Summary
تصف هذه المخطوطة الإجراء التجريبي وتحليل البرمجيات لمقايسة موقع التكامل ثنائية الاتجاه التي يمكن أن تحلل في وقت واحد المنبع والمصب ناقلات الحمض النووي تقاطع المضيف. يمكن استخدام منتجات ير ثنائية الاتجاه لأي منصة تسلسل المصب. البيانات الناتجة هي مفيدة لمقارنة عالية الإنتاجية، الكمية من أهداف الحمض النووي متكاملة.
Abstract
تعد مقايسات التكامل (إس) عنصرا حاسما في دراسة مواقع تكامل الفيروسة الرجعية وأهميتها البيولوجية. في دراسات العلاج الجيني للفيروسات الرجعية الأخيرة، استخدمت مقايسات إس، بالاقتران مع تسلسل الجيل التالي، كأداة تتبع الخلايا لتوصيف سكان الخلايا الجذعية النسيلي الذين يتقاسمون نفس الشيء. لمقارنة دقيقة من استنساخ الخلايا الجذعية ريبوبولاتينغ داخل وعبر عينات مختلفة، حساسية الكشف، استنساخ البيانات، والقدرة الإنتاجية العالية للمقايسة هي من بين الصفات فحص الأكثر أهمية. ويوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا وسير عمل تحليل البيانات لتحليل إس ثنائي الاتجاه. المقايسة ثنائية الاتجاه يمكن أن تتسلسل في وقت واحد كل من المنبع والمصب تقاطعات ناقلات المضيف. وبالمقارنة مع النهج التقليدية لتسلسل إس أحادي الاتجاه، فإن النهج ثنائي الاتجاه يحسن إلى حد كبير معدلات الكشف عن داعش وتوصيف أحداث التكامل عند طرفي tانه يستهدف الحمض النووي. ويحدد خط أنابيب تحليل البيانات الموصوفة هنا بدقة وتعدد متواليات إس المتطابقة من خلال خطوات متعددة من المقارنة ترسم متواليات إس على الجينوم المرجعي وتحدد أخطاء التسلسل. باستخدام إجراء الفحص الأمثل، قمنا مؤخرا بنشر أنماط إعادة إحياء مفصلة الآلاف من الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسك) استنساخ التالية زرع في ماكاك ريسوس، مما يدل للمرة الأولى على نقطة زمنية دقيقة من إعادة التركيب هسك والتغاير الوظيفي ل هسس في نظام الرئيسيات. يصف البروتوكول التالي الإجراء التجريبي خطوة بخطوة وسير العمل تحليل البيانات التي تحدد بدقة وتحدد متواليات إس متطابقة.
Introduction
الفيروسات القهقرية تدخل الحمض النووي الجيني في الجينوم المضيف في مواقع مختلفة. هذه الخاصية الفريدة من نوعها، والتي قد تسهم في تطوير السرطانات وغيرها من أشكال المرضية الفيروسية، لديها فائدة سخرية من جعل هذه الفيروسات قابلة للتحويل إلى الهندسة الخلوية للعلاج الجيني والبحوث البيولوجيا الأساسية. موقع التكامل الفيروسي (إس) - الموقع على الجينوم المضيف حيث يتم دمج الحمض النووي (الفيروس) الأجنبية - له آثار هامة على مصير كل من الفيروسات المتكاملة والخلايا المضيفة. وقد استخدمت مقايسات إس في مختلف البيئات البحثية البيولوجية والسريرية لدراسة اختيار موقع الاندماج الفيروسي والامراض، وتطوير السرطان، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، وعلم الأحياء التنموي 1 ، 2 ، 3 ، 4 . حساسية الكشف منخفضة، ضعف استنساخ البيانات، ومتكررة انتقال التلوث هي من بينالعوامل الرئيسية التي تحد من تطبيق مقايسات داعش على الدراسات الحالية والمخطط لها.
وقد تم تطوير العديد من تقنيات تحليل نظم المعلومات. مقايسات موقع الانزيم القائم على الانزيم، بما في ذلك تفاعلات البوليميراز المتسلسل (لم) 5 ، عكس ير 6 ، والخطي التضخيم بوساطة (لام) ير 7 ، هي الأكثر استخداما على نطاق واسع. ومع ذلك، فإن استخدام إنزيمات تقييد موقع معين يولد تحيزا خلال استرجاع داعش، مما يسمح فقط لمجموعة فرعية من إنتغرومز (الحمض النووي الأجنبي دمجها في الجينوم المضيف) في محيط موقع تقييد ليتم استردادها 4 . وقد أدخلت أيضا تقنيات الفحص التي تقيِّم أكثر شمولا ناقلات إس في السنوات الأخيرة. هذه المقايسات توظيف استراتيجيات مختلفة، بما في ذلك مو بوساطة ترانسبوسون ير 8 ، نونستريكتيف (نر) -LAM ير 9 ، نوع إي تقييد انزيم- مهضم 10 ، القص الميكانيكية 11 ، و ير القائم على هيكسامر ير (إعادة خالية ير) 12 ، لتجزئة الحمض النووي الجيني وتضخيم إس. التكنولوجيات الحالية لديها مستويات مختلفة من حساسية الكشف، وتغطية الجينوم، وخصوصية الهدف، والقدرة الإنتاجية العالية، وتعقيد إجراءات الفحص، والتحيز في الكشف عن الترددات النسبية للمواقع المستهدفة. ونظرا للصفات المتفاوتة للمقايسات الحالية ومجموعة متنوعة من الأغراض التي يمكن استخدامها، ينبغي اختيار نهج الفحص الأمثل بعناية.
