Summary
تم استخدام منهجية تعديل التدرج الطرد المركزي الكثافة المعدلة لعزل الخلايا الظهارية من الأنسجة ريفيسفالوس ميكروبلوس الأمعاء. والبروتينات سطح ملزمة كانت البيروكسيديز وتنقيته من خلال الخرز المغناطيسي ستريبتافيدين لاستخدامها في التطبيقات المصب.
Abstract
رابيسيفالوس ميكروبلوس - علامة الماشية - هو الطفيليات الخارجية الأكثر أهمية من حيث الأثر الاقتصادي على الثروة الحيوانية كمتجه لعدة مسببات الأمراض. وقد تم تكريس الجهود لمراقبة الماشية من أجل الحد من آثاره الضارة، مع التركيز على اكتشاف المرشحين اللقاح، مثل BM86، وتقع على سطح الخلايا الظهارية الأمعاء القراد. وتركز البحوث الحالية على استخدام كدنا والمكتبات الجينومية، للكشف عن المرشحين اللقاح الآخرين. عزل خلايا القناة الهضمية القراد يشكل ميزة هامة في التحقيق في تكوين البروتينات السطحية على غشاء الخلايا الهضمية القراد. هذه الورقة تشكل طريقة جديدة وقابلة للتنفيذ لعزل الخلايا الظهارية، من محتويات القناة الهضمية القراد من شبه محفور R. ميكروبلوس. يستخدم هذا البروتوكول تسيب و إدتا للافراج عن الخلايا الظهارية من الأنسجة دعم تحت الظهارية وتقطيع الكثافة الطرد المركزي المتقطعنت لفصل الخلايا الظهارية من أنواع الخلايا الأخرى. وكانت البروتينات السطحية الخلية البيروكسيديز ومعزولة من الخلايا الظهارية الأمعاء القراد، وذلك باستخدام الخرز المغناطيسي مرتبطة ستريبتافيدين السماح للتطبيقات المصب في فاكس أو لك-مس / MS- التحليل.
Introduction
و رابيسيفالوس ميكروبلوس ، علامة الماشية، هو الطفيليات الخارجية الأكثر أهمية من حيث الأثر الاقتصادي على صناعة الماشية في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية كما أنها تتجه حمى القراد البقري (بابيسيوسيس)، أنابلاسموسيس و بيروبلاسموسيس الخيول 1 ، 2 ، 3 ، 4 . وقد تم تكريس الجهود لمراقبة رقعة الماشية، لتقليل التأثير الضار، إلا أن الطرق التقليدية مثل استخدام مبيدات الكيماويات الكيميائية لها عيوب ضمنية، مثل وجود مخلفات كيميائية في الحليب واللحوم، والزيادة في انتشار القراد المقاوم كيميائيا 5 ، 6 ، 7 . ونتيجة لذلك، تم دراسة تطوير طرق بديلة لمراقبة القراد، مثل استخدام الماشية المقاومة الطبيعية، والمكافحة البيولوجية (المبيدات الحيوية) واللقاحاينيس 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 .
في السعي وراء البروتينات القادرة على استخدامها كمرشحين لقاح، وتركز البحوث الحالية على القناة الهضمية القراد. تم بناء جدار ميدغوت من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية يستريح على الصفيحة القاعدية رقيقة، مع خارج الصفيحة القاعدية تشكيل شبكة من العضلات. وتشير الملاحظات المجهر الخفيفة والإلكترون أن ميدجوت يتكون من ثلاثة أنواع من الخلايا: الاحتياطي (غير متمايزة)، إفرازية، والجهاز الهضمي. يختلف عدد أنواع الخلايا اختلافا كبيرا تبعا للمرحلة الفسيولوجية. الخلايا الإفرازية والهضمية تنشأ من خلايا احتياطية 18 ، 19 ، 20 .
