Summary
Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.
Abstract
Las lesiones cerebrales y de la médula espinal pueden conducir a una incapacidad permanente ya la muerte porque todavía no es posible regenerar las neuronas a largas distancias y reconectarlas con precisión con un objetivo apropiado. Aquí se describe un procedimiento para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Las velocidades de extensión alcanzadas alcanzan más de 1,2 mm / h, 30-60 veces más rápido que las tasas in vivo de los axones de crecimiento más rápido del sistema nervioso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 y 10 veces más rápido de lo que se informó anteriormente para el mismo Neuronal tipo en una etapa anterior de desarrollo [ 4] . En primer lugar, las poblaciones aisladas de las neuronas del hipocampo de rata se cultivan durante 2-3 semanas en dispositivos microfluídicos para posicionar con precisión las células, lo que facilita la micromanipulación y reproducibilidad experimental. A continuación, se colocan perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL) sobre neuritas para formar adhesivoActúa y la micromanipulación con pipeta se utiliza para mover el complejo perla-neurita resultante. A medida que se mueve el cordón, extrae una nueva neurita que puede extenderse a lo largo de cientos de micrómetros y conectarse funcionalmente a una célula diana en menos de 1 h. Este proceso permite la reproducibilidad experimental y la facilidad de manipulación mientras se evitan las estrategias químicas más lentas para inducir el crecimiento de las neuritas. Las medidas preliminares presentadas aquí demuestran una tasa de crecimiento neuronal muy superior a las fisiológicas. La combinación de estas innovaciones permite el establecimiento preciso de redes neuronales en la cultura con un grado de control sin precedentes. Es un método novedoso que abre la puerta a una plétora de información y conocimientos sobre la transmisión de señales y la comunicación dentro de la red neuronal, además de ser un campo de juego en el que explorar los límites del crecimiento neuronal. Las aplicaciones potenciales y los experimentos son generalizados con implicaciones directas para las terapias que apuntan a reconectar neuronaL después del trauma o en enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) adulto pueden conducir a una discapacidad permanente debido a múltiples mecanismos que limitan el rebrote axonal 1 . Tras la lesión, muchos axones del SNC no forman un nuevo cono de crecimiento y no logran montar una respuesta regenerativa eficaz 2 . Además, el daño y el tejido cicatricial que rodea las lesiones del SNC inhiben significativamente el crecimiento axonal 1 , 2 , 3 . Las terapias actuales para promover la regeneración del SNC después de la lesión se han centrado en mejorar el potencial de crecimiento intrínseco de la neurona lesionada y en enmascarar los inhibidores de la extensión axonal asociados con restos de mielina y la cicatriz glial 1 , 3 . A pesar de esto, la capacidad de regenerar axones largos a objetivos distantes y formar sinapsis funcionales apropiadas permanece severamente limitada 4 , 5 , 6 , 7 .
En el presente trabajo, las microperlas, la micromanipulación con pipeta y los dispositivos microfluídicos se utilizan para iniciar, alargar y conectar con rapidez nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Trabajos previos han demostrado que las perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL-perlas) inducen adhesión a la membrana seguido de la agrupación de complejos de vesículas sinápticas y la formación de boutons presinápticos funcionales [ 8] . También se demostró que cuando el PDL-perla es mecánicamente retirado después de la diferenciación presináptica, el grupo de proteínas sinápticas sigue el cordón, el inicio de una nueva neurita [ 9] . El siguiente procedimiento explora este hecho junto con la capacidad de cultivar las neuronas del hipocampo embrionarias de ratas en regiones organizadas en un cubreobjetos usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para volver a cablear precisamente una neuronacircuito.
Estos dispositivos microfluídicos PDMS son no tóxicos, ópticamente transparentes y consisten en dos cámaras conectadas por un sistema de microcanales. Una vez montados en un cubreobjetos, cada dispositivo sirve como molde para guiar el crecimiento neuronal y mantener cultivos neuronales sanos en patrones precisos durante más de 4 semanas in vitro .
Aquí, se presenta un marco en el que se investigan los límites de extensión y funcionalidad de la nueva neurita. Se crean neuritas nuevas y funcionales que se posicionan para controlar (re) alambre las redes neuronales. Las velocidades de extensión alcanzadas son más rápidas que 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica y se establecen conexiones funcionales. Estos resultados muestran, inesperadamente, que la capacidad intrínseca de estas neuritas para la elongación es mucho más rápida de lo que se pensaba anteriormente. Este enfoque mecánico propuesto ignora las estrategias químicas lentas y permite la conexión controlada a un objetivo específico. ThEs técnica abre nuevas vías para el estudio in vitro de nuevas terapias para restaurar la conectividad neuronal después de la lesión. También permite la manipulación y recableado de redes neuronales para investigar aspectos fundamentales del procesamiento de señales neuronales y la función neuronal in vitro .
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Protocol
Todos los procedimientos detallados a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill y conformados con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.
1. Estandarización de cultivos neuronales utilizando dispositivos microfluídicos: Montaje de dispositivos
- Seleccione un dispositivo microfluídico adecuado para el experimento deseado. Para conectar las neuronas dentro de la misma población, utilice los Neuro Devices ( Figura 1 ) y para conectar neuronas en diferentes poblaciones, use los Dispositivos de Co-Cultura ( Figura 6 ).
