Summary
Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.
Abstract
populações celulares heterogéneas, a partir de qualquer dos tecidos saudáveis ou malignas, podem conter uma população de células caracterizadas por uma capacidade diferencial para efluxo do corante de ligao a ADN Hoechst 33342. Este "população lado" de células podem ser identificados utilizando métodos de citometria de fluxo após a Hoechst 33342 corante é excitado por um (UV) do laser ultravioleta. A população lado de muitos tipos de células contem células progenitoras de haste ou semelhante. No entanto, nem todos os tipos de células têm uma população lado identificável. Danio rerio, peixe-zebra, tem um robusto em modelo vivo de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), mas se estes T-alls peixe-zebra tem uma população lado é desconhecida. O método descrito aqui descreve como para isolar as células da população lado em peixes-zebra T-ALL. Para começar, a T-ALL no peixe-zebra é gerado através da microinjeção de plasmídeos tol2 em embriões em estágio de uma célula. Uma vez que os tumores cresceram a uma fase em que eles se expandir para mais de metade do aniO corpo de mal, as células T-ALL podem ser colhidas. As células são depois coradas com Hoechst 33342 e examinadas por citometria de fluxo para as células da população lado. Este método tem amplas aplicações em peixe-zebra T-ALL pesquisa. Embora não existam marcadores de superfície celular conhecidos no peixe-zebra que confirmam se estas células da população lado são células-tronco como cancro, in vivo, ensaios de transplante funcionais são possíveis. Além disso, transcriptómica de célula única poderiam ser aplicados para identificar as características genéticas destas células população lado.
Introduction
O ensaio população lado capitaliza sobre a capacidade aumentada de determinadas células dentro de um tecido que efluxo o corante de ligao ao ADN Hoechst 33342, devido aos elevados níveis da cassete de ligao de ATP (ABC) proteínas transportadoras sobre a membrana celular. As células que efluxo o corante Hoechst 33342 pode ser identificado utilizando análise de citometria de fluxo duplo comprimento de onda após o corante é excitada por um laser de UV. Este ensaio foi utilizado pela primeira vez para identificar células estaminais hematopoiéticas murinas (HSCs) 1, mas foi uma vez utilizado para identificar populações de células estaminais / progenitoras em muitos tecidos e tipos de cancro (revisto em referência 2). No entanto, nem todas as populações de células têm uma população lado, e nem todas as populações laterais são enriquecidas para as células estaminais / progenitoras.
O peixe-zebra é um poderoso vertebrado sistema modelo genético para o estudo do cancro humano 3, 4, com um número de vantagens em relação mo murino tradicionaldels de cancro. Embriões de peixe-zebra são externamente fertilizado e são opticamente transparentes, facilitando transgénese e a observação in vivo de processos patológicos, incluindo a iniciação e progressão do cancro. Até à data, o ensaio população lado para detectar potenciais de células estaminais ou progenitoras só foi aplicada para a medula do rim em peixes-zebra para identificar HSCs, e não a quaisquer modelos de cancro de peixe-zebra 5, 6.
O modelo de peixe-zebra de células T de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) é morfologicamente e geneticamente semelhante ao humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL é uma neoplasia agressiva que, em humanos, é responsável por 10-15% dos pediátrica e 25% dos adultos TODOS os casos 9. Embora o tratamento de LLA-T tem melhorado, recaída ainda é comum e está associado a um prognóstico pobre. T-ALL tumores são hétérogèneous e conter muitas subpopulações de células de tumor diferentes, incluindo leucemia iniciar células (PBR). PBR são definidas pela sua capacidade de voltar a crescer todo o tumor a partir de uma única célula, e a frequência de PBR dentro de uma população de células de tumor pode ser calculado através do transplante de células doses variadas para receptores por meio de um ensaio de transplante de diluição limitante (LDA). Embora as experiências foram efectuadas de LDA em peixes-zebra para calcular a frequência de PBR 8, 10, 11, esta determinação é feita em retrospectiva e não permite o isolamento potencial do PBR. Por conseguinte, um método para isolar prospectivamente uma população enriquecida em actividade de células estaminais do cancro é inexistente. A identificação e isolamento de células da população lado de peixe-zebra t-alls é o primeiro passo no sentido de resolver esta deficiência.