بناء مكتبات [كدنا]لفحص تكوين الأمعاء القراد أدى إلى تحديد البروتينات المستضدية، مثل Bm86، كما المرشحين المحتملين اللقاح 2 ، 3 ، 4 . ويترجم بروتين سكري Bm86 على سطح خلايا الأمعاء القراد ويحفز استجابة مناعية وقائية ضد القراد الماشية ( R. ميكروبلوس ) في الماشية تطعيم. المضادة لل Bm86 إيغس التي تنتجها المضيف تحصين يتم تناولها من قبل القراد، والتعرف على هذا المستضد على سطح خلايا القناة الهضمية القراد، وبعد ذلك يزعج وظيفة القناة الهضمية الأمعاء والنزاهة. وقد أظهرت اللقاحات التي تستند إلى مستضدات Bm86 السيطرة الفعالة على R. ميكروبلوس و ريبيسفالوس أنولاتوس، عن طريق الحد من عدد والوزن والقدرة الإنجابية للنساء الانخراط ، مما أدى إلى انخفاض الإصابة اليرقات في الأجيال القراد لاحق 4 . ومع ذلك، اللقاحات Bm86 مقرها ليست فعالة ضد جميع مراحل القراد ولهاأظهرت فعالية غير مرضية ضد بعض السلالات الجغرافية من R. ميكروبلوس ، وبالتالي فإن لحوم البقر ومنتجات الألبان اعتمدت بشكل سيء هذه اللقاحات 2 ، 4 .
القدرة على عزل الخلايا الظهارية من الأمعاء القراد هو ابتكار كبير من شأنه أن يتيح تطور البحوث لتحديد تكوين غشاء البروتين بما في ذلك التشكل وعلم وظائف الأعضاء في ظل ظروف بيئية مختلفة. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم عامل خلات إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) و تريس عامل تخفيض (2-كاربوكسيثيل) فوسفين (تسيب) لاطلاق سراح الظهارة من الأنسجة دعم الظهارية الفرعية 10 . يتم استرداد ظهارة بعد انقطاع الميكانيكية من الأنسجة عن طريق الهز، تليها الطرد المركزي التدرج المتقطع في بيركول. هذه الورقة تصف تقنية مجدية ورائعة لعزل القراد الوراثي إيبيثيليال الخلايا. البروتينات السطحية الخلية البيروكسيديز، معزولة عن سطح هذه الخلايا الظهارية يمكن تحليلها لاحقا في التطبيقات المصب مثل فاكس و / أو لك-مس / MS- التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تشريح ظهارة الأمعاء من R. ميكروبلوس
- جمع القراد شبه انغورجد من الماشية في يوم التجربة. تشريح القراد في غضون 24 ساعة بعد إزالة من المضيف.
- التمسك شريط من شريط لاصق إلى الجزء السفلي من 92 ملم × 16 مم طبق بتري. إضافة قطرة من الغراء عظمى على الشريط. وضع القراد، الجانب البطني إلى أسفل على الغراء عظمى، والسماح لتجف لمدة 2 دقيقة.
- صب 100 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في طبق بتري، أو حتى القراد هو المغمور تماما.
- استخدام حجم 11 مشرط، وقطع من أعلى العينين إلى المهرجانات أسفل، على جانبي القراد.
- باستخدام ملقط معقم، وإزالة تماما الترس الطبلي وalloscutum، لفضح الأعضاء الداخلية.
- إزالة غرامة بيضاء مثل تشبه الأعضاء (القصبة الهوائية) والأغشية الأخرى لمنع التلوث.
- إزالة الأمعاء باستخدام ملقط، من خلال معسر المنطقة العليا وسحب منالذبيحة. إزالة أي أنسجة الأمعاء المتبقية، وضمان عدم وجود أي تشريح الأنسجة الأخرى.
- مخزن الأمعاء في الحل الملح المتوازن الجليد هانك الباردة (هبس) دون كلوريد الكالسيوم وكبريتات المغنيسيوم مع كوكتيل بروتينز المانع (بيك). التقط تجميد الشجاعة في الجليد الجاف وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: للمساعدة في تشريح القناة الهضمية وتفاصيل الأعضاء الداخلية القراد تشير إلى الفصل 3.1 من D. سوننشاين، "علم الأحياء من القراد" 19 .
2. الخلايا الظهارية التفكك
- صب الأمعاء تشريح على مصفاة الخلية 70 ميكرون داخل أنبوب 50 مل.
