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Immunology and Infection

माइक प्रेरित टी-सेल में साइड जनसंख्या का अलगाव Zebrafish में तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया

Published: May 4, 2017 doi: 10.3791/55711
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

यहां, हम एक तकनीक का वर्णन करते हैं जो माईसी प्रेरित टी-सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक लेकिमिया (टी-ऑल) के एक zebrafish मॉडल से पक्ष जनसंख्या की कोशिकाओं को अलग करने के लिए। इस ओर की आबादी परख अत्यधिक संवेदनशील है और इसे zebrafish T-ALL के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन यह अन्य घातक और गैर-घातक zebrafish सेल प्रकारों के लिए लागू हो सकता है।

Abstract

विषम सेल आबादी, या तो स्वस्थ या घातक ऊतकों से, एक अंतर डीएनए बाध्यकारी डाई हेक्स्ट 33342. कोशिकाओं की इस "पक्ष जनसंख्या" तपका करने की क्षमता की विशेषता कोशिकाओं की आबादी हो सकती 33342 Hoechst के बाद प्रवाह cytometric विधियों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है डाई एक पराबैंगनी (यूवी) लेजर से उत्साहित है। कई प्रकार की कोशिकाओं के किनारे आबादी stem- या पूर्वज की तरह सेल शामिल हैं। हालांकि, सभी प्रकार की कोशिकाओं एक पहचान ओर आबादी है। Danio rerio, zebrafish, टी सेल घातक लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (टी सभी) की विवो मॉडल में एक मजबूत है, लेकिन इन zebrafish टी Alls है कि क्या एक ओर जनसंख्या अज्ञात है। विधि यहाँ वर्णित कैसे zebrafish टी सभी में पक्ष आबादी कोशिकाओं को अलग करने की रूपरेखा। शुरू करने के लिए, zebrafish में टी सभी एक कोशिका चरण भ्रूण में tol2 प्लास्मिड के microinjection के माध्यम से उत्पन्न होता है। एक बार जब ट्यूमर एक चरण के लिए बड़े हो गए हैं, जिस पर वे अणि के आधे से अधिक में विस्तारमल के शरीर, टी-सभी कोशिकाओं काटा जा सकता है कोशिकाओं को फिर Hoechst 33342 के साथ दाग दिया जाता है और पक्ष जनसंख्या कोशिकाओं के लिए प्रवाह साइटमैट्री द्वारा जांच की जाती है। इस विधि में zebrafish T-all अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग हैं जबकि ज़ीब्राफीज में कोई ज्ञात कोशिका सतह के निशान नहीं हैं, जो पुष्टि करते हैं कि इन पक्ष की आबादी की कोशिकाएं कैंसर के स्टेम कोशिका हैं, जैसे कि विवो कार्यात्मक प्रत्यारोपण assays संभव हैं। इसके अलावा, इन पक्षीय जनसंख्या कोशिकाओं के आनुवंशिक गुणों की पहचान करने के लिए सिंगल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स लागू किया जा सकता है।

Introduction

पक्ष आबादी परख एक ऊतक के भीतर कुछ कोशिकाओं की बढ़ी क्षमता एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) कोशिका झिल्ली पर ट्रांसपोर्टर प्रोटीन का उच्च स्तर के कारण DNA बाइंडिंग डाई Hoechst 33342 तपका के लिए से फ़ायदा उठाने की। कोशिकाओं है कि तपका 33342 Hoechst डाई दोहरी तरंगदैर्ध्य प्रवाह cytometric विश्लेषण उपयोग करने के बाद डाई एक यूवी लेजर से उत्साहित है पहचाना जा सकता है। यह परख पहले murine hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) 1 पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन यह बाद से कई ऊतकों और कैंसर में स्टेम / पूर्वज सेल आबादी की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है (संदर्भ 2 में समीक्षा)। बहरहाल, कोशिकाओं के सभी आबादियों एक तरफ आबादी है, और सभी पक्ष आबादी नहीं स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए समृद्ध कर रहे हैं।

Zebrafish पारंपरिक murine मो से अधिक लाभ की एक संख्या के साथ, मानव कैंसर 3, 4 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली हड्डीवाला आनुवंशिक मॉडल प्रणाली हैकैंसर के dels। Zebrafish भ्रूण बाह्य निषेचित और ऑप्टिकली स्पष्ट हैं, transgenesis और कैंसर दीक्षा और प्रगति सहित वैकृत प्रक्रियाओं के इन विवो अवलोकन की सुविधा कर रहे हैं। तिथि करने के लिए, पक्ष आबादी परख संभावित स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं केवल zebrafish में गुर्दे मज्जा लिए लागू किया गया एचएससी की पहचान के लिए, और किसी भी zebrafish कैंसर मॉडल 5, 6 के लिए नहीं पता लगाने के लिए।

