Summary
כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.
Abstract
מבחני אינטגרציית האתר (IS) הם מרכיב קריטי בחקר אתרי אינטגרציה רטרו-ויראליים ומשמעותם הביולוגית. במחקרים שנעשו לאחרונה על גנים רטרו-ויראליים, מבחני ה- IS, בשילוב עם רצף הדור הבא, שימשו ככלי למעקב תאים כדי לאפיין אוכלוסיות של תאי גזע משובטים החולקים את אותו ה- IS. לשם השוואה מדויקת של repopulating שיבוטים תא גזע בתוך דגימות שונות, זיהוי רגישות, שחזור נתונים, קיבולת תפוקה גבוהה של assay הן בין התכונות assay החשוב ביותר. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט ונתונים ניתוח עבודה עבור ניתוח דו כיוונית IS. Assay דו כיווני יכול במקביל רצף הן במעלה או במורד הזרם ווקטור מארח צמתים. בהשוואה גישות חד צדדית קונבנציונאלי IS רצף, הגישה דו כיוונית משפר באופן משמעותי את שיעורי גילוי ה- IS ואת אפיון של אירועים אינטגרציה בשני הקצוות של tהוא מכוון לדנ"א. צינור ניתוח הנתונים המתואר כאן מזהה ומזהה במדויק רצפים IS זהה באמצעות שלבים מרובים של השוואה כי מפת מסלולים IS על הגנום התייחסות ולקבוע שגיאות רצף. באמצעות הליך אופטימיזציה assay, יש לנו פירסם לאחרונה את דפוסי repopulation מפורט של אלפי שיבוט תאים גזעית hematopoietic (HSC) שיבוטים הבאים השתלה ב macacques rsus, מפגין בפעם הראשונה את נקודת הזמן המדויקת של HSC repopulation ואת ההטרוגניות תפקודית של HSCs ב מערכת הפרימטים. הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך הניסוי שלב אחר שלב ואת זרימת עבודה ניתוח נתונים המזהה ומזהה במדויק רצפים IS זהה.
Introduction
רטרווירוסים מכניסים את הדנ"א הגנומי שלהם לגנום המארח באתרים שונים. תכונה ייחודית זו, אשר עשויה לתרום להתפתחות סרטן וצורות אחרות של פתוגנזה ויראלית, יש יתרון אירוני של הפיכת וירוסים אלה מקובלות מאוד להנדסה סלולרית עבור טיפול גנטי ומחקר ביולוגי בסיסי. אתר האינטגרציה הנגיפי (IS) - המיקום על הגנום המארח שבו משולב דנ"א זר (וירוס) - יש השלכות חשובות על גורלם של הנגיפים המשולבים ושל התאים המארחים. מבחני ה- IS שימשו בהגדרות מחקר ביולוגיות וקליניות שונות על מנת לבחון את הבחירה באתר האינטגרציה הרטרו-ויראלית והפתוגנזה, התפתחות סרטן, ביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה התפתחותית 1 , 2 , 3 , 4 . רגישות נמוכה לזיהוי, שחזור נתונים לקוי, וזיהום צולב תכופים הם ביןהגורמים המרכזיים להגבלת היישומים של מבחני ה- IS למחקרים הנוכחיים והמתוכננים.
הרבה טכנולוגיות ניתוח IS פותחו. הגבלת אנזימים מבוססי מבחני אינטגרציה האתר, כולל קישור LM) פולימרז שרשרת התגובה (PCR) 5 , הפוך PCR 6 , ו-ליניארי הגברה- Mediated (LAM) PCR 7 , הם הנפוצים ביותר. עם זאת, השימוש באנזימי הגבלה ספציפיים לאתר, יוצר הטיה בזמן אחזור ה- IS, ומאפשר רק תת-קבוצה של אינטגרומים (DNA זר המשולב בגנום המארח) בקרבת אתר ההגבלה שיש לשחזר. טכנולוגיות Assay כי הערכה מקיפה יותר וקטור IS כבר הציג בשנים האחרונות. מבחני אלה להעסיק אסטרטגיות שונות, כולל מו טרנספוזון בתיווך PCR 8 , nonrrictive (nr) -LAM PCR 9 , סוג II הגבלת אנזים-מ 'עיבוד מעבדה 10 , גז מכני 11 , ו - PCR אקראיים מבוססי hexamer (Re-free PCR) 12 , לרסס DNAs גנומי ולהגדיל את ה- IS. הטכנולוגיות הנוכחיות יש רמות משתנות של רגישות זיהוי, כיסוי הגנום, ספציפיות היעד, קיבולת תפוקה גבוהה, המורכבות של הליכי assay, ואת הטיות בזיהוי התדרים היחסיים של אתרי היעד. בהתחשב בתכונות שונות של מבחני הקיימים מגוון של מטרות אשר ניתן להשתמש בהם, הגישה assay אופטימלי צריך להיות נבחר בקפידה.