- Limpie y prepare el número deseado de cubreobjetos estériles o platos de fondo de vidrio. Para obtener los mejores resultados en superficies de plástico utilice platos de 35 mm, en el vidrio utilice cubreobjetos de 25 mm o platos de vidrio de 35 mm de fondo. Seleccione el grosor del vidrio según el sistema de imagen, por ejemplo 0,15 mm.
- Cubra los platos o cubreobjetos con 0,5-1 mL de PDL 100 μg / mL durante 2 h o durante la noche a temperatura ambienteAtura
Nota: El protocolo se puede pausar aquí y reanudarse el día siguiente si se desea. Además, los platos pueden recubrirse con PDL diluida en tampón de borato, poli-L-lisina (PLL), laminina o cualquier otra molécula de adhesión celular. - Lavar los platos dos veces con agua (no usar solución salina tamponada con fosfato (PBS) ya que los cristales de sal pueden bloquear los canales), quitar todo el líquido y dejarlo secar en un ambiente estéril como un gabinete de bioseguridad durante 5-10 min o hasta La superficie está completamente seca.
Nota: Tenga cuidado de asegurarse de que los cubreobjetos estén absolutamente secos, ya que cualquier líquido restante interferirá con la adherencia de los sistemas microfluídicos. - Coloque los dispositivos microfluídicos con los patrones hacia arriba bajo luz UV en un ambiente estéril (gabinete de bioseguridad) durante 10 min. Asegúrese de seguir los procedimientos estériles cuando trabaje en el gabinete de bioseguridad 10 .
- Usando pinzas colocar un dispositivo microfluídico con el patrón hacia abajo en contacto con la cubierta limpiaIp / plato. Utilice las pinzas para presionar suavemente el dispositivo para que se adhiera al cristal.
Nota: La transparencia de la zona adherida será visible al mirar contra la luz. Asegúrese de que todas las esquinas estén en contacto con el cristal. Haga esto a todos los dispositivos microfluídicos. Véase la Figura 1a . - Para llenar el dispositivo de población única con medio, dirija la pipeta hacia los canales y añada 50 μl de medio celular completo suplementado con B-27 libre de suero (relación de volumen 1:50) y 500 μg / mL de penicilina / estreptomicina / glutamina Llamado NBM) en el pocillo superior derecho, y luego añadir otros 50 μL al pozo que se encuentra diagonalmente a él. Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, añadir 50 μL de medio a los 2 pocillos restantes. Véase la figura 2a .
- Para llenar el dispositivo de población múltiple con medio, apunte la pipeta hacia los canales y añada 30 μLDe NBM completo a los pozos derechos, consulte la Figura 6a . Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, añadir 50 μL de medio a los 4 pocillos restantes.
- Coloque los aparatos en una placa más grande con un plato abierto con agua en autoclave (cámara húmeda) y colóquelo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad) durante 1-2 horas mientras se prepara el cultivo celular. Véase la figura 2b .
2. Colocación de neuronas en sistemas microfluídicos
- Siguiendo el protocolo descrito en la Ref. 8 , se obtienen neuronas hipocampales o corticales disociadas de embriones de rata Sprague Dawley (ambos géneros).
- Resuspender las neuronas embrionarias en NBM a una concentración de 1-2 millones de neuronas / mL. Verificar las concentraciones celulares en el microscopio utilizando un hemocitómetro y la siguiente referencia 8 . Ajustar la concentración celular segúnG a la densidad celular deseada. Para aumentar las posibilidades de obtener solo axones del hipocampo por canal, la placa de 10.000 neuronas por dispositivo. Para tener axones múltiples en el mismo canal, plancha 60.000 neuronas por dispositivo.
Nota: Estos números varían según el tipo neuronal utilizado. - Retire el medio de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pocillos. Deje aproximadamente 5 μl en cada uno.
- Para colocar las células en el dispositivo de población única, añada 50 μl de NBM al pocillo inferior derecho. En este punto el medio fluye por sí mismo para llenar el otro pozo inferior. Añadir 20 μl de la solución de células concentradas en el pozo superior derecho del dispositivo microfluídico, como se indica en la Figura 1b .
- Para placas de células en el dispositivo de población múltiple añadir 20 μ l de la solución de células de concentrado en cada uno de los pozos de la derecha en la Figura 6a .
- Verifique en el microscopio si las célulasEstán dentro de las cámaras y colocan los dispositivos en la incubadora durante 15-30 minutos para promover la unión de células al sustrato.
- Verifique en el microscopio si hay suficientes células en las cámaras. Si se necesitan más, repita los pasos 2.4 y 2.5.
- Añadir 50 μL de NBM a los 2 pozos superiores del dispositivo de población única y 20 μL de NBM en el mismo pozo, ya que las células se inyectaron en el dispositivo de población múltiple. Los medios sobresalen ligeramente para formar un menisco positivo que da a los pocillos un aspecto superior del mollete. Una vez más, vea la Figura 2a .
- Mantener las células a 37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad.
3. Mantenimiento de las culturas neuronales
- Retire NBM (aproximadamente 30 μL con una pipeta) de las células y aplique nuevo NBM precalentado al día siguiente de su introducción a los dispositivos (es decir, 1 d después del paso 2).
