Summary
该手稿描述了可以同时分析上游和下游载体 - 宿主连接DNA的双向整合位点测定的实验程序和软件分析。双向PCR产品可用于任何下游测序平台。所得数据对于综合DNA靶标的高通量，定量比较是有用的。
Abstract
整合位点（IS）测定是逆转录病毒整合位点研究的关键组成部分及其生物学意义。在最近的逆转录病毒基因治疗研究中，IS测定结合下一代测序已被用作细胞跟踪工具来表征共享相同IS的克隆干细胞群体。为了准确比较不同样品内和跨越不同样品的干细胞克隆，检测灵敏度，数据重现性和高通量能力均为最重要的检测标准之一。这项工作为双向IS分析提供了详细的协议和数据分析工作流程。双向测定可以同时排列上游和下游载体 - 宿主结。与常规单向IS测序方法相比，双向方法显着提高了IS检测率和t两端积分事件的表征他瞄准DNA。这里描述的数据分析流程通过多个比较步骤准确地识别和列举相同的IS序列，将IS序列映射到参考基因组上并确定测序误差。使用优化的测定程序，我们最近在恒河猴猕猴移植后发表了数千个造血干细胞（HSC）克隆的详细重新填充模式，首次证实了HSC重新增殖的精确时间点和HSC在功能异质性中的功能异质性灵长类动物系统。以下协议描述了准确识别和量化相同的IS序列的逐步实验过程和数据分析工作流程。
Introduction
逆转录病毒将其基因组DNA插入各个位点的宿主基因组。这种独特的性质可能有助于癌症和其他形式的病毒发病机制的发展，具有使这些病毒高度适应细胞工程用于基因治疗和基础生物学研究的讽刺意义。病毒整合位点（IS） - 整合了外来DNA（病毒）的宿主基因组上的位置 - 对整合的病毒和宿主细胞的命运具有重要意义。 IS测定已经用于各种生物和临床研究环境，以研究逆转录病毒整合位点选择和发病机理，癌症发展，干细胞生物学和发育生物学1,2,3,4 。检测灵敏度低，数据重现性差，交叉污染频繁将IS测定应用限制在当前和计划研究中的关键因素。
已经开发了许多IS分析技术。包括连接介导的（LM）聚合酶链反应（PCR） 5 ，逆PCR 6和线性扩增介导（LAM）PCR 7的限制性酶基整合位点测定法是最广泛使用的。然而，使用位点特异性限制性酶在IS的检索期间产生偏倚，仅允许在限制性位点附近恢复4个整合到宿主基因组内的整合子（集成到宿主基因组中的外来DNA） 4 。最近几年也引入了更综合评估载体IS的分析技术。这些测定采用各种策略，包括Mu转座子介导的PCR 8 ，非限制性（nr）-LAM PCR 9 ，II型限制性内切酶缓冲消化10 ，机械剪切11和随机六聚体基因PCR（Re-free PCR） 12 ，以克隆基因组DNA并扩增IS。目前的技术具有不同程度的检测灵敏度，基因组覆盖率，靶特异性，高通量能力，测定程序的复杂性以及检测目标位点相对频率的偏差。鉴于现有测定的不同质量和可以使用的各种目的，应仔细选择最佳测定方法。
该工作提供了详细的实验程序和双向测定的计算数据分析工作流程，通过同时分析整合的靶DNA的上游和下游IS，显着提高检测率和序列定量准确度（参见图1的测定程序示意图）。这种方法也提供了是表征逆转录病毒整合过程的手段（例如，靶位点重复的保真度和上游和下游插入的基因组序列的变化）。其他双向方法主要用于克隆和测序目标DNA 11,13,14的两端。使用公认的LM-PCR方法和计算分析映射以及用于量化上游和下游连接点，广泛优化用于载体标记克隆的高通量和可重复定量的测定。已经证明使用TaqαI酶的双向分析对于干细胞基因治疗临床前研究中的高通量克隆定量是有用的。本文介绍了一种使用更频繁的切割器（RsaI / CviQI-主题：GTAC）的修改方法，使两倍与基于TaqαI的测定相比，他检测到整合素的机会。描述了使用GTAC基序酶用于慢病毒（NL4.3及其衍生物）和γ-逆转录病毒（pMX载体）载体IS分析的详细实验和数据分析程序。测定中使用的寡核苷酸列于表1中 。用于IS序列分析的内部编程脚本在补充文档中提供。
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Protocol