- مسح الأنسجة الأمعاء مع 50 مل الجليد هبس الباردة مع الموافقة المسبقة عن علم حتى الحل يعمل واضح، والشجاعة تأخذ على مظهر أبيض / واضح.
- إعادة تعليق الشجاعة في 30 مل الجليد هبس الباردة مع الموافقة المسبقة عن علم، مزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة إلى بيليه الأمعاء. إزالة طاف وتكرار عملية غسل ثلاث مرات.
- تصفية تعليق من خلال مصفاة الخلية 250 ميكرون، دوامة تدفق من خلال وتصفية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون جمع المتبقية من خلال تدفق.
- أجهزة الطرد المركزي تعليق في 500 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتكوير الخلايا واحدة.
3. عزل الخلايا الظهارية واحدة باستخدام التدرج كثافة الطرد المركزي
- إعداد التدرج الكثافة الطرد المركزي (على سبيل المثال ، بيركول) عن طريق الترشيح من خلال ورقة ما قبل التصفية AP15. إعداد 40٪ و بيركول 20٪ في م 2 0 (V / V) وباردة في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة قبل طبقات التدرج.
- استخدام تحويمضخة مجموعة في أدنى سرعة، طبقة 3 مل من 40٪ الكثافة التدرج الطرد المركزي إلى أنبوب 16 مل نابذة فائقة السرعة، والسماح لها لتسوية على الجليد لمدة 15 دقيقة. سرعة المضخة يجب أن يؤدي إلى <1 مل لكل دقيقة معدل التدفق.
- إمالة الأنبوب إلى زاوية 45 درجة، استخدام مضخة تحوي لطبقة 20٪ الكثافة التدرج الطرد المركزي على رأس طبقة 40٪. سرعة المضخة ينبغي أن يؤدي إلى <1 مل لكل دقيقة معدل التدفق. السماح للطبقات لتسوية على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- استخدام مضخة تحوي في <1 مل لكل دقيقة معدل التدفق إلى طبقة 3 مل من دمم المتوسطة التي تحتوي على خلايا الأمعاء القراد على التدرج الطرد المركزي كثافة 20-40٪.
- برنامج الطرد المركزي لأقصى تسارع والحد الأدنى التباطؤ. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة. جمع الفواصل بين دمم: 20٪ الكثافة التدرج الطرد المركزي، و 20٪: 40٪ الكثافة التدرجات الطرد المركزي لعزل الخلايا الظهارية واحدة. تخزين البينات التي تم جمعها في 4 درجات مئوية لتحليلات لاحقة.
4. تقييم عزل الخلية
- عدادة الكريات
- تنظيف الشريحة هيماسيتوميتر مع الكحول.
- .Re تعليق الخلايا عن طريق بيبتينغ بلطف الخلايا صعودا وهبوطا. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية ومكان في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
- إضافة 400 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق. مزيج بلطف عن طريق عبها أنبوب.
- ماصة 100 ميكرولتر من تريبان تعليق خلية المعالجة الزرقاء لملء ببطء كل من غرف الكريات.
- وضع عدادة الكريات تحت المجهر الضوئي، مع التركيز على خطوط الشبكة من عدادة الكريات مع هدف 10X.
- باستخدام عداد رصيده باليد، عد الخلايا غير ملوثين الحية ضمن مجموعة من 16 المربعات. داخل المربع نفسه، عد الخلايا الميتة الزرقاء. استمر في العد حتى يتم حساب أربع مجموعات من 16 مربعا.
- حساب مجموع الخلايا لكل مل باستخدام الصيغة:
47eq1.jpg "/> - حساب بقاء الخلية المئوية باستخدام الصيغة:
- خلية عزل التصور
- تمييع 1 ميكرولتر من الخلايا المعزولة في 9 ميكرولتر من هبس في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. نفض الغبار أنبوب ميكروسنتريفوج بلطف لخلط.
- ماصة 5 ميكرولتر من الخلايا المعزولة في هبس في منتصف شريحة زجاجية. تطبيق ثلاث قطرات من وسط تصاعد مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي).
- احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع بعناية غطاء زلة على التحضير، وتجنب فقاعات الهواء.