O protocolo aqui apresentado descreve como gerar de forma eficiente T-ALL tumores em ZEBRafish utilizando transgénese mediada por tol2, a colheita das células T-ALL tumores, e mancham-los com Hoechst 33342 para identificar a população de células lado. Futuro em experiências in vivo com peixe-zebra LLA-T poderia incluir se as células da população lateral são enriquecidos para os PBR ou têm outras propriedades de haste ou progenitoras semelhantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos com peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Chicago. A Universidade de Chicago é credenciada pela Associação para Avaliação e Acreditação de Laboratório Animal Care (AAALAC).
1. Geração e isolamento de células T-ALL marcadas fluorescentemente em Zebrafish
- Microinjeção em embriões de peixe-zebra singênico
- Utilizando kits comercialmente disponíveis, isolar o ADN plasmídico de rag2 : c-myc e rag2 : proteína fluorescente verde ( rag2 : GFP) contendo repetições terminais invertidas reconhecidas por tol2 transposase (ver Tabela de Materiais para fonte de ADN plasmídico) 12 e eluir o ADN Em água estéril.
NOTA: O GFP é usado neste estudo, mas qualquer proteína fluorescente funcionará. - Preparar pCS2-transposase (tol2) RNA
- Isolar o ADN plasmídico tol2 utilizando kits comercialmente disponíveis (ver tele Tabela de Materiais para a fonte de ADN de plasmídeo) 12 e elui-se o ADN em água estéril.
- Incubar 1 ug de ADN tol2 a 37 ° C durante 1 h com 5 unidades de enzima de restrição de Notl no tampão apropriado para linearizar o plasmídeo. Calor-inactivar o NotI a 65 ° C durante 20 min.
- Transcrever o ARN tol2 com polimerase de ARN de SP6 do ADN linearizado utilizando um kit de transcrição de ARN disponível comercialmente 13. Armazenar o ARN em alíquotas de uso único, a -80 ° C.
- Preparar a mistura de injecção em gelo pela adição de 250 ng de RAG2: ADN de plasmídeo c-myc, 250 ng de RAG2: GFP plasmídeo de ADN, 150 ng de ARN tol2, e 0,5 mL de fenol vermelho. Ajustar o volume para 10 mL com água isenta de nuclease.
- Injectar ~ 1 nL de mistura de injecção para a célula de um estádio de uma célula de embrião do peixe-zebra singeneicos utilizando um micro-injector e a agulha puxada a partir de um tubo capilar de vidro, seguindo anteriormente estabemétodos cido 8, 14.
NOTA: peixe-zebra Singênico gerado por partenogénese 15 são utilizados aqui para eliminar a heterogeneidade genética e rejeição imunitária após o transplante. No entanto, também pode ser utilizado de tipo selvagem de peixe-zebra ou qualquer estirpe desejada. - Remover embriões mortos, subdesenvolvidos, ou malformados às 24 h e 48 h pós-injecção 16.
- Coloque o peixe injectado no sistema de peixe aos 6 dias pós-injecção e levantá-los de acordo com o protocolo padrão de 6.
- Utilizando kits comercialmente disponíveis, isolar o ADN plasmídico de rag2 : c-myc e rag2 : proteína fluorescente verde ( rag2 : GFP) contendo repetições terminais invertidas reconhecidas por tol2 transposase (ver Tabela de Materiais para fonte de ADN plasmídico) 12 e eluir o ADN Em água estéril.
- Rastreio de peixe-zebra injectada e acompanhar o crescimento tumoral
- Aos 21 dias pós-injecção, colocar uma única larva injectado em uma gota de meio de embriões em uma placa de Petri e tela de fluorescência de GFP por meio de um microscópio de epifluorescência (excitação de passagem de banda: 470/40, de passagem de banda de emissão: 525/50) 8.