עבודה זו מספקת נהלים ניסויים מפורט זרימת עבודה ניתוח נתונים חישובית עבור assay דו כיווני זה משפר באופן משמעותי את שיעורי גילוי ורמת כימות רצף על ידי ניתוח בו זמנית במעלה הזרם של הזרם של DNA משולב היעד (ראה איור 1 עבור תצוגה סכמטית של הליכי assay ). גישה זו גם לספק(לדוגמה, הנאמנות של שכפול אתר היעד ווריאציות ברצף הגנומי של הזרמות במעלה או במורד הזרם). שיטות דו-כיווניות אחרות שימשו בעיקר לשיבוט ולרצף של שני הקצוות של היעד DNA 11 , 13 , 14 . Assay זה מותאם באופן מיטבי עבור התפוקה גבוהה לשעתקו לשחזור של שיבוטים מסומנים וקטור, תוך שימוש בשיטת LM-PCR מבוססת היטב ומיפוי ניתוח חישובית, וכן לכימות שני צמתים במעלה או במורד. אנליזה דו-כיוונית עם האנזים TaqαI הוכיחה את עצמה עבור כימות גבוהה של התפוקה המשובצת בתאי גזע גזעניים מחקרים פרה-קליניים 2 , 15 . מאמר זה מתאר שיטה שונה באמצעות חותך תכופים יותר (RsaI / CviQI - מוטיב: GTAC), אשר מכפילההוא הסיכויים של גילוי integromes לעומת assay TaqαI מבוסס . ניסויים מפורטים וניתוח נתונים אשר משתמשים אנזימים מוטיב GTAC עבור lentiviral (NL4.3 ו נגזרותיה) ו גמא raterroviral (pMX וקטורים) וקטור IS ניתוח מתוארים. Oligonucleotides בשימוש assay המפורטים בטבלה 1 . סקריפט תכנות פנימי עבור ניתוח רצף IS מסופק במסמך המשלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יצירת Upstream (משמאל) - ו Downstream (מימין) -Junction רצף ספריות
- הכנה DNA מקשר:
- הכן 10 μL פתרון ה- DNA מקשר על ידי הוספת 2 μL של 100 מיקרומטר LINKER_A אוליגוס (הסופי: 20 מיקרומטר), 2 μL של 100 מיקרומטר LINKER_B אוליגוס (הסופי: 20 מיקרומטר), 2 μL של 5 M NaCl (סופי: 1M), ו 4 μL של מים nuclease ללא צינור PCR. ראה טבלה 1 עבור רצף הקישורים.
- דגירה הפתרון דנ"א מקשר ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות במכשיר PCR, לעצור את התוכנית להפעיל, ולהפוך את המכשיר לכבות את ה- PCR. השאירו את הפתרון מקשר במכשיר במשך 30 דקות לאט לאט לצנן את ה- DNA מקשר. פתרון ה- DNA מקשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.
- LTR ספציפית ביוטין-תחל הרחבה:
- השתמש ספקטרופוטומטר UV-Vis כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA ואת ערכי 260/280 ננומטר של הדנ"א הגנומי מ in vivoאו בניסויים חוץ גופית . לדלל 1-2 מיקרוגרם של דנ"א גנומי מדגם לנפח סופי של 170 μL של פתרון DNA גנומי באמצעות מים nuclease חינם.
- הכן 200 μL תגובה PCR על ידי ערבוב 2.5 μL כל אחד 10 מיקרומטר HIV-1 ספציפי ביוטין ביוטין (L-BPs ו- R-BPs בטבלה 1 : סך של 10 μL לארבעה primers ספציפיים lentivirus), 20 μL של 10X thermostable חיץ DNA פולימראז, 4 μL של 10 dNTPs mM (סופי: 200 מיקרומטר של כל dNTP), 3 μL של 2.5 U / μL פולימרז DNA thermostable, ו 163 μL של DNA גנומי.
הערה: עבור וקטורים gammaretroviral (וקטורים pMX), להשתמש 5 μL כל אחד משני 10 מיקרומטר pMX ספציפיים ביוטין primers (L-BP ו- R-BP: סך של 10 μL) במקום ארבעה HIV-1 ספציפי ביוטין primers לעיל. - מחלקים את הפתרון לתוך ארבע צינורות PCR (כל 50 μL) ולבצע מחזור הרחבה אחת בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 56 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 72 מעלות צלזיוס עבור 5דקות ו- 4 ° C לאחסון.
- בריכה כל ארבע תגובות PCR לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל ופעל הליך PCRE טיהור של ערכת טיהור PCR. Elute עם μL 50 של חיץ elution (5 פי לקפל מים elution מדולל בתנאי בערכה). מיד להמשיך עם שלב 1.3.1 או לאחסן את DNA eluted ב -20 מעלות צלזיוס.
- RSAI ו CviQI עיכול
- הכן תגובה 100 עיכול μL על ידי הוספת 50 μL של ה- DNA (משלב 1.2.4), 10 μL של חיץ 10x A, ו 2 μL (20 U) של אנזים RSAI. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR.
- הוסף 1 μL (10 U) של אנזים CviQI לתגובה ו דגירה על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במכשיר PCR. מיד עם שלב 1.4.1
- סיום בוטה:
- הכן תערובת 4.5-μL המכיל 2.5 μL של פולימרז DNA אני גדול (klenow) שבר ו 2 μL של 10 dNTPs mM. העברה 181 L של התערובת לדגימת DNA משלב 1.3.2. הנפח הכולל יהיה 102 μL. מערבבים היטב על ידי vortexing ו דגירה על 25 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR. מיד עם שלב 1.6.1.
