Summary
この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。
Abstract
統合サイト（IS）アッセイは、レトロウイルスの組込み部位およびその生物学的意義の研究の重要な要素である。最近のレトロウイルス遺伝子治療研究において、ISアッセイは、次世代シークエンシングと組み合わせて、同じISを共有するクローン幹細胞集団を特徴付ける細胞追跡ツールとして用いられてきた。異なるサンプル内およびその間の再増殖幹細胞クローンの正確な比較のために、アッセイの検出感度、データ再現性およびハイスループット能力は、最も重要なアッセイ特性の1つである。この作業は、双方向IS解析のための詳細なプロトコルとデータ解析のワークフローを提供します。双方向アッセイは、上流および下流の両方のベクター - 宿主接合部を同時に配列決定することができる。従来の単方向ISシークエンス手法と比較して、双方向アプローチはIS検出速度を大幅に改善し、tの両端での統合事象の特徴付けを大幅に改善する彼はDNAを標的にする。ここに記載されているデータ解析パイプラインは、IS配列を参照ゲノム上にマッピングし、シークエンシングエラーを決定する複数の比較ステップを経て、同一のIS配列を正確に同定および列挙する。最適化されたアッセイ手順を使用して、近年、アカゲザルでの移植後に何千もの造血幹細胞（HSC）クローンの詳細な再増殖パターンを発表し、HSC再増殖の正確な時点およびHSCの機能的異種性を初めて示した。霊長類システム。以下のプロトコルは、同一のIS配列を正確に同定および定量する、段階的な実験手順およびデータ解析ワークフローを説明しています。
Introduction
レトロウイルスは、そのゲノムDNAを様々な部位の宿主ゲノムに挿入する。癌やその他のウイルス性病因の発生に寄与するこのユニークな特性は、これらのウイルスを遺伝子治療や基礎生物学研究のための細胞工学に非常に適したものにするという皮肉な利点があります。外来DNA（ウイルス）が組み込まれている宿主ゲノム上の場所であるウイルス統合サイト（IS）は、統合ウイルスと宿主細胞の両方の運命に重要な意味を持っています。 ISアッセイは、レトロウイルスの組込み部位の選択と病因、癌の発生、幹細胞の生物学、および発達生物学1,2,3,4を研究するために、様々な生物学的および臨床的研究環境で使用されてきた。低い検出感度、低いデータ再現性、頻繁な相互汚染は現在のおよび計画された研究へのISアッセイの適用を制限する重要な要因である。
多くのIS分析技術が開発されている。リンカー媒介（LM）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） 5 、逆PCR6、および線状増幅媒介（LAM）PCR7を含む制限酵素に基づく組込み部位アッセイが最も広く使用されている。しかしながら、部位特異的制限酵素の使用は、ISの回収中にバイアスを生成し、回収される制限部位の近傍の組込み体（宿主ゲノムに組み込まれた外来DNA）のサブセットのみを可能にする4 。近年、ベクターISをより包括的に評価するアッセイ技術も導入されている。これらのアッセイは、Muトランスポゾン媒介PCR8、非限定的（nr）-LAM PCR9、タイプII制限酵素-m（re-free PCR） 12を用いて 、ゲノムDNAを断片化し、ISを増幅させるために、遺伝子操作された消化10 、機械的せん断11 、およびランダムヘキサマーベースのPCR現在の技術は、検出感度、ゲノムカバレッジ、標的特異性、ハイスループット容量、アッセイ手順の複雑さ、および標的部位の相対頻度の検出における偏りのレベルが様々である。既存のアッセイの様々な性質およびそれらが使用され得る様々な目的が与えられた場合、最適なアッセイ手法を注意深く選択する必要があります。
この作業では、統合された標的DNAの上流および下流を同時に解析することにより、検出率および配列定量精度を大幅に向上させる双方向アッセイの詳細な実験手順および計算データ解析ワークフローを提供します（図1を参照） ）。このアプローチはまた、レトロウイルス組み込みプロセス（例えば、標的部位重複の忠実度および上流および下流挿入のゲノム配列の変動）を特徴付ける手段である。他の双方向法は、標的DNA11,13,14の両端をクローニングおよび配列決定するために主に使用されている。このアッセイは、十分に確立されたLM-PCR法および計算解析マッピングを使用し、上流および下流接合部の両方を定量するために、ベクター標識クローンのハイスループットおよび再現性のある定量化のために広く最適化されている。 TaqαI酵素による双方向分析は、幹細胞遺伝子治療前臨床試験における高スループットクローン定量化に有用であることが証明されている2,15 。本稿では、より頻繁に使用されるカッター（RsaI / CviQI - モチーフ：GTAC）を用いて、tTaqαIに基づくアッセイと比較してインテグロムを検出する可能性がある。レンチウイルス（NL4.3およびその誘導体）およびガンマ - レトロウイルス（pMXベクター）ベクターIS分析にGTACモチーフ酵素を用いる詳細な実験およびデータ解析手順が記載されている。アッセイに用いたオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。補遺資料には、IS配列解析のための社内プログラミングスクリプトが用意されています。