- Compruebe cada 2 días si hay suficiente medio en cada canal. Si el muffin tOp es baja sólo agregue más medio a los pozos superiores.
- Células de cultivo durante al menos 7 d antes de la eliminación de los dispositivos microfluídicos. Las células pueden sobrevivir en estos dispositivos durante varias semanas. Retire los dispositivos 1-2 días antes de que los experimentos se realicen en muestras.
4. Eliminación de dispositivos microfluídicos
- 1 - 2 d antes de la eliminación de los dispositivos microfluídicos, añadir 2 mL de NBM precalentado a 37 ° C a cada plato de muestra, inundando las cámaras, y mantener los dispositivos en la incubadora.
- Utilice pinzas estériles y una punta para quitar los dispositivos microfluídicos de los cubreobjetos dejando una configuración modelada de las neuronas. Utilice la punta para sujetar el cubreobjetos en su lugar y las pinzas para sujetar el borde del dispositivo en la esquina inferior izquierda del pozo. Aplicar delicadamente la torsión, levantando el dispositivo con las pinzas para que se despegue de la cubreobjetos. Vea la Figura 2c - 2d .
- Cada 2-3 días, reemplazar haSi se utiliza el NBM hasta que la muestra se utilice para experimentos.
- Antes de realizar experimentos de cableado en la muestra, verifique que las neuritas en los canales de dispositivo de población única y las poblaciones neuronales en el dispositivo de población múltiple se aíslan examinando los vacíos entre ellos en el microscopio para asegurar que no hay filamentos que enlazan poblaciones neuronales.
5. Preparación de perlas recubiertas de PDL
- Añadir 2 x 50 μL gotas de 4, 10 o 20 μm de bolitas de poliestireno diluidas en agua (1: 500) a 1 mL de PDL (100 μg / mL). Dejar por lo menos 2 h a temperatura ambiente.
Nota: El protocolo puede pausarse aquí y reanudarse al día siguiente. - Centrifugar la solución a 8,820 xg durante 1 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas acumuladas en el fondo del recipiente.
- Lavar las perlas dos veces con 1 ml de solución HEPES 10 mM estéril pH 8,4.
- Resuspender las perlas recubiertas de PDL en 200 ml de HEPES 10 mM pH 8,4solución.
6. Preparación de Micropipetas
- Prepare pipetas de tubos capilares de vidrio (diámetro interno de 1 mm, diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un extractor de electrodos horizontal. Ajustar los ajustes para que la punta exterior de la micropipeta extraída sea ~ 2-5 μm. Antes de tirar, asegúrese de que los tubos de vidrio estén limpios.
- Fije las pipetas a los portaobjetos de vidrio para el almacenamiento y asegúrese de que la punta no entre en contacto con la superficie del portaobjetos, ya que la punta es frágil. Guarde a temperatura ambiente en un recipiente cubierto para protegerlo del polvo. Utilice las pipetas el mismo día en que son tiradas.
7. Adherencia de PDL-gránulo a neuronas
- Añadir 40-60 μL de perlas recubiertas con PDL preparadas en el paso 5 a un cultivo celular preparado en el paso 4. Centrar la punta de la pipeta sobre las neuronas, que son débilmente visibles en la cubreobjetos, y añadir las perlas.
- Devolver la muestra a la incubadora durante 1 h para promover la formación de syContactos nápticos 8 , 9 .
- Después de la incubación, retire las perlas no adheridas lavando suavemente el cultivo con NBM previamente calentado.
8. Preparación de una solución fisiológica salina (para experimentos con temperatura ambiente)
- Preparar solución fisiológica salina mediante la combinación de los ingredientes enumerados en las referencias 7 , 8 . Esto es para regular el ambiente celular fuera de la incubadora.
- Verificar la osmolaridad y los niveles de pH como se indica en las referencias 7 , 8 .
- Infundir continuamente la solución con O 2 para minimizar las fluctuaciones del pH mientras se realizan experimentos.
- Calentar a temperatura ambiente.
- Instalar el sistema de perfusión mediante la inserción de un extremo de un tubo de plástico (dimensiones opcionales) en solución fisiológica infundida con O 2 y fijar el otroNd a una aguja insertada en el soporte de muestras. Coloque el tubo y la solución por encima de la muestra (vea la Figura 4 ).
- Desconecte el tubo de la aguja y conéctelo a una jeringa. Utilice la jeringa para ejercer presión y extraer líquido, llenando el tubo. Selle con una abrazadera de rodillo y vuelva a conectar la aguja.
9. Micromanipulación del grano
- Instale la muestra en una instalación experimental de tal manera que las células se puedan acceder desde arriba por dos micropipetas montadas en micromanipuladores y se accede ópticamente por debajo, por ejemplo con el objetivo de fase 40X (apertura numérica de 0,6) de un microscopio óptico invertido. En esta configuración, montar una cámara CCD para la captura de imágenes en el puerto lateral del microscopio. Conecte cada pipeta a jeringas de 1 ml a través de tubos de plástico. En este paso, reemplace NBM con solución salina fisiológica (1-2 mL) (Ver Figura 4 ).