- تصور الخلايا الملطخة دابي في الإثارة 360 نانومتر والانبعاثات في 460 نانومتر تحت المجهر الفلورسنت.
5. خلية بروتين السطح بيوتينيلاتيون
- بيوتينيلات 100 ميكرولتر من الخلايا الظهارية خلية واحدة باستخدام البيوتين (نوع A) الإقترانمجموعة، في نسبة المولي من 1: 1 سطح البروتين إلى تصريف، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة
- لتحلل الخلية، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، 1٪ تريتون X-100، 10٪ الجلسرين، 100 ميكرومتر الجلوتاثيون المؤكسد و بيك إلى الخلايا البيروكسيديز. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة مع خلط لطيف كل 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا البيروكسيديز في 20،000 زغ في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لبيليه المواد غير قابلة للذوبان. جمع طاف تحتوي على السيتوبلازمية، والبروتينات الغشاء البيروكسيديز.
- تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
6. عزل البروتينات السطحية البيروكسيديز
- إضافة 50 ميكرولتر من ستريبتافيدين الخرز المغناطيسي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
- وضع أنبوب في موقف المغناطيسي، وجمع الخرز ضد الجانب من الأنبوب. إزالة وتجاهل طاف.
- إضافة 1000 ميكرولتر من تبس، 0.1٪ توين 20 إلى الأنبوب. مزيج بلطف وجمع الخرز مع ستان المغناطيسيد. إزالة وتجاهل طاف.
- الجمع بين 40 ميكروغرام من البروتينات سطح الخلية البيروكسيديز، المخفف إلى 300 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X مع الخرز المغناطيسي غسلها. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة.
- جمع الخرز مع موقف المغناطيسي، وإزالة وتجاهل طاف.
- إضافة 300 ميكرولتر من تبس، 0.1٪ توين -20 إلى أنبوب، بلطف خلط لإعادة تعليق الخرز. جمع الخرز، وإزالة وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة غسل مرتين.
- إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 M الجلايسين الرقم الهيدروجيني 2.0 إلى الخرز المغناطيسي، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. جمع الخرز وإزالة طاف تحتوي على إلوتيد البروتينات السطحية البيروكسيديز.
- تصور البروتينات السطحية المعزولة على 4-20٪ تريس-موبس هلام سدز-بادج.
7. تقييم البروتين السطحي البيروكسيديز
- نقطة لطخة
- قطع 7 سم × 3 سم قطاع غشاء النيتروسليلوز.
- تطبيق 10 ميكروغرام مجموع القراد غو(من 1.8 أعلاه)، و 10 ميكروغرام من البروتين السطح البيروكسيديز إلى الغشاء. السماح للتجفيف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل إلى وعاء وغمر في 100 مل من عرقلة العازلة. احتضان في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لمدة ساعة. تجاهل العازلة حظر.
- غسل غشاء النتروسليلوز في 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين 20 لمدة 5 دقائق مع الإثارة. تجاهل غسل العازلة وكرر يغسل لمدة ثلاث مرات.
- احتضان في 1/5000 Streptavidin- البيروكسيداز الفجل (هرب) في 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين 20 لمدة 2 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل أي حل المتبقية.
- غسل غشاء النتروسليلوز في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين 20 لمدة 5 دقائق مع الإثارة. تجاهل غسل العازلة وكرر غسل ثلاث مرات.
- للكشف، حل 1 قرص من 4-كلورو-1-نابثول في 10 مل من الميثانول الجليد الباردة. إضافة 4 مل من مخزون الميثانول إلى 20 مل من تبس. إضافة 10 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين الطازجة و إميدياتنطبق على غشاء النيتروسليلوز.
- احتضان مع التحريض في درجة حرارة الغرفة حتى الركيزة تنتج منتج نهاية الأزرق غير قابلة للذوبان. هذا قد يستغرق ما بين 2-15 دقيقة.
- تجاهل حل الكشف وغسل الغشاء ثلاث مرات في 100 ميكرولتر م 2 O.
