを含有する細胞の翻訳状態を評価するためのリボプロマイシン酸化。一緒に、これらのアッセイは、ストレス誘発病巣が真正 SGとして分類され得るか否かを決定することができる。
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Protocol
1.細胞の準備
- 図1Aに示すように、オートクレーブしたカバーガラスを24ウェルプレートの12ウェルに加える。これは、各カバースリップを拾うために真空に取り付けられた滅菌パスツールピペットを用いて行うことができる。穏やかに井戸の側面にあるカバースリップをタップして吸引を解放し、カバースリップが井戸に落ちるのを許します。
- プレート1×10 5 U-2 OS（U2OS）骨肉腫細胞を、最終容量500μLの培地で1ウェルあたり1個ずつ接種した。プレートの側面を上下左右に数回動かして、細胞が均等に分布するようにします。
- 優しくP1000チップでカバースリップを押し下げて、カバースリップがウェルの底にあり、カバースリップの下に泡がないことを確認します。
2.ストレス細胞
- 翌日、細胞が均等に分散し、カバースリップ全体に均等に集まることを確認するためにプレートを目視検査し、saメープルは、結果の再現性に悪影響を与える可能性があります。倒立組織培養顕微鏡で10倍の対物レンズを使用する。
- 培地を37℃に予熱する。冷たい衝撃や熱衝撃の原因となるので、冷たいまたは熱い培地を細胞に塗布しないでください。
- 予熱した培地で薬物を希釈する。異なる薬物濃度ごとに、500μLの培地を含む2つのウェルを調製する。ピペッティング中に損失を許容するために500μLをさらに調製する。それぞれが1.5mLを含むアリコート4本のチューブ。
- 亜ヒ酸ナトリウムについて：500μLを含む各ウェルに、100mM亜ヒ酸ナトリウム（最終濃度100μM）1.5μLを添加するか、または0.75μLの100mM亜ヒ酸ナトリウム（最終濃度50μM）を加える。
- ビノレルビンについて：500μLを含む各ウェルに、10mMビノレルビン（最終濃度150μM）22.5μLを加えるか、または10mMビノレルビン（最終濃度100μM）18.75μLを加える。
注：亜ヒ酸ナトリウムよく特徴付けられ、一般的に使用されるストレス顆粒誘導物質であり、したがって、陽性対照として古典的に使用される。
- ウェルB1〜4およびC1〜4から培地を取り出して捨てる。薬剤を添加して培地を添加し、60分間待つ（図1A）。
- 100μM亜ヒ酸ナトリウムを含む培地500μLをウェルB1およびB2に添加する。 50μM亜ヒ酸ナトリウムを含む培地500μLをウェルB3およびB4に添加する。
- 150μMのビノレルビンを含む500μLの培地をウェルC1およびC2に添加する。 125μMのビノレルビンを含む500μLの培地をウェルC3およびC4に添加する。
- 固定の30分前に、カラム2のウェルを5μLのシクロヘキシミド（1mg / mLのストック）で処理し、カラム4のウェルを2μLのピューロマイシン（1.25mg / mLのストック）で処理する。プレートを37℃のインキュベーターに戻す前に、プレートをゆっくりと揺らしてミックスします。
3.細胞固定および免疫蛍光
リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、PBS中5％正常馬血清（NHS）、および4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含む緩衝液を調製する（実験の前に、メタノールを-20℃に冷却する） ）を含有する。- 培地を捨て、カバースリップを含むウェルをPBSで洗浄する。使用される薬物に応じて、薬物を含む媒体を適切に廃棄することが重要である。具体的な指示については、地域環境安全局にお問い合わせください。効率的に洗浄するには、スクイズボトルをPBSで満たし、先端を切り取って、穏やかな流れではなく穏やかな流れを可能にし、これを使用して元のPBSを吸引した後に各ウェルにPBSを加える。
- 穏やかな攪拌下、室温で15分間4％PFA〜250μLを用いて細胞を固定する。カバースリップの上部をPFAで完全に覆います。 250μLで十分であるが、そうでない場合は、より多く添加する。いくつかの細胞（または細胞のストレス処理）が付着を変える可能性があるため、カバースリップに直接ピペットをかけないでください。彼はピペット操作から細胞を取り除くことができます。
- PFAを取り外し、正しく廃棄してください。パラホルムアルデヒドを適切に廃棄する方法については、地域の環境安全局にお問い合わせください。
- 約250μLのメタノール（-20℃）を添加し、緩やかなロッキング下、室温で5分間インキュベートする。この両方が細胞を透過して平らになる。
- メタノールを除去して捨て、〜250μLの5％NHSをRTで1時間4℃で適用して細胞をブロックする。メタノールを適切に廃棄する方法については、地域環境安全局にお問い合わせください。