1.生成上游（左） - 和下游（右） - 连接序列库
- DNA接头制备：
- 通过加入2μL100μM的LINKER_A寡核苷酸（最终的20μM），2μL的100μM的LINKER_B寡核苷酸（最终的20μM），2μL的5M的NaCl（最终的1M），加入2μL的10μL的接头DNA溶液PCR管中4μL无核酸酶的水。接头序列见表1 。
- 在PCR仪器中将接头DNA溶液在95℃孵育5分钟，停止运行程序，并关闭PCR仪器电源。将接头溶液留在仪器中30分钟以缓慢冷却接头DNA。接头DNA溶液可以在4℃下储存。
- LTR特异性生物素引物延伸：
- 使用UV-Vis分光光度计来确定体内基因组DNA的DNA浓度和260/280 nm值或体外实验。使用无核酸酶的水稀释1-2μg样品基因组DNA至终体积为170μL的基因组DNA溶液。
- 通过混合10μMHIV-1特异性生物素引物（ 表1中的 L-BP和R-BP：四种慢病毒特异性引物共10μL），将20μL10X热稳定剂DNA聚合酶缓冲液，4μL10mM dNTPs（最终每个dNTP200μM），3μL2.5U /μL热稳定DNA聚合酶和163μL基因组DNA。
注意：对于gammaretroviral载体（pMX载体），使用两个10μMpMX特异性生物素引物（L-BP和R-BP：总共为10μL）的5μL，而不是上述四种HIV-1特异性生物素引物。 - 将溶液分成四个PCR管（每个50μL），并在以下条件下进行单个延伸循环：94℃5分钟，56℃3分钟，72℃5分钟min和4℃储存。
- 将所有四个PCR反应物合并到2 mL微量离心管中，并按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化程序进行。用50μL洗脱缓冲液（试剂盒中提供的5倍水稀释洗脱缓冲液）洗脱。立即进行步骤1.3.1或将洗脱的DNA储存在-20℃。
- RsaI和CviQI消化
- 通过加入50μL的DNA（来自步骤1.2.4），10μL的10x缓冲液A和2μL（20U）的RsaI酶，准备100μL的消化反应。在PCR仪中37℃孵育1小时。
- 向反应中加入1μL（10U）CviQI酶，并在PCR仪中于25℃温育30分钟。立即进行第1.4.1节
- 钝的结局：
- 制备含有2.5μLDNA聚合酶I大（klenow）片段和2μL10 mM dNTP的4.5μL混合液。转移181;将来自步骤1.3.2的DNA样品的混合物的L。总体积为102μL。通过涡旋混合并在25℃下在PCR仪中孵育1小时。立即进行步骤1.6.1。
- 链霉亲和素珠的制备：
- 简单地涡旋链霉亲和素珠溶液，并将50μL转移到新的2 mL微量离心管中。使用磁性支架取出上清液，用200μL的结合溶液洗涤珠子。
- 将珠子悬浮在100μL的结合溶液中，并将管放置在离磁架上。立即进行步骤1.6.1。
- 链霉抗生物素蛋白珠结合：
- 将100μL样品DNA（步骤1.4.1）转移到100μL再悬浮珠粒溶液（步骤1.5.2），并通过移液小心混合，以避免溶液发生任何发泡。在旋转轮或滚筒上，室温孵育3小时。
- 使用磁性支架捕获珠子并丢弃上清液。在400μL洗涤溶液中洗涤珠子两次，并在400μL1x T4 DNA连接酶缓冲液（从不含核酸酶的水稀释的10X溶液）中洗涤两次。
- 将珠子悬浮于200μL的1×T4 DNA连接酶缓冲液中（使用不含核酸酶的水从10X溶液中稀释），并将其放置在磁性架上。立即继续执行步骤1.7.1。
- 连接器结扎：
- 通过混合0.5μL的DNA接头（步骤1.1.2），10μL的10×T4 DNA连接酶缓冲液，20μL的5X T4 DNA连接酶缓冲液（含有25％的聚乙烯），制备400μL的连接反应溶液于2mL的微量离心管中乙二醇），5μLT4 DNA连接酶，164.5μL无核酸酶的水和200μL再悬浮的珠（步骤1.6.3）。将反应管放在旋转轮上，并在RT（22℃）下孵育3小时（或16°CO / N）。 用洗涤溶液洗涤珠子两次，并用1X耐热DNA聚合酶缓冲液（使用不含核酸酶的水从10x溶液稀释）使用磁性支架两次。