- إليسا الفحص
- تمييع 200 نانوغرام من كل عينة مع 400 ميكرولتر من 100 ملي كربونات عازلة عازلة ومعطف 2 الممرات من الصف الأول (A #) من لوحة إليسا (آبار القاع المسطح)
- إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملي عازلة طلاء كربونات لجميع الآبار المقابلة الأخرى في الصفوف (ب).
- إعداد التخفيفات المسلسل لكل عينة من قبل بيبتينغ 100 ميكرولتر من كل بئر في الصف ألف، ونقل إلى الصف B. مزيج بلطف بواسطة بيبتينغ وتجنب إنتاج فقاعات. كرر التخفيفات أسفل كل صف، والتخلص من 100 ميكرولتر النهائي من كل بئر في الصف H.
- تغطية لوحة مع بارافيلم واحتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- غسل بلاته مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين 20 لكل بئر ثلاث مرات.
- إضافة 200 ميكرولتر من عرقلة العازلة إلى الآبار المغلفة، وتغطي مع بارافيلم واحتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تمييع 1 / 15،000 ستريبتافيدين-هرب في عرقلة العازلة وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة. تغطية مع بارافيلم واحتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- غسل لوحة في 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني، 0.05٪ توين -20 لكل بئر خمس مرات.
- للكشف، إضافة 100 ميكرولتر من كاشف تمب لكل بئر. بعد تطوير اللون كافية، وعادة ما بين 10-15 دقيقة، إضافة 100 ميكرولتر من 1 M حامض الفوسفوريك لوقف رد الفعل.
- قراءة الامتصاصية لكل بئر في λ = 450nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم عزل الخلايا الظهارية من أنسجة الأمعاء من R. ميكروبلوس وفقا للتخطيطي المقدمة في الشكل 1 . وترد مضان صور مضان المجهري من القراد الأمعاء الخلايا الظهارية أعدت باستخدام هذا البروتوكول في الشكل 2A و 2 باء. كما يتم إجراء العزلة الخلية على شبه محفور R. ميكروبلوس، تظهر الخلايا كما المفرد، كروية، سطح الصرف السلس وحجم متسقة في جميع أنحاء العينة. الاختلافات في حجم ونوع السكان خلية الأمعاء، هي أكثر وضوحا مرة واحدة في القراد يتحول إلى أن تصبح البالغين محرضين تماما.
تلطيخ الفلورسنت من نواة الخلايا الظهارية معزولة مع دابي يساعد على تصور الخلايا. وتصور العزلة السيئة لاحتواء التفكك غير المكتمل للحديثخلايا إليال مع السكان الخلية متفاوتة التي تم تحديدها من خلال أحجام مختلفة الخلية و مورفولوجيز ( الشكل 2C و 2D )
استخدام هذا البروتوكول، ما يقرب من 1.2 × 10 7 خلية لكل / مل من 50 تشريح القناة الهضمية القناة الهضمية، مع معزولة 75-80٪ البقاء على قيد الحياة بنجاح من R. ميكروبلوس الأمعاء القراد. ويمكن تقليل التلوث المتبادل من البروتينات المضيفة ( الشكل 3A ) عن طريق الشطف الشجاعة القراد بشكل كاف حتى يكون لها مظهر أبيض أن يؤدي إلى التدرج بيركول أبيض / واضح ( الشكل 3B ).
تم عزل البروتينات السطحية من خلال بيوتينيلاتيون من البروتينات المرتبطة السطح، وتدمير الأغشية الخلوية وتنقية البروتينات السطحية البيروكسيديز مع الخرز ستريبتافيدين المغناطيسي. ما مجموعه 20-24 ميكروغرام من بيوتيني النقييمكن عزل البروتينات السطحية المغطاة بطبقات أسفل تيار من تشريح الأولي من الشجاعة القراد 50X باستخدام هذا البروتوكول. مقارنة بين البروتينات التي كتبها سدز-بادج ( الشكل 4A )، وصمة عار الفضة ( الشكل 4B )، وصمة عار نقطة ( الشكل 5 ) و إليسا ( الشكل 6 ) يشير إلى أن المنهجية الموصوفة بنجاح تنقية البروتينات السطحية البيروكسيديز من الخلايا الظهارية معزولة من R. ميكروبلوس القراد القناة الهضمية.
