Summary
Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe .
Abstract
Las células son a menudo desafiadas por cambios ambientales repentinos. Los Gránulos de Estrés (SG), complejos de ribonucleoproteínas citoplasmáticas que se forman en células expuestas a condiciones de estrés, están implicados en diversos aspectos del metabolismo celular y la supervivencia. Las SG modulan las vías de señalización celular, la expresión génica post-transcripcional y los programas de respuesta al estrés. La formación de estos gránulos que contienen mRNA está directamente conectada a la traducción celular. SG se desencadena por la iniciación de la traducción inhibida, y el desmontaje SG se promueve por activación de la traducción o por elongación de la traducción inhibida. Esta relación se pone más de relieve por la composición SG. Los componentes de núcleo SG son complejos de preiniciación de traducción estancados, mRNA, y proteínas RNA-binding (RBPs) seleccionadas. El propósito de la asamblea de SG es conservar la energía celular secuestrando los mRNAs de mantenimiento doméstico traducionalmente estancados, permitiendo la traducción mejorada de proteínas que responden al estrés. En additiSobre los constituyentes del núcleo, tales como complejos de preiniciación de traducción estancada, SGs contienen una plétora de otras proteínas y moléculas de señalización. Los defectos en la formación de SG pueden alterar la adaptación celular al estrés y, por lo tanto, pueden favorecer la muerte celular. Las SG y los gránulos similares que contienen ARN se han ligado a una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cáncer, dando lugar al reciente interés en clasificar y definir subtipos de gránulos de ARN. Este protocolo describe ensayos para caracterizar y cuantificar SGs de mamíferos.
Introduction
Las células emplean muchos mecanismos para responder al estrés. Algunas respuestas se producen a nivel post-transcripcional e implican la regulación de la traducción y / o la estabilidad del mRNA 1 , 2 . La detención y degradación de la ARNm de mRNA modulada por estrés se asocian con la formación de focos celulares no membranosos específicos, siendo los más bien caracterizados los Stress Granules (SGs) 3 . Las SGs son focos citoplasmáticos que concentran mRNPs no traducientes en células detenidas en translación que responden al estrés ( por ejemplo, oxidación, choque térmico, inanición de nutrientes e infección viral) 4 . Además de no traducir mRNAs, SGs contienen factores de iniciación de la traducción, RNA-proteínas de unión, y varias proteínas de señalización [ 5] . SGs son biomarcadores de la traducción de proteínas inhibidas y el metabolismo del ARN alterado y se han relacionado con la supervivencia celular y la apoptosis, vía de señalizaciónS, y los procesos nucleares 5 .
SGs son entidades dinámicas, y su formación está estrechamente conectado con el estado de la traducción celular [ 6] . A pesar de su aspecto aparentemente sólido, la mayoría de los componentes de la proteína SG transitan rápidamente dentro y fuera, con un tiempo de residencia de segundos. Mientras SGs persistir durante minutos a horas, la mayoría de sus componentes están en rápido flujo. La inhibición de la iniciación de la traducción y el consiguiente desmontaje de los polisomas de translación promueven la formación de SGs; Por lo tanto, SGs están en equilibrio con la traducción de polisomas. Este equilibrio polysome / SG es clave para distinguir los SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés 6 , 7 .
La detención de la iniciación de la traducción implica la conversión de complejos de preiniciación competentes para la traducción que contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción (eIF) y subunidades ribosómicas 40S O-llamados 48S complejos) en complejos traslacionalmente estancado (lo que se llama 48S * complejos) que pueden coalescer en SGs 4 , 6 . SGs son promovidos por detención traslacional en dos etapas diferentes antes de la formación del complejo 48S: interferencia con las funciones del complejo eIF4F de unión a la capa ( por ejemplo, dirigida a su subunidad eIF4A) o fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación de la traducción eIF2, mediada por una O más de las cuatro quinasas eIF2. La presencia de complejos 48S bloqueados ( es decir subunidades ribosómicas 40S y factores de iniciación de la traducción seleccionados) es un sello distintivo de las SG 8 , 9 .
Las SG se han relacionado con varios estados patológicos, como infecciones virales, neurodegeneración, autoinmunidad y cáncer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Las formas mutadas de varios componentes de SG están asociadas con enfermedades neurodegenerativas ( por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica) en las que las neuronas presentan inclusiones patológicas intracelulares que pueden desempeñar papeles activos en la muerte neuronal 13 . Algunos virus secuestrar componentes SG para inhibir la formación de SG y para mejorar la replicación viral [ 14] . Estudios recientes también vinculan SGs al cáncer 15 ya la supervivencia de las células cancerígenas en tratamientos de quimioterapia y radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Si bien estos hallazgos han estimulado un gran interés en la biología de SG, muchos de los informes publicados carecen de controles importantes para distinguir la formación de SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés.
Las SG se describieron inicialmente como focos citoplasmáticos no membranosos compuestos de proteínas de unión a mRNA seleccionadas (RBP), incluyendo el antígeno ntracelular de células T 1 (TIA-1) y la proteína de unión a PolyA (PABP); Factores de iniciación de la traducción; MARN poliadenilado; Y pequeñas subunidades ribosómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, su composición ha sido determinada por técnicas como la inmunotinción y la expresión ectópica de las proteínas marcadas con fluorescencia 23 , 24 . Debido a su naturaleza altamente dinámica, la inmunolocalización de las proteínas SG y / o ARNm sigue siendo la metodología que define la detección de SGs 23 , 24 . Hasta la fecha, muchas RBP y otras proteínas (más de 120 proteínas distintas) se describen como SG componentes [ 11] . TantasLas proteínas G-localizadas cambian su localización tanto de una manera dependiente del estrés como de una manera independiente y pueden acumularse en otros compartimentos y focos intracelulares, es importante elegir marcadores SG correctos y emplear criterios funcionales para distinguir SG de otros tipos de estrés inducido Focos Bona fide SGs contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción, y pequeñas subunidades ribosómicas y están en equilibrio dinámico con la traducción.