- 将珠子重悬于50μL的1×热稳定DNA聚合酶PCR缓冲液中，并将其放置在离磁架上。立即进行第1.8.1步，或在4℃下储存长达一天。
- 左和右连接DNA的预扩增：
- 通过加入10μL10μM1L引物，10μL10μM1R引物，20μL10μM引物Link1（表1），10μL10X热稳定DNA聚合酶缓冲液，4μL 10mM dNTPs（终体积：每个dNTP为200μM），8μL（20U）热稳定DNA聚合酶和88μL无核酸酶的水加入来自步骤1.7.3的再悬浮珠子（50μL）中。
- 将反应混合物等分成4个PCR管（每个50μL1; L）并进行PCR，具有以下条件：94℃孵育2分钟; 94℃20秒，56℃25秒，72℃2分钟25个循环;最后在72℃延伸5分钟。
- 将所有4个PCR反应混合到2 mL微量离心管中，并按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化程序进行。用50μL洗脱缓冲液洗脱。
- 使用UV-Vis分光光度计测定DNA浓度和260/280-nm值; DNA可以保存在-20°C直到准备下一步。继续执行步骤1.9.1 / 1.10.1（可选）或直接执行步骤1.11.1 / 1.12.1。
- 取出左侧内部DNA扩增子（可选）：
- 将高达100ng PCR DNA产物从步骤1.8.4转移到2mL微量离心管中，并使用不含核酸酶的水将体积调节至10μL。
- 准备专门针对左侧内部D的限制酶反应NA扩增子。
注意：反应条件可能因酶的选择而异。例如，当从基于NL4.3的慢病毒载体中除去左侧内部DNA时，加入1μL的pvuII ，2μL的缓冲液B和7μL的无核酸酶的水。在PCR仪中37℃孵育1小时。立即进行步骤1.11.1或存储在-20°C。
- 取出右侧内部DNA扩增子（可选）：
- 继续与步骤1.9.1相同。
- 准备特异性靶向右侧内部DNA扩增子的限制酶反应。
注意：例如，从基于NL4.3的慢病毒载体中取出右侧内部DNA时，加入1μLsfoI ，2μL缓冲液B和7μL无核酸酶的水。在PCR仪中37℃孵育1小时。立即进行步骤1.12.1或储存于-20°C。
- 剩下结特异性扩增：
- 通过混合来自步骤1.8.4（或选自步骤1.9.2）的5μLDNA，5μL10μM2L引物（终体积：1μM），5μL10μM引物Link2，制备50μLPCR反应（最终为1μM），5μL10×耐热DNA聚合酶缓冲液，1μL10mM dNTP（终体积：每个dNTP200μM），2μL（5U）热稳定DNA聚合酶和27μL无核酸酶水。
- 进行以下条件的PCR：94℃孵育3分钟; 94℃20s，56℃25s，72℃2分钟8-15个循环;最后在72℃延伸5分钟。
注：扩增的DNA可以储存在-20°C。 *建议循环次数优化。 - 按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化程序。用50μL洗脱缓冲液洗脱。确定DNA浓度和260/280 nm值。
- 所有方法与“左结特异性扩增”相同（步骤1.11.1-1.11.3），不同之处在于使用不同的引物;在该步骤中使用右侧特异性引物（2R-引物， 参见表1 ）。
- 通过进行2％琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增子长度变化（ 图2 ）。
注意：这是确认完成测定程序并基于PCR带图案粗略评估IS模式的重要步骤。来自步骤1.11.3和1.12.3的纯化的PCR扩增子可用于各种DNA测序平台。继续进行经典链终止（Sanger）测序或下一代测序的适当样品制备程序。 DNA可以保存在-20°;C。
2.计算IS序列分析
- 数据文件的准备：