ويوفر هذا العمل إجراءات تجريبية مفصلة وسير العمل تحليل البيانات الحاسوبية لمقايسة ثنائية الاتجاه التي تحسن إلى حد كبير معدلات الكشف وتسلسل دقة الكمي من خلال تحليل في وقت واحد من المنبع والمصب من الحمض النووي الهدف المتكامل (انظر الشكل 1 للحصول على وجهة نظر التخطيطي إجراءات الفحص ). ويوفر هذا النهج أيضا(على سبيل المثال، دقة ازدواجية الموقع المستهدف والاختلافات في التسلسلات الجينومية للإضافات في المنبع والمصب). وقد استخدمت طرق ثنائية الاتجاه الأخرى في المقام الأول لاستنساخ وتسلسل كلا طرفي الحمض النووي الهدف 11 ، 13 ، 14 . هذا الفحص هو الأمثل على نطاق واسع لانتاجية عالية والتقدير الكمي استنساخه من استنساخ ناقلات ملحوظ، وذلك باستخدام طريقة لم-ير راسخة ورسم الخرائط التحليل الحاسوبي، ولقياس كم تقاطعات المنبع والمصب. وقد أثبت التحليل ثنائي الاتجاه مع إنزيم تقعي مفيدة لكمية عالية الإنتاجية الكمي في الدراسات الجينية الخلايا الجذعية العلاج قبل السريرية 2 ، 15 . تصف هذه الورقة طريقة معدلة باستخدام القاطع الأكثر تواترا (رساي / كفيكي - موتيف: غاك) الذي يضاعف tانه فرص الكشف عن إنتغرومز مقارنة مقايسة تقيي . يتم وصف إجراءات التحليل التجريبي وتحليل البيانات التفصيلية التي تستخدم إنزيمات غتاك موتيف ل لنتيفيرال (NL4.3 ومشتقاته) و غاما-ريتروفيرال (بمكس ناقلات) ناقلات تحليل إس. وترد أوليغونوكلأوتيدس المستخدمة في الفحص في الجدول 1 . ويرد في البرنامج التكميلي نص برمجي داخلي لتحليل تسلسل نظم المعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد المنبع (يسار) - والمصب (يمين) -junction تسلسل المكتبات
- إعداد رابط الحمض النووي:
- إعداد 10 ميكرولتر رابط حل الحمض النووي عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LINKER_A أوليغوس (النهائي: 20 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر LINKER_B أوليغوس (النهائي: 20 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 5 M (النهائي: 1M)، و 4 ميكرولتر من المياه نوكليس خالية في أنبوب ير. انظر الجدول 1 لتسلسل الوصلة.
- احتضان حل الحمض النووي رابط في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في أداة ير، ووقف تشغيل البرنامج، وتحويل ير أداة خارج السلطة. ترك حل رابط في الصك لمدة 30 دقيقة لتبريد ببطء دنا رابط. يمكن تخزين حل الحمض النووي رابط في 4 درجات مئوية.
- لتر محددة البيوتين التمهيدي التمديد:
- استخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي لتحديد تركيز الحمض النووي وقيم 260/280 نانومتر من الحمض النووي الجيني من في الجسم الحيأو في التجارب المختبرية. تمييع 1-2 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الجيني إلى الحجم النهائي من 170 ميكرولتر من حل الحمض النووي الجيني باستخدام المياه نوكليس خالية.
- إعداد 200 ميكرولتر تفاعل ير عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر كل من 10 ميكرومتر هيف-1 محددة البيوتين الاشعال (L- بس و R-بس في الجدول 1 : مجموعه 10 ميكرولتر لأربعة الاشعال للفيروسات محددة)، 20 ميكرولتر من 10X ترموستابل الحمض النووي البلمرة العازلة، 4 ميكرولتر من 10 مل دنتبس (النهائي: 200 ميكرومتر من كل دنتب)، 3 ميكرولتر من 2.5 U / ميكرولتر الحمض النووي البلمرة الحمض النووي، و 163 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني.
ملاحظة: لنواقل غاماريتروفيرال (ناقلات بمكس)، واستخدام 5 ميكرولتر كل من اثنين 10 ميكرومتر بمكس الاشعال البيوتين محددة (L-بب و R-بب: ما مجموعه 10 ميكرولتر) بدلا من أربعة الاشعال البيوتين هيف-1 محددة أعلاه. - تقسيم الحل إلى أربعة أنابيب ير (كل 50 ميكرولتر) وتنفيذ دورة تمديد واحدة تحت الشرط التالي: 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 56 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 72 درجة مئوية لمدة 5دقيقة، و 4 درجة مئوية للتخزين.
- تجمع جميع ردود الفعل ير أربعة إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل واتبع إجراء تنقية ير من عدة تنقية ير. أزل مع 50 ميكرولتر من العازلة شطف (5 أضعاف المياه المخفف شطف عازلة المنصوص عليها في عدة). المضي قدما فورا مع الخطوة 1.3.1 أو تخزين الحمض النووي إلوتد في -20 درجة مئوية.
- رساي و كفيكي الهضم
- إعداد 100 ميكرولتر رد فعل الهضم بإضافة 50 ميكرولتر من الحمض النووي (من الخطوة 1.2.4)، 10 ميكرولتر من 10X العازلة A، و 2 ميكرولتر (20 U) من إنزيم رساي. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير.
- إضافة 1 ميكرولتر (10 U) من إنزيم كفيكي إلى رد فعل واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في أداة ير. الشروع فورا في الخطوة 1.4.1
- نهاية حادة:
- إعداد خليط 4.5 ميكرولتر تحتوي على 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي البلمرة أنا كبير (كلينو) جزء و 2 ميكرولتر من 10 مل دنتبس. النقل 181؛ L من الخليط إلى عينة الحمض النووي من الخطوة 1.3.2. وسوف يكون حجم الكلي 102 ميكرولتر. مزيج جيدا من فورتيكسينغ واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير. الشروع فورا في الخطوة 1.6.1.