टी सेल घातक लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया के zebrafish मॉडल (टी सभी) आकृति विज्ञान और आनुवंशिक रूप से करने के लिए मानव टी सभी 7, 8, 11 के समान है। टी सभी एक आक्रामक द्रोह कि मानव में, बाल चिकित्सा का 10-15% और वयस्क सभी मामलों 9 की 25% का योगदान है। टी सभी के उपचार में सुधार हुआ है, वहीं पतन अभी भी आम है और एक गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है। टी सभी ट्यूमर heterogene हैंous और ल्यूकेमिया की शुरुआत कोशिकाओं (LICs) सहित कई अलग अलग ट्यूमर कोशिका उप-जनसंख्या, होते हैं। LICs एक एकल कोशिका से पूरे ट्यूमर regrow करने की क्षमता है, और एक ट्यूमर कोशिका जनसंख्या के भीतर LICs की आवृत्ति द्वारा परिभाषित कर रहे एक सीमित कमजोर पड़ने प्रत्यारोपण परख (LDA) के माध्यम से प्राप्तकर्ताओं में अलग सेल खुराक रोपाई से गणना की जा सकती। झील प्राधिकरण प्रयोगों zebrafish में प्रदर्शन किया गया है जबकि LICs 8, 10, 11 की आवृत्ति की गणना करने के इस संकल्प मसा में किया जाता है और LICs के संभावित अलगाव के लिए अनुमति नहीं है। इसलिए, एक विधि भावी अलग करने के लिए आबादी कैंसर स्टेम सेल गतिविधि के लिए समृद्ध कमी है। पहचान करना और zebrafish टी Alls से पक्ष आबादी कोशिकाओं को अलग इस कमी को संबोधित करने की दिशा में पहला कदम है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे कुशलतापूर्वक zebr में टी सभी ट्यूमर उत्पन्न करने के लिएafish उपयोग tol2 की मध्यस्थता transgenesis, फसल टी सभी ट्यूमर कोशिकाओं, और उन्हें 33342 Hoechst के साथ दाग कोशिकाओं की ओर आबादी की पहचान। Zebrafish टी सभी के साथ विवो प्रयोगों में शामिल हो सकते हैं भविष्य की ओर आबादी कोशिकाओं LICs के लिए समृद्ध या अन्य stem- या पूर्वज की तरह गुण होते हैं है या नहीं।

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Protocol

zebrafish साथ सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) शिकागो विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित किया गया है। शिकागो विश्वविद्यालय मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन (AAALAC) द्वारा मान्यता प्राप्त है।

