Summary
Her præsenterer vi en hjernemembranfraktioneringsprotokol, der repræsenterer en robust procedure til isolering af proteiner, der tilhører forskellige synaptiske rum.
Abstract
Vurdering af den synaptiske proteinsammensætning og funktion udgør en vigtig udfordring inden for neurovidenskab. Det er imidlertid ikke let at vurdere neurotransmission, der forekommer inden for synaps, fordi den er stærkt reguleret af dynamiske protein-proteininteraktioner og fosforyleringshændelser. Når en metode anvendes til at studere synaptisk transmission, er det derfor vigtigt at bevare disse forbigående fysiologiske modifikationer. Her præsenterer vi en hjernemembranfraktioneringsprotokol, der repræsenterer en robust procedure til isolering af proteiner, der tilhører forskellige synaptiske rum. Med andre ord beskriver protokollen en biokemisk metode til udførelse af proteinberigelse fra presynaptiske, postsynaptiske og ekstrasynaptiske rum. For det første opnås synaptosomer eller synaptiske terminaler fra neuroner, som indeholder alle synaptiske rum ved hjælp af en diskontinuerlig sucrosegradient. Det bemærkes, at kvaliteten af dette indledende synaptiske membranpræparat er critical. Derefter opnås isoleringen af de forskellige subsynaptiske rum med let solubilisering under anvendelse af milde detergenter ved forskellige pH-forhold. Dette muliggør adskillelse ved gradient- og isopykniske centrifugeringer. Endelig valideres proteinberigelse i de forskellige subsynaptiske rum ( dvs. præ-, post- og ekstrasynaptiske membranfraktioner) ved hjælp af immunoblot-analyse ved anvendelse af velkarakteriserede synaptiske proteinmarkører ( dvs. SNAP-25, PSD-95 og synaptofysin, Henholdsvis), hvilket muliggør en direkte vurdering af den synaptiske fordeling af et hvilket som helst bestemt neuronalt protein.
Introduction
Synaptisk transmission er afhængig af synaps fysiske integritet, et koncept, der var planlagt allerede i 1897 af Foster and Sherrington 1 . Således er forståelse for fordelingen af centrale neurotransmissionskomponenter ( f.eks. Ionkanaler, receptorer, etc. ) afgørende for at belyse synaptisk funktion både under normale og patologiske forhold. Elektronmikroskopi (EM) har bidraget enormt til den nuværende ultrastrukturelle opfattelse af prototypiske centralnervesystems (CNS) synaps. EM har således på en sådan måde fastslået forskellene mellem præ- og postsynaptiske tætheder, som adskilles af en spalt af en ret ensartet afstand (~ 25 nm) 2 . Interessant nok udviser det postsynaptiske apparat en relativt kontinuerlig, elektron-tæt fortykning under sin plasmamembran, den såkaldte postsynaptiske densitet eller PSD 2 . Omvendt, ved det præsynaptiske apparat, en notifikationsblankEt diskontinuerligt cytomatrix netværk er anbragt lige under plasmamembranen, hvilket er afgørende for tilpasningen og dockningen af synaptiske vesikler til den plasmamembranaktive zone 3 . Derfor udgør EM den gyldne eksperimentelle tilgang til undersøgelse af fordelingen af proteiner inden for strukturelt bevarede CNS-synapser. Imidlertid er informationen fra elektronmikrografier statisk. Faktisk viser akkumulerende bevismaterialer, at in vivo synapser er ekstremt dynamiske og oplever således dramatiske strukturelle ændringer ved vedvarende synaptisk transmission. Desuden kan morfologien og sammensætningen af synapser ændre sig gennem forskellige CNS-regioner og ved udvikling, modning, aldring og udvikling af neuropatologiske tilstande. Samlet set repræsenterer en protokol om isolering af proteiner, der tilhører forskellige synaptiske rum i fysiologiske forhold, et værdifuldt redskab til en mere omfattende undersøgelse af synaptisk funktion.