- הכנת חרוזים streptavidin:
- מערבולת בקצרה את הפתרון חרוז streptavidin ולהעביר 50 μL לצינור חדש microcentrifuge 2 מ"ל. הסר את supernatant באמצעות מעמד מגנטי לשטוף את החרוזים עם 200 μL של פתרון מחייב.
- Resuspend את החרוזים μL 100 של פתרון מחייב ומניחים את הצינור מן הדוכן המגנטי. מיד עם שלב 1.6.1.
- Streptavidin חרוז חרוז:
- העברת 100 μL של דגימת מדגם (שלב 1.4.1) ל -100 μL מחדש מושעה פתרון חרוז (שלב 1.5.2) ומערבבים היטב על ידי pipetting, כדי למנוע הקצפה של הפתרון. דגירה הצינור בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות על גלגל מסתובב או רולר.
- השתמש במעמד המגנטי כדי ללכוד את החרוזים ולזנוח supernatant. לשטוף את החרוזים פעמיים μL 400 של פתרון כביסה פעמיים μL 400 של חיץ ליגז 1x T4 D4 (בדילול של פתרון 10X באמצעות מים nuclease חינם).
- Resuspend את החרוזים μL 200 של חיץ ליגז 1x T4 DNA (מדולל מ 10 X פתרון באמצעות מים nuclease חינם) ומניחים אותו מן הדוכן המגנטי. מיד עם שלב 1.7.1.
- לינקר קשירת:
- הכן פתרון μL 400 קשירת תגובה בצינור microcentrifuge 2 מ"ל על ידי ערבוב 0.5 μL של מקשר דנ"א (שלב 1.1.2), 10 μL של חיץ ליגה 10x T4 DNA, 20 μL של 5X T4 DNA חיץ ligase (המכיל פוליאתילן 25% גליקול), 5 μL של ליגז DNA T4, 164.5 μL של מים ללא nuclease, ו 200 μL של החרוזים מושעה מחדש (שלב 1.6.3). מניחים את צינור התגובה על גלגל מסתובב ו דגירה ב RT (22 מעלות צלזיוס) במשך 3 שעות (או 16 ° CO / N). שטפו את החרוזים פעמיים עם פתרון הכביסה פעמיים עם 1X thermromable DNA פולימרז חיץ (בדילול מ 10x פתרון באמצעות מים nuclease חינם) באמצעות מעמד מגנטי.
- Resuspend את החרוזים μL 50 של 1x thermromable DNA פולימרז חיץ PCR ומניחים אותו מן הדוכן המגנטי. מיד להמשיך עם שלב 1.8.1 או לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד יום אחד.
- טרום הגברה של הצומת מימין ומשמאל צומת DNA:
- הכן 200 μL תגובה PCR על ידי הוספת 10 μL של 10 מיקרומטר 1L- תחל, 10 μL של 10 מיקרומטר 1R-primer, 20 μL של 10 מיקרומטר קישור Primer (טבלה 1), 10 μL של חיץ 10X פולימרז thermostable DNA, 4 μL של 10 mM dNTPs (סופי: 200 מיקרומטר של כל dNTP), 8 μL (20 U) פולימרז DNA thermostable, ו 88 μL של מים nuclease חינם על חרוזים מושעה מחדש (50 μL) מ שלב 1.7.3.
- Aliquot תערובת התגובה לתוך 4 צינורות PCR (כל 501, L) ולבצע PCR עם המצב הבא: 94 ° C דגירה של 2 דקות; 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 20 s, 56 מעלות צלזיוס במשך 25 s, ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ו הארכה הסופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- בריכה כל 4 תגובות PCR לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל ופעל הליך טיהור PCR של ערכת טיהור PCR. Elute עם 50 μL של חיץ elution.
- קביעת ריכוז ה- DNA ו 260/280 ננומטר ערכים באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis; הדנ"א ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן לשלב הבא. המשך בצעדים 1.9.1 / 1.10.1 (אופציונלי) או ישירות עם צעדים 1.11.1 / 1.12.1.
- הסרת בצד שמאל DNA amplicon פנימי (אופציונלי):
- העברת עד 100 ng של מוצר ה- DNA PCR משלב 1.8.4 לצינור microcentrifuge 2 מ"ל ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 μL באמצעות מים nuclease ללא.
- הכן תגובה אנזים הגבלה במיוחד במיקוד השמאלי בצד שמאל DNA amplicon.
הערה: מצב התגובה עשוי להשתנות בהתאם לבחירה של האנזים. לדוגמה, בעת הסרת הדנ"א בצד השמאלי של NL4.3 מבוססי וקטורים lentiviral, להוסיף 1 μL של pvuII , 2 μL של חיץ B, ו 7 μL של מים ללא nuclease. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR. מיד עם שלב 1.11.1 או לאחסן ב -20 ° C.
- הסרת צד ימין DNA פנימי amplicon (אופציונלי):
- המשך כמו בשלב 1.9.1.
- הכן תגובה אנזים הגבלה במיקוד ספציפי בצד ימין DNA amplicon פנימי.