1. उत्पन्न और अलग fluorescently लेबल टी सभी Zebrafish में कोशिकाओं

  1. Syngeneic zebrafish भ्रूण में microinjection
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करना, अलग परिपत्र rag2: सी Myc और rag2: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (rag2: GFP) प्लाज्मिड उल्टे अंतवाले दुहराव युक्त डीएनए tol2 Transposase (प्लाज्मिड डीएनए के स्रोत के लिए सामग्री की तालिका देखें) 12 से मान्यता प्राप्त है और डीएनए elute बाँझ पानी में।
      नोट: GFP इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है, लेकिन किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन काम करेंगे।
    2. pCS2-Transposase तैयार (tol2) आरएनए
      1. पृथक tol2 प्लाज्मिड डीएनए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर (देखें टीवह प्लाज्मिड डीएनए के स्रोत के लिए सामग्री की तालिका) 12 और बाँझ पानी में डीएनए elute।
      2. 1 μg को टोल 2 डीएनए से 1 डिग्री सेल्सियस के लिए उचित बफर में 5 इकाइयों को नोटिस अवरोध एंजाइम से मिलाकर प्लास्मिड लाइनरिइज करें। 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एनटीआई में गर्मी-निष्क्रिय
      3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए ट्रांसक्रिप्शन किट 13 का उपयोग करके रैखिक डीएनए से SP6 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ tol2 आरएनए को लिप्यंतरित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सिंगल उपयोग अल्कोट में आरएनए को स्टोर करें
    3. 250 एनजी रागा 2: सी-माइक प्लास्मिड डीएनए, 250 एनजी रागा 2: जीएफपी प्लाज्मिड डीएनए, 150 एनजी टूएल 2 आरएनए, और 0.5 μL फिनोल लाल जोड़कर इंजेक्शन मिश्रण तैयार करें। न्युकले-मुक्त पानी के साथ मात्रा 10 μL में समायोजित करें
    4. इंजेक्शन के 1 एनएल इंजेक्शन को इंजेक्शन के एक सेल स्टेज syngeneic zebrafish भ्रूण के एक माइक्रो इंजेक्टर और एक गिलास केशिका ट्यूब से खींचा सुई का उपयोग करके सेल को इंजेक्ट करें, पहले का अनुसरण करेंलिश किए गए तरीकों 8 , 14
      नोट: प्रजनन के बाद आनुवंशिक विविधता और प्रतिरक्षा अस्वीकृति को खत्म करने के लिए parthenogenesis 15 द्वारा उत्पन्न सिगेनेनिक zebrafish यहां उपयोग किया जाता है। हालांकि, wildtype zebrafish या किसी भी वांछित तनाव का इस्तेमाल भी किया जा सकता है।
    5. 24 घंटे और 48 घंटे के बाद इंजेक्शन 16 में मृत, अविकसित या भ्रष्ट भ्रूण निकालें।
    6. इंजेक्शन के इंजेक्शन के 6 दिनों में मछली प्रणाली पर इंजेक्टेड मछली रखें और मानक प्रोटोकॉल 6 के अनुसार उन्हें बढ़ाएं।
  2. स्क्रीनिंग ने zebrafish इंजेक्शन और ट्यूमर के विकास की निगरानी
    1. इंजेक्शन के 21 दिनों के बाद, पेट्री डिश पर भ्रूण माध्यम के एक छोटी बूंद में एक इंजेक्शन लार्वा और जीएफपी प्रतिदीप्ति के लिए एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (उत्तेजना बैंडपास: 470/40, उत्सर्जन बैंडपास: 525/50) का उपयोग करके स्क्रीन रखें।
      नोट: ज़ेबराफिश लार्वा कि एचएवेन्यू एकीकृत दोनों rag2: सी Myc और rag2: GFP एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट थाइमस (सकारात्मक मछली) होगा और पहले से ही थाइमस परे घातक हरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के विस्तार के प्रदर्शन कर सकते हैं। एक GFP + थाइमस साथ सभी मछली पर जाना एक GFP + T-सभी विकसित करने के लिए होगा। लार्वा कि प्लास्मिड के एकीकरण का प्रदर्शन नहीं है किसी भी हरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (नकारात्मक मछली) नहीं होगा।
    2. एक अलग टैंक में नकारात्मक मछली (प्रतिदीप्ति की कमी के आधार पर) को अलग करें और मछली 28 और 35 दिनों के इंजेक्शन के बाद में फिर से नजर रखने के। 28 और 35 दिनों के इंजेक्शन के बाद में, बफ़र tricaine स्क्रीनिंग से पहले (MS-222) मछली प्रणाली पानी में 0.02% के साथ मछली anesthetize।
    3. प्रत्येक zebrafish लार्वा कि एक fluorescently लेबल थाइमस या ट्यूमर के विकास हफ्ते में तीन बार की निगरानी के लिए एक व्यक्ति के टैंक में एक fluorescently लेबल ट्यूमर के लिए सकारात्मक है रखें।
  3. संग्रह की fluorescently प्राथमिक ट्यूमर मछली से टी सभी कोशिकाओं लेबल
    1. कम से कम 20 0.9x फॉस्फेट बफ़र खारा (एफबीएस / पीबीएस) में 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के एमएल तैयार करें।
    2. एफबीएस / पीबीएस के 1 एमएल हेपरिन सोडियम नमक में से एक शीशी (300 इकाइयों) में जोड़े।
    3. मछली का चयन शरीर के 50% से अधिक में ट्यूमर असर, या उन मछली कठिनाई खाने या तैराकी रही है। उन्हें tricaine साथ या बर्फ के पानी विसर्जन से अधिक मात्रा द्वारा मछली बलिदान। गिल आंदोलन और दिल की धड़कन की कमी एक से मौत की पुष्टि करें।
    4. मछली के सिर को हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें।
    5. हेपरिन समाधान के साथ मछली की गुहा धो अतिरिक्त लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए।
      1. एक विंदुक का प्रयोग, मछली के शरीर गुहा में हेपरिन समाधान (कदम 1.3.2 में तैयार) के 100 μL इंजेक्षन। सभी तरल कि बाहर फैल निकालें (यह रक्त कोशिकाओं में शामिल होंगे) और एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में पिपेट।
      2. शरीर फिर से धोने के लिए एक ताजा विंदुक टिप का उपयोग। कम से कम तीन धोने प्रदर्शन करना, या जब तक तरल कि बाहर फैल बीएल से मुक्त दिखाई देता हैood।
      3. 1.3.5.1 और 1.3.5.2 चरणों में सभी तरल पदार्थों से धोएं, क्योंकि इससे आगे के विश्लेषण में उपयोग नहीं किया जाएगा।
    6. लेकिमिया कोशिकाओं को लीजिए
      1. मछलियों की शरीर की गुहा में 100 μL की एफबीएस / पीबीएस इंजेक्षन करें।
      2. ट्यूमर कोशिकाओं को निचोड़ने / धकेलने के लिए विंदुक टिप के साथ मछली के शरीर के बाहर कोमल दबाव लागू करें।
        नोट: यदि यह कदम एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, तो शरीर गुहा से बाहर फैल रहे ट्यूमर कोशिकाओं को स्पष्ट किया जाएगा।
      3. प्रत्येक धोने से तरल और कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ले लीजिए।
      4. 1.3.6.1-1.3.6.3 चरणों तक दोहराएं जब तक कि अधिकांश ट्यूमर कोशिकाओं को एकत्रित नहीं किया जाता (आमतौर पर 5-10 बार)। सभी ट्यूमर कोशिकाओं को उसी 1.5-एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में ले लीजिए। कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर रखें
    7. कोशिकाओं के क्लंप को अलग करने के लिए उन्हें धीरे से pipetting द्वारा चरण 1.3.6 से एकत्र ट्यूमर कोशिकाओं मिलाएं। 4 के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें0-सुक्ष्ममापी जाल फिल्टर। एफबीएस / पीबीएस के 100 μL के साथ फिल्टर धो 1-2 बार। कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखें।
    8. (0.4%, पतला 1:10 और फ़िल्टर किए गए) trypan नीले रंग के 18 μL एक नया ट्यूब में साथ सेल निलंबन की 2 μL मिक्स। लोड एक hemocytometer पर 10 μL और पृथक ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए लाइव (गैर नीला) फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या गिनती।
      नोट: गैर-नीले GFP-नकारात्मक कोशिकाओं की संभावना सामान्य, गैर घातक टी कोशिकाओं रहे हैं और नहीं गिना जाना चाहिए। कम से कम 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं Hoechst 33342 के साथ कोशिकाओं दाग के लिए आवश्यक हैं।