- 一次抗体については、抗体を5％NHSで希釈する。
注意：複数のSGマーカーを使用することは、観察された顆粒が真正 SGであるかどうかを確認するために重要です。使用可能なSGマーカーの数は、顕微鏡で利用できるフィルターによって異なります。緑色、赤色、遠赤色の標準フィルターセットが利用可能な場合は、G3BP1、eIF4G、およびeIF3bを1/250希釈で使用してください。 - ウェルをPBSで3回洗浄し、各洗浄液を5分間インキュベートする。
- 二次抗体については、5％NHS中のすべての二次抗体（1/250希釈）およびHoechst色素（1/1000希釈）を希釈する。
- この実験のために、各250μLの12個のカバースリップ（合計：3％の5％NHS）に、Cy2-Mouse、Cy3-Rabbit、およびCy5-Goatの各12μLを添加する（各1/250希釈Hoechst色素3μLを加える。
- カバースリップを二次抗体と共に室温で1時間インキュベートする。これ以降の手順では、プレートを箱で覆うか、またはホイルを組織培養皿の上に置くことによって、サンプルを光から保護します。
- 私たちを洗うそれぞれ5分間、PBSで3回洗浄する。
- マウントメディアを使用して、ラベルスライドガラスにカバースリップをマウントします。マウント培地を37℃のヒートブロックで10分間加熱します。これにより粘度が低下し、ピペット操作が容易になります。切断されたP200チップを用いて、ガラススライド上にカバースリップ当たり25μLの取り付け媒体をピペットで入れる。顕微鏡ステージがこれを可能にすると仮定すると、4-8カバースリップは1つのスライドガラスに収まることができる。細かい鉗子を使用して、ウェルからスライドにカバースリップを移し、細胞の側を確実にマウント媒体に置く。清潔なP200チップを使用して、カバーガラスを押し下げます。
- すべてのカバースリップが取り付けられたら、折り畳まれたラボティッシュを使用して、ラボの組織をスライド上にしっかりと押し込んで余分なマウントメディアをきれいにします。 H 2 Oを含むスクイズボトルを使用して余分なマウントメディアを洗い流し、折り畳まれたラボティッシュでブロッティングを繰り返して水を除去します。
4. その場での蛍光</ em>ハイブリダイゼーション（FISH）
- プレートとして、ステップ1および2.1-4をガイドとして使用して細胞を処理する。次の実験では3枚のカバースリップのみが必要であるため、カラム1に細胞をプレートするだけでよい。
- メタノールを-20℃に冷却し、すべての緩衝液が準備されていることを確認します（PBS中4％PFA、水中70％エタノール、2倍食塩水 - クエン酸ナトリウム（SSC）、5％NHS）。ハイブリダイゼーションオーブンを適切な温度まで温める。
- ステップ3.1-3.3を実行して細胞を洗浄し、固定する。
- メタノールを-20℃で10分間添加して細胞を透過させます。
- メタノールを除去し、70％エタノール中でカバースリップをインキュベートする。プレートを4℃で一晩置く。蒸発を防ぐためにパラフィルムを使用してプレートをシールします。
- 翌日、エタノールを除去し、500μLの2×SSCを加えて細胞を再水和する。室温で穏やかに撹拌しながらカバースリップを5分間インキュベートする。
- 2x SSCを取り外して500を追加する2X SSCのμL。穏やかに攪拌しながら5分間インキュベートする。
- ハイブリダイゼーションオーブンの底に平らなパラフィルム片を置きます。ハイブリダイゼーション緩衝液25μLを各カバースリップのパラフィルムにピペットで入れる。 24ウェルディッシュからカバースリップを取り除き（この時点で、カバースリップは細胞側を上にしている）、カバースリップを細胞側をハイブリダイゼーション緩衝液の上に置く。これを42℃または任意に65℃で15分間行う。
注：65℃でこのステップを完了すると、細胞RNAが変性します。これは、ポリAがタンパク質との相互作用によってマスクされている場合にシグナルを改善することができる。 - ハイブリダイゼーションバッファー中のBiotin-Oligo（dT）プローブ（100ng /μL）を2ng /μLの濃度に希釈する。カバースリップあたり25μLで十分です。
- 各カバースリップについて、ビオチン - オリゴ（dT）を含むハイブリダイゼーション緩衝液25μLをパラフィルム上にピペットで移す。鉗子でカバースリップを拾い、穏やかに余分を除去するために実験室の組織上にカバースリップの端に触れるハイブリダイゼーション緩衝液。 Biotin-Oligo（dT）を用いてカバーガラスをハイブリダイゼーションバッファーに移す。セル側を下にしておいてください。