הערה: לדוגמה, בעת הסרת בצד ימין DNA פנימי מן NL4.3 מבוססי וקטורים lentiviral, להוסיף 1 μL של sfoI , 2 μL של חיץ B, ו 7 μL של מים ללא nuclease. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR. מיד להמשיך עם צעד 1.12.1 או לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- שמאלה- הגברה ספציפית:
- הכן תגובה 50 μL PCR על ידי ערבוב 5 μL של DNA מ צעד 1.8.4 (או מן שלב אופציונלי 1.9.2), 5 μL של 10 מיקרומטר 2L- תחל (הסופי: 1 מיקרומטר), 5 μL של 10 מיקרומטר תחל LINK2 (הסופי: 1 מיקרומטר), 5 μL של 10x חיץ DNA פולימרז thermostable, 1 μL של 10 dNTPs mM (סופי: 200 מיקרומטר של כל dNTP), 2 μL (5 U) של פולימרז DNA thermostable, ו 27 μL של nuclease ללא מַיִם.
- לבצע את PCR עם המצב הבא: 94 מעלות צלזיוס דגירה במשך 3 דקות; 8-15 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 20 s, 56 מעלות צלזיוס במשך 25 s, ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ו הארכה הסופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
הערה: DNA מוגבר עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. * אופטימיזציה מספר מחזור מוצע. - בצע את ההליך טיהור PCR של ערכת טיהור PCR. Elute עם 50 μL של חיץ elution. קביעת ריכוז ה- DNA ו 260/280 nm ערכים.
- כל הנהלים זהים ל"הגברה ספציפית של צומת שמאל "(שלבים 1.11.1-1.11.3), למעט שימוש בפרימרים שונים; להשתמש בצומת הימני ספציפי צומת (2R-primer, ראה טבלה 1 ) בשלב זה.
- ניתוח גרסאות אורך PCR amplicon ידי ביצוע אלקטרופורזה 2% agarose ג'ל או אלקטרופורזה נימי ( איור 2 ).
הערה: זהו צעד חיוני כדי לאשר את השלמת הליכי assay ולעשות הערכה גסה של דפוסי IS מבוסס על דפוסי הלהקה PCR. AMPlicon PCR מטוהרים מ 1.11.3 ו 1.12.3 ניתן להשתמש עבור פלטפורמות שונות רצף דנ"א. המשך בהליך הכנת המדגם המתאים לסיום שרשרת הסיום הקלאסית (סנגר) או לרצף הדור הבא. הדנ"א יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות; ג.
2. חישוב IS רצף ניתוח
- הכנת קבצי נתונים:
- הכן שלושה קבצי נתוני קלט: קובץ נתונים בפורמט רצף fasta (Test_data.fa בנתונים משלימים), קובץ tsv עבור מוטיבים לחיפוש עבור רצפים וקטוריים וקישורים (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv בנתונים משלימים) וקובץ tsv להגבלת מידע אנזימי (Enzyme.tsv נתונים משלימים).
הערה: קבצים אלה נדרשים עבור demultiplexing, זמירה וקטור רצפים מקשר, והסרה רצפים וקטור פנימיים ( איור 3 א ). הוראות מפורטות שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה החישובית מסופקות בקובץ README.txt בנתונים המשלימים.
- הכן שלושה קבצי נתוני קלט: קובץ נתונים בפורמט רצף fasta (Test_data.fa בנתונים משלימים), קובץ tsv עבור מוטיבים לחיפוש עבור רצפים וקטוריים וקישורים (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv בנתונים משלימים) וקובץ tsv להגבלת מידע אנזימי (Enzyme.tsv נתונים משלימים).
- ניתוח חישובי:
- הפעל demultiplexing ו זמירה סקריפטים.
הערה: רצף הגלם יעובד עבור demultiplexing ועל trimminG של וקטור, מקשר, רצפים תחל (ראה STEP-1 בקובץ README.txt משלים). - הפעל את הפקודה מיפוי (ראה STEP-2 בקובץ README.txt) כדי למפות את sequences מעובד על הגנום התייחסות באמצעות כלי יישור דמוי BLAST (BLAT, www.genome.ucsc.edu).
- הפעל את התסריט ניתוח כמותי IS (ראה STEP-3 בקובץ README.txt).
הערה: שני קבצי פלט (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt ו- Final_count.txt) ייווצרו. פרטים נוספים על אסטרטגיות מיפוי ורצף רצף ניתן למצוא בקובץ "README.txt בנתונים המשלימים ובפרסומים קודמים 2 , 15 .
- הפעל demultiplexing ו זמירה סקריפטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אסאי IS דו כיווני שנוצר בגדלים שונים של amplicons PCR עבור שניהם במעלה הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) וקטור מארח צמתים ( איור 2 ). הגודל של amplicon PCR תלוי במיקום של מוטיב GTAC הקרוב במעלה או במורד מהאינטגרמה. Assay גם המיוצר פנימי amplicons DNA DNA: רצפים retroviral ליד דרכי פוליפורין ואת האתר מחייב תחל היו מוגבר במקביל בעת שמאל PCR ימין ושמאל, בהתאמה. PCR amplicon להקות יכול להיות דמיינו ידי נימי או agarose (2%) אלקטרופורזה.