Este simple flujo de trabajo está diseñado para determinar si los focos inducidos por el estrés son SGs de buena fe . Este flujo de trabajo incluye varios enfoques experimentales utilizando células U2OS, células comúnmente utilizadas para estudiar SGs. Estas células son ideales, ya que tienen un citoplasma grande, son relativamente plana, y se adhieren fuertemente a cubreobjetos de vidrio. Otros tipos de células se pueden utilizar para estudiar SGs, pero es importante tener en cuenta que las diferencias en el tiempo, la concentración de fármacos, y la abundancia de SG-nucleating proteínas pueden alterar la cinética y compoSión. Además, algunas células responden a la fijación de paraformaldehído formando vesículas superficiales de las células, dando entonces un aspecto rizado que causa la localización puntiforme de algunos marcadores SG; Sin un análisis cuidadoso, estos pueden ser clasificados erróneamente como SGs. Esto pone de relieve la necesidad de evaluar todos los criterios necesarios para identificar los focos inducidos por el estrés como SG de buena fe . Vinorelbina (VRB), un cáncer terapéutico que promueve SGs 20 , así como Sodium Arsenite (SA), un robusto y bien caracterizado SG inductor, se utilizan como las tensiones para los experimentos en este protocolo.
Canonical SGs contienen múltiples marcadores SG (proteínas y mRNAs) que colocalize en focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto la inmunofluorescencia como la hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar la localización de los marcadores de proteínas y el ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Brevemente, la inmunofluorescencia indirecta utiliza anticuerpos ( i.mi. Anticuerpos primarios) específicos para una proteína dada para detectarla dentro de la célula. Entonces, los anticuerpos secundarios (generalmente específicos de la especie) unidos a los fluorocromos reconocen el anticuerpo primario y revelan la localización de la proteína diana. La microscopía fluorescente se utiliza para detectar la señal localizada dentro de la célula. El uso de anticuerpos producidos en diferentes especies y su detección con anticuerpos secundarios de color diferente permite la detección de la colocalización de múltiples anticuerpos, lo que indica que sus objetivos de proteínas se encuentran en el mismo lugar [ 23] . Es importante seleccionar marcadores que han sido verificados para colocalizar en SGs de buena fe .
FISH utiliza una sonda marcada que pares de bases a un ARN o secuencia de ADN específicos [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza una sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (o pares de bases) a la cola poliA de mRNA ( es decir, poliA FISH). La sonda biotinilada se detecta entonces utilizando estreptavidina conjugada con fluorescencia, ya que la estreptavidina tiene una alta afinidad por la biotina. Al evaluar SGs, es importante acoplar el poliA FISH con la inmunofluorescencia detectando un marcador SG, como en SGs de buena fe , las dos señales deben colocalize.
Usando este protocolo, la colocalización se evalúa de múltiples maneras. En una imagen multicanal ( es decir, RGB: rojo, verde y azul), la colocalización alterará el color de la señal superpuesta ( p. Ej . Color rojo compartido y verde aparecen en color amarillo) 23 . Además, la colocalización se cuantifica gráficamente mediante análisis de barrido lineal, donde la intensidad de cada color se mide a través de una línea dada 8 , 20 . Este protocolo describe dos procedimientos de análisis de exploración de línea utilizando ImageJ 26 . Un procedimiento es manual y pasa por todo el proceso,El otro utiliza una macro, o un programa simple que automatiza los pasos manuales. Es importante pasar por el programa manual para entender el procedimiento macro.
Las SG se forman en las celdas donde se reprime la traducción; Por lo tanto, las células con SGs deben mostrar niveles disminuidos de traducción global en comparación con las células no tratadas. Experimentalmente, se usa ribopuromicilación. Puromicina y emetina se añaden a las células durante un breve período de tiempo antes de la fijación, permitiendo que la puromicina se incorpore en polipéptidos que forman activamente, causando la terminación 27 , 28 . El tratamiento con emetina es necesario para evitar la reiniciación 29 . La puromicina puede entonces detectarse usando anticuerpos anti-puromicina, dando una instantánea de la traducción activa. Este método se utiliza porque es rápido, no requiere pre-hambre con un medio que carece de un aminoácido particular (y potencialmente el pretensado de las células), y revela laLocalización subcelular de la traducción de proteínas. Se han utilizado otros métodos, especialmente el uso de análogos de aminoácidos modificados, tales como el análogo de metionina L-azidohomoalaína (AHA), junto con la química "click-it" 30 , para mostrar que las células que contienen SG presentan una traducción mucho menor que las células vecinas 31 . Sin embargo, esta técnica requiere inanición de metionina seguido de marcaje por pulso durante 15-30 min. El hambre por metionina constituye un estrés adicional, mientras que el largo tiempo de etiquetado ( es decir, 15-30 minutos) da como resultado la medición de la traducción acumulativa en lugar de la continua y también permite que las proteínas recién sintetizadas se muevan desde su sitio de síntesis hasta su destino final dentro del celda. Por el contrario, la ribopuromicilación es mucho más rápida y es compatible con cualquier medio, tal como el medio libre de glucosa utilizado para inducir SG a través de la ingesta de glucosa.