- إعداد الخرز ستريبتافيدين:
- باختصار دوامة الحل حبة ستريبتافيدين ونقل 50 ميكرولتر إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل جديد. إزالة طاف باستخدام موقف المغناطيسي وغسل الخرز مع 200 ميكرولتر من حل ملزم.
- ريسوسبيند الخرز في 100 ميكرولتر من حل ملزمة ووضع أنبوب بعيدا عن موقف المغناطيسي. الشروع فورا في الخطوة 1.6.1.
- ستريبتافيدين حبة ملزمة:
- نقل 100 ميكرولتر من الحمض النووي عينة (الخطوة 1.4.1) إلى 100 ميكرولتر إعادة تعليق حبة الحل (الخطوة 1.5.2) وتخلط بعناية عن طريق بيبتينغ لتجنب أي رغوة من الحل. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على عجلة دوارة أو الأسطوانة.
- استخدام موقف المغناطيسي لالتقاط الخرز وتجاهل طاف. غسل الخرز مرتين في 400 ميكرولتر من محلول الغسيل ومرتين في 400 ميكرولتر من 1X T4 الحمض النووي ليغاز العازلة (المخفف من حل 10X باستخدام نوكليس خالية من المياه).
- ريسوسبيند الخرز في 200 ميكرولتر من 1X T4 الحمض النووي ليغاز العازلة (المخفف من حل 10X باستخدام نوكليس خالية من المياه) ووضعه بعيدا عن موقف المغناطيسي. الشروع فورا في الخطوة 1.7.1.
- ربط الرابط:
- إعداد 400 ميكرولتر حل رد فعل ربط في أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل عن طريق خلط 0.5 ميكرولتر من رابط الحمض النووي (الخطوة 1.1.2)، 10 ميكرولتر من 10X T4 دنا يغاز العازلة، 20 ميكرولتر من 5X T4 الحمض النووي يغاز العازلة (التي تحتوي على 25٪ البولي ايثيلين غليكول)، 5 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4، 164.5 ميكرولتر من المياه خالية من نوكليس، و 200 ميكرولتر من الخرز إعادة تعليق (الخطوة 1.6.3). وضع أنبوب التفاعل على عجلة الدورية واحتضان في رت (22 درجة مئوية) لمدة 3 ساعات (أو 16 ° كو / N). غسل حبات مرتين مع حل الغسيل ومرتين مع 1X عازلة الحمض النووي البلمرة العازلة (المخفف من حل 10X باستخدام نوكليس خالية من المياه) باستخدام موقف المغناطيسي.
- ريسوسبيند الخرز في 50 ميكرولتر من 1X الحمض النووي البلمرة ير البلمرة العازلة ووضعه بعيدا عن موقف المغناطيسي. على الفور المضي قدما في الخطوة 1.8.1 أو تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يوم واحد.
- قبل التضخيم من كل من الحمض النووي مفترق اليسار واليمين:
- إعداد 200 ميكرولتر تفاعل ير عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 1L التمهيدي، 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 1R التمهيدي، 20 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي Link1 (الجدول 1)، 10 ميكرولتر من 10X عازلة الحمض النووي البلمرة عازلة، 4 ميكرولتر من 10 مل دنتبس (النهائي: 200 ميكرومتر من كل دنتب)، 8 ميكرولتر (20 U) البوليميراز الحمض النووي الحرارية، و 88 ميكرولتر من المياه نوكليس خالية من الخرز إعادة تعليق (50 ميكرولتر) من الخطوة 1.7.3.
- قسامة خليط التفاعل في 4 أنابيب ير (كل 501؛ L) وتنفيذ ير مع الشرط التالي: 94 درجة مئوية الحضانة لمدة 2 دقيقة. 25 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 56 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- بركة كل 4 ردود الفعل ير إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل واتبع إجراء تنقية ير من عدة تنقية ير. أزل مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة.
- تحديد تركيز الحمض النووي و 260/280 نانومتر القيم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي. يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للخطوة التالية. المضي قدما في الخطوات 1.9.1 / 1.10.1 (اختياري) أو مباشرة مع الخطوات 1.11.1 / 1.12.1.
- إزالة الجانب الأيسر الداخلي أمبليكون الحمض النووي (اختياري):
- نقل ما يصل إلى 100 نانوغرام من ير الحمض النووي المنتج من الخطوة 1.8.4 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل وضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر باستخدام المياه نوكليس خالية.
- إعداد رد فعل انزيم تقييد تستهدف على وجه التحديد الجانب D الداخلي من الجانب الأيسرنا أمبليكون.
ملاحظة: قد تختلف حالة رد الفعل اعتمادا على اختيار الانزيم. على سبيل المثال، عند إزالة الحمض النووي الداخلي من الجانب الأيسر من ناقلات لنتيفيرال القائم على NL4.3، إضافة 1 ميكرولتر من بويي ، 2 ميكرولتر من العازلة B، و 7 ميكرولتر من المياه خالية من نوكليس . احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير. على الفور المضي قدما في الخطوة 1.11.1 أو تخزين في -20 درجة مئوية.
- إزالة الجانب الأيمن من الحمض النووي الداخلي أمبليكون (اختياري):
- المضي قدما كما هو الحال في الخطوة 1.9.1.
- إعداد رد فعل انزيم تقييد تستهدف على وجه التحديد الجانب الأيمن من أمبليكون الحمض النووي الداخلي.
ملاحظة: على سبيل المثال، عند إزالة الحمض النووي الداخلي الجانب الأيمن من ناقلات لنتيفيرال القائم على NL4.3، إضافة 1 ميكرولتر من سفوي ، 2 ميكرولتر من العازلة B، و 7 ميكرولتر من المياه خالية من نوكليس . احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أداة ير. على الفور المضي قدما في الخطوة 1.12.1 أو تخزين في -20 درجة مئوية.