NOTA: larvas do peixe que hAve integrada tanto rag2 : c-myc e rag2 : GFP terá um timo fluorescente verde (peixe positivo) e pode já exibir a expansão de células fluorescentes verdes malignas para além do timo. Todos os peixes com um GFP + timo irão desenvolver um GFP + T-ALL. As larvas que não demonstram a integração dos plasmídeos não terão quaisquer células fluorescentes verdes (peixes negativos). - Separar os peixes negativos (com base numa falta de fluorescência) num tanque diferente e monitorizar os peixes novamente aos 28 e 35 dias após a injecção. Aos 28 e 35 dias após a injeção, anestesiar o peixe com 0,02% de tricaína tamponada (MS-222) em água do sistema de peixes antes do rastreio.
- Coloque cada larva zebrafish que é positivo para um timo marcado fluorescentemente ou um tumor marcado fluorescentemente em um tanque individual para monitorar o crescimento do tumor três vezes por semana.
- Aos 21 dias pós-injecção, colocar uma única larva injectado em uma gota de meio de embriões em uma placa de Petri e tela de fluorescência de GFP por meio de um microscópio de epifluorescência (excitação de passagem de banda: 470/40, de passagem de banda de emissão: 525/50) 8.
- A recolha de células T-ALL marcadas fluorescentemente a partir do peixe de tumor primário
- Preparar pelo menos 20 ml de soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10% em 0,9x tampão fosfato salino (FBS / PBS).
- Adicionar 1 mL de FBS / PBS a um frasco de sal de sódio de heparina (300 unidades).
- Seleccionar peixe portadores de tumores em mais de 50% do corpo, ou aqueles peixes que tem dificuldade em comer ou natação. Sacrificar o peixe por sobredosagem com eles tricaina ou por imersão em água gelada. Confirmar a morte por falta de um movimento de emalhar e os batimentos cardíacos.
- Utilizar uma lâmina de barbear para remover a cabeça do peixe.
- Lava-se a cavidade do peixe com a solução de heparina, para remover os glóbulos vermelhos em excesso.
- Usando uma pipeta, injectar 100 ul de solução de heparina (preparado no passo 1.3.2) na cavidade do corpo do peixe. Remover todo o líquido que sai (irá conter os glóbulos) e pipeta-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Usar uma nova ponta de pipeta para lavar o corpo de novo. Executar, pelo menos, três lavagens, ou até que o líquido que sai aparecer livre de blOod.
- Descarte todo o líquido das lavagens nos passos 1.3.5.1 e 1.3.5.2, uma vez que não será utilizado em análises adicionais.
- Recolher as células de leucemia.
- Injectar 100 μL de FBS / PBS na cavidade corporal do peixe.
- Aplique suave pressão para o exterior do corpo do peixe com a ponta da pipeta para espremer / empurrar as células tumorais.
NOTA: Se esta etapa é realizada usando um microscópio de dissecação, as células tumorais derramando fora da cavidade do corpo será evidente. - Recolher o líquido e as células de cada lavagem em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Repita os passos 1.3.6.1-1.3.6.3 até a maioria das células tumorais serem coletadas (geralmente 5-10 vezes). Recolher todas as células tumorais no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Manter as células à temperatura ambiente.
- Misturam-se as células tumorais recolhidas do passo 1.3.6 pipetando-as suavemente para dissociar os aglomerados de células. Filtrar a suspensão de células através de um 4Filtro de malha de 0 μm. Lavar o filtro 1-2 vezes com 100 μL de FBS / PBS. Manter as células à temperatura ambiente.
- Misture 2 μL de suspensão celular com 18 μL de azul de tripano (0,4%, diluído 1:10 e filtrado) num novo tubo. Carregar 10 μL num hemocitómetro e contar o número de células fluorescentes vivas (não azuis) para calcular o número de células tumorais isoladas.
NOTA: As células GFP-negativas não-azuis são provavelmente células T normais não malignas e não devem ser contadas. São necessárias pelo menos 2 x IO6 células para corar as células com Hoechst 33342.