- Durante experi, Perfundir continuamente las células con la solución salina fisiológica preparada en la etapa 8 a una velocidad de 0,5-1 ml / min.
- Seleccione un talón PDL NO conectado a una neurona en el campo de visión. Alinee el cordón con una punta de micropipeta enfocándola sobre el talón y luego hacia arriba hasta la micropipeta. Lleve la punta hacia abajo lo más cerca posible de la cuenta mediante la supervisión a través del microscopio.
- Aplique presión negativa con la jeringa de 1 ml conectada a la pipeta para recoger el cordón. Mantener la presión negativa durante todo el experimento.
10. Tirando Neuritos
- Seleccione un talón PDL unido a una neurona en el campo de visión y adjúntelo a la segunda micropipeta utilizando succión como se describe en los pasos 9.3-9.4.
- Tire del complejo PDL-perla-neurona lentamente (~ 0,5 μm / min) moviendo el micromanipulador o la etapa de muestra por 1 μm y haga una pausa de 5 min para permitir la iniciación de la neurita.
- Repita el paso 10.2 dos veces.
Nota: Los primeros 3 &# 181; m tiene que ser jalado muy lentamente para garantizar el éxito experimental, que ocurre sobre el 95% del tiempo. - Tire del complejo PDL-perla-neurona lentamente (~ 0,5 μm / min) moviendo el micromanipulador o la etapa de la muestra en 2 μm y haga una pausa de 5 min para permitir el alargamiento de las neuritas.
- Después de la iniciación exitosa y la extensión de las neuritas para los primeros 5 μm, tire de la neurita a 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica.
Nota: La tracción puede realizarse de forma continua o por etapas ya diferentes velocidades. Véase la Figura 5b- 5c .
11. Conexión de neuronas
- Seleccione una región rica en neuritas y baje el complejo PDL-bead-neurite para que físicamente se ponga en contacto con él. Utilice otras perlas para medir la altura de la punta sobre la superficie del cubreobjetos. Vea la Figura 5d .
- Dejar el complejo PDL-perla-neurita en contacto con la neurita diana mientras se manipula la segunda micropiPette Baje la segunda pipeta con la segunda perla de PDL encima de la neurita recién formada de aproximadamente 20 μm de la primera perla. Utilice el segundo talón de PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula objetivo.
- Mantenga ambas perlas en su lugar durante al menos 1 h. Comprobar la ausencia de hinchamiento focal, un engrosamiento de las neuritas en contacto con el cordón, con el microscopio [ 16] .
- Durante este tiempo, utilice la perfusión para cambiar lentamente el medio de la muestra de solución salina fisiológica a NBM equilibrado precalentado con CO 2 .
- Libere el cordón de la segunda pipeta liberando la succión. Si la nueva neurita permanece unida, libere el primer cordón también. Véase la figura 5e .
- Remueva suavemente la solución salina y reemplácelas con NBM (~ 2 mL).
- Cuidadosamente colocar la muestra de nuevo en la incubadora para fortalecer la conexión neuronal para futuros experimentos. Esta conexión es estable durante> 24 h 7
12. Verificación de la funcionalidad de la nueva conexión a través de grabaciones de parche de parche
- Siga las referencias 7 , 18 , 19 . Para montar una instalación de electrofisiología.
- Siga las referencias 7 . Para preparar los electrodos pre y postsinápticos.
- Reúna los datos de pinza de parche, siguiendo de nuevo las referencias 18 , 19 .
- Compare los resultados con las señales naturales 7 para determinar el tipo de conexión.
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Representative Results
Las neuronas del hipocampo de ratas embrionarias se cultivan en dispositivos microfluídicos para permitir el posicionamiento preciso de células, perlas de PDL y micromanipuladores. El primer paso es montar adecuadamente el dispositivo microfluídico en un cubreobjetos o plato de vidrio. Es esencial que el dispositivo microfluídico esté bien unido al sustrato para evitar que las células salgan de las cámaras y se muevan bajo las partes del dispositivo que deben sellarse ( Figura 1a ). Para mantener los cultivos sanos durante varias semanas, es importante evitar la evaporación del medio comprobando el medio celular cada 2-3 días y preservando un menisco positivo de medio ( Figura 2a ). También se evita la evaporación media manteniendo las células y un plato abierto de agua dentro de una placa más grande ( Figura 2b ). Los dispositivos microfluídicos pueden ser removidos en cualquier momento. Para obtener resultados óptimos, NBM debe agregarse a la célula-deAl menos 1 d antes de retirar el dispositivo. Esto minimiza el estrés celular ya que las neuronas están en contacto con el medio a temperatura y pH ideales cuando se retiran los dispositivos. Cuando los dispositivos microfluídicos se retiran lentamente del plato ( Figura 2c Y 2d ) permanecerán en la posición modelada ( Figura 3 y Figura 5a ).
Se utilizan dos tipos de dispositivos microfluídicos: Neuro Device y Co-Culture Device. El primero permite la fácil identificación de axones, dendritas y cuerpos celulares. El soma permanece en la cámara del soma superior mientras que los axones y las dendritas crecen a lo largo de los canales microfluídicos ( Figura 5a ) hacia la cámara axonal.