לאחר הרצף, ניתחו את רצף הצומת השמאלי והימני על-ידי סקריפט תכנות פנימי לעיבוד מראש של רצפים גולמיים (כולל demultiplexing ו- trimming וקטור DNA ו- linker), מיפוי סדרות IS על גבי הגנום, זיהוי וספירה של IS זההרצפים, ויישם הליכי תיקון השגיאה ( איור 3 ). מיקומים של 5'-end של רצפים שאילתה בגנום התייחסות נחשבים IS והם משמשים לספירה הראשונית של כל IS. הקריטריונים הקובעים את שני הרצפים התואמים - רצפי הצומת במעלה הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) שמקורם באותו אינטגרום - מבוססים על דפוסי רצף נוקליאוטידים של אינטגרציה מתואמת ספציפית של רטרו-וירוס, והם כדלקמן: (i) שני רצפים של צומת ישר על הגנום בכיוון ההפוך. (2) ה- IS של שני צמתים רצף מופרדים על ידי חפיפה 5-BP עבור נגיף איידס וירוס (HIV) וקטורים חפיפה 4-BP עבור וקטור לוקמיה מלמין (MLV) וקטורים. הראשון 5 BP של שני צמתים של HIV ו 4 BP של צמתים MLV הם משלימים לאחור.
ספירת רצף ה- IS נקבעת בשלושה שלבים: (1) מיפוי רצפי ה- IS על הגנוםבאמצעות BLAT, אשר מייצר את איכות המיפוי ומפריד רצפים IS בודדים לתוך "מכה אחת", "רב מכה", "לא פגע", "אחרים" קבוצות; (2) באמצעות כלי חיפוש מקומי יישור מקומי (BLAST) להשוות רצפים יחיד פגע עם רצפים אחרים ממופים suboptimally, כולל רב להיטים, ללא להיטים, ואחרים; ו (3) זיהוי ותיקון שגיאות רצף, כולל שגיאות homopolymer. Multi- פגע sequences הם רצפים IS שיכול ליישר שתי עמדות גנום או יותר עם ציון מיפוי גבוה. למרות שעדיין שימושית בזיהוי וכימות של אוכלוסיות משובצות, לא ניתן להשתמש ברצפים של מספר רב של התאמות לאפיון דפוסים של תפוצה גנומית של אתרי אינטגרציה (לדוגמה, קשר עם גנים, חזרות או תווים גנומיים אחרים). במקרים נדירים, שני רצפי הצומת מראים תכונות מיפוי שונות. לדוגמה, אחד מציג "להיט יחיד", בעוד הרצף תואם מראה "מרובה פגע". במקרים כאלה, שניהםרצפים מטופלים כמו "מכה אחת" רצפים.
חלק מרצפי ה- IS עם ציוני מיפוי תת-אופטימליים, המציגים התאמה גבוהה של גנום באחוזים (זהות) עם גודל שאילתה לא תקין (QSIZE), או להיפך, הופרדו מ"לא-להיטים "וקובצו ל"אחרים" לתוספת נוספת ולעתים קרובות ידנית הערכה מחדש. לדוגמה, בעת שימוש ב- BLAT עבור מיפוי הגנום, רצפי IS מסוימים עשויים להראות QSIZE לא נורמלי עקב נוקליאוטידים התואמים להחמצה ב- 5-10 נוקליאוטידים ראשונים או אחרונים. רצפים אלה לעתים קרובות אינם עומדים בקריטריונים המיפוי של "מכה אחת" או "מרובי פגע" מעמד, למרות שיש תוצאות מיפוי באיכות גבוהה יחסית.
קובץ נתוני רצף גולמי (Test_DATA.fa: 33,374 רצפים) וקבצי נתוני פלט לדוגמה מסופקים כנתונים משלימים. 1 מיקרוגרם של DNA גנומי מן תאים repopulating האדם, transduced עם מושאל Iviral וקטורים (FG12) במוח מוח העצם / כבד / תימוס (BLT) עכבר 17 , נותחו באמצעות assay דו כיווני. רטרו-ויראלי נמצא בכל הגנום. בדרך כלל, וקטורים lentiviral הם overrepresented בגנים, ואילו וקטורים גמא retroviral הם overrepresented באתרי שעתוק להתחיל 16 ( איור 4 ). משתי דגימות תאים של תאים אנושיים, סך של 1,081 רצפים - 851 מהמעלה (משמאל) ו -230 צמתים במורד הזרם (מימין) - הוסמכו כרצפי IS. מתוך אלה sequences, 93 ייחודי IS בצד שמאל ו 50 ייחודי IS בצמתים הזכות זוהו. מתוכם, 44 זוהו בשני צמתים (שמאל וימין), מראה סך של 99 integromes ייחודי בדגימות הבדיקה. IS מועשרים באופן משמעותי בגנים (66%, p <0.0001) בהשוואה לאירועים אקראיים ( איור 4 א ).