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Protocol
1.上流（左）および下流（右）接合配列ライブラリーの作製
- DNAリンカー調製：
- 100μMLINKER_Aオリゴ（最終：20μM）2μL、100μMLINKER_Bオリゴ（最終：20μM）2μL、5M NaCl（最終：1M）2μLを加えて10μLのリンカーDNA溶液を調製する。 PCRチューブ中に4μLのヌクレアーゼフリー水。リンカー配列については、 表1を参照してください。
- リンカーDNA溶液をPCR装置で95℃で5分間インキュベートし、実行プログラムを停止し、PCR装置の電源をオフにします。リンカー溶液を30分間機器に放置し、リンカーDNAをゆっくりと冷却します。リンカーDNA溶液は4℃で保存することができます。
- LTR特異的ビオチン - プライマー伸長：
- UV-Vis分光光度計を使用して、 インビボからのゲノムDNAのDNA濃度および260 / 280nm値を決定する。またはインビトロ実験を含む。 1〜2μgのサンプルゲノムDNAをヌクレアーゼフリーの水を使用してゲノムDNA溶液の最終容量170μLに希釈する。
- 10μMのHIV-1特異的ビオチンプライマー（ 表1の L-BPおよびR-BP：4つのレンチウイルス特異的プライマーの合計10μL）2.5μL、20μLの10X熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液、4μLの10mM dNTP（最終：200μMの各dNTP）、3μLの2.5U /μL熱安定性DNAポリメラーゼ、および163μLのゲノムDNAを含む。
注意：ガンマレトロウイルスベクター（pMXベクター）については、上記の4種類のHIV-1特異的ビオチンプライマーの代わりに2種類の10μMpMX特異的ビオチンプライマー（L-BPおよびR-BP：合計10μL）を5μLずつ使用してください。 - 溶液を4本のPCRチューブ（各50μL）に分け、94℃で5分間、56℃で3分間、72℃で5分間分、および保存のために4℃。
- すべての4つのPCR反応を2 mLのマイクロ遠心チューブにプールし、PCR精製キットのPCR精製手順に従います。 50μLの溶出緩衝液（キットに含まれている5倍の水で希釈した溶出緩衝液）で溶出する。直ちにステップ1.3.1に進み、溶出したDNAを-20℃で保存します。
- RsaIおよびCviQI消化
- 50μLのDNA（ステップ1.2.4）、10μLの10倍緩衝液A、および2μL（20U）のRsaI酵素を添加することにより、100μLの消化反応を準備する。 PCR装置で37℃で1時間インキュベートする。
- 反応に1μL（10U）のCviQI酵素を添加し、PCR装置で25℃で30分間インキュベートする。直ちにステップ1.4.1に進みます。
- ブラントエンディング：
- 2.5μLのDNAポリメラーゼIラージ（クレノウ）断片と2μLの10mM dNTPを含む4.5μL混合液を調製する。転送181; Lの混合物を、ステップ1.3.2のDNA試料と混合する。総容量は102μLになります。ボルテックスしてよく混合し、PCR装置で25℃で1時間インキュベートする。直ちにステップ1.6.1に進みます。
- ストレプトアビジンビーズの調製：
- ストレプトアビジンビーズ溶液を短時間ボルテックスし、50μLを新しい2mLマイクロ遠心チューブに移す。磁気スタンドを用いて上清を除去し、ビーズを結合溶液200μLで洗浄する。
- 100μLの結合溶液にビーズを再懸濁し、チューブを磁気スタンドから離して置きます。直ちにステップ1.6.1に進みます。
- ストレプトアビジンビーズ結合：
- 100μLのサンプルDNA（ステップ1.4.1）を100μLの再懸濁ビーズ溶液（ステップ1.5.2）に移し、ピペットで注意深く混合して溶液の発泡を避けます。チューブを回転ホイールまたはローラー上で室温で3時間インキュベートする。
- 磁気スタンドを使用してビーズを捕獲し、上清を捨てる。ビーズを400μLの洗浄液で2回洗浄し、400μLの1×T4 DNAリガーゼ緩衝液（ヌクレアーゼフリー水を用いて10倍溶液で希釈）で2回洗浄します。
- ビーズを1x T4 DNAリガーゼバッファー（ヌクレアーゼフリー水を使用して10倍溶液から希釈）200μLに再懸濁し、磁気スタンドから離して置きます。直ちにステップ1.7.1に進みます。
- リンカーライゲーション：
- 0.5μLのDNAリンカー（ステップ1.1.2）、10μLの10×T4DNAリガーゼバッファー、20μLの5×T4DNAリガーゼバッファー（25％のポリエチレンを含有する）を混合することにより、2mLのマイクロ遠心チューブ中で400μLの連結反応溶液を調製する。グリコール）、5μLのT4DNAリガーゼ、164.5μLのヌクレアーゼフリー水、および200μLの再懸濁したビーズ（工程1.6.3）を含む。反応チューブを回転ホイールに置き、RT（22℃）で3時間（または16℃/ N）インキュベートする。 ビーズを洗浄液で2回洗浄し、磁気スタンドを用いて1倍熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液（ヌクレアーゼフリー水を用いて10倍溶液から希釈）で2回洗浄する。