- اليسارالتضخيم -junction محددة:
- إعداد 50 ميكرولتر تفاعل ير عن طريق خلط 5 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 1.8.4 (أو من الخطوة الاختيارية 1.9.2)، 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 2L التمهيدي (النهائي: 1 ميكرومتر)، 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي Link2 (النهائي: 1 ميكرومتر)، 5 ميكرولتر من 10X العازلة الحمض النووي البلمرة الحرارية، 1 ميكرولتر من 10 مل دنتبس (النهائي: 200 ميكرومتر من كل دنتب)، 2 ميكرولتر (5 U) من البوليميراز الحمض النووي، و 27 ميكرولتر من نوكليس خالية ماء.
- تنفيذ ير مع الشرط التالي: 94 درجة مئوية الحضانة لمدة 3 دقائق. 8-15 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 56 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي تضخيم في -20 درجة مئوية. * يقترح رقم دورة الأمثل. - اتبع الإجراء تنقية ير من عدة تنقية ير. أزل مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة. تحديد تركيز الحمض النووي والقيم 260/280 نانومتر.
- جميع الإجراءات متطابقة مع "التضخيم-- تقاطع-- محددة التضخيم" (الخطوات 1.11.1-1.11.3)، باستثناء استخدام الاشعال مختلفة؛ استخدام التمهيدي الحق تقاطع محددة (2R التمهيدي، انظر الجدول 1 ) في هذه الخطوة.
- تحليل ير الاختلافات أمبليكون طول عن طريق أداء 2٪ الاغاروز هلام الكهربائي أو الشعري الكهربائي ( الشكل 2 ).
ملاحظة: هذا هو خطوة أساسية لتأكيد الانتهاء من إجراءات الفحص وإجراء تقييم تقريبي لأنماط إس استنادا إلى أنماط الفرقة ير. ويمكن استخدام أمبليكون ير المنقى من الخطوات 1.11.3 و 1.12.3 لمختلف منصات تسلسل الحمض النووي. المضي قدما في إجراءات إعداد العينات المناسبة لسلسلة الكلاسيكية إنهاء (سانجر) التسلسل أو الجيل القادم التسلسل. قد يتم تخزين الحمض النووي في -20 درجة. C.
2. التحليل التسلسلي إس التسلسل
- إعداد ملفات البيانات:
- إعداد ثلاثة ملفات بيانات المدخلات: ملف البيانات تسلسل صيغة فاستا (Test_data.fa في البيانات التكميلية)، ملف تسف لعناصر البحث عن المتجهات و لينكر تسلسل (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv في البيانات التكميلية)، وملف تسف لتقييد المعلومات انزيم (Enzyme.tsv في البيانات التكميلية).
ملاحظة: مطلوب هذه الملفات ل ديمولتيبليكسينغ، وتقليم ناقلات وتسلسل رابط، وإزالة متواليات ناقلات الداخلية ( الشكل 3A ). يتم تقديم تعليمات مفصلة خطوة بخطوة لتنفيذ سير العمل الحسابي في ملف README.txt في البيانات التكميلية.
- إعداد ثلاثة ملفات بيانات المدخلات: ملف البيانات تسلسل صيغة فاستا (Test_data.fa في البيانات التكميلية)، ملف تسف لعناصر البحث عن المتجهات و لينكر تسلسل (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv في البيانات التكميلية)، وملف تسف لتقييد المعلومات انزيم (Enzyme.tsv في البيانات التكميلية).
- التحليل الحسابي:
- تشغيل ديمولتيبليكسينغ وتقليم البرامج النصية.
ملاحظة: سيتم معالجة تسلسل الخام لإزالة ديمولتيبليكسينغ و تريمينg من المتجهات، لينكر، وتسلسل التمهيدي (انظر ستيب-1 في ملف README.txt التكميلي). - تشغيل الأمر تعيين (انظر الخطوة 2 في ملف README.txt) لتعيين تسلسل معالجتها على الجينوم المرجعي باستخدام أداة محاذاة بلاست (بلات؛ www.genome.ucsc.edu).
- تشغيل النص البرمجي تحليل إس الكمي (انظر الخطوة 3 في الملف README.txt).
ملاحظة: سيتم إنشاء ملفي إخراج (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt و final_count.txt). ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن استراتيجيات رسم الخرائط والتسلسل في "الملف README.txt في البيانات التكميلية وفي المنشورات السابقة 2 ، 15 .
- تشغيل ديمولتيبليكسينغ وتقليم البرامج النصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اختبار ثنائي الاتجاه إس ولدت أحجام مختلفة من أمبليكونس ير لكل من المنبع (يسار) والمصب (يمين) تقاطع المضيف ناقلات ( الشكل 2 ). حجم أمبليكون ير يعتمد على موقع أقرب عزر غتاك المنبع والمصب من إنتغروم. وأنتج الفحص أيضا أمبليكونس ير الحمض النووي الداخلية: تسلسل فيروسات بالقرب من المسالك المتعددة البوليبور وموقع التمهيدي ملزمة تم تضخيمها في نفس الوقت خلال اليسار واليمين تقاطع ير، على التوالي. يمكن تصور العصابات أمبليكون ير من الشعيرات الدموية أو الاغاروز (2٪) الكهربائي.