et al . (2001) 4 , er baseret på et pH-skifte, som svækker de klæbende interaktioner der forekommer inden for det præ- og postsynaptiske apparat. For det første er det muligt at skelne adhærensforbindelsen, der indeholder det præ- og postsynaptiske apparat, og som opretholdes fra det ekstrasynaptiske membrandomæne, som er solubiliseret og således kan ekstraheres fra de synaptiske kontakter, ved at anvende milde vaskemidler ved pH 6,0. Efterfølgende hæver pH-værdien fra 6,0 til 8,0 i nærvær af milde vaskemidler styrken af adherensforbindelsen, som holder den presynaptiske aktive zone tæt bundet til den postsynaptiske densitet. Derfor er det presynaptiske rum såledesLubilized og kan adskilles fra den postsynaptiske tæthed, som hovedsagelig bevares, fordi den anvendte koncentration af detergent ikke fremmer dets solubilisering 4 . Interessant nok kan fraktioneringseffektiviteten, som til sidst er højere end 90%, bekræftes af forskellige subsynaptiske markører: i ) synaptosomalt associeret protein 25 (SNAP-25) fra den presynaptiske aktive zone; Ii ) Synaptophysin, fra den ekstrasynaptiske fraktion ( dvs. uden for den aktive zone og inklusiv mikrosomer); Og iii ) postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD-95), fra den postsynaptiske densitet. Især er denne hjernemembranfraktioneringsmetode blevet anvendt med succes. Følgelig har det været muligt præcist at bestemme den subsynaptiske lokalisering af forskellige receptorer, såsom alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) receptorer 5 , adenosin A1 receptor (A1R) 6 ,Adenosin A 2A- receptor (A 2A R) 7 , adenosintrifosfat (ATP) P2-receptorer 8 , nicotinacetylcholinreceptorunderenheder 9 og Parkinsons sygdomsassocierede receptor GPR37 10 . En række begrænsninger kan dog hæmme den korrekte vurdering af den synaptiske fordeling af et bestemt neuronalt protein. Således beskriver vi i denne procedure ikke kun hele protokollen fuldstændigt, men vi fremhæver også nogle kritiske punkter, der skal overvejes, såsom den ret store mængde væv, der kræves, lavproteinudbyttet og det obligatoriske krav til at validere effektiviteten af Hver adskillelse inden udførelse af det konkrete eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøgsprocedurer blev godkendt af University of Barcelona Committee for Animal Use and Care (CEEA) i overensstemmelse med retningslinjerne beskrevet i Vejledningen om pleje og brug af laboratoriedyr 11 og efter Det Europæiske Fællesskab, lov 86/609 / CCE, FELASA og ARRIVE retningslinjer. Mus er således anbragt i standardburer med ad libitum adgang til mad og vand og opretholdes under kontrollerede standardbetingelser (12 h mørk / lyscyklus startende ved 7:30, 22 ° C og 66% fugtighed).
1. Opnåelse af hjernens synaptosomer med en diskontinuerlig sucrosegradient
Bemærk: Denne metode blev rapporteret tidligere 10 .
- Forbered frisk isoleringsbuffer (IB), pH 7,4; 2 M saccharose; 1 M saccharose / 0,1 mM CaCl2; Og 0,1 mM CaCl2 (se tabel 1 ). Chill opløsningerne på is.
- SaCrifice fem mus ved cervikal dislokation. Dekapitér og fjern hurtigt hjernen i hvert dyr. Dissect hjernen regionen af interesse (dvs. hippocampus, 0,25-0,35 g frisk væv) og placere det i et 5 ml Potter-Elvehjem glasrør på is med 1 ml IB.
- Homogeniser vævet ved hjælp af en homogeniserende omrører (10 slag ved 700-900 rotationer pr. Minut), fortrinsvis i et isbad for at forhindre prøveopvarmning.
- Anbring det homogeniserede væv (1 ml) i et 15 ml rør indeholdende 6 ml 2 M saccharose og 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 ved 4 ° C. Bland langsomt ved at invertere røret.
Bemærk: Tilsætningen af calcium er afgørende for at opretholde klæbeinteraktionerne mellem organeller og således bevare strukturen af de forskellige "tætheder". - Anbring opløsningen i et 12 ml centrifugerør og langsomt tilsæt 2,5 ml 1 M saccharose / 0,1 mM CaCl2 oven på hvert rør for at danne sucrosegradienten.
Bemærk: Marker positionen oF gradientgrænsefladen på centrifugerøret ved hjælp af en permanent markør. - Væg og ækvilibrere centrifugerørene med IB-opløsning inden for deres tilsvarende stålstøtter og med deres lukkedæksler.