Los SGs canónicos están en equilibrio dinámicoCon traducción activa de polisomas. Esto puede evaluarse experimentalmente mediante el tratamiento de las muestras con los fármacos que estabilizan o desestabilizar polisomas, por lo tanto, el equilibrio entre la inclinación SGs y polisomas [ 23] . La cicloheximida (o emetina, que se comporta de manera similar) bloquea el alargamiento mediante la "congelación" de los ribosomas en el ARNm, disminuyendo así el grupo de mRNP no polisómicos disponibles capaces de formar SGs. Experimentalmente, esto puede ser utilizado de dos maneras: añadiendo cicloheximida (o emetina) antes del estrés para prevenir la formación de SG o añadiendo cicloheximida (o emetina) después de que se hayan formado los SG, incluso sin eliminar el agente tensor, causando el desmontaje SG, Los complejos de preinitiación se introducen lentamente en la fracción de polisoma. Por el contrario, la puromicina provoca la terminación prematura y promueve el desensamblaje del polisoma, aumentando el grupo de ARNm iniciadores capaces de ensamblarse en SGs. Experimentalmente, el tratamiento con puromicina aumenta el número de SG o disminuye el umbralD en la que se forman en respuesta al estrés graduado oa la dosis de fármaco. Cuando se evalúa el efecto de la puromicina, es importante usar un nivel sub-máximo del fármaco de interés, ya que se espera que la puromicina aumente el efecto del fármaco y aumente el porcentaje de células que presentan SGs - esto no puede ocurrir si el fármaco / Estrés provoca SGs en el 100% de las células inicialmente. Esto contrasta con el tratamiento con cicloheximida, que desensambla SGs y funciona mejor cuando ~ 95% de las células inicialmente muestran SGs de modo que se puede observar y cuantificar con precisión la mayor disminución posible.
Este protocolo proporciona un marco para estudiar SGs en células de mamíferos. Los métodos incluyen: (1) tinción inmunofluorescente y análisis ImageJ para evaluar la colocalización de los marcadores clásicos SG asociados eIF4G, eIF3b, y Ras GTPasa-proteína activadora de la proteína de unión 1 (G3BP1) en putativo SGs; (2) hibridación in situ de fluorescencia de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamiento con cicloheximida y puromicina para determinar si los focos inducidos por el estrés están en equilibrio dinámico con polisomas; Y (4) ribopuromicilación para evaluar el estado de traslación de células que contienen SGs putativas. Juntos, estos ensayos pueden determinar si los focos inducidos por el estrés pueden clasificarse como SGs de buena fe .
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Protocol
1. Preparación de células
- Añadir cubreobjetos autoclavados a 12 pocillos de una placa de 24 pocillos, como se indica en la Figura 1A ; Esto se puede hacer usando una pipeta Pasteur estéril unida a un vacío para recoger cada cubreobjetos. Golpee suavemente la cubreobjetos en el lado del pozo para liberar la succión, permitiendo que la cubreobjetos caiga en el pozo.
- Placa 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) células de osteosarcoma por pocillo a un volumen final de 500 μl de medio. Mueva la placa de lado a lado y arriba y abajo varias veces para asegurarse de que las células están distribuidas uniformemente.
- Presione suavemente los cubreobjetos con una punta P1000 limpia para asegurarse de que el cubreobjetos está en la parte inferior del pozo y que no hay burbujas debajo de la cubreobjetos.
2. Subrayando las células
- Al día siguiente, revise visualmente la placa para asegurarse de que las células están uniformemente dispersas y uniformemente confluentes a través de la cubreobjetos, ya que las variaciones entre saLos modelos pueden afectar negativamente a la reproducibilidad de los resultados. Utilice un objetivo de 10X en un microscopio invertido de cultivo de tejidos.
- Precaliente el medio a 37 ° C. Evite aplicar medios fríos o calientes a las células, ya que éstas causan choque en frío o choque térmico, respectivamente.
- Diluir los medicamentos en medios precalentados. Para cada concentración de fármaco diferente, preparar 2 pocillos que contienen 500 μl de medio. Prepare 500 μl adicionales para permitir la pérdida mientras se pipetea. Alícuota 4 tubos, cada uno conteniendo 1,5 mL.
- Para el arsenito de sodio: a cada pocillo que contenga 500 μl, añadir 1,5 μl de arsenito sódico 100 mM (concentración final: 100 μM) o añadir 0,75 μl de arsenito sódico 100 mM (concentración final: 50 μM).
- Para la vinorelbina: a cada pocillo que contiene 500 μl, añadir 22,5 μl de vinorelbina 10 mM (concentración final: 150 μM) o añadir 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentración final: 100 μM).
NOTA: Arsenito de sodio Es un inductor de gránulos de esfuerzo bien caracterizado y comúnmente utilizado y, por lo tanto, se utiliza clásicamente como control positivo.
- Retire y deseche el medio de los pocillos B1 - 4 y C1 - 4. Agregue el medio con medicamentos y espere 60 min (Figura 1A).