بعد التسلسل، تم تحليل كل من تسلسل تقاطع اليسار واليمين من خلال برنامج البرمجة داخل المنزل من أجل المعالجة المسبقة للمتواليات الخام (بما في ذلك إزالة تعدد الإرسال وتقليم المتجهات ووصل الحمض النووي)، ورسم تسلسل إس على الجينوم، وتحديد عد إس المتطابقةتسلسل، وتطبيق إجراءات تصحيح الخطأ ( الشكل 3 ). وتعتبر المواقع من 5 إلى نهاية تسلسل الاستعلام في الجينوم المرجعي داعش وتستخدم في العد الأولي لكل داعش. وتستند المعايير التي تحدد التتابعين المتوازيين - تسلسل تقاطع المنبع (يسار) والمصب (الأيمن) - من نفس المتغير - إلى أنماط تسلسل النيوكليوتيدات للتكامل المتضافر في الفيروس المعاد للروتيروسات، وهي كما يلي: '1' تسلسلان تقاطعان على الجينوم في التوجهات المعاكسة. (2) تفصل داعش من تسلسل تقاطع اثنين من التداخل 5-بب ل ناقلات فيروس نقص المناعة البشرية (هيف) ناقلات وتداخل 4-بب في ناقلات فيروس سرطان الدم الفئران (جبهة التحرير). أول 5 نقطة أساس من التقاطعين لفيروس نقص المناعة البشرية و 4 نقاط أساس من تقاطعات جبهة تحرير مورو الإسلامية هي تكميلية عكسية.
يتم تحديد التتابع تسلسل إس في ثلاث خطوات: (1) تعيين تسلسل إس على الجينومباستخدام بلات، الذي يولد جودة رسم الخرائط ويفصل تسلسل إس الفردية في "واحد ضرب"، "متعددة ضرب"، "لا ضرب"، و "الآخرين" المجموعات. (2) باستخدام أداة البحث المحاذاة المحلية الأساسية (بلاست) لمقارنة التتابعات ذات النتيجة الواحدة مع التسلسلات الأخرى التي تم تعيينها بشكل غير متناوب، بما في ذلك النتائج المتعددة، وعدم الزيارات، وغيرها؛ و (3) تحديد وتصحيح أخطاء التسلسل، بما في ذلك أخطاء هوموبوليمر. تسلسل متعددة ضرب هي تسلسل إس التي يمكن محاذاة اثنين أو أكثر من المواقف الجينية مع درجة رسم الخرائط عالية. في حين لا تزال مفيدة لتحديد وقياس السكان النسيلي، لا يمكن استخدام تسلسل متعددة ضرب لتوصيف أنماط التوزيع موقع التكامل الجيني (على سبيل المثال، مع الجينات، يكرر، أو الأحرف الجينية الأخرى). في بعض الحالات النادرة، تسلسل تقاطع اثنين تظهر صفات مختلفة رسم الخرائط. على سبيل المثال، يظهر واحد "ضرب واحد"، في حين يظهر تسلسل مطابقة "متعددة ضرب". في مثل هذه الحالات، على حد سواءيتم التعامل مع التسلسلات على أنها متواليات "ضرب واحد".
تم فصل جزء من تسلسل إس مع نتائج رسم الخرائط دون المستوى الأمثل، والتي تظهر نسبة عالية من الجينوم مطابقة (الهوية) مع حجم الاستعلام غير عادية (كسيز)، أو العكس بالعكس من "لا يضرب" ومجمعة في "الآخرين" ل إضافية وكثيرا ما دليل إعادة التقييم. على سبيل المثال، عند استخدام بلات لرسم الخرائط الجينوم، قد تظهر بعض تسلسل إس كسيز غير طبيعية بسبب النوكليوتيدات مطابقة للأخطاء في النوكليوتيدات 5-10 الأولى أو الأخيرة. وغالبا ما لا تفي هذه التتابعات بمعايير رسم الخرائط للحالة "ذات النتيجة الواحدة" أو "متعددة الضربات"، على الرغم من وجود نتيجة رسمية عالية الجودة نسبيا.
يتم توفير ملف بيانات تسلسل عينات الخام (Test_DATA.fa: 33،374 متواليات) وملفات بيانات إخراج نموذج كبيانات تكميلية. 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني من الخلايا ريبوبولاتينغ الإنسان، ترانسدوسد مع الصوم ناقلات فيروسية (FG12) في نخاع العظام أنسنة / الكبد / الغدة الصعترية (بلت) الماوس 17 ، تم تحليلها باستخدام مقايسة ثنائية الاتجاه. تم العثور على داء الفيروسات الرجعية في جميع أنحاء الجينوم. عادة، ناقلات لنتيفيرال هي ممثلة تمثيلا زائدا في الجينات، في حين أن ناقلات غاما-ريتروفيرال هي ممثلة تمثيلا زائدا في مواقع بدء النسخ 16 ( الشكل 4 ). من اثنين من عينات خلايا إعادة الإنسان البشري، ما مجموعه 1،081 تسلسل -851 من المنبع (يسار) و 230 تقاطع المصب (يمين) - كانت مؤهلة كما تسلسل داعش. من هذه التتابعات، تم تحديد 93 إس فريدة من نوعها في اليسار و 50 إس فريدة من نوعها في التقاطعات الصحيحة. من هذه، تم التعرف على 44 في كل من (اليسار واليمين) تقاطعات، مما يدل على ما مجموعه 99 الفلاتر التكاملية فريدة من نوعها في عينات الاختبار. يتم إثراء إس بشكل كبير في الجينات (66٪، p <0.0001) مقارنة مع الأحداث العشوائية ( الشكل 4A ).