- Centrifuger rørene i 3 timer ved 100.000 x g og 4 ° C ved hjælp af en svingende spandrotorcentrifuge. Fyld helt rotoren med alle stålstøtterne (selv tom, hvis det er nødvendigt).
- Kassér det øverste lag indeholdende myelin. Med en Pasteur pipette indsamles den hvide ring mellem 1,25-M og 1-M saccharose interfasen svarende til synaptosomfraktionen.
- Fortynd synaptosomerne med 9X deres volumen ved anvendelse af IB i et centrifugerør.
- Væg og ækvilibrere centrifugerørene med IB-opløsning inden for deres tilsvarende stålstøtter og med deres lukkedæksler.
- Centrifuger rørene i 30 minutter ved 15.000 x g og 4 ° C ved hjælp af en svingende buketrotorsentrifuge.
- Kassér supernatanten og resuspender thE pellet med 1,1 ml IB-opløsning. Saml 100 μL af denne synaptosomale opløsning og centrifuger i 5 minutter ved 11.000 x g og 4 ºC.
- Resuspender den synaptosomale pellet i 5% natriumdodecylsulfat (SDS) og opbevar denne prøve ved -20 ºC.
Bemærk: Denne prøve vil svare til den totale synaptosomfraktion til yderligere Western-blot-analyse. Den resterende synaptosomale fraktion (~ 1 ml) kan enten nedfryses ved -20 ºC indtil anvendelse eller forarbejdning til efterfølgende subsynaptisk fraktionering. Synaptosomerne eller rensede synapser repræsenterer mellem 1 og 2% af det samlede hippocampale volumen 12 .
2. Pre-, post- og ekstrasynaptisk-isolering
- Forbered 2x frisk opløseliggøringsbuffer, pH 6,0; 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0; Solubiliseringsbuffer, pH 8,0; Og 0,1 mM CaCl2 (se tabel 1 ). Chill opløsningerne på is.
Bemærk: pH-værdien af disse opløsninger skal være nøjagtigeY justeret for at opnå en god subsynaptisk fraktionering. - Fortynd langsomt den 1 ml resuspenderede synaptosomale fraktion (se trin 1.12) med 5 ml 0,1 mM CaCl2.
- Tilsæt det samme volumen (5 ml) iskold 2x solubiliseringsbuffer, pH 6,0 og inkuber i 50 minutter på is under høj omrøring i et bæger på is.
Bemærk: Mens 1% Triton X-100 ved pH 6,0 solubiliserer alle plasmamembranproteiner, bevares proteinerne indenfor de synaptiske kontakter eller krydsninger ( dvs. præ- og postsynaptiske strukturer) 4 . - Anbring opløsningen i et centrifugerør. Væg og ækvilibrere rørene med ækvivalente volumener 0,1 mM CaCl2 og 2x opløsningsbufferopløsning, pH 6,0, inden for deres tilsvarende stålunderstøtninger og med deres lukkede låg.
- Centrifuger rørene i 30 minutter ved 40.000 x g og 4 ° C ved hjælp af en svingende spandrotorcentrifuge. Den resulterende supernatant repræsenterer den ekstrasynaptiske fraktion,Og pelleten svarer til de synaptiske krydsninger ( dvs. præ- og postsynaptiske fraktioner).
- Koncentrer supernatanten indeholdende den extrasynaptiske fraktion til et endelig 200 μl volumen ved anvendelse af et 15 ml 10K filterrør centrifugeret ved 4.000 xg og 4 ºC.
- Præcipiter den resulterende koncentrerede ekstrasynaptiske fraktion (200 μl) med 5 volumener (1 ml) forkølet (-20 ° C) acetone natten over ved -20 ° C.
- Den næste dag centrifuger den extrasynaptiske fraktion i 30 minutter ved 18.000 x g og -15 ° C. Efter centrifugering kasseres acetonsupernatanten og tørres pelleten for at fjerne ethvert spor af acetone.
- Endelig resuspender pelleten indeholdende de extrasynaptiske proteiner med 200 μl 5% SDS. Sonikér pelleten, hvis det er nødvendigt.
- Uden at forstyrre det skal du forsigtigt vaske pelleten indeholdende præ- og postsynaptiske fraktioner med 2 ml 1x opløsningsbuffer, pH 6,0. Kassér bufferen.