2. Coloração das células T-ALL marcadas fluorescentemente com Hoechst 33342 para identificar a população lateral
- Diluir Hoechst 33342 1:10 com H 2 O nuclease-livre para fazer a concentração de trabalho de 1 mg / mL. Armazenar o corante a 4 ° C e no escuro.
- Preparar uma solução 100 mM de verapamil por dissolução de 49,1 mg em 1 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
NOTA: Verapamil é um inibidor de transportadores ABC e é um importante controle para experimentos de populações laterais. A adição de verapamilo a amostras irá inibir a capacidade dos transportadores ABC de efluxar o corante Hoechst 33342. Portanto, uma verdadeira população lateral desaparecerá quando o verapamil for adicionado à amostra. - Coloque um banho-maria a 28 ° C.
- Preparar amostras e controles no escuro, adicionando células e soluções a fluorescência ativado por classificador de células (FACS) tubos.
- Prepare as amostras adicionando 10 6 células, 15 μL de Hoechst 33342 a 1 mg / mL e 2,5 μL de DMSO a um tubo FACS. Ajustar o volume para 1 mL com FBS / PBS.
- Preparar os controlos adicionando 10 6 células, 15 μL de Hoechst 33342 a 1 mg / mL e 2,5 μL de verapamil 100 mM a um tubo FACS. Ajustar o volume para 1 mL com FBS / PBS.
NOTA: Recomenda-se um mínimo de 10 6 células / amostra, mas é preferível a coloração de células, especialmente se a população lateralcélulas de iões serão classificados para análise posterior. Não exceder 10 6 células / ml, e manter a concentração de Hoechst 33342 a 15 ug / mL. Se 10 x 10 6 culas s coradas, o volume total da reacção é de 10 ml.
- Incubar em um banho de ua 28 ° C no escuro durante 120 min.
- Após a incubação, colocar as células imediatamente em gelo e mantê-los no escuro.
- Sedimentar as células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Lava-se com 1 mL de FBS / PBS.
- Sedimentar as células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de FBS / PBS.
- Manter a 4 ° C até à separação de células.
- 15 min antes da separação de células, adiciona-se 2 mL de iodeto de propídio estoque (PI) (1 mg / mL) para cada 1 mL de FBS / PBS (concentração final: 2 ug / ml). Misture bem.
3. Use FACS encontrar o População Side dentro do T-ALL população de células fluorescente etiquetado
- Determine um portão para o ao vivo, GFP + T-ALL células.
- Uso de dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral área (SSC) a porta para fora detritos.
NOTA: FSC é usado para distinguir o tamanho celular e SSC é usado para distinguir a granularidade da célula. - Use FSC eo SSC width para discriminar dobletes.
NOTA: Não há três componentes identificados pelo citetro de fluxo detectores: área, altura e largura. Área é normalmente usado para medir a fluorescência da célula. Largura mede a tempo de voo e é o dobro da largura, se duas células são aglutinados. - Para as células tumorais vivas, desenhar uma porta em torno das células positivas para GFP e negativas para PI usando os detectores apropriados (por exemplo, FITC para GFP e PerCP Cy5-5 para PI).
- Uso de dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral área (SSC) a porta para fora detritos.
- Se a classificação de células da população lado para outras experiências, utilizar o grande ponta do bocal (100? M) e recolher as células num tubo de FACS contendo 3 mL de 100% de FBS. Utilizar uma ponta maior do bocal (100 um) em vez da ponta menor (70? M) para melhorar a viabilidade celular, após separação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para gerar eficientemente tumores T-ALL induzidos por myc induzidos por fluorescência em peixe-zebra, as construções de ADN circulares flanqueadas por locais de transposase tol2 podem ser co-injectadas com ARN tol2. Estudos prévios da injeção de DNA linearizado em embriões de peixe-zebra relatam uma taxa de transgênese de 5% 8 . Com o protocolo ajustado para incluir a transgénese mediada por tol2, podem ser observadas taxas de transgénese que variam de 10-44% ( Tabela 1 ).