- 准备三个输入数据文件：fasta格式序列数据文件（补充数据中的Test_data.fa），用于向量和链接器序列的搜索图案的tsv文件（补充数据中的Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv）和限制酶信息的tsv文件（Enzyme.tsv补充资料）。
注意：这些文件是解复用，修剪向量和链接器序列，以及删除内部向量序列所必需的（ 图3A ）。在补充数据中的README.txt文件中提供了实现计算工作流程的详细分步说明。
- 准备三个输入数据文件：fasta格式序列数据文件（补充数据中的Test_data.fa），用于向量和链接器序列的搜索图案的tsv文件（补充数据中的Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv）和限制酶信息的tsv文件（Enzyme.tsv补充资料）。
- 计算分析：
- 运行解复用和修剪脚本。
注意：原始序列将被处理用于解复用和trimming的载体，接头和引物序列（见补充README.txt文件中的STEP-1）。 - 运行映射命令（参见README.txt文件中的STEP-2），使用类似BLAST的对齐工具（BLAT; www.genome.ucsc.edu）将处理的序列映射到参考基因组上。
- 运行定量IS分析脚本（请参阅README.txt文件中的STEP-3）。
注意：将生成两个输出文件（Initial_count_without_homopolymer_correction.txt和Final_count.txt）。有关映射和序列枚举策略的更多详细信息，请参见“README.txt文件中的补充数据和以前的出版物2,15。
- 运行解复用和修剪脚本。
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Representative Results
双向IS测定为上游（左）和下游（右）载体宿主结（ 图2 ）产生不同大小的PCR扩增子。 PCR扩增子的大小取决于最后的GTAC基序上游和下游的位置。该测定还产生内部DNA PCR扩增子：分别在左侧和右侧连接PCR期间在多巴胺附近的逆转录病毒序列和引物结合位点同时扩增。通过毛细管或琼脂糖（2％）电泳可以显示PCR扩增子条带。
测序后，通过用于预处理原始序列（包括解复用和修剪载体和接头DNA）的内部编程脚本分析左和右连接序列，将IS序列映射到基因组上，识别和计数相同的IS序列，并应用纠错程序（ 图3 ）。参考基因组中查询序列的5'端的位置被认为是IS，并且用于每个IS的初始计数。确定两个匹配序列的标准 - 起源于相同内含子的上游（左）和下游（右）连接序列是基于逆转录病毒特异性协同整合的核苷酸序列模式，并且如下：（i）两个连接序列在相反的取向上对准基因组。 （ii）两个连接序列的IS被人类免疫缺陷病毒（HIV）载体的5-bp重叠和鼠白血病病毒（MLV）载体的4-bp重叠分开。 HIV的两个连接点的前5个碱基对和MLV连接的4 bp是反向互补的。
IS序列计数分三步确定：（1）将IS序列映射到基因组上使用BLAT，其产生映射质量并将单个IS序列分离成“单击”，“多命中”，“无命中”和“其他”组; （2）使用基本局部比对搜索工具（BLAST）将单命中序列与其他非最佳映射序列进行比较，包括多命中，无命中等;和（3）识别和校正测序误差，包括均聚物误差。多重命中序列是可以将两个或多个基因组位置与高映射分数对准的IS序列。虽然仍然可用于鉴定和定量克隆群体，多重命中序列不能用于表征基因组整合位点分布模式（例如，与基因，重复序列或其他基因组特征的关联）。在一些罕见的情况下，两个连接序列显示不同的映射质量。例如，一个显示“单击”，而匹配序列显示“多命中”。在这种情况下，两者都是序列被视为“单击”序列。
具有次优映射分数的IS序列的一部分，显示具有异常查询大小（QSIZE）的高百分比基因组匹配（身份）或反之亦然的IS序列与“无命中”分开并分组为“其他”，用于额外和经常手动重新评估。例如，当使用BLAT进行基因组测绘时，由于第一个或最后5-10个核苷酸中的错配匹配核苷酸，一些IS序列可能显示异常的QSIZE。这些序列通常不符合“单击”或“多命中”状态的映射标准，尽管具有相对高质量的映射结果。