- カバースリップをハイブリダイゼーションボックスに入れて蒸発を制限する。 42℃で60分間ハイブリダイゼーションバッファー中のビオチン - オリゴ（dT）でカバースリップをインキュベートする。
- ハイブリダイゼーションオーブンに2×SSCを入れて42℃で平衡化させます。
- 暖かい2×SSCの〜500μLを24ウェルディッシュのウェルに加え、カバープレートをウェルに移すために鉗子を使用する。 10分間インキュベートする。
- 上記の洗浄工程を42℃で2回、RTで2回繰り返します。
- 1つの従来の抗体の代わりにビオチン - オリゴ（dT）を検出するためにストレプトアビジン蛍光色素を使用することを確実にして、3.5-3.10のステップを完了してください。
翻訳状態を評価するためのリボプローブクロマトグラフィー
- ステップ1に示されているように、カバースリップ上にU2OS細胞をプレートするが、条件ごとに1つのカバースリップのみをプレートする（このケース、3つのカバースリップ：未処理、100μM亜ヒ酸ナトリウム、および150μMビノレルビン）（ 図1A ）。
- ステップ2のプロトコルを使用して細胞にストレスを与え、ステップ2.1〜2.4を完了させます。
- 固定前5分、ピューロマイシン2μL（ストック：1.25mg / mL;500μLで2μLを希釈して最終的なピューロマイシン濃度5μg/ mLを得る）および2.9μLのエメチン（ストック：20μg/ mL; add 2.9μLを既にピューロマイシンを含む同じ溶液に）0.5mLを含む各ウェルに添加する。
- ピューロマイシンを検出するために抗ピューロマイシン抗体（1/1000希釈）を用いて、上に示したようにステップ3.1-3.10を完了させる。理想的には、残りのチャンネルに2つの他のSGマーカーを使用します。
- ピューロマイシンシグナルを定量するときは、同じ露光量ですべての画像を撮影します。最も明るい（ストレスのない）サンプルを使用し、できるだけ明るい画像を彩度なしで撮影することで、この露出を選択します。
注：抗ピューロマイシン蛍光シグナルの強度アミノ酸の代用ピューロマイシンのような進行中の翻訳は、新生タンパク質に取り込まれ、タンパク質の早期終結を強制する。
6.画像取得と解析
- ストレス顆粒の定量化
- SGを定量するには、40X対物レンズを使用して、サンプルあたり100個以上の細胞を集めた3〜5枚の画像を取得します。あるいは、他の目的を用いて画像を取得するが、カバースリップ当たり100個以上の細胞がカウントされ、顆粒を明瞭に視覚化するのに十分な倍率であることを確認する。カバースリップを5つのほぼ等しい領域に分け、各領域（ 図1B ）からフィールドをランダムに選択することでこれを行います。同じフィールドの画像は、マーカーの共局在化を評価するためのすべてのチャンネルを含むべきである。
- すべての画像を取得したら、チャンネルをマージします。カメラソフトウェアの中には自動的にこれを行うものもあれば、手動マージが必要なものもあります。これはすべての画像を開き、[Image |カラー|チャンネルをマージする]。
- Hoechstを核マーカーとして使用して、核の数を数えることによって、細胞の総数を手動で数える。セルあたり2つ以上のSGを含むセルの数を手動で数えます。
注：たとえば、G3BP1（緑色）、eIF4G（赤色）、およびHoechst（青色）を表示するマージされた3チャネル画像を使用して、青色チャネルを使用して核（または細胞数）を数えます。次に、細胞あたり2つ以上の黄色のフォーカスを有するものとしてSG陽性細胞を計数する。顆粒は黄色、G3BP1からは緑、eIF4Gからは赤色が共局在化すれば黄色に見える。 - 3〜5の独立領域からのデータを組み合わせてSG陽性である細胞のパーセンテージを決定し、
SG陽性数/核数）×100 = SG陽性細胞の割合
- ラインスキャン分析による共局在化の評価 - 手動方法
- 開いたImageJ。 （）から無料でダウンロードしてください
- ROIマネージャを開きます：[分析|ツール| ROIマネージャー...]。
- ImageJでマージされたイメージを開きます：[File |開いた]。
- ImageJツールバーにある線ツールを使用して、SGを通過する行を追加します.SGの前後に必ず挿入します。 ROIマネージャーウィンドウの[追加]をクリックして、ROIマネージャーにこの行を追加します。
- マージされたイメージを別々のチャネルに分割して、各マーカーのグラニュールへのローカライゼーションを評価します。カラー|スプリットチャンネル];これにより、合成された画像が3つの白黒画像に分割されます。
- 白黒画像では、ラインが選択されていることを確認してください。イメージに表示されている場合はその行が選択されます。そうでない場合は、ROIマネージャウィンドウで、パネル内の線をクリックします。 ROIマネージャーウィンドウの青色の線がハイライト表示され、白黒画像に線が表示されます。行がまだ表示されない場合は、 "show all"がchであることを確認してくださいROIマネージャーで確認して、画像内の線をクリックします。