No exemplo representativo, um peixe com uma T-ALL GFP + foi corado com Hoechst 33342 para determinar a percentagem de células na população lateral. A Figura 1 mostra o esquema de bloqueio utilizado para determinar a percentagem de células de população lateral. Em primeiro lugar, utilizando FSC e SSC, as células T-ALL são isoladas excluindo detritos ( Figura 1A ) e subsequentemente seleccionando contra dupletos ( Figura 1B ). Em seguida, todas as c�ulas vivas s� isoladas atrav� de c�ulas que s� GFP + e negativas para o discriminador de c�ulas mortas PI ( Figura 1C ). Uma vez seleccionadas as células T-ALL vivas, a população lateral pode ser encontrada no perfil Hoechst 33342. Na popula�o celular principal, Hoechst 33342 permanece nas c�ulas, e estas c�ulas podem ser separadas em grupos por conte�o de ADN. No entanto, a popula�o lateral de c�ulas �distingu�el da popula�o de c�ulas principais, uma vez que as c�ulas de popula�o lateral efluxam o corante devido a um maior n�ero de transportadores ABC na membrana celular. Para visualizar a população lateral, o perfil de Hoechst é usado para comparar dois canais, Hoechst Blue e Hoechst Red. A popula�o lateral �a cauda escura de c�ulas que se estendem a partir do lado esquerdo da popula�o de c�ulas principais para o eixo azul de Hoechst ( Figura 1D ).
Uma verdadeira população lateral será perdida quando as células são tratadas com um inibidorF transportadores ABC, como verapamil. A Figura 2 mostra as populações laterais em vários tumores T-ALL representativos, bem como quando esses tumores são tratados com verapamil durante a coloração com Hoechst 33342. Para assegurar que a população encontrada na amostra seja uma verdadeira população lateral, essas células devem desaparecer Na presença do inibidor, como se mostra na Figura 2 .
| Número de estoque | Número de peixes examinados | Número positivo | Taxa de transgênese |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tabela 1: Taxas Transgénese Quando Usando tol2 transposase para plasmídeo microinjeco em embriões de peixe-zebra. As taxas calculadas de transgénese são mostrados para dezanove dias de injecção separados. O número de peixes filtradas representa o número de peixes que permaneceram vivos 21 dias após a injecção, e o número positivo representa o número de peixes que foram positivos para tumores fluorescentes.
Figura 1: Esquema Lado gating População. Um exemplo do esquema de intermitcia usado para identificar a população lado em um GFP + T-ALL no peixe-zebra. (A) Em primeiro lugar, os detritos são excluídos usando a frente de dispersão (FSC) edispersão lateral (SSC) área. (B) Em seguida, as células individuais são isolados por discriminar dupletos usando FSC e SSC parâmetros de largura. (C) Uma vez que neste exemplo de tumor foi GFP +, todas as células vivas deve ser GFP + e negativa para o marcador de células mortas iodeto de propídio. (D) A população lado pode ser visto com o Vermelho Hoechst versus o perfil de Hoechst azul. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A figura 2: Side População desaparece quando tratados com o ABC Transporter Inhibitor, Verapamil. Portões para a população lateral são mostrados. Os painéis superiores mostram quatro amostras de tumor diferentes. É importante notar que nem todos os tumores têm a mesma percentagem da população lado, eo ca população ladoN aparecem diferentes para cada tumor testado. Os painéis inferiores mostram amostras tumorais que foram tratadas com verapamil durante a coloração com Hoechst 33342 para bloquear o efluxo do corante. Enquanto as populações laterais podem parecer diferentes para cada tumor, o efeito do verapamil é o mesmo: a população lateral desaparece. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio de população lateral é altamente sensível; Portanto, pequenas alterações no protocolo podem resultar em uma dificuldade na detecção de células populacionais laterais. Em primeiro lugar, a temperatura durante o passo de coloração é específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, o ensaio de população lateral é tipicamente realizado a 37 ° C 2 . Quando as células T-ALL de zebrafish foram incubadas a 37 ° C, muitas das células morreram, o que tornou esta temperatura de incubação inaceitável (dados não apresentados). Quando Kobayashi e colaboradores (2008) dissecaram a medula óssea de peixe-zebra para o ensaio de população lateral, as incubações foram realizadas a 25 ° C 5 . Esta temperatura de incubação não foi suficiente para células T-ALL de peixe-zebra, uma vez que resultou num perfil fraco de Hoechst 33342 (dados não apresentados). No protocolo aqui descrito, uma temperatura de incubação de 28 ° C era óptima para manter a viabilidade celular e para conseguir um perfil forte de Hoechst 33342.