"> متضمنة أيضا تسلسل موقع تكامل جاما-ريتروفيروس متجه (بمكس) في ملف بيانات الاختبار.من عينة خلية مختلطة بمكس، ترانسدوسد مع بمكس التعبير عن أكتوبر 4، كميك، Clf4، و Sox2، 1،611 تسلسل إس و 129 فريدة من نوعها تم تحديد هوية داعش من بين 65 و 76 من داعش فريدة من نوعها تم تحديدها في تقاطعات اليسار واليمين، على التوالي، كانت 12 في كلا التقاطعات.وقد تبين سابقا أن أمبليكونس ير من ≥500 بب هي التسلسل السيئ في منصة بايروسكنسينغ، في حين أن أمبليكونس ير من <500 بي بي هي عموما بشكل جيد التسلسل، دون تحيز ملحوظ فيما يتعلق أطوال تسلسل 15 . وهكذا، تم استبعاد بيانات تسلسل من أمبليكونس ≥ 500 بب ير في إزالة التحيز تسلسل طول المرتبطة بها. استخدمت فقط بيانات من <500 بب ير أمبليكون (يطلق عليه كمتجه ناقلات كميا قابلة للقياس الكمي، أو كفي) لتحليل نسيلي كمي. ترددات الكشف النسبية من إنتغروميس ناقلاتتم حساب فقط باستخدام التتابع تسلسل من تقاطعات إس توليد <500 بب أمبليكونس ير ( الشكل 4B -4D ؛ انظر أيضا الجدول 2 ). ما يقرب من 77٪ من ناقلات يمكن تحليلها كميا من خلال هذه الاستراتيجية ( الشكل 4B ). ونتيجة لذلك، كان من المتوقع أن تزيد الترددات المحسوبة لكل كفي على تقدير الترددات الحقيقية في العينة ( الشكل 4E ) بمقدار 1.25x.
الشكل 1: عرض تخطيطي للتحليل موقع التكامل ثنائي الاتجاه. ويظهر الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (الأسود والأحمر) يحيط بها الحمض النووي الخلوي (الأزرق). تمثل الأسهم الاشعال أوليغونوكليوتيد، والسهام مع علامة النجمة تمثل الاشعال البيوتين. ويشار إلى الحمض النووي رابط من قبل الخطوط الأرجواني. باختصار، امتداد خطي من اليسارالبيوتين الاشعال (L-بب) والاشعال البيوتين الحق (R-بب) من الفيروس الطرفية طويلة تكرار (لتر) يولد البيروكسيديز، مزدوج حبلا هو الحمض النووي. بعد الهضم مع كفيكي و رساي، يتم إثراء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل البيروكسيديز باستخدام ستريبتافيدين البيوتين محددة ملزمة و ليغاتد مع دنا رابط. يتم تضخيم ستريبتافيدين القبض عليها، لينكر-ليغاتد ناقلات الحمض النووي تقاطع المضيف عن طريق خطوة من ير: التضخيم قبل (تضخيم كل من تقاطعات اليسار واليمين) تليها اثنين من تقارير إنجاز المشاريع المتداخلة، كل استهداف اليسار واليمين تقاطعات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ممثل ير أمبليكون الصورة. ( A ) التحليل الكهربائي الشعري يظهر أطوال متفاوتة من أمبير يرليكونس في ناقلات لنتيفيرال (FG12) مواقع التكامل بعد بويي أو سفوي الهضم . وتظهر نطاقات متفرقة ير لمنافذ التيار المنبع (يسار) والمصب (يمين) ناقلات المضيف. رؤوس الأسهم الظلام تشير إلى أمبليكونس الحمض النووي ناقلات الداخلية المتبقية بعد بويي أو سفوي الهضم. علامة حجم الحمض النووي (0.1 - 2.5 كبب) على الخط M. تشير رؤوس الأسهم المفتوحة إلى علامات المحاذاة (15 و 5،000 نقطة أساس). وتستخدم علامات محاذاة الحمض النووي لمعايرة الاختلاف الوقت الهجرة عبر جميع القنوات. ( B ) غاما-ريتروفيرال (بمكس) مواقع تكامل ناقلات في استنساخ الخلايا الفئران ترانسدوسد مع ناقلات بمكس متعددة. يتم عرض دناز اليسار واليمين تقاطع، فضلا عن أمبليكونس الحمض النووي ناقلات الداخلية (رؤوس الأسهم). رؤوس الأسهم الظلام ومفتوحة تشير إلى الحمض النووي ناقلات الداخلية وعلامات المحاذاة، على التوالي. علامة حجم الحمض النووي (50-1،500 نقطة أساس) على حارة M. يمكن العثور على تفاصيل حول الكهربائي الشعري في الشركةبروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التكامل تحليل تسلسل الموقع. ( A ) مخطط انسيابي لتحليل البيانات الحسابية. هناك حاجة إلى ثلاثة ملفات البيانات، بما في ذلك ملف تسلسل صيغة فاستا، ملف مع زخارف تسلسل مرجع لإزالة ديمولتيبليكسينغ وتقليم، وملف مع معلومات انزيم التقييد. يتم تقديم ملفات العينة، بما في ذلك Test_DATA.fa (بيانات تسلسل)، Demultiplexing_Trimming.tsv (عناصر تسلسل البحث)، و Enzyme.tsv (تسلسل التعرف على انزيم التقييد) كملفات بيانات تكميلية. سيتم تعيين التتابعات المعالجة (متواليات الجينوم المضيفة) من الجزء 1 مقابل المرجع باستخدام بلات. المواقع في 5'- نهاية تسلسل الاستعلامفي الجينوم المرجعي تعتبر مواقع التكامل ( الجدول 2 ). يتم تحديد التتابع التسلسلي لكل إس في ثلاث خطوات: (1) تعيين تسلسل إس على الجينوم باستخدام بلات؛ (2) مقارنة تسلسل إس واحد ضرب (مواءمة على موقع فريد من الجينوم المضيف) مع تسلسل الأخرى التي تم تعيينها بشكل غير مباشر على الجينوم. و (3) تحديد وتصحيح أخطاء التسلسل. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن استراتيجيات رسم الخرائط والتسلسل في الدراسات السابقة 2 ، 15 . ( قبل الميلاد ) اثنين من عينات تسلسل الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل لالمصب (B) وأظهرت المنبع (C) تقاطع ناقلات المضيف المضيف. وتستخدم الاشعال بايروسكنسينغ A و B (الأخضر) لقطرات ير والتسلسل. رموز الألوان تتفق مع تلك الموجودة في الشكل 1 . نموذج تسلسل تقاطع المصب (B) يشمل التمهيدي A (الأخضر)، ميد (الأخضر)، ناقلات U5 نهاية (الأحمر)، الجينوم المضيف (الأزرق)، لينكر (الأرجواني)، والتمهيدي B (الأخضر). في تسلسل الحمض النووي مختلطة (المنبع والمصب)، ويستخدم التمهيدي A لتسلسل تقاطعات المصب (B)، ويستخدم التمهيدي B لتسلسل تقاطعات المنبع. نموذج تسلسل تقاطع المنبع (C) يشمل التمهيدي B، ميد، نهاية U3 ناقلات، الجينوم المضيف، رابط، والتمهيدي A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال ممثل عن تحليل موقع التكامل ثنائي الاتجاه. ( A ) نسبة التكامل في الجينات (ريفسيك)، ألو، وخط 1 (L1) يكرر من ناقلات لنتيفيرال في أنسنة الماوس خلايا إعادة التركيب (لف-هوميس)، بالمقارنة مع في سيليكو، ولدت 10000 الأحداث التكامل العشوائي. يتم تعيين مواقع التكاملعلى الجينوم البشري (hg19). تكون مواقع تكامل لف-هوميس أكثر تمثيلا بشكل ملحوظ في الجينات ( P <0.0001، تقريب مربع تشي) ( B ) في تحليل سيليكو ل 10000 حدث تكامل عشوائي. مع نهج أحادي الاتجاه، حوالي 52٪ من إنتغرومز عشوائية ولدت أمبليكونس ير من <500 نقطة أساس، في حين مع نهج ثنائي الاتجاه، 77٪ ولدت أمبليكون ير من <500 نقطة أساس في أي من تقاطعات اليمين أو اليسار. ير أمبليكونس أطول من 500 بب هي تسلسل غير فعال مع بروسفورسينغ بلاتفور 2 ، 15 ، وبالتالي ينبغي استبعادها من تحليلات البيانات الكمية. ( ج ) استراتيجية التحديد الكمي النسيجي. كل سهم استنساخ الفردية نفس المتجهات إنتغروم (أو إس). يتم الجمع بين الترددات النسبية لليسار (x) واليمين (ص) تقاطعات لتمثيل الكميات النسبية من السكان النسيلي (كميا ناقلات إنتغروميس، أو كفي). INTEG فإن مواقع الحصص التموينية التي ليس لديها عزر غتاك في 450 نقطة أساس غير مؤهلة (دق) وإزالتها من التحليل الكمي. ( D ) وتظهر الترددات النسبية (بالنسبة لجميع تسلسل كفي) من 44 استنساخ كفي في خلايا إعادة تكوين الفئران أنسنة في مخطط الألوان (الأبيض إلى الأحمر: 0 إلى 0.16). ( ه ) المتوقع الإفراط في تقدير الترددات النسيلي مع تحليل ثنائي الاتجاه. استنادا إلى سيليكو 10،000 تحليل التكامل العشوائي، ومن المتوقع أن 1.25 أضعاف الإفراط في تقدير عند استخدام انزيمات موتيف غتاك ( رساي و كفيكي ) بسبب ما يقرب من 20٪ استنساخ دق. ومن المتوقع أن يزيد تقدير 2.56x بسبب استنساخ دق حوالي 60٪ عند استخدام إنزيم الحافز تسغا ( تقي ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أواد / 55812 / 55812table1.jpg "/>
الجدول 1: أوليغونوكلأوتيدس ل لينتيفيرال و غاما-ريتروفيرال تكامل ناقلات تحليل الموقع. * 5BioTEG: تعديل البيوتين في نهاية 5 '. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 2: بيانات تمثيل تسلسل الموقع الإدراج ممثل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
1 خريطة: يمكن تعيين تسلسل موقع التكامل على موقع فريد من نوعه (ضرب واحد) أو متعددة لوكي (متعددة ضرب) من الجينوم المرجعي. نا (غير متوفر): لم يتم الكشف عن أي تسلسل.
2 سترد: اتجاه تسلسل الاستعلام في الجينوم
3 كلين: طول تسلسل الاستعلام
4 غلين: الطول المتوقع لتسلسل موقع التكامل، محسوبا على أساس المسافة من أقرب عزر متاح من غتاك في الجينوم إلى موقع الإدراج. غلين <450 بب مقبولة للتحليلات الكمية.
5 المجموع الكلي: عدد التتابع الكلي
6 يتم عرض مواقع التكامل من خلال عدد كروموسوم (شر) ورقم موقع للمفصل الصحيح (CHR_SITE1) ورقم للمفصل الأيسر (CHR_SITE2). CHR_SITE1 و CHR_SITE2 هي 5 بب بعيدا عن ناقلات لنتيفيرال و 4 بب فيما عدا ل ملف (بمكس) ناقلات
7 التتابع التتابع للوصلة اليمنى (R_A) والتقاطع الأيسر للعينة A (L_A)؛ (R_B) والتقاطع الأيسر للعينة B (L_B)
* مستثناة (دق): غلين ≥450 في سيليكو بب
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المقايسة ثنائية الاتجاه تمكن التحليل المتزامن لكلا من تسلسل تقاطع الحمض النووي في اتجاه المنبع (يسار) والمصب (يمين) المضيف المضيف، ومفيد في عدد من العلاج الجيني، والخلايا الجذعية، وتطبيقات البحوث السرطان. استخدام الانزيمات موتيف غتاك (رساي و كفيكي) ونهج ير ثنائي الاتجاه يحسن بشكل كبير من فرص الكشف عن إنتغروم (أو السكان النسيلي) عند مقارنته مع تسا-عزف السابقة المقايسات القائم على تقي 2 ، 15 وغيرها أحادي الاتجاه لم-ير نهج 5 . مقايسة ثنائية الاتجاه يحسن تحليل إس، لا سيما في عينات الحمض النووي محدودة التي غالبا ما تنشأ في الدراسات السريرية أو الحيوانات الصغيرة نموذج.