- 線の強度を分析する：[分析|プロットプロファイル];これは、線を横断して信号の強度をプロットする「プロットプロファイル」ウィンドウを表示します。
- "Plot Profile"ウィンドウ内で[List]をクリックすると、グラフから生データを含むウィンドウが表示されます。このウィンドウ内のすべてのデータをコピーし、スプレッドシートファイルに貼り付けます。これを行うには、ウィンドウ内のすべてのデータを選択します。すべて選択]。日付をコピーする：[編集|コピー]をクリックします。スプレッドシートファイルを開き、データを貼り付けます：[編集|ペースト]。
- 各チャンネルごとに手順6.2.6 - 6.2.8を別々に完了してください。評価されているチャネルを必ず記録しておいてください。
- スプレッドシートで、結果の折れ線グラフを生成します。 [control]を押し、各列の上部にある文字をクリックして、データを含む列を選択します。次に、線グラフを選択します。折れ線グラフ]。
- multについてこの分析を繰り返します。複数の独立した実験にまたがる複数のストレス顆粒。
- ラインスキャン分析によるColocalizationの評価 - ImageJ Plugin
- ImageJのWebサイト（https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt）からRGBプロファイルツールをダウンロードしてインストールします。正しくインストールされると、赤、緑、青（RGB）のアイコンがツールバーに表示されます。
- ImageJで画像を開きます（ 例： Tiff、JPG）：[File |開いた]。
- ImageJツールバーにあるRGBアイコンをクリックします。
- クリックしてドラッグすると、隣接する領域が含まれていることを確認しながら、SGを通る線を追加できます。ヒストグラムの画像がポップアップウィンドウに表示されます。
- データをイメージとして保存します：[ファイル| |名前を付けて保存| Tiff]。または、上のステップ6.2.8を使用して、別のグラフ作成プログラムでデータをエクスポートしてグラフ化します。
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Representative Results
ストレス誘発病巣は必ずしもSGではない。 SGは、mRNA、翻訳開始因子、およびRNA結合タンパク質を含み、活性翻訳と平衡状態にある細胞質病巣として分類される。上記のプロトコルは、与えられたストレスが真正 SGを誘導するかどうかを特徴付けるためのテンプレートとして用いることができる。
SGは、タンパク質およびmRNAの両方を含む他の既知のSGマーカーと共存する。 SAおよびVRBは、G3BP1、eIF4GおよびeIF3bを含む細胞質病巣を誘導する（ 図2A ）。これらのマーカーの共局在化は、ラインスキャン分析および増大した倍率を有する単一チャネル画像を用いて確認される（ 図2A ）。さらに、これらの病巣は、ポリA FISHによって示されるようにMrnaを含み、オリゴ（dT）シグナルはG3BP1免疫蛍光シグナルと共局在する（ 図2B ）。ポリA-FISHストレスが複数のタイプの病巣を促進する可能性があるため、既知のSGマーカーと重複する。
SGは、翻訳が禁止された状態で発生します。 VRBとSAの両方は、リボプロファイリングによって実験的に評価されるように、翻訳的に抑制された状態を促進する（ 図3 ）。 真正な SGは活発に翻訳するポリソームと動的な平衡関係にあります。 SAおよびVRB誘発SGは、mRNA上のポリソームを捕捉するCHXによって溶解され、したがってポリソーム分解を停止させ、SGを予防する（ 図4A、4B ）。逆に、puroはポリソーム分解を促進し、SG形成に有利である（ 図4A、4C ）ので、より多くのSAおよびVRB SGがpuroで処理後に誘導される。
要約すると、陽性対照SAと同様に、VRBは、（1）既知のSGマーカーと共局在し、（2）タンパク質およびmRNAの両方を含む真正 SGを誘導する（ Figu翻訳が抑制された細胞（ 図3 ）および（4）は能動的翻訳と動的平衡状態にある（ 図4A〜4C ）。