提供样本原始序列数据文件（Test_DATA.fa：33,374个序列）和样本输出数据文件作为补充数据。 1μg来自人类重组细胞的基因组DNA，用借用转导使用双向测定分析人源化骨髓/肝/胸腺（BLT）小鼠17中的病毒载体（FG12）。在整个基因组中都发现了逆转录病毒。通常，慢病毒载体在基因中过表达，而γ-逆转录病毒载体在转录起始位点16中过表达（ 图4 ）。从两个人类重组细胞样品中，共有1,081个序列 - 来自上游（左）和230个下游（右）结的851个序列被鉴定为IS序列。从这些序列中，确定了左侧93个独特的IS和右侧的50个独特的IS。其中，在（左）和右两个交界处确定了44个，在测试样品中总共显示99个独特的整体。与随机事件相比，IS显着丰富了基因（66％， p <0.0001）（ 图4A ）。
“样品γ-逆转录病毒载体（pMX）整合位点序列也包括在测试数据文件中。从表达Oct4，cMyc，Klf4和Sox2的pMX转导的混合Pmx工程细胞样品中，1,611个IS序列和129个独特的IS被鉴定出来，分别在左，右交界处鉴定出65和76个独特的IS，两个交界处都有12个。以前已经显示，在焦磷酸测序平台中，≥500bp的PCR扩增子测序不良，而500bp的PCR扩增子通常是良好的序列，而对序列长度15没有显着的偏差。因此，排除了来自≥500bpPCR扩增子的序列数据以消除长度相关的测序偏差。仅使用<500bp PCR扩增子（称为可量化载体内含子或QVI）的数据进行定量克隆分析。向量积分的相对检测频率仅使用产生<500bp PCR扩增子的IS结的序列计数计算（ 图4B -4D ;也参见表2 ）。通过该策略可以定量分析约77％的载体（ 图4B ）。因此，每个QVI的计算频率预计会使样本中的真实频率（ 图4E ）过高估计1.25倍。
图1：双向集成现场分析示意图。显示了侧翼为细胞DNA（蓝色）的双链逆转录病毒DNA（黑色和红色）。箭头表示寡核苷酸引物，带有星号的箭头表示生物素引物。接头DNA由紫色线表示。简单来说，左边是一个线性扩展来自病毒长末端重复（LTR）的生物素引物（L-BP）和右生物素引物（R-BP）产生生物素化的双链IS DNA。用CviQI和RsaI消化后，使用链霉亲和素 - 生物素特异性结合富集生物素化的双链DNA，并与接头DNA连接。通过两步PCR扩增链霉亲和素捕获的连接物连接的载体 - 宿主连接DNA：预扩增（左和右连接的扩增），然后两个嵌套PCR，每个靶向左，右连接。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：代表性PCR扩增子图像。 （ A ）毛细管电泳分析显示不同长度的PCR amp在pvuII或sfoI消化后，慢病毒载体（FG12）整合位点的许可证。显示了用于上游（左）和下游（右）载体宿主结的不同PCR带。暗箭头表示pvuII或sfoI消化后残留的内部载体DNA 扩增子。 DNA大小标记（0.1-2.5kbp）位于M泳道上。开放箭头表示比对标记（15和5,000bp）。 DNA对准标记用于校准所有通道的迁移时间变化。 （ B ）用多个pMX载体转导的鼠细胞克隆中的γ反转录病毒（pMX）载体整合位点。显示左和右连接DNA，以及内部载体DNA扩增子（箭头）。黑暗和开放的箭头分别表示内部载体DNA和对准标记。 DNA大小标记（50-1,500bp）位于M泳道上。毛细管电泳的细节可以在公司找到协议。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：集成站点序列分析。 （ A ）计算数据分析的流程图。需要三个数据文件，包括fasta格式序列文件，具有用于解复用和修剪的参考序列基序的文件以及具有限制酶信息的文件。