2. धुंधला fluorescently लेबल टी सभी 33342 Hoechst के साथ कोशिकाओं की ओर आबादी की पहचान

  1. Nuclease मुक्त एच 2 ओ के साथ 33342 Hoechst 1:10 पतला 1 मिलीग्राम / एमएल काम कर रहे एकाग्रता बनाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर और अंधेरे में डाई संग्रहित करें।
  2. डाइमिथाइल sulfoxide के 1 एमएल (DMSO) में 49.1 मिलीग्राम भंग द्वारा वेरापामिल की एक 100 मिमी समाधान तैयार करें।
    नोट: Verapamil एबीसी ट्रांसपोर्टरों का अवरोधक है और साइड जनसंख्या प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है। नमूनों के लिए वेरापाइल जोड़ना एईसी ट्रांसपोर्टरों की क्षमता को हईचस्ट 33342 डाई को प्रभावित करने के लिए बाधित करेगा। इसलिए, एक सही पक्ष की आबादी गायब हो जाएगी, जब वर्पिमल को नमूना में जोड़ा जाएगा।
  3. पानी का पानी 28 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें
  4. कोशिकाओं और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर (एफएसीएस) ट्यूबों के समाधानों को जोड़कर अंधेरे में नमूने और नियंत्रण तैयार करें।
    1. 10 6 कोशिकाओं, 1 मिलीग्राम / एमएल होक्स्ट 33342 के 15 μL, और डीएमएसओ की 2.5 μL एफएसीएस ट्यूब में जोड़कर नमूनों को तैयार करें। एफबीएस / पीबीएस के साथ मात्रा को 1 एमएल में समायोजित करें
    2. 10 6 कोशिकाओं, 1 मिलीग्राम / एमएल होच्स्ट 33342 के 15 μL, और 100 एमएम के वायरापिल के 2.5 μL एफएसीएस ट्यूब को जोड़कर नियंत्रण तैयार करें। एफबीएस / पीबीएस के साथ मात्रा को 1 एमएल में समायोजित करें
      नोट: कम से कम 10 6 कोशिकाओं / नमूने की सिफारिश की जाती है, लेकिन अधिक कोशिकाओं को धुंधला जाना पसंद किया जाता है, खासकर अगर पक्ष की आबादीआयन कोशिकाओं को आगे विश्लेषण के लिए सॉर्ट किया जाएगा 10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक न हो, और 15 माइक्रोग्राम / एमएल पर हाईचस्ट 33342 एकाग्रता बनाए रखें। यदि 10 x 10 6 कोशिका दाग रहे हैं, तो कुल प्रतिक्रिया मात्रा 10 एमएल है।
  5. 120 मिनट के लिए अंधेरे में 28 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं
  6. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को तुरंत बर्फ पर रखें और उन्हें अंधेरे में रखें।
  7. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 300 x ग्रा में गोली करें सतह पर तैरनेवाला निकालें 1 एमएल ऑफ एफबीएस / पीबीएस से धोएं
  8. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 300 x ग्रा में गोली करें सतह पर तैरनेवाला निकालें 1 एमएल ऑफ एफबीएस / पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से खोलें
  9. सेल सॉर्टिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस तक रखें।
  10. सेल सॉर्टिंग से 15 मिनट पहले, प्रत्येक 1 एमएल एफबीएस / पीबीएस (अंतिम एकाग्रता: 2 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) स्टॉक (1 मिलीग्राम / एमएल) के 2 μL जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं।