- Añadir 500 μl de medio con arsenito sódico 100 μM a los pocillos B1 y B2. Añadir 500 μl de medio con 50 μM de arsenito de sodio a los pocillos B3 y B4.
- Añadir 500 μl de medio con 150 μM de vinorelbina a los pozos C1 y C2. Añadir 500 μl de medio con 125 μM de vinorelbina a los pozos C3 y C4.
- 30 min antes de la fijación, tratar los pocillos en la columna 2 con 5 μl de cicloheximida (1 mg / ml de stock) y los pocillos en la columna 4 con 2 μl de puromicina (1,25 mg / ml de stock). Rocíe suavemente la placa para que se mezcle antes de colocar la placa en la incubadora a 37 ° C.
3. Fijación Celular e Inmunofluorescencia
Nt "> NOTA: antes del experimento, asegúrese de que el metanol se enfría a -20 ° C. Hacer tampones, incluyendo solución salina tamponada con fosfato (PBS), 5% de suero de caballo normal (NHS) en PBS y 4% de paraformaldehído ) En PBS.- Deseche el medio y lave los pocillos que contengan cubreobjetos con PBS. Dependiendo de los fármacos utilizados, puede ser importante descartar adecuadamente los medios que contienen drogas; Póngase en contacto con la oficina de seguridad ambiental local para obtener instrucciones específicas. Para lavar de manera eficiente, llenar una botella de compresión con PBS, cortar la punta para permitir un flujo suave en lugar de una corriente apretada, y utilizar esto para agregar PBS a cada pozo después de aspirar el PBS original.
- Fijar las células utilizando ~ 250 μ l de 4% PFA durante 15 min a RT bajo agitación suave. Cubra completamente la parte superior del cubreobjetos con PFA; 250 μL debe ser suficiente, pero si no, agregue más. Siempre evite pipetear directamente sobre los cubreobjetos, ya que algunas células (o tratamientos de estrés de las células) pueden alterar el apego, y tLa fuerza de la pipeta puede desalojar las células.
- Retire el PFA y deséchelo correctamente. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener detalles sobre cómo desechar adecuadamente el paraformaldehído.
- A~nadir ~ 250 μl de metanol (-20 ◦ C) e incubar durante 5 min a TA bajo agitación suave; Esto permeabiliza y aplana las células.
- Retirar y descartar el metanol y bloquear las células mediante la aplicación de ~ 250 μ l de NHS al 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener más información sobre cómo desechar adecuadamente el metanol.
- Para los anticuerpos primarios, diluir los anticuerpos en NHS al 5%.
NOTA: El uso de múltiples marcadores SG es clave para confirmar si los gránulos observados son SGs de buena fe . El número de marcadores SG que se pueden utilizar depende de los filtros disponibles en el microscopio. Si se dispone de juegos de filtros estándar verde, rojo y rojo distante, utilice G3BP1, eIF4G y eIF3b a una dilución de 1/250. - Lavar los pocillos 3x con PBS, e incubar cada lavado durante 5 min.
- Para anticuerpos secundarios, diluir todos los anticuerpos secundarios (dilución 1/250) y colorante Hoechst (dilución 1/1000) en NHS al 5%.
- Para este experimento (12 cubreobjetos a 250 μL cada uno-Total: 3 ml de NHS al 5%), añada 12 μl de cada uno de los siguientes: Cy2-Ratón, Cy3-Conejo y Cy5-Cabra (una dilución 1/250 de cada uno ) Y añadir 3 μl de colorante Hoechst.
- Incubar los cubreobjetos con los anticuerpos secundarios durante 1 h a RT. Durante este y los pasos siguientes, proteja las muestras de la luz cubriendo la placa con una caja o colocando la hoja sobre la tapa de la placa de la cultura de tejido.
- Lava elLls tres veces con PBS durante 5 min cada uno.
- Coloque los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio etiquetados utilizando el soporte de montaje. Calentar el medio de montaje en un bloque de calor a 37 ° C durante 10 min; Esto disminuye la viscosidad y facilita la pipeta. Con una punta de corte P200, pipetee 25 μl de medio de montaje por cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio; 4-8 cubreobjetos pueden caber en una diapositiva de cristal, suponiendo que la etapa de microscopio permite esto. Usando fórceps finos, transfiera el cubreobjeto del pozo a la diapositiva, asegurándose de colocar el lado de la celda hacia abajo en el soporte de montaje. Utilizando una punta P200 limpia, presione el cubreobjetos hacia abajo.
- Una vez que todos los cubreobjetos han sido montados, use tejido de laboratorio doblado para limpiar el exceso de medio de montaje presionando el tejido de laboratorio muy firmemente sobre la diapositiva. Utilice una botella de compresión que contenga H2O para eliminar el exceso de medio de montaje y luego repetir la transferencia con el tejido doblado de laboratorio para eliminar el agua.
4. Fluorescencia In Situ </ Em> Hibridación (FISH)
- Plato y tratar las células, utilizando los pasos 1 y 2.1-4 como una guía; Sólo es necesario chapar las células en la columna 1, ya que sólo 3 cubreobjetos son necesarios en el siguiente experimento.
- Asegúrese de que todos los tampones están preparados ( es decir, PFA al 4% en PBS, etanol al 70% en agua, 2x Citrato de Sodio Salino (SSC) y NHS al 5%), que el metanol se enfríe a -20ºC y que El horno de hibridación se calienta hasta la temperatura apropiada.
- Lleve a cabo los pasos 3.1-3.3 para lavar y fijar las células.