- GensuspendérPelleten med 10 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 8,0, under anvendelse af en Pasteur pipette.
Bemærk: Mens 1% Triton X-100 ved pH 8,0 solubiliserer den presynaptiske specialisering bevares den uopløselige postsynaptiske densitet 4 . - Inkuber suspensionen i 50 minutter på is under høj omrøring i et bæger på is.
- Anbring opløsningen i et centrifugerør. Væg og ækvilibrere rørene med 1x opløsningsbufferopløsning, pH 8,0, inden for deres tilsvarende stålunderstøtninger og med deres lukkede låg.
- Centrifuger rørene i 30 minutter ved 40.000 x g og 4 ° C ved hjælp af en svingende buketrotorsentrifuge; Den resulterende supernatant svarer til den præsynaptiske fraktion og pelleten til den postsynaptiske fraktion.
- Fremgangsmåde supernatanten indeholdende den præsynaptiske fraktion som beskrevet i trin 2.6-2.9.
- Resuspender den pellet indeholdende postsynaptiske fraktion med 200 μl 5% SDS. Sonikere pelleten, iF kræves.
3. Analyser prøverne ved hjælp af immunoblot for at validere membranfraktionering
- Bestem mængden af protein i hver fraktion ( dvs. de samlede, ekstra-, præ- og postsynaptiske fraktioner) ved anvendelse af bicinchoninsyreproteinassayet.
- Tag 20 μg protein fra hver fraktion og fortynd det til et slutvolumen på 50 μl i SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) prøvebuffer. Kog i 5 minutter ved 100 ºC.
- Separat proteinerne ved SDS-PAGE elektroforese 10%, med en 4% koncentrerende gel under reducerende betingelser. Elektroforese ved konstant spænding på 80 V indtil farvestoffet kommer ind i den nederste gel og derefter øge spændingen til 120 V.
- Overfør proteinerne til en PVDF-membran og bloker med IB-blokeringsopløsning i 45 minutter ved stuetemperatur under kontinuerlig omrystning.
- Inkuber membranen natten over ved 4 ºC med det angivne primære antistof ( dvs. anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptofysin eller anti-GPR37) fortyndet i IB-blokeringsopløsning under kontinuerlig omrystning.
- Vask membranen tre gange (10 minutter hver) med IB vaskopløsning for at eliminere ubundet primært antistof.
- Inkuber med det angivne sekundære antistof i 90 minutter i mørke omgivelser ved stuetemperatur under kontinuerlig omrystning.
- Vask membranen tre gange (10 minutter hver) med IB vaskopløsning for at eliminere ubundet sekundært antistof.
- Inkubér membranen med kemiluminescerende substrat (tilbered blandingen under mørke forhold og efter 1: 1-proportionen af opløsning A og B fra producenten).
- Analyser membranen i en kemiluminescerende detektionsanordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metodik er i vid udstrækning anvendt til den subsynaptiske analyse af neuronale proteiner generelt og til isolering og biokemisk karakterisering af synaptiske receptorer 5 , 6 , 7 , 8 , 9 i særdeleshed. Interessant nok viser det repræsentative resultat, der vises her, brugen af denne eksperimentelle procedure til analyse af den subsynaptiske hippocampalfordeling af en forældreløs G-proteinkoblet receptor, nemlig Parkinsons sygdomsassocierede receptor GPR37 10 . GPR37 blev oprindeligt identificeret ved søgninger efter homologer til endotelin og bombesinreceptorer 13 , skønt det blev fundet ikke at binde til endotheliner eller beslægtede peptider. På sin plads blev GPR37 foreslået at blive aktiveret af hovedaktivatoren pEptide 14 , 15 , 16 og for nylig af neuropeptiderne prosaposin og prosaptid 17 , selv om disse foreninger endnu ikke er universelt accepterede. GPR37 har fået mest opmærksomhed for dets forbindelse til Parkinsons sygdom 18 . Således er der betydelig interesse i at kende neurobiologien af denne spændende receptor, både under normale og patologiske tilstande. Derfor kan afdække GPR37-subsynaptisk lokalisering bidrage til at afklare sin funktion i hjernen. Til dette formål blev hippocampus først isoleret fra C57BL / 6J (WT) og GPR37-KO-mus ved otte uger. Derefter blev de ekstra-, præ- og post-subsynaptiske