फ्लोरोसेंटली लेबल वाले टी-ऑल सेल जनसंख्या में साइड जनसंख्या को खोजने के लिए एफएसीएस का इस्तेमाल करें

  1. लाइव, जीएफपी + टी-ऑल कोशिकाओं के लिए एक द्वार निर्धारित करें।
    1. फॉरेस्ट स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) क्षेत्र का उपयोग गेट बाहर मलबे के लिए करें।
      नोट: एफएससी का उपयोग सेल आकार में अंतर करने के लिए किया जाता है और सेल की ग्रैन्युलैरिटी भेद करने के लिए एसएससी का उपयोग किया जाता है।
    2. दोहरी भेदभाव के लिए एफएससी और एसएससी चौड़ाई का उपयोग करें
      नोट: प्रवाह कोशिकामीटर डिटेक्टरों द्वारा पहचाने गए तीन घटक हैं: क्षेत्र, ऊंचाई, और चौड़ाई। क्षेत्र आमतौर पर सेल के प्रतिदीप्ति को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। चौड़ाई उड़ान के समय को माप देती है और दो कोशिकाओं को एक साथ जोड़कर दोगुनी हो जाती है।
    3. जीवित ट्यूमर कोशिकाओं के लिए, जीएफ़पी के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट और उचित डिटेक्टरों का उपयोग करते हुए पीआई के लिए नकारात्मक ( उदाहरण के लिए , जीआईपी के लिए एफआईटीसी और पीआई के लिए पेपर सीआई 5-5) को आकर्षित करें।
    2. नोट: यदि उपस्थित हो, तो पक्ष आबादी, यह स्थापित होने के बाद स्पष्ट हो जाएगी। महत्वपूर्ण बात यह है कि साइड जनसंख्या वरामामिली नियंत्रण में गायब होनी चाहिए क्योंकि यह सही पक्ष आबादी माना जाता है।
  2. यदि अतिरिक्त प्रयोगों के लिए पक्ष की आबादी कोशिकाओं को छांटते हैं, तो बड़ी नोजल टिप (100 माइक्रोन) का उपयोग करें और एक एफएसीएस ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें जिसमें 3 एमएल 100% एफबीएस है। सॉर्टिंग के बाद सेल व्यवहार्यता में सुधार के लिए छोटे टिप (70 माइक्रोन) के बजाय एक बड़ी नोजल टिप (100 माइक्रोन) का उपयोग करें।

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Representative Results

कुशलतापूर्वक फ्लोरोसेंट myc प्रेरित टी सभी zebrafish में ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए चक्रीय डीएनए tol2 Transposase साइटों से घिरे निर्माणों tol2 शाही सेना के साथ सह-इंजेक्ट किया जा सकता। Zebrafish भ्रूण में linearized डीएनए के इंजेक्शन से पिछले अध्ययनों से एक 5% transgenesis दर 8 रिपोर्ट। साथ प्रोटोकॉल tol2 की मध्यस्थता transgenesis शामिल करने के लिए समायोजित, transgenesis 10-44% से लेकर दरों मनाया जा सकता है (तालिका 1)।