Se recomienda que las perlas de PDL se añadan a las células en una proporción de 10: 1 y que la mayoría de las perlas que haNo adherido al cultivo se eliminó lavando las células una vez con NBM después de la incubación de 1 h ( Figura 3 ). Después de adhesión PDL-perlas a las neuritas, el complejo PDL-bead-neurite se tira y se puede extender a grandes distancias. La neurita recién formada puede estar conectada con precisión a neuritas o soma milímetros de distancia ( Figura 5b -5e ). La tasa de éxito para tirar de una nueva neurita para los primeros 3 μm a velocidades inferiores a 1 μm / min es> 95% (n = 206). La tasa de éxito para conectar la nueva neurita a otra célula es 70% (n = 30). La conexión es muy frágil en las primeras 18 h, principalmente porque la nueva neurita es un filamento de menos de 1 μm de diámetro anclado por un talón PDL de 10 μm. Si el plato se mueve rápidamente durante los primeros minutos de contacto, la turbulencia resultante del medio puede hacer que el grano ruede y consecuentemente se pierda la adhesión. Sin embargo, si la muestra no es shaKen, en 30 min el talón se une a las neuritas en el plato y la nueva conexión permanece durante al menos 48 h. Consulte la Figura 4 para ver un esquema de la configuración.
La posición del talón PDL en el cultivo también se puede usar para identificar fácilmente la localización de la neurita conectada ( Figuras 6d-6e ). Después de la iniciación, extensión y conexión de una nueva neurita, se utiliza una segunda y no adherente PDL-perla, recogida a través del micromanipulador, para crear un segundo sitio de adhesión entre la neurita iniciada y la segunda población neuronal. El segundo PDL-perla se coloca en la parte superior de la nueva neurita, comprimiendo de tal manera que la nueva neurita sólo contactos con la segunda población neuronal [ 11] . Esto promoverá la adhesión con la segunda población neuronal ( Figura 5f ).
El dispositivo de población múltiple enabEl crecimiento de 4 poblaciones neuronales aisladas en el mismo plato. Cada población neuronal se limita a un rectángulo de 4 x 7 mm separado de otras poblaciones neuronales por intervalos de 100 o 200 μm ( Figura 6a ). Las neuronas sanas pueden crecer dentro de los dispositivos durante varias semanas. Normalmente, las poblaciones neuronales permanecen aisladas hasta 48 h después de la eliminación del dispositivo. Después de este período de 48 h, las neuronas tienden a crecer hacia las poblaciones neuronales vecinas y forman conexiones naturales. Antes de conectar dos poblaciones aisladas, se debe verificar que las poblaciones están verdaderamente aisladas examinando toda la brecha con el microscopio para establecer que no hay relación entre las dos poblaciones neuronales ( Figura 6b ).
Después de la conexión, las muestras se incubaron durante 24 horas y se realizaron grabaciones de parche de parche de electrodos de células enteras eléctricas para investigar si los nuevosFormada para conectar dos poblaciones neuronales aisladas era funcional y capaz de transmitir señales eléctricas. Se seleccionó una neurona en la población uno, situada a menos de 100 μm de radio del sitio donde se inició la neurita inducida, para registrar los potenciales de acción presinápticos (PAPs). Esta neurona fue considerada la célula presináptica. La actividad excitadora o inhibitoria postsináptica se registró a partir de una neurona en la población dos, en el otro lado de la brecha, situada en un radio inferior a 100 μm de la conexión micromanipulada ( Figura 7a-7c ). Se analizaron las grabaciones derivadas de las conexiones inducidas mecánicamente y se compararon con las de poblaciones neuronales conectadas naturalmente y poblaciones no conectadas ( Figura 7 ). Las respuestas eléctricas después de PAP registradas a partir de neuronas conectadas naturalmente y por micromanipulación son significativamente más altas y temporalmente correlacionadas con la presináptica( Figura 7 ).
Figura 1: Estandarización de cultivos neuronales utilizando dispositivos microfluídicos 7 . (A) Montaje del dispositivo: cuando los dispositivos microfluídicos están correctamente montados sobre una superficie seca, todas las cámaras son visibles. ( B ) Plating celular: placa de las células en el pozo superior derecho y las células deben moverse hacia el pozo izquierdo. ( C ) Densidad de las células: justo después del chapado, revise en el microscopio si la concentración de células es adecuada. ( D ) Después de 1 d en cultivo, las neuronas del hipocampo están bien adheridas cerca de los microcanales y comienzan a formar neuritas. Por favor, haga clic aquí para ver una De esta cifra.