דוגמת גמא - רטרווירוס וקטור (pMX) רצפים באתר אינטגרציה כלולים גם בקובץ הנתונים הבדיקה.מדגם מעורב Pmx- מהונדסים תא, transduced עם pMX להביע Oct4, cMyc, Klf4, ו Sox2, 1,611 IS רצפים ו 129 ייחודי מתוך 65 ו- 76 ייחודיים שזוהו בצומת השמאלי והימני, בהתאמה, 12 היו בשני צמתים.הוכח בעבר כי amplicons PCR של ≥ 500 bp הם רצף גרוע בפלטפורמה pyrosequencing, בעוד amplicons PCR של <500 bp הם בדרך כלל היטב רצף, ללא הטיה בולטת לגבי אורכים רצף 15 . לפיכך, נתוני רצף מ- 500 pp amplicons PCR לא נכללו בהסרת הטיה של רצף האורך. רק נתונים מ <500 bp amplicon PCP (המוגדרים כאינטגרציה וקטורית ניתנת לכימות, או QVI) שימשו לניתוח קוונלי כמותי. תדירות זיהוי יחסית של אינטגרמה וקטוריתחושבו רק באמצעות רצף רצף של צמתים IS יצירת <500 pp amplicons PCR ( איור 4B -4D , גם לראות טבלה 2 ). כ 77% של הווקטורים ניתן ניתח כמותית על ידי אסטרטגיה זו ( איור 4 ב ). כתוצאה מכך, התדרים מחושב עבור כל QVI היו צפויים להעריך את התדרים האמיתיים במדגם ( איור 4E ) על ידי 1.25x.
איור 1: תצוגה סכמטית של ניתוח אתר דו-כיווני. דנ"א רטרו-ויראלי בעל גדילה כפולה (שחור ואדום), מוקף בדנ"א הסלולר (כחול). החצים מייצגים primers oligonucleotide, וחצים עם כוכבית מייצגים ביוטין primers. דנ"א לינקר מסומנים על ידי קווים סגולים. בקצרה, הרחבה ליניארית של שמאלביוטין primers (L-BP) ואת הזכות ביוטין primers (R-BP) מן ויראלי ארוך Terminal חוזר (LTR) מייצר biotinylated, פעמיים גדיל ה- DNA DNA. לאחר עיכול עם CviQI ו RSAI, DNA biotinylated פעמיים תקועים מועשרים באמצעות מחייב streptavidin-biotin ספציפיים והם ligated עם ה- DNA מקשר. Streptavidin- שנתפסו, מקשר ligated וקטור צומת דנ"א צומת מוגברים על ידי צעד שני PCR: הגברה מראש (הגברה של שני צמתים שמאל וימין) ואחריו שני PCRs מקוננים, כל המיקוד משמאל וימין צמתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נציג תמונה PCR Amplicon. ( א ) ניטור אלקטרופורזה נימי מראה אורכים משתנים של המגבר PCRליקויים באתרי וקטור lentiviral (FG12) אתרי אינטגרציה לאחר pvuII או sfoI . משתנה הלהקות PCR עבור הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) צומת מארח וקטור מוצגים. ראשי החץ הכהים מצביעים על הדופק הפנימי של דנ"א הדנ"א שנותר לאחר עיכול pvuII או sfoI. סמן ה- DNA גודל (0.1 - 2.5 kbp) הוא על נתיב M. ראשי החץ הפתוחים מציינים סמני יישור (15 & 5,000 bp). סמני יישור DNA משמשים לכיול של גרסת זמן ההגירה בכל הערוצים. ( B ) Gamma-retroviral (pMX) וקטור אתרי אינטגרציה שיבוטים תא Murine transduced עם מספר וקטורים pMX. דנ"א של ימין ושמאל צומת, כמו גם amplicons DNA פנימי וקטור (ראשי החץ), מוצגים. ראשי החץ כהה ופתוח מצביעים על דנ"א וקטור פנימי וסמני יישור, בהתאמה. סמן ה- DNA גודל (50-1,500 BP) הוא על נתיב M. פרטים על אלקטרופורזה נימית ניתן למצוא בחברהפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אינטגרציה ניתוח רצף האתר. ( א ) תרשים זרימה לניתוח נתונים חישוביים. שלושה קבצי נתונים, כולל קובץ רצף פורמט fasta, קובץ עם מוטיבים רצף התייחסות עבור demultiplexing ו זמירה, וכן קובץ עם אנזים מידע הגבלה, נדרשים. קבצים לדוגמה, כולל Test_DATA.fa (רצף נתונים), Demultiplexing_Trimming.tsv (מוטיבים רצף החיפוש), ואת Enzyme.tsv (הגבלת אנזים רצף הכרה), מסופקים כמו קבצי נתונים משלימים. רצפים מעובדים (רצף הגנום המארח) מחלק 1 ימופו כנגד ההפניה באמצעות BLAT. מיקומים ב 5'-end של שאילתת sequencEs בגנום הפניה נחשבים אתרי האינטגרציה ( טבלה 2 ). סדרי רצף עבור כל IS נקבעים בשלושה שלבים: (1) מיפוי IS רצפים על הגנום באמצעות BLAT; (2) השוואת רצפים IS יחיד פגע (יישור על אתר ייחודי של הגנום המארח) עם רצפים אחרים, כי היו ממופים אופטימלית על הגנום; ו (3) זיהוי ותיקון שגיאות רצף. פרטים נוספים על מיפוי ורצף אסטרטגיות רצף ניתן למצוא מחקרים קודמים 2 , 15 . ( BC ) שני מדגם חד גדילי DNA רצפים עבור במורד (B) ו במעלה (ג) וקטור מארח צמתים מוצגים. Pyrosequencing primers A ו- B (ירוק) משמשים טיפות PCR ו