प्रतिनिधि उदाहरण में, एक GFP + T-सभी के साथ एक मछली Hoechst 33342 के साथ दाग था ओर जनसंख्या में कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए। चित्रा 1 पक्ष आबादी कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया gating योजना को दर्शाता है। सबसे पहले, एफएससी और एसएससी का उपयोग कर, टी सभी कोशिकाओं मलबे (चित्रा 1 ए) को छोड़कर और बाद में दोहरी के खिलाफ का चयन करके अलग हो जाती हैं (चित्रा 1 बी)। इसके बाद, सभी जीवित कोशिकाओं को जीटीपी + और मृत सेल भेदभाव करने वाला पीआई ( चित्रा 1 सी ) के लिए नकारात्मक कोशिकाएं देकर अलग हो जाती हैं। सिंगल, लाइव टी-ऑल कोशिकाओं का चयन करने के बाद, पक्ष की आबादी Hoechst 33342 प्रोफ़ाइल में पाई जा सकती है। मुख्य सेल की आबादी में, होच्स्ट 33342 कोशिकाओं में बनी हुई है, और इन कोशिकाओं को डीएनए सामग्री द्वारा समूह में अलग किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं की ओर की आबादी मुख्य सेल आबादी से अलग होती है, क्योंकि सेल आंचल पर एबीसी ट्रांसपोर्टर की उच्च संख्या के कारण पक्ष की आबादी की कोशिकाएं जलते हैं। पक्ष की आबादी को कल्पना करने के लिए, हईचस्ट प्रोफाइल का प्रयोग दो चैनलों के तुलना करने के लिए किया जाता है, होच्स्ट ब्लू और हॉचस्ट रेड। पक्ष की आबादी मुख्य कोशिका आबादी के बाईं ओर से हईचस्ट ब्लू एक्सिस ( चित्रा 1 डी ) की ओर स्थित कोशिकाओं की मंद पूंछ है।

एक असली पक्ष की आबादी खो जाएगी जब कोशिकाओं को अवरोधक ओ के साथ व्यवहार किया जाता हैच एबीसी ट्रांसपोर्टर, जैसे वरापामिल चित्रा 2 चित्रा 2 कई प्रतिनिधि टी-ऑल ट्यूमर में पक्ष आबादी को दिखाता है, साथ ही जब उन ट्यूमर का इलाज होपेस्ट 33342 के साथ धुंधला होने के दौरान वेरापिल के साथ किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना में मिली आबादी सही पक्ष की आबादी है, उन कोशिकाओं को गायब होना चाहिए अवरोधक की उपस्थिति में, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है।

भंडार न नंबर मछली स्क्रीन किए गए संख्या सकारात्मक ट्रांसजेनेसिस की दर
930 21 3 14.3%
934 12 4 33.3%
950 12 5 41.7%
951 19 3 15.8%
960 3 </ Td> 1 33.3%
983 9 4 44.4%
1004 30 3 10.0%
1013 4 1 25.0%
1025 35 5 14.3%
1029 10 2 20.0%
1065 5 1 20.0%
1070 6 1 16.7%
1073 19 8 42.1%
1079 8 1 12.5%
1105 38 7 18.4%
1193 30 8 26.7%
1215 9 1 11.1%
1229 10 2 20.0%
1314 6 1 16.7%

तालिका 1: transgenesis दरें जब Zebrafish भ्रूण में प्लाज्मिड Microinjection के लिए tol2 Transposase का उपयोग करना। transgenesis की गणना की दरों उन्नीस अलग इंजेक्शन दिनों के लिए दिखाए जाते हैं। मछली की जांच की संख्या कि जीवित रहे 21 दिनों के इंजेक्शन के बाद मछलियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, और संख्या सकारात्मक कि फ्लोरोसेंट ट्यूमर के लिए सकारात्मक थे मछलियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: साइड जनसंख्या गेटिंग योजना। zebrafish में में एक GFP + T-सभी पक्ष आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल gating योजना का एक उदाहरण। (ए) सबसे पहले, मलबे आगे बिखराव (एफएससी) का उपयोग कर बाहर रखा गया है औरपक्ष बिखराव (एसएससी) क्षेत्र। (बी) इसके बाद, एकल कोशिकाओं एफएससी और एसएससी चौड़ाई पैरामीटर का उपयोग कर दोहरी के खिलाफ भेदभाव से अलग हो जाती हैं। (सी) के बाद से इस उदाहरण ट्यूमर था GFP +, सभी जीवित कोशिकाओं में होना चाहिए GFP + और मृत सेल मार्कर Propidium आयोडाइड के लिए नकारात्मक। (डी) की ओर जनसंख्या हेक्स्ट लाल बनाम हेक्स्ट ब्लू प्रोफाइल के साथ देखा जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: साइड जनसंख्या गायब हो जाता है जब एबीसी ट्रांसपोर्टर अवरोध करनेवाला, Verapamil के साथ इलाज किया। पक्ष आबादी के लिए गेट्स दिखाए जाते हैं। शीर्ष पैनल के चार अलग अलग ट्यूमर के नमूने दिखाते हैं। यह ध्यान रखें कि सभी ट्यूमर एक ही तरफ जनसंख्या प्रतिशत है, और पक्ष आबादी सीए महत्वपूर्ण हैप्रत्येक ट्यूमर के परीक्षण के लिए n अलग दिखता है नीचे के पैनल ट्यूमर के नमूनों को दिखाते हैं, जिन्हें डाई फ्लिकक्स ब्लॉक करने के लिए होच्स्ट 33342 के साथ धुंधला होने के दौरान वरामामिल के साथ इलाज किया गया था। जबकि पक्ष की आबादी प्रत्येक ट्यूमर के लिए अलग दिख सकती है, वारापामिल का प्रभाव समान है: पक्ष जनसंख्या गायब हो जाती है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