- Permeabilizar las células mediante la adición de -20 ° C de metanol durante 10 min.
- Retire el metanol e incube los cubreobjetos en etanol al 70%. Colocar la placa a 4 ° C durante la noche. Selle la placa usando parafilm para evitar la evaporación.
- Al día siguiente, eliminar el etanol y rehidratar las células mediante la adición de 500 μ l de 2x SSC. Incubar los cubreobjetos durante 5 min con agitación suave a RT.
- Quite el SSC 2x y añada 500Μl de SSC 2X. Incubar durante 5 min bajo agitación suave.
- Coloque un pedazo de parafilm plano en la parte inferior del horno de hibridación. Pipetear 25 μL de tampón de hibridación sobre el parafilm para cada cubreobjetos. Retire el cubreobjetos del plato de 24 pocillos (en este punto, los cubreobjetos están al lado de la celda hacia arriba) y coloque el cubreobjetos hacia abajo sobre el tampón de hibridación. Hacer esto a 42 ° C o opcionalmente a 65 ° C durante 15 min.
NOTA: Completar este paso a 65 ° C desnaturalizará los RNAs celulares; Esto puede mejorar la señal si el poliA está enmascarado por las interacciones con las proteínas. - Diluir la sonda Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μl) en tampón de hibridación a una concentración de 2 ng / μl; 25 μL por cubreobjetos es suficiente.
- Para cada cubreobjetos, pipetee 25 μL de tampón de hibridación que contiene Biotin-Oligo (dT) sobre el parafilm. Recoja el cubreobjetos con una pinza y toque suavemente el borde del cubreobjetos en un tejido de laboratorio para eliminar el excesoTampón de hibridación. Transferir el cubreobjetos al tampón de hibridación con Biotin-Oligo (dT); Recuerde mantener el lado de la celda hacia abajo.
- Coloque los cubreobjetos en una caja de hibridación para limitar la evaporación. Incubar los cubreobjetos con Biotin-Oligo (dT) en tampón de hibridación durante 60 min a 42 ° C.
- Colocar 2 x SSC en el horno de hibridación para permitir que se equilibre a 42 ° C.
- Añadir ~ 500 μl de 2X SSC calentado a los pocillos en el plato de 24 pocillos y usar fórceps para transferir los cubreobjetos al pocillo. Incubar durante 10 min.
- Repetir el paso de lavado anterior dos veces a 42 ° C y después dos veces a TA.
- Complete los pasos 3.5-3.10, asegurándose de usar un fluorocromo de estreptavidina para detectar el Biotin-Oligo (dT) en lugar de un anticuerpo convencional.
5. Ensayo de ribopuromicilación para evaluar el estado translacional
- Las células U2OS de la placa en cubreobjetos, como se indica en el paso 1, pero sólo la placa un cubreobjetos por condición (en esteCaso, 3 cubreobjetos: no tratado, arsenito de sodio 100 μM y vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A).
- Células de estrés utilizando el protocolo en el paso 2, completando los pasos 2.1-2.4.
- 5 minutos antes de la fijación, añadir 2 μl de puromicina (stock: 1,25 mg / ml, diluir 2 μL en 500 μl para obtener una concentración final de puromicina de 5 μg / ml) y 2,9 μl de emetina (stock: 20 μg / ml; 2,9 μL a la misma solución que ya contiene la puromicina) a cada pocillo que contiene 0,5 ml.
- Completar los pasos 3.1-3.10 como se indicó anteriormente, utilizando un anticuerpo anti-puromicina (dilución 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use otros dos marcadores SG en los canales restantes.
- Al cuantificar la señal de puromicina, tome todas las imágenes usando la misma exposición. Elija esta exposición utilizando la muestra más brillante (sin tensión) y obtenga una imagen lo más brillante posible sin saturación.
NOTA: La intensidad de la señal fluorescente anti-puromicina represMientras que la puromicina sustituye a un aminoácido, se incorpora a la proteína naciente y hace cumplir la terminación prematura de la proteína.
6. Adquisición y análisis de imágenes
- Cuantificación de Gránulos de Estrés
- Para cuantificar SGs, adquiera de 3 a 5 imágenes con un total de> 100 células por muestra utilizando un objetivo de 40X. Alternativamente, adquiera imágenes utilizando otros objetivos, pero asegúrese de que se cuenten> 100 células por cubreobjetos y que la ampliación sea lo suficientemente grande para visualizar claramente los gránulos. Hacer esto dividiendo el cubreobjetos en cinco regiones aproximadamente iguales y seleccionando aleatoriamente un campo de cada región ( Figura 1B ); Las imágenes del mismo campo deben incluir todos los canales para evaluar la colocalización de los marcadores.
- Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes, combine los canales. Algún software de la cámara hará automáticamente esto, mientras que otros requieren la fusión manual; Esto se puede hacer conImageJ abriendo todas las imágenes y seleccionando [Image | Color | Combinar canales].
- Contar manualmente el número total de células contando el número de núcleos, utilizando Hoechst como el marcador de núcleos. Contar manualmente el número de celdas que contienen más de dos SG por celda.