الخطوات 1.1-1.7 هي خطوة حاسمة وينبغي القيام به دون تأخير لا لزوم لها. وعادة ما تتم هذه الخطوات في يوم واحد. ينصح بشدة الإنزيمات اختبار قبل هذه الخطوات. خطوةs 1.9 و 1.10 اختيارية. هذه الخطوات سوف تقلل من تسلسل الحمض النووي ناقلات الداخلية التي تتضخم بشكل متزامن مع تسلسل داعش. يوفر الجدول 1 مجموعات التمهيدي مناسبة لتحليل إس من ويلديب NL4.3 فيروس نقص المناعة البشرية -1، ناقلات المشتقة NL4.3، بما في ذلك FG12 21 ، وناقلات غاماريتروفيرال القائم على بمكس 22 . اعتمادا على الاختلافات النوكليوتيدات في تسلسل محطة طويلة تكرار (لتر)، تصميم التمهيدي والنهج التجريبي قد تحتاج إلى تعديل السليم.
برنامج بلات المستخدمة لرسم الخرائط متوافق فقط مع تنسيق فاستا ولا يعمل مع الملفات فاستق. يمكن للمرء تحويل ملفات فاستك إلى فاستا باستخدام أدوات البرمجيات المختلفة، مثل فاستكس-تولكيت أو بتولس. يمكن للمستخدم مع المعرفة الأساسية من الثعبان استخدام بيوبيثون لتحويل الملفات فاستك إلى فاستا لرسم الخرائط لهم مع بلات.
ومن المتوقع ألا يتم الكشف عن جزء من داعش مع الاتجاه IS، وحتى لو تم الكشف عنها، لن تكون مؤهلة للحصول على القياس الكمي النسبي. عندما تم استخدام إنزيمات غتاك-موتيف، ما يقرب من 23٪ من إنتيغرومز في تسلسل البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة منصة بايروسكنسينغ لم يمر معايير التحليل للكمي تحليل تسلسل إس ( الشكل 4 ). عندما التغطية الشاملة إس هو أمر بالغ الأهمية، على سبيل المثال في مراقبة سلامة الخلايا المهندسة الجينات في إعدادات العلاج الجيني، فمن المستحسن أن تختار مقايسة مع وصول الجينوم غير المقيد إلى إس 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 أو لإعادة تحليل نفس العينة مع مجموعة مختلفة أو الأمثل من ريستريسيس 4 ، 18 .
مقايسات إس مع وصول الجينوم غير المقيد، مثل غير مقيدة لام ير والعشوائية القص أبرأوتشس 19 ، 20 ، يحمل وعدا خاصا لتحليل داعش شامل. وتستخدم هذه المقاربات تكنولوجيات يصعب التحكم فيها نسبيا، مما يجعل من الصعب التنبؤ بنتائج تجزئة الحمض النووي الجيني وتضخيم إس. من ناحية أخرى، مقايسات إس باستخدام الإنزيمات تقييد تتميز جيدا اثنين من الفوائد الرئيسية: (1) فمن السهل نسبيا لمعايرة وتحسين المقايسات، لأن نتائج الفحص هي أكثر قابلية للتنبؤ بسبب خصوصية التفاعل انزيم وتوافر مرجع تسلسل الجينوم. (2) تسلسل البيانات هي استنساخه للغاية مرة واحدة وقد تم تحسين ظروف الفحص. وقد أثبتت ير ثنائي الاتجاه مع الظروف الأمثل مفيدة لكمية واسعة ودقيقة كمون النسيجي 2 ، 15 . على الرغم من أن جزء فقط من السكان النسيلي الموجودة قد تم تحليلها بسبب تقييد انزيم التحيز، والكميات من إنديفيدوا لتر تم قياسها بدقة، وبالتالي تمكين تحديد دقيق من الاختلافات حجم استنساخ داخل وعبر العينات. تم توليد عدد كاف من الحيوانات المستنسخة لتحديد أنماط سلوك الخلايا الجذعية والتغاير الوظيفي.
و أمبليكونس ير المنتجة من هذا الإجراء ير ثنائي الاتجاه هي مناسبة لأي منصة تسلسل المصب. نظرا للحساسية العالية للمقايسة، ينبغي توخي أقصى قدر من العناية لمنع التلوث المتبادل عن طريق إجراء التجارب في غرفة خالية من التلوث. وينصح بإدراج تجربة سلبية (لا قالب) السيطرة لجميع الخطوات ير. وحتى مع الممارسة الأكثر حذرا، فإن منع انتقال العينات من عينة إلى عينة أمر صعب للغاية. وبالتالي، عند مقارنة السكان النسيلي من عينات مختلفة، فمن المستحسن استخدام التحكم في الاصطدام، الذي يزيل البيانات الملوثة المحتملة 23 ، وقطع لنسخ منخفضة التردد، غير موثوق بها> 2 من أجل تقليل الضوضاء من الحمض النووي الملوثة عبر. ويولد النهج ثنائي الاتجاه بيانات إس لكل من طرفي الأكسروم، مما يوفر فرصة إضافية لتقليل أخطاء الكشف الكاذبة المحتملة المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R00-HL116234، U19 AI117941، و R56 HL126544؛ مؤسسة العلوم الوطنية منحة دمس-1516675؛ المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (نرف-2011-0030049، نرف-2014M3C9A3064552)؛ وبرنامج مبادرة كريب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