साइड जनसंख्या परख अत्यधिक संवेदनशील है; इसलिए प्रोटोकॉल में छोटे बदलाव पक्ष आबादी की कोशिकाओं का पता लगाने में कठिनाई का कारण बन सकते हैं। सबसे पहले, धुंधला हो जाना चरण के दौरान तापमान प्रत्येक पशु / सेल प्रणाली के लिए विशिष्ट है स्तनधारी प्रणालियों के लिए, पक्ष की आबादी परख आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस 2 पर किया जाता है जब Zebrafish T-ALL कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated थे, कई कोशिकाओं की मृत्यु हो गई, जो इस ऊष्मायन तापमान अस्वीकार्य (डेटा नहीं दिखाया गया) बनाया है जब कोबायाशी और सहकर्मियों (2008) ने जनसंख्या परख के लिए zebrafish किडनी मज्जा को विच्छेदित किया, तो ऊष्मायन 25 डिग्री सेल्सियस 5 पर किया गया था । यह ऊष्मायन तापमान ज़ेब्राफिश टी-ऑल कोशिकाओं के लिए पर्याप्त नहीं था, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप एक कमजोर हईचस्ट 33342 प्रोफ़ाइल (डेटा नहीं दिखाया गया था)। वर्णित प्रोटोकॉल में, 28 डिग्री सेल्सियस के एक ऊष्मायन तापमान सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए और एक मजबूत होच्स्ट 33342 प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए इष्टतम था।

पक्ष आबादी परख के लिए एक दूसरी स्थिति जिसके लिए विचार और पूर्व परीक्षण की आवश्यकता होती है, Hoechst 33342 की एकाग्रता है। यदि होच्स्ट 33342 की एकाग्रता बहुत कम है, तो पक्ष की आबादी दिखाई नहीं दे सकती है, या पक्ष की जनसंख्या फेनोटाइप (डाई फ्लिकक्स क्षमता) हो सकती है वास्तविक रूप से मौजूद 2 की तुलना में अधिक पक्ष जनसंख्या की कोशिकाओं की पहचान करते हुए झूठा वृद्धि हो सकती है दूसरी तरफ, होच्स्ट 33342 की एकाग्रता की उच्च कोशिकाओं को विषैला हो सकता है। Zebrafish टी-सभी कोशिकाओं के लिए, 120 मिनट के लिए incubated 15 μg / mL Hoechst 33342 इष्टतम संयोजन है। होच्स्ट 33342 की कम मात्रा में zebrafish टी-सभी कोशिकाओं के लिए प्रयास किया गया था, लेकिन पक्ष जनसंख्या हमेशा स्पष्ट नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया है)। 90 मिनट का कुल ऊष्मायन समय एक पक्ष की आबादी का पता लगाने के लिए पर्याप्त था, लेकिन ऊपरी भाग 120 मिनट के बाद पक्ष की आबादी की अधिकतम संख्या देखा गया था।

जैसा स्तनधारी के लिए पहले बताया गया है ystems, नहीं हर ट्यूमर एक detectable ओर जनसंख्या 17, 18, 19 होगा। इस विधि का उपयोग करना, हम 17 टी Alls परीक्षण किया 14 में एक पक्ष आबादी मनाया (डेटा नहीं दिखाया गया है)। टी Alls से अलग पक्ष आबादी कोशिकाओं के बाद, इस विधि अन्य zebrafish ट्यूमर मॉडल के लिए लागू होने की उम्मीद है।

विषम zebrafish के भीतर टी सभी ट्यूमर, ल्यूकेमिया की शुरुआत कोशिकाओं (LICs) ट्यूमर के विकास reinitiating में सक्षम हैं और इस तरह के रूप कैंसर पुनरावृत्ति और मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार माना जाता है। वर्तमान में, zebrafish में कोई विधि है कि विवो में LICs के संभावित अलगाव के लिए अनुमति देता है। एलआईसी आवृत्ति गिना जा रहा है एक सीमित कमजोर पड़ने 8, 10 में ट्यूमर कोशिका प्रत्यारोपण की आवश्यकता है। प्रतिरूप zebrafish साथ पहले प्रकाशित अध्ययन की पहचान की है कि LICs प्राथमिक टी सभी कोशिकाओं के 0.1-1.4% है"Xref"> 10 यहां, क्लोनल ज़ेब्राफिब्स टी-एल्स से पक्ष जनसंख्या कोशिकाओं (0.2-1.0%) की आवृत्ति में समान परिवर्तनशीलता की सूचना दी गई है ( चित्रा 2 )। यह निर्धारित करने के लिए आगे की प्रयोगों की आवश्यकता है कि क्या पक्ष की आबादी एलआईसी में समृद्ध है या नहीं; हालांकि, एलआईसी आवृत्ति की श्रेणियों और इन टी-ऑल में पक्ष आबादी कोशिकाओं के प्रतिशत के बीच समानता इस परिकल्पना का समर्थन करती है।