NOTA: Por ejemplo, usando una imagen de tres canales combinada que muestra G3BP1 (verde), eIF4G (rojo) y Hoechst (azul), cuente los núcleos (o el número de celdas) usando el canal azul. A continuación, cuente las células SG-positivas como aquellas con dos o más focos amarillos por célula. Los gránulos aparecerán de color amarillo, como el verde de G3BP1 y el rojo de eIF4G aparecen en color amarillo si están colocalizados. - Determine el porcentaje de células que son SG positivo combinando los datos de las 3-5 regiones independientes y luego calcule:
Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = porcentaje de células SG-positivas
- Evaluación de la Colocalización por Análisis de Análisis de Línea - Método Manual
- AbiertoImageJ. Descargalo de forma gratuita desde ()
- Abra el gestor de ROI: [Analyze | Herramientas | Gerente de ROI ...].
- Abra la imagen fusionada en ImageJ: [File | Abierto].
- Utilizando la herramienta de línea situada en la barra de herramientas ImageJ, añada una línea que pasa por un SG, asegurándose de incluir antes y después del SG. Agregue esta línea al gestor de ROI haciendo clic en [Agregar] en la ventana del gestor de ROI.
- Dividir la imagen fusionada en canales separados para evaluar la localización de cada marcador en el gránulo: [Image | Color | Split Channel]; Esto dividirá la imagen fusionada en tres imágenes en blanco y negro.
- En la imagen en blanco y negro, asegúrese de que la línea está seleccionada; La línea se selecciona si aparece en la imagen. Si no, en la ventana del administrador de ROI, haga clic en la línea en el panel; Esto resaltará la línea en azul en la ventana del gestor de ROI y hará que la línea sea visible en la imagen en blanco y negro. Si la línea todavía no aparece, asegúrese de que "mostrar todo" es chEcked en el gestor de ROI y luego haga clic en la línea en la imagen.
- Analizar la intensidad de la línea: [Analizar | Perfil de trazado]; Esto mostrará la ventana "Perfil de trazado", que traza la intensidad de la señal a través de la línea.
- En la ventana "Perfil de trazado", haga clic en [Lista], que abre una ventana que contiene los datos sin procesar del gráfico. Copie todos los datos de esta ventana y péguelos en un archivo de hoja de cálculo. Para ello, seleccione todos los datos de la ventana: [Editar | Seleccionar todo]. Copie la fecha: [Editar | Dupdo]. Abra un archivo de hoja de cálculo y pegue los datos: [Editar | Pegar].
- Complete los pasos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal por separado. Asegúrese de realizar un seguimiento del canal que se está evaluando.
- En una hoja de cálculo, genere un gráfico de líneas de los resultados. Seleccione las columnas que incluyen datos pulsando [control] y haciendo clic en la letra en la parte superior de cada columna. A continuación, seleccione el gráfico de líneas: [Insertar | Gráfico de líneas].
- Repita este análisis para multLos gránulos de estrés a través de múltiples experimentos independientes.
- Evaluación de la colocalización por análisis de barrido de línea - Plugin de ImageJ
- Descargue e instale la herramienta de perfil RGB del sitio web de ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Cuando esté correctamente instalado, aparecerá un icono rojo, verde y azul (RGB) en la barra de herramientas.
- Abra la imagen ( por ejemplo, Tiff, JPG) en ImageJ: [Archivo | Abierto].
- Haga clic en el icono RGB situado en la barra de herramientas de ImageJ.
- Haga clic y arrastre para agregar una línea que se extienda a través de un SG, asegurándose de incluir regiones adyacentes; Una imagen del histograma aparecerá en una ventana emergente.
- Guardar los datos como una imagen: [Archivo | Guardar como | Pelea]. Alternativamente, exporte y luego grafique los datos en otro programa gráfico usando el paso 6.2.8 desde arriba.
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Representative Results
Los focos inducidos por el estrés no son necesariamente SGs. Las SG se clasifican como focos citoplásmicos que contienen mRNAs, factores de iniciación de la traducción y proteínas de unión al ARN y están en equilibrio con la traducción activa. El protocolo anterior puede usarse como una plantilla para caracterizar si un esfuerzo dado induce SGs de buena fe .
Las SG se colocalizan con otros marcadores SG conocidos, incluyendo tanto proteínas como mRNA. SA y VRB inducen focos citoplasmáticos que contienen G3BP1, eIF4G y eIF3b ( Figura 2A ). La colocalización de estos marcadores se confirma mediante el análisis de barrido de línea y las imágenes de un solo canal con mayor aumento ( Figura 2A ]. Además, estos focos contienen Mrna, como se indica por polyA FISH, y la señal oligo (dT) co-localiza con la señal de inmunofluorescencia G3BP1 ( Figura 2B ). Es crítico demostrar que el poliA-FISHSe superpone con un marcador de SG conocido, ya que un estrés podría promover múltiples tipos de focos.
SGs ocurren durante un estado translacionalmente inhibido. Tanto VRB y SA promover un estado traslacionalmente reprimidos, como experimentalmente evaluados con ribopuromycylation ( Figura 3 ]. Bona fide SGs están en equilibrio dinámico con la traducción activa de polisomas. SA - y VRB inducida SGs se disuelven con CHX, que atrapa polisomas en mRNAs, por lo tanto, detener polysome desmontaje y la prevención SGs ( Figura 4A, 4B ]. Por el contrario, más SA y VRB SGs son inducidos después del tratamiento con puro, como puro promueve polysome desmontaje, lo que favorece la formación SG ( Figura 4A, 4C ).
En resumen, al igual que con la SA de control positivo, la VRB induce SGs de buena fe que: (1) colocalizan con marcadores SG conocidos, (2) incluyen tanto proteína como mRNA ( Figu Re 2), (3) se encuentran en las células donde la traducción es reprimida ( Figura 3 ], y (4) están en equilibrio dinámico con la traducción activa ( Figura 4A-4C ).