Uma segunda condição para o ensaio população lado que requer consideração e ensaios anteriores é a concentração de Hoechst 33342. Se a concentração de Hoechst 33342 é demasiado baixo, a população lateral pode não ser visível, ou o fenótipo população lado (tingir capacidade de efluxo) pode falsamente ser aumentado, a identificação de células da população mais laterais que se encontram efectivamente presentes dois. Por outro lado, demasiado elevada de uma concentração de Hoechst 33342 pode ser tóxico para as células. Para zebrafish T ALL-células, 15 ug / mL Hoechst 33342 incubadas durante 120 minutos, é a combinação óptima. Concentrações mais baixas de Hoechst 33342 foram testados para zebrafish T ALL-células, mas a população lado nem sempre foi evidente (dados não mostrados). Um tempo total de incubação de 90 minutos foi suficiente para detectar uma população lado, mas o número máximo de células da população secundários foi observada após 120 minutos de tempo de incubação.
Como reportado anteriormente para s de mamíferos fo r, nem todos os tumores terá uma população detectável lateral 17, 18, 19. Usando este método, observa-se uma população lado em 14 de 17 t-alls testadas (dados não mostrados). Tendo isolado as células da população lado de t-alls, este método deverá ser aplicável a outros modelos de tumor de peixe-zebra.
Dentro do peixe-zebra heterogénea LLA-T de tumor, as células de leucemia de início (PBR) são capazes de reiniciando o crescimento do tumor e, como tal, são acreditados responsável para recorrência e metástase do cancro. Actualmente, não existe nenhum método no peixe-zebra que permite o isolamento potencial do PBR in vivo. Calcular a frequência LIC requer transplantação de células de tumor a uma diluição limitante 8, 10. estudos publicados anteriormente com peixe-zebra clonal identificaram que os PBR compõem 0,1-1,4% de células T-ALL primários"xref"> 10. Aqui, a variabilidade semelhante na frequência de células da população secundários (0,2-1,0%) do peixe-zebra clonal T-alls é reportado (Figura 2). São necessários mais estudos para determinar se a população lado é enriquecida em PBR; no entanto, a semelhança entre as gamas de frequência LIC e a percentagem de células da população em lado estes T-alls suporta esta hipótese.
Enquanto o ensaio de população lado é sensível e nem sempre é fácil de realizar, o ensaio permite aos investigadores, pela primeira vez, para isolar uma população rara de células em peixes-zebra LLA-T que pode ter estaminais ou células progenitoras propriedades. Existem actualmente não há marcadores da superfície celular disponíveis em peixes-zebra para identificar as células de haste ou progenitoras semelhantes; daí, a capacidade de isolar a população lado é muito promissora. As aplicações futuras deste método incluem limite de experiências de transplante de diluição ordenada população lado T-ALL de células para avaliar o enriquecimento de LICs. Além disso, este método permitirá características que definem LICs para ser elucidado, incluindo os mecanismos moleculares que governam LICs em zebrafish T-ALL. Estes experimentos poderiam fornecer pontos de partida para a descoberta de novos alvos terapêuticos para T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela University of Chicago Women's Board, o Wendy Will Case Fund, e da Universidade de Chicago Comprehensive Cancer Center Grant Grant (P30 CA014599). Gostaríamos de agradecer ao Flow Cytometry Core da Universidade de Chicago por sua ajuda na criação deste experimento, bem como outros membros do laboratório de de Jong, particularmente Leslie Pedraza e Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