Figura 2 : Mantenimiento de cultivos neuronales sanos durante varias semanas 7 . (A) Agregue medio cada 2-3 dy mantenga un menisco positivo en los pocillos superiores de las cámaras microfluídicas para que las células tengan un suministro constante de nutrientes. ( B ) Mantenga las células dentro de una placa más grande con un plato que contenga agua para reducir la evaporación del medio. ( C ) Utilice puntas y pinzas estériles para ( d ) despegar con facilidad los microdispositivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3 : Ubicación de la pipeta que deposita perlas en las culturas. Una vez que el dispositivo microfluídico ha sido removido, las neuronas son visibles en el cubreobjetos. Al depositar las perlas, coloque la punta de la pipeta de modo que esté en el centro de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquema de una instalación típica de tracción de neurita. La muestra reposa en una etapa (piezo-accionada) y se puede acceder desde arriba por 2 micropipetas mantenidas en micromanipuladores y conectadas a jeringas de 1 ml a través de tubos de plástico. La muestra se accede ópticamente desde abajo por un objetivo conectado a una cámara CCD que envíaS a una CPU. Un tubo de entrada alimenta la solución salina fisiológica oxigenada a la muestra, que descansa por debajo de ella, y un tubo de salida conectado a una jeringa permite la retirada de la solución en caso de desbordamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Adherencia de las bolas de PDL a las neuronas y la micromanipulación con pipeta 7 . (A) Las neuronas permanecen organizadas en patrones después de la eliminación de las cámaras microfluídicas permitiendo la identificación fácil de soma y neuritas. ( B ) La micromanipulación de perlas de PDL adheridas a neuritas permite la iniciación de neurita, extensión ( c ) y conexión ( d ),Seguido por la liberación de la perla PDL de la pipeta ( e ). ( F ) Después de ponerse en contacto con dos poblaciones neuronales aisladas (flecha inferior), se utiliza un segundo micromanipulador de PDL y pipeta (flecha superior) para establecer un segundo punto de adhesión, unos pocos centenares de micras aparte del primer punto de contacto, Conexiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Iniciación, Elongación y Conexión de Nuevos Neuritos para Conectar Dos Poblaciones Aisladas Utilizando Dispositivo de Población Múltiple y Micromanipulación 7 . (A) El dispositivo aísla 4 poblaciones neuronalesEntre 3 intervalos de 100 o 200 μm cada uno. ( B ) Después de retirar el dispositivo, seleccione una brecha y certifique que ninguna neurita conecta las dos poblaciones individuales. ( C ) Esquema de la instalación experimental como debería ser visible en el microscopio óptico, indica la posición de dos micropipetas y la presencia de perlas recubiertas de PDL. ( D ) Aplicando presión negativa a una pipeta, se tira de una punta de PDL adherida a una población neuronal con la punta de la pipeta, iniciando así una nueva neurita. Manteniendo la presión negativa en la pipeta, el complejo PDL-perla-neurita (verde) se puede tirar, alargando la neurita. ( E ) La micromanipulación de la pipeta guía la extensión de la nueva neurita sobre el hueco y la formación de una conexión con una nueva población neuronal. Para asegurar la adhesión de la nueva neurita a la segunda población, se coloca una perla PDL (roja) con una segunda pipeta encima de la neurita extendida y de la neuroNal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: El Neurito Inducido Recientemente, Elongado y Conectado puede Transferir Información entre Dos Poblaciones Neuronales Aisladas 7 . Las poblaciones neuronales aisladas se cultivaron separadas por una brecha de 100 μm en microdispositivos PDMS. Paired patch grabaciones se realizaron en la configuración de la célula entera de una neurona en la población uno y una neurona en la población dos (en el otro lado de la brecha) cuando las dos poblaciones se conectaron a través de la manipulación mecánica ( a ), permitió a la interconexión natural a través de la ( B ) o permanecer sin conexión por maint( C ). Se muestran trazas representativas de grabaciones emparejadas para cada condición ( df ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Utilizando una micromanipulación estándar y dispositivos microfluídicos innovadores, se desarrolló una nueva técnica para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a grandes distancias. La micromanipulación con pipeta es una herramienta común en la mayoría de los laboratorios de neurociencia 4 , 13 . El verdadero desafío para lograr resultados reproducibles y confiables fue la estandarización de cultivos neuronales sanos y precisamente posicionados durante el experimento (que puede ser del orden de las semanas) mediante el desarrollo de dispositivos microfluídicos para organizar cultivos celulares con precisión micrométrica. Los cultivos celulares de alta calidad son la piedra angular de la validación de los datos. Esto contribuye a una imagen microscópica más fácil y rápida y estandarización de culturas y resultados. Los dispositivos microfluídicos fueron diseñados para cultivar células in vitro con una organización similar a la in vivo . El dispositivo de población única permiteEl crecimiento de neuritas largas y la fácil identificación de axones, neuritas y soma. El número de células plateadas en las cámaras microfluídicas determina la densidad neuronal. Por lo tanto, al colocar menos células por dispositivo es fácil identificar neuronas individuales cerca de los canales. El axón y las dendritas múltiples de una sola neurona crecen dentro de un canal. Dendritas crecen al menos 5 veces más lento que los axones 6 , 17 y después de 2-3 semanas in vitro su crecimiento en los canales suele limitarse a 200 μ m, mientras que los axones de rápido crecimiento puede llegar más allá de 2 mm 17 . Por lo tanto, después de añadir las bolas de PDL a las muestras, es relativamente fácil estimar si las cuentas se adhieren principalmente a los axones oa los axones y dendritas ( Figura 5b - 5f ). Hay mayores posibilidades de extraer nuevos axones y dendritas al tirar las perlas de PDL unidas a neuritas menores de 200 μm, whHay mayores probabilidades de tirar sólo de nuevos axones al tirar de PDL-perlas unidas a las neuritas más de 500 μm. El dispositivo de población múltiple es útil para el crecimiento reproducible de poblaciones sanas separadas durante varias semanas. Este sistema de canales es útil para estudiar hasta 4 tipos de células diferentes o comparar las mismas células con diferentes tratamientos.