Figura 1: Diagramas experimentales. ( A ) Seed células en cubreobjetos previamente colocados en una placa de 24 pozos, como se indica. Tratar las filas A y B durante 60 minutos con SA o VRB usando la concentración en μM como se indica. Después de 60 minutos, a~nadir CHX (concentración final: 20 μg / ml para la columna 2) o puro (20 μg / ml de puromicina para la columna 4) al medio que contiene el fármaco. Continuar la incubación durante 30 minutos adicionales antes de la fijación y tinción. ( B ) Diagrama de un cubreobjetos, indicando los campos que deben ser visualizados para contar. El cubreobjetos se divide en cinco regiones aproximadamente iguales; Se toma una imagen en cada región."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: SA y VRB inducen citoplasmáticos Foci que contienen SG marcadores anPoly (A) mRNA. ( A ) células U2OS inmunoturadas para G3BP1 (verde), eIF3b (rojo) y eIF4G (azul). Las células fueron tratadas con 100 μ M SA o 150 μ M VRB durante 60 min o no fueron tratados (control). Las regiones con zoom son ampliadas (2X) y se muestran como canales separados en blanco y negro (abajo). El gráfico indica el análisis de barrido lineal de un gránulo de región (línea blanca) y muestra el grado de superposición o colocalización. La barra de escala representa 10 μm. ( B ) PolyA-FISH acoplado con inmunotinción detecta ARNm poliA con una sonda oligo (dT) 40 (roja), se detecta G3BP1 (verde) usando un anticuerpo anti-G3BP, y se detecta ADN nuclear usando colorante Hoechst (azul). Las regiones con zoom (2X), las imágenes de un solo canal y el análisis de exploración de línea muestran colocalización. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: SA y VRB Tratamiento Causa Represión de Traducción. La inmunofluorescencia de las células U2OS se marcó por pulso con puromicina durante 5 min después de los tratamientos indicados. Puromicina (verde), eIF3b (rojo), y ADN nuclear teñido con Hoechst (azul). Las células se trataron con 100 μM de SA o 150 μM de VRB durante 60 minutos o no se trataron (control). Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grandeDe esta cifra.
Figura 4: SA y VRB inducen focos citoplasmáticos que están en equilibrio dinámico con polisomas. ( A ) Esquema general que describe la relación polisoma / SG. ( BC ) células U2OS teñidas de G3BP1 (verde), eIF3b (rojo), y el ADN nuclear utilizando Hoechst (azul). Las células se trataron con SA 100 μM o VRB 150 μM durante 60 minutos o no se trataron (control) antes de la adición de ( B ) CHX (cicloheximida, 20 μg / mL), ( C ) puro (Puromicina, 10 μg / mL ), O sin aditivo durante 30 minutos adicionales de incubación. Los números corresponden al porcentaje de células con SG en un experimento representativo. Barra de escala = 25 μm, en (BC). Haga clic aquí para ver unaVersión de esta figura.
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Discussion
Como evidenciado por estudios inmunohistológicos en múltiples enfermedades, el estrés crónico conduce a la formación de diferentes focos intracelulares. Por ejemplo, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por agregados intracelulares de proteínas insolubles. La presencia de SG-proteínas asociadas en tales agregados es a menudo la base para concluir que tales focos son SGs. Una conclusión similar se deduce también cuando se observan focos citoplasmáticos con marcador positivo en células tratadas con nuevos estímulos de estrés. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sencillo para identificar SGs de buena fe .
Se deben cumplir varios criterios para que las SG putativas puedan ser confirmadas como tales, incluyendo la caracterización tanto de la composición como de la dinámica. En primer lugar, SGs son focos citoplasmáticos que contienen mRNPs traslacionalmente estancado. Por lo tanto, el primer enfoque es caracterizar su composición utilizando dos técnicas basadas en microscopía, a saber, polyA-FISH e IF. FISH es un método fiable para visualizarIzar ARNm que colocalize con SGs. Se usa una sonda de oligo (dT) 40 para detectar ARNm poliadenilados que se empaquetan en SG en condiciones de estrés. Dado que el oligo (dT) no detectará mRNAs mortenilados, que son componentes centrales de los cuerpos de procesamiento (PBs), la presencia de una fuerte señal oligo (dT) en los focos citoplasmáticos es una primera indicación (aunque no suficiente para la definición) de que estos focos son SGs. La segunda prueba es demostrar la colocalización de una señal poli (A) con otros marcadores SG ( por ejemplo, G3BP1) ( Figura 2A ). Esto se realiza mediante la realización de IF contra las proteínas marcadoras SG. Los marcadores SG eIF3b, eIF4G y G3BP1 se utilizan rutinariamente porque eIF3b y eIF4G son factores de iniciación de la traducción conocidos como componentes de complejos 48S * y G3BP1 es necesario para la formación de SG ( Figura 2B ). Es importante enfatizar que se requiere más de un marcador SG, ya que diferentes esfuerzos reclutan diferentes factores SG asociados a SGs, y algunas tensiones pueden cAuse la agregación de proteínas que podría confundirse con la formación de SG.