提供样本文件，包括Test_DATA.fa（序列数据），Demultiplexing_Trimming.tsv（搜索序列基序）和Enzyme.tsv（限制酶识别序列）作为补充数据文件。将使用BLAT将来自第1部分的经处理的序列（宿主 - 基因组序列）与参考文献进行比对。查询序列5-end的位置参考基因组中的es被认为是整合位点（ 表2 ）。每个IS的序列计数分三步确定：（1）使用BLAT将IS序列映射到基因组上; （2）比较单命中IS序列（与宿主基因组的唯一位点对齐）与次优地映射到基因组上的其他序列;和（3）识别和纠正排序错误。有关映射和序列计数策略的更多细节可以在以前的研究2,15中找到。 （ BC ）显示用于下游（B）和上游（C）载体 - 宿主结的两个样品单链DNA序列。引物A和B（绿色）用于液滴PCR和测序。颜色代码与图1中的颜色代码一致。样品下游连接序列（B）包括引物A（绿色），MID（绿色），载体U5末端（红色），宿主基因组（蓝色），李nker（紫色）和Primer B（绿色）。在混合（上游和下游）DNA测序中，引物A用于测序下游接头（B），引物B用于测序上游接头。样品上游连接序列（C）包括引物B，MID，载体U3末端，宿主基因组，接头和引物A. 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：双向整合现场分析的代表性例子。 （ A ）与人造小鼠再生细胞（LV-huMice）中的慢病毒载体的基因（refseq），Alu和LINE 1（L1）的重复序列比较，与计算出的10,000个随机整合事件相比较。集成站点被映射到人类基因组（hg19）。 LV-huMice集成位点在基因中显着超过（ p <0.0001，卡方近似）（ B ）10,000个随机整合事件的计算机分析。采用单向方法，大约52％的随机整合产生<500 bp的PCR扩增子，而在双向方法中，77％的左侧或右侧连接点产生了500 bp的PCR扩增子。长于500bp的PCR扩增子与焦磷酸测序平台2,15无效地排序，因此应排除在定量数据分析之外。 （ C ）克隆量化策略。每个单克隆共享相同的向量内容（或IS）。将左（x）和右（y）结的相对频率组合以表示克隆群体的相对量（可量化载体整合或QVI）。 INTEG在450bp内没有GTAC基序的配给位点被取消资格（dQ），并从定量分析中去除。 （ D ）人源化小鼠再生细胞中44个QVI克隆的相对频率（相对于所有QVI序列）显示为配色方案（白色至红色：0至0.16）。 （ E ）通过双向分析预期克隆频率过度估计。基于silico 10,000随机整合分析，当使用GTAC基序酶（ RsaI和CviQI ）时，由于大约20％的dQ克隆，所以预计会出现1.25倍的超估。使用TCGA基序酶（ TaqαI ）时，由于大约60％的dQ克隆，预计会出现2.56倍的过度估计。 请点击此处查看此图的较大版本。
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表1：慢病毒和γ-逆转录病毒载体整合位点分析的寡核苷酸。 * 5BioTEG：5'末端的生物素修饰。 请点击这里查看此表的较大版本。
表2：代表性插入位点序列计数数据。 请点击这里查看此表的较大版本。
1地图：整合位点序列可以映射到参考基因组的独特位置（单命中）或多个基因座（多重命中）。 NA（不可用）：没有检测到序列。
2 STRD：基因组中查询序列的方向
3 QLEN：查询序列的长度
4 GLEN：基于从基因组中最接近的可用GTAC基序到插入位点的距离计算的整合位点序列的预期长度。接受定量分析的GLEN <450 bp。
5 Total_Count：总序列数
6个整合位点以染色体数（CHR）和右结点（CHR_SITE1）的位点编号和左结点（CHR_SITE2）的数字显示。对于慢病毒载体，CHR_SITE1和CHR_SITE2分别为5bp，MLV（pMX）载体为4bp
7右侧结点（R_A）和样本A左侧结点（L_A）的序列计数;右结点（R_B）和样品B（L_B）的左结点的序列计数