Además, un entorno de cultivo de células controlado y reproducible proporciona un marco ideal para el análisis y manipulación de células. La colocación precisa de las células en un plato facilita la identificación de las regiones de interés, así como la orientación y la navegación a través de estas áreas de interés que, en última instancia, permite un control sin precedentes sobre el sitio de iniciación neurita. Una distribución celular controlada facilita la visualización de la conexión recién formada y mucho más rápido para encontrar la nueva conexión con el microscopio en los días siguientes a la incubación. Además, las configuraciones reproducibles de las célulasPermiten la colocación fácil y precisa de las señales químicas, tales como las cuentas recubiertas de PDL, sobre el soma, las dendritas o los axones 8 . En conjunto, la obtención de imágenes y el análisis de células cultivadas en dispositivos microfluídicos son más rápidos debido a la organización celular estándar reproducida en todos los platos. Además, los dispositivos están hechos de material biocompatible, transparente y extraíble, permitiendo la formación de imágenes en todas las longitudes de onda visibles y la supervivencia celular dentro de los dispositivos durante varias semanas. La miniaturización de los ensayos celulares también ayuda a reunir más datos con menos células. El consumo de bajo volumen de los dispositivos microfluídicos reduce el número de células necesarias por experimento y aumenta la eficacia experimental. Por ejemplo, en lugar de pasar varias horas buscando con un microscopio para tal vez 1 o 2 axones aislados en un plato, el dispositivo de población única puede ser utilizado para acceder de inmediato a más de 100 axones aislados por muestra de células. Los dispositivos microfluídicos ofrecen un sistema miniaturizado de controlCultivo de células ambiente favoreciendo el análisis de muestras raras con el tiempo para realizar múltiples pruebas.
Las posibles variaciones de la técnica implican la unión directa del cordón a la micropipeta. En el presente protocolo, se describe un método para unir el cordón a la punta por succión, pero el cordón también se puede pegar a la punta. El pegamento es la mejor opción si se desea una conexión altamente estable entre la punta y el cordón, por ejemplo si se realizan mediciones de fuerzas usando la pipeta como sensor o si la investigación de adhesión entre PDL y la neurita es el principal objetivo experimental. En otra vena, la succión es ventajosa ya que permite la liberación de la perla después de la colocación sin cortar el complejo de nervio-perla permitiendo así que se hagan varias conexiones en paralelo. La succión proporciona medios para experimentos de reconexión de alto rendimiento, una mejora sobre otras técnicas de manipulación como la microscopía de fuerza atómica (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Ambas modificaciones de este método permiten que el sitio de iniciación de neuritas sea seleccionado simplemente manteniendo un cordón en contacto con una dendrita para que se formen sinapsis. Sin embargo, la estrategia de incubar varias perlas según se describe en el paso 7 ahorra tiempo en la etapa de manipulación y se recomienda si no es necesario un control preciso sobre el sitio de iniciación en el experimento.
La investigación futura podría tratar de abordar varias limitaciones instrumentales, a saber, el control de la temperatura y la accesibilidad de las muestras. Las propiedades mecánicas de la membrana celular pueden variar significativamente a diferentes temperaturas [ 27] . Idealmente todos los experimentos deben realizarse a 37 ° C en medio neuronal y condiciones adecuadas (controles correctos de presión y humedad de CO 2 ). Sin embargo, no fue posible utilizar una incubadora de células cerradas, ya que para los micromanipuladores se requiere acceso a las muestras desde la parte superiorFondo para el microscopio y desde el lado para mover el escenario. Por lo tanto, se utilizó perfusión a temperatura ambiente. En una vena similar, ya que la configuración sólo tiene suficiente espacio para acomodar 2 micromanipuladores y se tarda casi 1 h para establecer una sola conexión, hay un límite al número de experimentos que uno puede realizar. Este problema podría tratarse con un manipulador que extrae más de una cuenta a la vez. Otra mejora potencial de este protocolo es la capacidad de registrar la altura del complejo de perlas-pipeta desde la superficie de la muestra. La imposibilidad de hacer esto puede conducir a imprecisiones al bajar el segundo cordón y colocarlo en la neurita inducida para fijarlo. El cordón se baja sobre la nueva neurita en una región rica en neuritas hasta que la nueva neurita y las del plato se encuentran en el mismo plano focal. La nueva neurita nunca está entre el cordón y el plato, pero siempre entre un cojín de materia celular y el cordón, por lo tanto la compresión se reduce. Además,La nueva neurita se observa durante 10 minutos en el microscopio para evaluar si los hinchazones focales neurite se forman cerca de cuentas. Como se describe en la referencia 16 , la presencia de hinchazones indica la degeneración neurítica. Sin embargo, puesto que la aplicación de cantidades variables de presión a los axones puede conducir a cambios fisiológicos 16 , la investigación futura podría centrarse en la adaptación de las sondas de pipeta mediante la fijación de reflectores y el seguimiento de desplazamiento perpendicular a la superficie de la muestra con métodos AFM. Finalmente, quizás el mayor desafío a este protocolo es probar la funcionalidad de la conexión manipulada. La técnica más directa, confiable y bien establecida es la emparejamiento de las grabaciones de la abrazadera del remiendo de la célula entera. Sin embargo, la tasa de éxito de la grabación regular de parche patch clamp es muy baja (<25%) 18 . La abrazadera del remiendo de la célula entera tiene varias desventajas incluyendo tiempo de disposición largo, número limitado de experimentos / día, tiempo de grabación limitado (~ 30Min), bajo rendimiento experimental para grabaciones de parche de parche y la muerte celular después de las mediciones. Debido a estos retos técnicos, el rendimiento experimental de las grabaciones de parche de parche de células enteras después de la micromanipulación es muy bajo. Se necesitan mejores plataformas y técnicas para estimular, registrar y comparar más precisamente la actividad neuronal en conexiones naturales y micromanipuladas.