En segundo lugar, SGs se forman debido a la inhibición de la traducción. Si bien la inhibición de la traducción puede detectarse mediante diferentes enfoques ( por ejemplo, mediante el marcado tradicional de [35S] Met Chase), se prefiere la ribopuromicilación, ya que detecta la traducción de proteínas en curso en células tratadas. Esta técnica es también compatible con la inmunofluorescencia estándar contra los marcadores SG, permitiendo así el monitoreo simultáneo de SGs y del grado de inhibición de la traducción en células individuales. Como se ve en la Figura 3 , SA y VRB promueven la formación de SG en diferentes grados. Mientras que SA provoca SGs en casi el 100% de las células, VRB promueve la formación de SG en aproximadamente el 75% de las células. La capacidad de promover SGs se correlaciona con el grado de inhibición de la traducción: mientras que las células no tratadas tienen un alto nivel basal de traducción, SA inhibe la traducción por completo, pero VRB sólo paRcialmente inhibe la traducción ( Figura 3 ).
En tercer lugar, las SG son dinámicas y están en equilibrio con los polisomas que se traducen. El tratamiento de células con cicloheximida antes del estrés o simultáneamente con el estrés impide el desmontaje del polisoma y la formación de SG. El equilibrio SG-polisoma es bidireccional, ya que las células sometidas a estrés que presentan SGs pueden ser tratadas con cicloheximida para reforzar el desmontaje SG atrapando mRNAs en polisomas o monosomas cada vez que se inicien productivamente. Un control importante es el uso de puromicina, que inhibe el alargamiento promoviendo la terminación prematura, aumentando así la cantidad de mRNP no polisomales disponibles para la formación de SG. Cambios dramáticos en SGs se observan cuando SA o VRB tratamiento se combina con CHX o puro tratamiento ( Figura 4 ]. Por lo tanto, la evaluación de si putativo SGs se disuelven sobre el tratamiento de cicloheximida, pero son aumentados o no afectados por puromycin es un parámetro experimental clave para su uso en SG identificicatión. El desmontaje de la fuerza SG emetina-emforzada en células CD34 + de médula ósea humana primarias no muy adherentes, se demostró con éxito tratando las células en suspensión antes de citospinning 32 .
El arsenito de sodio es ampliamente utilizado para activar SGs al inducir la fosforilación 33 de eIF2-α, pero debe ser cuidadosamente titulado , ya que se dirige a muchas proteínas y activa una serie de vías de señalización 34 , 35 . Diferentes líneas celulares exhiben diversos grados de sensibilidad al arsenito sódico. U2OS son relativamente sensibles (100 μM), mientras que COS7, MEFs y HeLa requieren 200 μM. DU-145 6 , células CD34 + primarias de médula ósea humana primaria 32 , linfoblastos humanos 36 , neuronas corticales de ratón 37 y células Huh7 31 requieren 500-1.000 μM.
El flujo de trabajo experimental descrito aquí permite la detección de SGs en diferentes células y bajo diferentes tensiones. La principal ventaja de este flujo de trabajo es que es simple y permite la detección inequívoca de SGs de buena fe , así como para el sondeo simultáneo de la traducción celular en células tratadas con estrés. Este protocolo utiliza células U2OS, pero puede ser modificado para diferentes líneas celulares o incluso para células primarias. Una lista reciente y exhaustiva de células utilizadas para estudios de estrés gránulo es revisión [ 11] . El número de células debe ajustarse para alcanzar el 80% de confluencia el día del tratamiento con fármaco. La concentración y la duración del tratamiento farmacológico deben ajustarse también, ya que las células responden de manera diferente. Además, aunque este protocolo está configurado para un formato de 24 pocillos, puede ajustarse a cualquier placa de tamaño o plato donde los cubreobjetos (de cualquier tamaño) puedan permanecer planos durante el tratamiento con placas y medicamentosNuevo Testamento. Las líneas celulares que expresan de forma estable los marcadores SG / PB se han utilizado en alto rendimiento, siRNA basado en pantallas 33 y células vivas de imágenes 38 . Se realizó un cribado basado en imágenes utilizando células HeLa teñidas para el marcador SG PABP endógeno para detectar compuestos químicos que bloqueaban el conjunto SG 39 . Se prevé que este flujo de trabajo será útil en futuros estudios y aplicaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Ivanov y Anderson por su útil discusión y comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [GM111700 y CA168872 a PA, NS094918 a PI], el Centro Nacional de Ciencias en Polonia [otorgar UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS también reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior en Polonia (Programa Mobility Plus) ya la Comisión Fulbright Polaco-Americana por el apoyo financiero de su investigación en los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | Commonly written "U2OS" Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin Prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | Used to supplement media |
| 24-well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues (kimwipes) | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | Autoclaved before use Keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | Used to assess translation level (ribopuromycylation) -Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | Used in combination with puromycin to assess general translation level Used to assess SG connection with active translation -Dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide (CHX) | Sigma | C4859 | Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma | P6148-500G | Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved Aliquots can be stored at -20 °C for several months Hazardous, use ventilation Discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Prechill to -20 °C before use Discard in special waste |
| Normal Horse Serum (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Dilute to 5% in PBS Add sodium azide for storage at 4 °C Blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Store at 4 °C 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Store at 4 °C 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η is also known as eIF3b Store at 4 °C 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | Store at 4 °C 1/1,000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/2,500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | Incubate with secondary antibodies Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light -Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use Custom order |
| hybridation box | / | / | Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use |
| 20x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated) Store at RT Wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | Block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | Reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | Preservative agent for blocking solution and vinol Make a 20% dilution in water |
References
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