fraktioner oprenset ved anvendelse af membranfraktioneringsprotokollen (se figur 1 for et skematisk overblik over proceduren). Derefter blev renheden af disse subsynaptiske rum verificeret afSegregering af de respektive synaptiske markører: i ) ekstrasynaptisk vesikulær markør (synaptophysin); Ii ) den præsynaptiske aktive zone markør (SNAP-25); Og iii ) postsynaptisk densitetsmarkør (PSD95). Følgelig blev berigelserne i synaptofysin, SNAP-25 og PSD95 i henholdsvis de ekstra-, præ- og post-subsynaptiske fraktioner analyseret ved immunoblot ved anvendelse af specifikke antistoffer mod disse proteiner ( figur 2 ). Derfor blev en fraktioneringseffektivitet på mindst 90% fundet for hver synaptisk markør testet ( figur 3 ), svarende til dem, der er beskrevet tidligere 6 . Interessant var GPR37-immunreaktiviteten mere rigelig (n = 3; P <0,001) i den ekstrasyn-syniske fraktion i sammenligning med de præsynaptiske (20 ± 4%) og de postsynaptiske (36 ± 2%) fraktioner ( figur 3 ). Derudover viste vores data, at GPR37, mens den var til stede i den presynaptiske aktive zone, hovedsagelig var loKalibreret i postsynaptisk densitet (n = 3; P <0,05) ( figur 3 ). Samlet set tillod hjernemembranfraktioneringsprotokollen til vurdering af den subsynaptiske fordeling af GPR37 i mushippocampus og tilvejebringer således værdifuld information til fremtidige manipulationer af denne forældreløse receptor.
Figur 1: Skematisk flowdiagram repræsentation af membranfraktioneringsprotokollen. Alle forsøgsprocedurer beskrives i den venstre kolonne, mens prøveopsamlingen er afbildet i højre kolonne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur2: Subsynaptisk fordeling af GPR37 i mushippocampus. Repræsentativ immunoblot, der viser synaptofysin, SNAP-25 og PSD-95 som ekstra-, pre- og postsynaptiske specifikke synaptiske markører såvel som GPR37-immunoreaktivitet i hippocampale synaptiske fraktioner af WT- og GPR37-KO-mus. Hippocampale synaptosomer (Syn) blev fraktioneret til ekstrasynaptiske (ekstra) og presynaptiske (Pre) aktive zoner og postsynaptiske densitets (Post) fraktioner. Disse blev analyseret ved immunblot (20 μg protein / bane) under anvendelse af kanin-anti-synaptofysinet (1: 3000), anti-SNAP-25 (1: 3000), kanin anti-PSD95 (1: 3000) -GPR37 (1 μg / ml) antistoffer. Det primære bundne antistof blev påvist under anvendelse af enten en HRP-konjugeret gede-anti-kanin (1 / 30.000) eller et kanin-anti-mus (1: 30.000) antistof. Disse data er hentet fra reference 10 med tilladelse. Klik venligst på hEre at se en større version af denne figur.
Figur 3: Relativ kvantificering af GPR37-berigelse i hippocampale ekstra-, præ- og postsynaptiske fraktioner. Intensiteterne af de immunoreaktive bånd på de immunblottede membraner svarende til ekstrasynaptisk (ekstra, gul søjle), presynaptisk (Pre, grøn søjle) og postsynaptisk (Post, rød søjle) fraktioner, vist i figur 2, blev målt ved densitometrisk scanning. Tæthederne blev kvantificeret fra ikke-mættede bånd. Værdier blev normaliseret (i% af den relative densitometriske scanning, RDS) under anvendelse af mængden af Synaptophysin, SNAP-25, PSD95 og GPR37 i den mest berigede fraktion og blev præsenteret som middel ± SEM af tre uafhængige eksperimenter 10 . Asteriskerne angiver væsentligt forskellige data: * p <0,05, *** p <0.001 (1-vejs ANOVA med en Bonferronis post-hoc- test). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economia y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 og PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), Og Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) til FC Også X. M, VF-D og FC tilhører den akkrediterede forskningsgruppe "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Arbejdet blev også støttet af "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" fra CAPES (Brasilien) til FC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30,000 |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