जबकि ओर की आबादी परख संवेदनशील है और प्रदर्शन करना हमेशा आसान नहीं होता है, परख ने शोधकर्ताओं को पहली बार, ज़ेब्राफिब्स टी-ऑल में कोशिकाओं की एक दुर्लभ आबादी को अलग करने की अनुमति दी है जो कि स्टेम या पूर्व कोशिका गुण हो सकते हैं। वर्तमान में स्टेम- या पूर्वज-जैसी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए zebrafish में कोई सेल सतह मार्कर उपलब्ध नहीं हैं; इसलिए, पक्ष की आबादी को अलग करने की क्षमता बहुत आशाजनक है। इस पद्धति के भविष्य के अनुप्रयोगों में एल के संवर्धन का आकलन करने के लिए क्रमबद्ध पक्ष आबादी टी-सभी कोशिकाओं के सीमित कमजोर पड़ने वाले प्रत्यारोपण प्रयोग शामिल हैंICs। इसके अलावा, इस पद्धति में एलआईसी को स्पष्ट करने वाले विशेषताओं की अनुमति होगी, जिसमें आणविक तंत्र शामिल हैं, जो कि एलबीसी को ज़ेबराफिश टी-एएल में नियंत्रित करते हैं। ये प्रयोग टी-ए एल के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्य की खोज के लिए शुरुआती बिंदु प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम शिकागो महिला बोर्ड, वेंडी विल कैस फंड, और शिकागो विश्वविद्यालय के व्यापक कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (पी 30 सीए 0145 99) द्वारा समर्थित था। हम इस प्रयोग की स्थापना के लिए शिकागो विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर का धन्यवाद करना चाहते हैं, और साथ ही जोंग लैब के अन्य सदस्यों, विशेष रूप से लेस्ली पेड्राज़ा और सीन मैककोनेल का धन्यवाद करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Syngeneic zebrafish (CG2) See Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc plasmid Langenau Laboratory
rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab rag2 promoter from Langenau Laboratory
pCS2-transposase plasmid Chien Laboratory
NotI -HF restriction enzyme New England Bio-Labs Inc. R3189S 500 units in 25 µL
mMessage Machine SP6 Transcription Kit Ambion Thermo Fisher Scientific - AM1340 25 reactions
QIAGEN Plasmid Midi Kit Qiagen, Inc. 12643
SteREO Discovery V8 Microscope Carl Zeiss Microscopy 495015-0008-000
Digital microinjector Tritech Research MINJ-D
Brass straight-arm needle holder Tritech Research MINJ-4
Magnetic base and stand Tritech Research MINJ-HBMB
Micromanipulator Narishige International MN153
Glass capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10 10 cm without filament
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument Co. P-97
Microloader pipette tips Eppendorf North America Inc. 930001007
Phenol Red solution Sigma Life Science P0290 0.5% concentration 100 mL
Plastic Transfer pipettes Fisherbrand 137119D graduated 7.5 mL bulb
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Western Chemical, Inc. Fisher Scientific - NC0342409 100 g
Fetal bovine serum (FBS) HyClone Laboratories, Inc. Fisher Scientific - SH3007103 500 mL
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco by Life Technologies 1001-023 pH 7.4 (1x) - 500 mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich 2106 15 - 300 unit vials
40 µm mesh filter Falcon Corning Brand 352340 Case of 50
Trypan blue Sigma Life Science T8154 20 mL - Solution (0.4%)
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 10 mL
Verapamil Sigma Life Science V4629 1 g
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Life Science D8418 100 mL
Propidium Iodide Life Technologies P3566 10 mL
FACSAria Fusion cell sorter BD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1 BD Biosciences
FlowJo v10.2 FlowJo, LLC

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 123 पक्ष आबादी cytometry टी सेल घातक लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया zebrafish tol2 की मध्यस्थता transgenesis ल्यूकेमिया की शुरुआत सेल प्रवाह
माइक प्रेरित टी-सेल में साइड जनसंख्या का अलगाव Zebrafish में तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया
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Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. … More

Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55711, doi:10.3791/55711 (2017).

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