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي لعزل البروتينات البيروكسيديز الموجودة في سطح الخلايا ميكروبلوس R. ميدلوت . يرجى كلإيك هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الإسفار المجهر التصور (100X) من R. ميكروبلوس الخلايا الظهارية ميدجوت ملطخة دابي. تم استخدام البرنامج لإجراء تراكب مضان. A & B) تمثل الخلايا الظهارية بنجاح معزولة من ميدكوت R. ميكروبلوس . C / D) الخلايا الظهارية المعزولة من الأمعاء R. ميكروبلوس الملوثة مع أنسجة القراد أكبر.
الشكل 3 : بيركول التدرج التي تحتوي على دمم: 20٪ بيركول: 40٪ بيركول. تم تشكيل طبقات الخلايا الظهارية بين دمم: 20٪ Pإركول و 20: 40٪ بيركول. ( A ) علامة القناة الهضمية تشريح دون خطوة غسل كافية. ( B ) علامة القناة الهضمية تشريح مع خطوة غسل كافية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : الفصل الكهربي للبروتينات السطحية البيروكسيديز تشغيل على 4-20٪ هلام تريس-موبس، في 140 V لمدة 55 دقيقة مع 10 ميكروغرام من العينة المستخدمة. (L) PageRuler Prestained البروتين سلم (1) لا تحمل اسما R. المتثني الأمعاء عينة كاملة (2) البروتينات المعقدة البيروكسيديز المستخرجة من R. المتثني الأمعاء كله كما في الخطوة 6. (3) والبروتينات من خلايا الظهارية المستخرجة من التي لا تحمل علامات R. المتثني الأمعاء (4 ) البروتينات بيوتينيلاتد المستخرجة من R. ميكروبلوسالخلايا الظهارية وفقا للخطوة 6. ( A ) سدز-بادج الملون من قبل كوماسي الأزرق ( B ) وصمة عار الفضة.
الشكل 5 : تحليل البقعة نقطة. ستريبتافيدين-هرب مترافق المخفف 1 / 5،000. ( A ) ما مجموعه 10 ميكروغرام من الخام استخراج القناة الهضمية البروتين ( ب ) البروتينات السطحية البيروكسيديز المستخرجة من الخلايا الظهارية المنقى (10 ميكروغرام).
الشكل 6 : تقييم البروتينات السطحية البيروكسيديز قابلية استخدام إليسا. تم تطوير إليسا من البروتينات السطحية بواسطة الأجسام المضادة المترافق هريب-هرب المخفف 1 / 15،000 ضد تركيزات مختلفة من تيك البيروكسيديزK البروتينات الأمعاء (من 0.7 نانوغرام إلى 100 نانوغرام). استخدمت بروتينات الأمعاء القرادية غير المسماة و ألبومين المصل البقري (بسا) كسيطرة سلبية على إليسا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشكل إصابات القراد الماشية مشكلة رئيسية في صناعة الماشية في المناطق المدارية وشبه الاستوائية في العالم، حيث تعتمد الطريقة الأكثر شيوعا للسيطرة على استخدام مبيدات أكاريدس 1 ، 4 . تم تحديد Bm86 سابقا ضمن سطح الظهارة الأمعاء الظهارية كمستضد واقية ضد R. ميكروبلوس الإصابة 10 ، مع نجاح محدود كاستراتيجية لقاح بسبب Bm86 الاختلاف تسلسل الجغرافية ومتطلبات تعزيز العادية 4 .