図1：実験図 （ A ）示されているように、以前に24ウェルプレートに置かれたカバースリップ上に細胞をシードする。示されているように、μM単位の濃度を使用して、SAまたはVRBで60分間、行AおよびBを処理する。 60分後、薬物含有培地にCHX（最終濃度：カラム2に20μg/ mL）またはpuro（カラム4に20μg/ mLピューロマイシン）を添加する。固定および染色の前にさらに30分間インキュベーションを続ける。 （ B ）カウントするために画像化されるべき領域を示すカバースリップの図。カバースリップは5つのほぼ等しい領域に分割されています。各領域で1つの画像が撮影されます。"http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2：SAおよびVRBは、SGマーカーおよびポリ（A）mRNAを含む細胞質焦点を誘導する。 （ A ）G3BP1（緑色）、eIF3b（赤色）、およびeIF4G（青色）について免疫染色されたU2OS細胞。細胞を100μMSAまたは150μMVRBで60分間処理したか、または処理しなかった（対照）。拡大された領域は拡大（2倍）され、黒と白の別々のチャネルとして表示されます（下）。グラフは、領域（白線）顆粒のラインスキャン分析を示し、重複または共局在の程度を示す。スケールバーは10μmを表します。 （ B ）免疫染色と組み合わせたPolyA-FISHは、polyA mRNAをオリゴ（dT） 40プローブ（赤色）で検出し、G3BP1（緑色）は抗GHoechst色素（青色）を用いて核DNAを検出する。拡大された領域（2X）、単一チャンネル画像、およびラインスキャン分析は、共局在化を示す。スケールバー=10μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：SAおよびVRB処置原因翻訳抑制。指示された処置に続いて5分間ピューロマイシンでパルス標識されたU2OS細胞の免疫蛍光。 Puromycin（緑色）、eIF3b（赤色）、およびHoechst（青色）で染色された核DNA。細胞を100μMのSAまたは150μMのVRBで60分間処理したか、または処理しなかった（対照）。スケールバー=10μm。 もっと大きなものを見るにはここをクリックしてくださいこの図のイオン。
図4：SAおよびVRBは、ポリソームと動的平衡にある細胞質叢を誘導する。 （ A ）ポリソーム/ SG関係を説明する一般的なスキーム。 （ BC ）U2OS細胞はG3BP1（緑色）、eIF3b（赤色）、および核DNAはHoechst（青色）を用いて染色した。細胞を100μMのSAまたは150μMのVRBで60分間処理したか、または（ B ）CHX（シクロヘキシミド、20μg/ mL）、（ C ）puro（Puromycin、10μg/ mL）を添加する前に処理しなかった）、または追加の30分間のインキュベーションのための添加物を含まない。数値は、代表的な実験においてSGを有する細胞のパーセンテージに対応する。スケールバー=25μm、in（BC）。 もっと見るにはここをクリックしてくださいこの図のバージョン。
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Discussion
複数の疾患における免疫組織学的研究によって証明されるように、慢性ストレスは、異なる細胞内病巣の形成をもたらす。例えば、ほとんどの神経変性疾患は、不溶性タンパク質の細胞内凝集物を特徴とする。このような凝集体中のSG結合タンパク質の存在は、しばしば、そのような病巣がSGであると結論付けるための基礎である。新しいストレス刺激で処理した細胞でSGマーカー陽性細胞質病巣が観察された場合も同様の結論が導かれる。このプロトコルは、 真の SGを識別するための簡単なワークフローを提供します。
組成とダイナミクスの両方の特徴付けを含む、推定SGsがそのように確認されるためのいくつかの基準が満たされなければならない。第1に、SGは翻訳停止したmRNPを含む細胞質の病巣である。したがって、第1のアプローチは、2つの顕微鏡ベースの技術、すなわちポリA-FISHおよびIFを使用してそれらの組成を特徴付けることである。 FISHは視覚的に信頼できる方法ですSGと共局在するmRNAを生成する。オリゴ（dT） 40プローブを用いて、ストレス条件下でSGにパックするポリアデニル化mRNAを検出する。オリゴ（dT）はプロセシングボディ（PB）のコア成分であるデテニル化されたmRNAを検出しないので、細胞質病巣における強力なオリゴ（dT）シグナルの存在が、これらの病巣がSGs。第2の試験は、他のSGマーカー（ 例えば、 G3BP1）（ 図2A ）とポリ（A）シグナルの共局在を実証することである。これは、SGマーカータンパク質に対してIFを行うことによって行われる。 eIF3bおよびeIF4Gは48S *複合体の成分であることが知られている翻訳開始因子であり、G3BP1はSG形成に必要である（ 図2B ）ため、SGマーカーeIF3b、eIF4G、およびG3BP1が日常的に使用される。異なるストレスが異なるSG関連因子をSGに動員するので、複数のSGマーカーが必要であることを強調することが重要であり、いくつかのストレスはcSG形成と間違える可能性のあるタンパク質凝集を利用する。