רצף. קודי הצבע מסכימים עם אלה בתרשים 1 . רצף הצומת במורד הזרם (B) כולל פריימר A (ירוק), MID (ירוק), וקטור U5 סוף (אדום), הגנום המארח (כחול), liNker (סגול), ו- Primer B (ירוק). ב רצף DNA מעורב (במעלה ומורד) רצף, פריימר A משמש רצף צמתים במורד הזרם (B), פריימר B משמש רצף את הצמתים במעלה הזרם. מדגם רצף הצומת במעלה (C) כולל פריימר B, MID, סוף וקטור U3, הגנום המארח, מקשר, פריימר א אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: דוגמה מייצגת של ניתוח אתר דו-כיווני. ( A ) אחוז האינטגרציה בגנים (refseq), Alu, LINE 1 (L1) חוזר על וקטורים lentiviral בתאי reopulating עכבר מאוננים (LV-huMice), בהשוואה ל- 10,000 אירועי אינטגרציה אקראית של סיליקו. אתרי אינטגרציה ממופיםעל הגנום האנושי (hg19). אתרי האינטגרציה LV-huMice מיוצגים באופן משמעותי בגנים ( p <0.0001, קירוב מרובע צ'י) ( ב ) בניתוח סיליקו של 10,000 אירועי אינטגרציה אקראית. עם גישה חד-כיוונית, כ -52% מהאינטרומים האקראיים יצרו אמפליקונים של PCR של <500 bp, ואילו בגישה דו-כיוונית, 77% יצרו אמפליקון PCR של <500 bp בצמתים הימניים או הימניים. PCR amplicons יותר מ 500 BP הם רצף ביעילות עם pyrosequencing platfor 2 , 15 ולכן צריך להיות נשלל מנתונים נתונים כמותיים. ( ג ) אסטרטגיה לכימות המשובטים. כל פרט לשכפל מניות אותו וקטור integrom (או IS). התדרים היחסיים של צמתים שמאל (x) ימני (y) משולבים לייצג את כמויות יחסית של אוכלוסיות משובטים (integromes וקטור לכמות, או QVI). אינטגרל אתרי קיצוב שאין להם מוטיב GTAC בתוך 450 bp פסולים (dQ) ומוסרים מניתוח כימות. ( D ) התדרים היחסיים (יחסית לכל הרצפים QVI) של 44 שיבוטים QVI בתאי reopulating עכברים אנושיים מוצגים ערכת צבעים (לבן לאדום: 0-1,16). ( E ) צפוי הערכה יתר של תדרים משובטים עם ניתוח כיווני. בהתבסס על סיליקון 10,000 ניתוח אינטגרציה אקראית, 1.25 פי הערכה מעל צפוי בעת שימוש אנזימים מוטיב GTAC ( RSAI ו CviQI ) בגלל כ 20% שיבוטים dQ. אומדן יתר של 2.56x צפוי בשל כ 60% שיבוטים dQ בעת שימוש אנזים מוטיב TCGA ( TaqαI ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Oad / 55812 / 55812table1.jpg "/>
טבלה 1: Oligonucleotides עבור Lentiviral ו- Gamma-retroviral וקטור אינטגרציה ניתוח האתר. * 5BioTEG: שינוי ביוטין בסוף 5 '. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של טבלה זו.
טבלה 2: נתונים מייצגים של נתוני ההכנסה באתר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של טבלה זו.
1 מפה: רצפים אינטגרציה האתר יכול להיות ממופה על מיקום ייחודי (מכה אחת) או מספר לוקוסים (רב מכה) של הגנום התייחסות. NA (לא זמין): לא זוהה רצף.
2 STRD: כיוון של רצף השאילתה בגנום
3 QLEN: אורך רצף השאילתות
4 GLEN: האורך הצפוי של רצף האינטגרציה באתר, מחושב על סמך המרחק בין מוטיב GTAC הקרוב ביותר בגנום לאתר ההכנסה. GLEN <450 bp מתקבלים לניתוחים כמותיים.
5 Total_Count: מספר הרצף הכולל
6 אתרי האינטגרציה מוצגים על ידי מספר כרומוזום (CHR) ומספר אתר עבור הצומת הימנית (CHR_SITE1) ומספר עבור הצומת השמאלי (CHR_SITE2). CHR_SITE1 ו CHR_SITE2 הם 5 bp בנפרד עבור וקטורים lentiviral ו 4 bp מלבד עבור MLV (pMX) וקטורים
7 רצף סעיפים עבור צומת ימין (R_A) ואת הצומת השמאלית של מדגם A (L_A); רצף עבור צומת ימין (R_B) ואת הצומת השמאלית של מדגם B (L_B)
* פסילה (dQ): GLEN ≥ 450 ב silico bp
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay דו כיווני מאפשר ניתוח סימולטני של שניהם במעלה הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) וקטור רצפים רצף DNA והוא שימושי במספר טיפולים גנטיים, תאי גזע, ויישומים מחקר סרטן. השימוש באנזימים של GTAC-Motif (RSAI ו- CviQI) וגישת ה- PCR הדו-כיוונית משפרת באופן משמעותי את הסיכוי לגילוי אינטגרום (או אוכלוסייה משובצת) בהשוואה לאבחונים קודמים של אנזים TCGA- Motif ( TaqαI ) , 2 , 15 ועוד חד כיווני LM-PCR מתקרב 5 . Assay דו כיווני משפר את הניתוח של IS, במיוחד בדגימות DNA מוגבל כי לעתים קרובות להתעורר במחקרים קליניים או בעלי חיים קטנים מודל.