وكانت المنشورات السابقة التي تركز على منهجيات العزل الظهاري تركز أساسا على الفقاريات أو أنواع الحشرات 9 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 . على سبيل المثال، يحاول التجزؤ المبكر عزل العزلة الوسطىباستخدام تقنيات الثدييات، وجدت أن نفس المنهجية لا يمكن تطبيقها على الحشرات بسبب بنية الخلية المختلفة والمنظمات 12 . وعلاوة على ذلك، وتقنيات الثدييات تعتمد على استخدام إما ديباس أو كولاجيناز، إلى هضم إنزيميا الخلية خلية البروتينات تقاطع 9 ، 13 . ديباس وكولاجيناز تؤثر بشكل كبير على سطح الخلية ملزمة البروتينات، وبالتالي تقنيات تعتمد على استخدامها ليست مناسبة لدراسات البروتين سطح الخلية 15 . وتركز العزلات الخلية المتوسطة الحشرة حاليا على اثنين من التقنيات. الأول يستخدم تعطيل الميكانيكية من ميدغوت من خلال الموجات فوق الصوتية تليها الانفصال على التدرج الخطي المستمر السكروز 8 ، 11 ، 12 ، 14 . هذه التقنية الميكانيكية تنتج عينات واضحة تقريبا من الملوثات، هاوفر ينتج عائد منخفض من ميكروفيلارمبرانس 14 . تقنية الثانية تعتمد على تريس تعطيل الأغشية للافراج عن الأغشية ميكروفيلار 8 .
التقنية المذكورة في هذه الورقة تسمح لعزل الخلايا الظهارية، بيوتينيلاتيون من البروتينات السطحية وعزلتها 16 ، مما يسمح بإجراء المزيد من الدراسات من خلال التطبيقات المصب مثل مطياف الكتلة أو فاكس. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم عامل مخلب إدتا و تسيب عامل مختزل. إدتا وظائف لعزل أيونات الكالسيوم، وتثبيط كاديرينز، وكسر كاديرين بوساطة تقاطعات خلية الخلية في حين تسيب يقلل من السندات ثاني كبريتيد التي تمنح اللزوجة من غليكان الغنية المخاطية مثل المصفوفة المحيطية التي تفصل تجويف الأمعاء من الظهارة. يتم استرداد ظهارة بعد انقطاع الميكانيكية من الأنسجة عن طريق الهز، تليها الطرد المركزي التدرج المتقطع في الكثافةذ التدرج الطرد المركزي. يتم عزل الخلايا الظهارية بين دمم: 20٪ الكثافة التدرج الطرد المركزي، و 20٪: 40٪ الكثافة طبقات التدرج الطرد المركزي.
استخدام درجة حرارة أعلى خلال تفكك الخلايا الظهارية سوف يسبب أنسجة كبيرة من الانفصال عن القناة الهضمية، مما يؤدي إلى الفشل في عزل الخلايا الظهارية. ضمان أن يتم إجراء تفكك الخلايا الظهارية على الفور بعد تشريح القراد. واستخدام المخازن المؤقتة الباردة الجليد وتجنب سرعات الطرد المركزي عالية أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على خلايا قابلة للحياة الحية. على الرغم من هذا، فإن إزالة الخلايا الكبيرة من الصفيحة القاعدية يمكن أن توفر بعض التلوث. وعلاوة على ذلك، ظهارة ميدغوت القراد يغير يعتمد بشكل كبير على الوقت من آخر وجبة الدم 18 ، 19 ، 20 .
على هذا النحو، وقد تم تصميم هذا البروتوكول والوصول إليها على R. ميكروبلوس الشكل 1 ) هي ذات طبيعة موحدة.
في الختام، الطرق المستخدمة في هذه الدراسة بنجاح عزل الخلايا الظهارية من القناة الهضمية كلها من R. ميكروبلوس . تم الحصول على البروتينات من سطح R. خلايا ميكروبلوس الظهارية لمزيد من التحليل والدراسات. وأخيرا، وقد أثبتت بروتوكول المتقدمة العائد المحتمل للخلايا الظهارية من القناة الهضمية القراد، وكفاءة البروتينات السطحية البيروكسيديز من الخلية. بروتوكول يمكن استخدامها في أي أنواع القراد ذات الأهمية الاقتصادية في محاولة للتحقيق القراد: التفاعلات المضيف من خلال دراسة بروتين الغشاء كومموقف الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا مستعمرة بيوسكوريتي تيك كولوني (إدارة ولاية كوينزلاند للزراعة ومصائد الأسماك في أستراليا) على توفير علامات ميكروبلوس ريبيسفالوس المستخدمة لهذه الدراسة، ولوكاس كاربانويتز للمساعدة في تصوير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont - Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | - | - |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | - | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue - Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , AgNote No. K58. (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , Pergamon Press. 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).