*不符合资格（dQ）：GLEN≥450在硅胶bp
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Discussion
双向测定能够同时分析上游（左）和下游（右）载体 - 宿主DNA连接序列，并且可用于许多基因治疗，干细胞和癌症研究应用。与以前的基于TCGA基序的酶（ TaqαI ）为基础的检测2,15和其他方法相比，使用GTAC基序酶（RsaI和CviQI）和双向PCR方法显着提高了检测内含子（或克隆群体）的机会单向LM-PCR方法5 。双向测定改善了IS的分析，特别是在临床或小动物模型研究中经常出现的有限DNA样品中。
步骤1.1-1.7是关键的一步，应该没有不必要的延误。这些步骤通常在一天内完成。强烈推荐在这些步骤之前测试酶。步s 1.9和1.10是可选的。这些步骤将减少与IS序列同时扩增的内部载体DNA序列。 表 1提供了适用于分析野生型NL4.3 HIV-1，NL4.3衍生载体（包括FG1221）和基于pMX的加马拉维拉病毒载体22的IS的引物组。根据长末端重复（LTR）序列中的核苷酸变化，引物设计和实验方法可能需要适当的修改。
用于映射的blat软件仅与fasta格式兼容，不适用于fastq文件。可以使用各种软件工具（如FASTX-Toolkit或BBTools）将fastq文件转换为fasta。具有python基础知识的用户可以使用Biopython将fastq文件转换为fasta，以将其与blat进行映射。
预计IS的一部分将不会被双向I检测到S检测，即使检测到，将不符合下游克隆定量的资格。当使用GTAC基序酶时，焦磷酸测序平台产生的序列数据中约23％的整合素没有通过定量IS序列分析的分析标准（ 图4 ）。当综合IS覆盖范围至关重要时，例如在基因治疗设置中基因工程细胞的安全监测中，建议选择具有无限制基因组访问IS 8,9,10,11,12的测定法，以重新分析相同的样品与限制酶4,18的不同或优化组合。
具有无限制基因组访问的IS测定，例如非限制性LAM PCR和随机剪切应用呃20,20 岁 ，对全面的IS分析有特殊的希望。这些方法使用相对难以控制的技术，难以预测基因组DNA片段化和IS扩增的结果。另一方面，使用良好表征的限制性酶的IS测定具有两个主要优点：（1）由于酶反应的特异性和可用性的可用性，测定结果更可预测，因此相对容易校准和优化测定参考基因组序列。 （2）一旦测定条件已经被优化，序列数据是高度可重复的。已经证明具有优化条件的双向PCR可用于大规模和准确的克隆定量2,15。虽然由于限制酶偏差，现有克隆种群的一部分已被分析，但个体数量 l克隆被准确测量，从而能够准确测定样品内和样品间的克隆大小变化。产生足够数量的克隆以确定干细胞行为模式和功能异质性。
从双向PCR程序产生的PCR扩增子适用于任何下游测序平台。由于测定的高灵敏度，应特别注意通过在无污染的房间中进行实验来防止交叉污染。建议在所有PCR步骤中包括阴性（无模板）对照实验。即使是最细心的做法，防止样本间的交叉污染是非常困难的。因此，当比较来自不同样本的克隆种群时，建议采用冲突控制，其去除潜在的污染数据23 ，以及用于低频，不可靠克隆的截止> 2，以减少交叉污染的DNA的噪音。双向方法为内容的两端生成IS数据，从而为减少潜在的假阳性检测错误提供了额外的机会。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
资助由美国国家卫生研究院R00-HL116234，U19 AI117941和R56 HL126544提供;国家科学基金会授予DMS-1516675;韩国国家研究基金会（NRF-2011-0030049，NRF-2014M3C9A3064552）;和KRIBB倡议计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
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