第2に、SGは翻訳阻害のために形成される。翻訳の阻害は異なるアプローチ（ 例えば伝統的な[ 35 S] Metチェイスラベリング）によって検出することができるが、処理された細胞における進行中のタンパク質翻訳を検出するので、リボプロマイシン酸化が好ましい。この技術はまた、SGマーカーに対する標準的な免疫蛍光と適合し、したがって、SGおよび個々の細胞における翻訳阻害の程度の同時監視を可能にする。 図3に見られるように、SAおよびVRBの両方は、SG形成を異なる程度に促進する。 SAは細胞の100％近くのSGを引き起こすが、VRBは約75％の細胞でSGの形成を促進する。 SGを促進する能力は、翻訳阻害の程度と相関する：未処理細胞は高い基底レベルの翻訳を有するが、SAは翻訳を完全に阻害するが、VRBのみはpa翻訳を阻害する（ 図3 ）。
第3に、SGは動的であり、ポリソームを翻訳することと平衡している。ストレスの前またはストレスと同時にシクロヘキシミドで細胞を処理することは、ポリソームの分解およびSG形成を防止する。 SGを提示するストレス細胞は、生産的に開始されるときはいつでも、ポリソームまたはモノソーム中のmRNAをトラッピングすることによってSG分解を実施するためにシクロヘキシミドで処理することができるので、SG-ポリソーム平衡は双方向性である。重要なコントロールは、早期終了を促進することによって伸長を阻害するピューロマイシンを使用することであり、SG形成に利用可能な非ポリソームmRNPの量を増加させる。 SGの劇的な変化は、SAまたはVRB処置がCHXまたはpuro処置と組み合わせられた場合に観察される（ 図4 ）。したがって、推定SGがシクロヘキシミド処置に分解されるかどうかを評価するが、ピューロマイシンによって増強されるか、または影響を受けないかは、SG同定に使用するための重要な実験パラメータであるカチオン。非常に小さく付着していない一次ヒト骨髄CD34 +細胞におけるエメチン誘発SG分解は、細胞内染色前に懸濁細胞を処理することによって首尾よく実証された32 。
亜ヒ酸ナトリウムは、eIF2-αリン酸化33を誘導することによってSGを誘発するために広く使用されているが、多くのタンパク質を標的とし、多くのシグナル伝達経路34,35を活性化するので、 注意深く滴定すべきである。異なる細胞株は亜ヒ酸ナトリウムに対する様々な程度の感受性を示す。 U2OSは比較的感受性が高く（100μM）、COS7、MEFおよびHeLaは200μMを必要とする。 DU-145 6 、初代正常ヒト骨髄CD34 +細胞32 、ヒトリンパ芽球36 、マウス皮質ニューロン37 、およびHuh7細胞31は、500〜1,000μMを必要とする。
ここに記載された実験的なワークフローは、異なる細胞および異なるストレス下でのSGの検出を可能にする。このワークフローの主な利点は、簡単であり、 真正な SGの明確な検出だけでなく、ストレス処理細胞における細胞翻訳の同時プロービングも可能であることです。このプロトコールはU2OS細胞を使用するが、異なる細胞株または一次細胞についても改変することができる。ストレス顆粒研究に使用される細胞の最近の包括的リストはレビュー11である。細胞数は、薬物治療の当日に80％コンフルエントに達するように調整しなければならない。細胞の反応が異なるため、薬物治療の濃度と期間も調整する必要があります。さらに、このプロトコルは24ウェルフォーマットに設定されていますが、カバーグラス（任意のサイズ）がプレーティングおよび薬物処理中に平らになることができる任意のサイズプレートまたはディッシュに調整することができますnt。 SG / PBマーカーを安定して発現する細胞株は、ハイスループットのsiRNAベースのスクリーン33および生細胞イメージング38で使用されている 。内在性SGマーカーPABPについて染色されたHeLa細胞を使用して、SGアセンブリ39をブロックする化合物を検出する画像ベースのスクリーニングを用いた。このワークフローは将来の研究やアプリケーションに役立つことが期待されています。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
私はイワノフとアンダーソンのラボのメンバーに、この原稿に関する有益な議論とフィードバックを感謝します。この研究は、ポーランド国立科学センター（UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054からWSへの付与）の国立衛生研究所[PA、NS094918からPIへのGM111700およびCA168872]によって支持された。 WSはまた、ポーランドの科学と高等教育省（モビリティプラスプログラム）とポーランド・アメリカのフルブライト委員会が米国での彼の研究の財政的支援を認めていることも認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | Commonly written "U2OS" Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin Prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | Used to supplement media |
| 24-well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues (kimwipes) | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | Autoclaved before use Keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | Used to assess translation level (ribopuromycylation) -Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | Used in combination with puromycin to assess general translation level Used to assess SG connection with active translation -Dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide (CHX) | Sigma | C4859 | Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma | P6148-500G | Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved Aliquots can be stored at -20 °C for several months Hazardous, use ventilation Discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Prechill to -20 °C before use Discard in special waste |
| Normal Horse Serum (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Dilute to 5% in PBS Add sodium azide for storage at 4 °C Blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Store at 4 °C 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Store at 4 °C 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η is also known as eIF3b Store at 4 °C 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | Store at 4 °C 1/1,000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/2,500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | Incubate with secondary antibodies Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light -Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use Custom order |
| hybridation box | / | / | Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use |
| 20x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated) Store at RT Wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | Block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | Reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | Preservative agent for blocking solution and vinol Make a 20% dilution in water |
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