צעדים 1.1-1.7 הם צעד קריטי צריך להיעשות ללא עיכובים מיותרים. השלבים האלה נעשים בדרך כלל ביום אחד. בדיקות אנזימים לפני הצעדים האלה מומלץ מאוד. שלבS 1.9 ו 1.10 הם אופציונליים. צעדים אלה יקטין רצפי DNA פנימיים וקטוריים אשר מוגבר יחד עם רצפים IS. טבלה 1 מספקת ערכות פריימר המתאימות לניתוח ה- IS של wildtype NL4.3 HIV-1, NL4.3 נגזרות נגזרות, כולל FG12 21 ו- pMX מבוססי וקטורים gammaretiral 22 . בהתאם וריאציות נוקליאוטידים ב רצף ארוך לחזור רצף (LTR) רצפים, עיצוב פריימר וגישה ניסיונית ייתכן שיהיה צורך שינוי נכון.
התוכנה blatt המשמש מיפוי תואם רק עם פורמט fasta ואינו עובד עם קבצי fastq. ניתן להמיר את קבצי fastq כדי fasta באמצעות כלי תוכנה שונים, כגון FASTX-Toolkit או BBTools. משתמש עם ידע בסיסי של python יכול להשתמש Biopython כדי להמיר את הקבצים fastq כדי fasta למיפוי אותם עם blat.
זה צפוי כי חלק של IS לא יזוהו עם דו כיוונית אניS assay, גם אם זוהה, לא יהיה זכאי לכימות המשוב במורד הזרם. כאשר אנזימים מוטיב GTAC שימשו, כ 23% של integromes בנתוני רצף שנוצר על ידי פלטפורמת pyrosequencing לא לעבור את הקריטריונים ניתוח ניתוח כמותי IS רצף ( איור 4 ). כאשר כיסוי IS מקיף הוא קריטי, למשל בניטור בטיחות של תאים מהונדסים גנטית בהגדרות טיפול גנטי, מומלץ לבחור assay עם גישה בלתי מוגבלת של גנום ל- IS 8 , 9 , 10 , 11 , 12 או כדי לנתח מחדש את אותו מדגם עם שילוב שונה או מותאם של הגבלות 4 , 18 .
הוא מבחני עם גישה הגנום ללא הגבלה, כגון לא מוגבל LAM PCR ו אקראי גזירה apprOache 19 , 20 , להחזיק בהבטחה מיוחדת עבור ניתוח מקיף של ה- IS. גישות אלה משתמשות בטכנולוגיות שקשה יחסית לשלוט בהן, מה שמקשה על ניבוי התוצאה של פיצול דנ"א גנומי והגברת ה- IS. מצד שני, מבחני IS באמצעות אנזימים הגבלה מאופיינים היטב יש שני יתרונות עיקריים: (1) זה יחסית קל לכייל אופטימיזציה מבחני, כי תוצאות assay הם צפויים יותר בשל הספציפיות של התגובה האנזים ואת הזמינות של התייחסות גנום sequences. (2) נתונים רצף הם לשחזור מאוד לאחר התנאים assay כבר אופטימיזציה. PCR דו כיוונית עם תנאים אופטימיזציה הוכיחה שימושי בקנה מידה גדול ומדויק כימות המשובטים 2 , 15 . למרות שרק חלק מהאוכלוסיות הקיימות נותחו עקב הטיה של אנזים הגבלה, כמויות האינדיבידואליות שיבוטים l נמדדו במדויק, ובכך מאפשר קביעת מדויקת של וריאציות גודל שיבוט בתוך דגימות ברחבי. מספר מספיק של שיבוטים נוצרו כדי לקבוע דפוסי התנהגות תאי גזע ו הטרוגניות תפקודית.
AMPlicons PCR המיוצר זה הליך PCR דו כיוונית מתאימים לכל פלטפורמת רצף במורד הזרם. בשל הרגישות הגבוהה של assay, יש להקפיד על מנת למנוע זיהום צולב על ידי ביצוע ניסויים בחדר ללא זיהום. הכללת ניסוי בקרה שלילית (ללא תבנית) מומלץ לכל שלבי PCR. גם עם הנוהג הזהיר ביותר, מניעת מדגם לדגימה זיהום צולבת קשה מאוד. לכן, כאשר משווים אוכלוסיות משובשות מדגימות שונות, מומלץ להשתמש בבקרת התנגשות, המסירה נתונים מזוהמים פוטנציאליים 23 , וכן ניתוק של תמלילים בעלי תדירות נמוכה, לא מהימנים> 2 על מנת למזער רעש מזיהום דנ"א מזוהם. הגישה הדו-כיוונית מייצרת נתוני IS בשני קצות האינטגרומים, ובכך מספקת הזדמנות נוספת לצמצום שגיאות גילוי פוטנציאליות שגויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המימון ניתן על ידי המוסדות הלאומיים לבריאות מענקים R00-HL116234, U19 A191141, R56 HL126544; הקרן הלאומית למדע גרנט DMS-1516675; הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); ואת תוכנית היוזמה KRIBB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