La importancia de la tensión en el crecimiento axonal se conoce desde los primeros días de la neuroanatomía - refiriéndose a ella como el estiramiento pasivo [ 20] . Durante el desarrollo embrionario temprano las neuritas migran a través de pequeñas distancias para alcanzar sus objetivos. Como la mayoría de las células se dividen y duplicar, los axones se someten a fuerzas continuas para alargar y ajustar su longitud al crecimiento embrionario [ 20 , 21] . Varios grupos han intentado probar los límites del crecimiento de neuritas aplicando señales químicas y / o tensión mecánica a neu(Véase la referencia 22 ). En estos informes 23 , 24 , 25 , 26 así como durante el crecimiento fisiológico, las neuritas se extraen mientras están unidas a un sustrato. La principal diferencia con nuestra configuración es que en la presente técnica las nuevas neuritas sólo tienen dos contactos de adhesión; En la base de la neurita se une a la neurona y en la punta de la neurita se une a la cuenta. Durante el alargamiento, los componentes de la nueva neurita tienen la libertad de dispersarse de la manera más eficiente para acomodar las fuerzas de tracción. Más importante aún, este protocolo describe cómo reproducir estos experimentos sin causar ruptura neurita ni degeneración, sobre la base de estudios previos sobre la formación de contactos sinápticos 8 y sobre la resistencia de los axones a la presión 16 que muestra cómo usar micro y nanotools paraTire continuamente de las neuritas con la fuerza apropiada. Las velocidades de extensión de las neuritas descritas aquí (1,2 mm / h) son 30-60 veces más rápidas que las tasas in vivo de los axones de crecimiento más rápido del sistema nervioso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 . Cuando se compara con el mismo tipo neuronal in vitro , las tasas de extensión axonal descritas aquí son 7,5 veces más rápidas que las tasas de crecimiento descritas por otros autores en una etapa anterior de desarrollo (0,1 mm / h) 4 . Diferentes tipos de neuronas se han encontrado para extender axones a diferentes tasas intrínsecas que varían por varios veces [ 29] . Además, axones del sistema nervioso central por lo general pierden la alta tasa de crecimiento axonal después de la inervación in vivo 29 y 3 d de cultivo in vitro [ 6] . Por lo tanto, la actual técnica de extensión axonal debe ser probado con diferentes tipos neuronales para entender mejorE límites de la extensión neurítica.
Micromanipulación de pipeta y dispositivos microfluídicos son técnicas demostradas para crear nuevas neuritas funcionales y para posicionar de forma controlada o (re) cablear redes neuronales. Esta plataforma es ideal para mediciones sistemáticas y estandarizadas. Introduce la reproducibilidad y el control in vivo en experimentos en redes complejas de neuronas. Las velocidades de extensión alcanzadas son más rápidas que 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica y se establecen conexiones funcionales. Estos resultados muestran, inesperadamente, que la capacidad intrínseca de los axones para el alargamiento, incluyendo la de sus componentes citoesqueléticos, es mucho más rápido de lo que se pensaba anteriormente 10 , 11 , 12 . Este acercamiento mecánico propuesto pasa por alto las estrategias químicas lentas y representa así un cambio del paradigma para los progresos terapéuticos para restaurar la conectividad neuronal después de la lesiónY para la micro-neuroingeniería de redes neuronales artificiales para su estudio controlado in vitro . Estos resultados también tienen un gran impacto en la medicina regenerativa y los enfoques de neuroingeniería con implicación directa para las terapias que apuntan a reconectar los circuitos neuronales después del trauma o en las enfermedades neurodegenerativas. Esta plataforma abre la puerta a la obtención de datos sobre la comunicación neuronal, la modulación de la señal, así como el crecimiento y la regeneración. Es una nueva forma de regenerar mecánicamente el SNC y técnicas similares pueden permitir la restauración de la función después de la lesión. Además, esta técnica puede utilizarse para crear redes neuronales de ingeniería sistemática como nuevas plataformas de bioensayo para el descubrimiento de fármacos y la validación de objetivos. Es un precursor del cableado directo de interfaces robustas cerebro-máquina.
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Disclosures
La autora Margaret H Magdesian es la directora general de Ananda Devices que produce instrumentos utilizados en este artículo.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Yoichi Miyahara por muchas discusiones y puntos de vista útiles. MA y PG reconocen fondos del CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
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