- ビーズを50μLの1×熱安定性DNAポリメラーゼPCRバッファーに再懸濁し、磁気スタンドから離して置きます。すぐにステップ1.8.1に進むか、4℃で1日まで保存します。
- 左と右の接合DNAの両方の前増幅：
- 10μLの1L-プライマー、10μLの1R-プライマー、20μLの10μMプライマーLink1（表1）、10μLの10X熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液、4μLのステップ1.7.3からの再懸濁したビーズ（50μL）に10mM dNTP（最終：各dNTP200μM）、8μL（20U）熱安定性DNAポリメラーゼ、および88μLのヌクレアーゼフリー水を添加する。
- 反応混合物を4つのPCRチューブ（それぞれ501; L）、以下の条件でPCRを行う：94℃2分間のインキュベーション; 94℃で20秒間、56℃で25秒間、および72℃で2分間を25サイクル;最終伸長は72℃で5分間行った。
- すべての4つのPCR反応を2 mLのマイクロ遠心チューブにプールし、PCR精製キットのPCR精製手順に従います。 50μLの溶出バッファーで溶出する。
- UV-Vis分光光度計を用いてDNA濃度および260 / 280nm値を決定する; DNAは次のステップの準備ができるまで-20℃で保存することができます。ステップ1.9.1 / 1.10.1（オプション）またはステップ1.11.1 / 1.12.1を使用して直接実行してください。
- 左側の内部DNAアンプリコンを取り外す（オプション）：
- ステップ1.8.4のPCR DNA産物100 ngを2 mLのマイクロ遠心チューブに移し、ヌクレアーゼフリーの水を使用して10μLに調整する。
- 左側の内部Dを特異的に標的とする制限酵素反応を調製するNAアンプリコン。
注：反応条件は、酵素の選択によって異なる場合があります。例えば、NL4.3ベースのレンチウイルスベクターから左側の内部DNAを除去する場合は、1μLのpvuII、2μLのバッファーB、および7μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。 PCR装置で37℃で1時間インキュベートする。直ちにステップ1.11.1を実行するか、-20℃で保存します。
- 右側の内部DNAアンプリコン（オプション）の取り外し：
- 手順1.9.1と同じ手順に進んでください。
- 右側の内部DNAアンプリコンを特異的に標的とする制限酵素反応を準備する。
注：例えば、NL4.3ベースのレンチウイルスベクターから右側の内部DNAを除去する場合は、1μLのsfoI 、2μLのバッファーB、および7μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。 PCR装置で37℃で1時間インキュベートする。直ちにステップ1.12.1に進むか、または-20℃で保存します。
- 左接合特異的増幅：
- ステップ1.8.4（またはオプションのステップ1.9.2）からの5μLのDNA、10μMの2Lプライマー（最終：1μM）5μL、10μMのプライマーLink2（1μM）の5μLを混合することにより50μLのPCR反応を調製する。 （最終：1μM）、5μLの10×熱安定性DNAポリメラーゼ緩衝液、1μLの10mM dNTP（最終：200μMの各dNTP）、2μL（5U）の熱安定性DNAポリメラーゼ、および27μLのヌクレアーゼフリー水。
- 次の条件でPCRを行う：94℃で3分間インキュベートする; 94℃で20秒間、56℃で25秒間、および72℃で2分間の8~15サイクル;最終伸長は72℃で5分間行った。
注：増幅されたDNAは-20℃で保存することができます。 *サイクル数の最適化が推奨されます。 - PCR精製キットのPCR精製手順に従ってください。 50μLの溶出バッファーで溶出する。 DNA濃度と260 / 280nm値を決定する。
- 異なるプライマーの使用を除いて、すべての手順は「左接合特異的増幅」（ステップ1.11.1-1.11.3）と同一です。このステップで右接合特異的プライマー（2Rプライマー、 表1参照）を使用する。
- 2％アガロースゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を行うことによってPCRアンプリコンの長さの変動を分析する（ 図2 ）。
注：これは、アッセイ手順の完了を確認し、PCRバンドパターンに基づいてISパターンの大まかな評価を行うために不可欠なステップです。ステップ1.11.3および1.12.3から精製されたPCRアンプリコンは、様々なDNAシーケンシングプラットフォームに使用できます。古典的なチェーンターミネーション（Sanger）シーケンシングまたは次世代シーケンシングのための適切なサンプル調製手順に進みます。 DNAは-20°で保存することができます; C。
2.計算ISシーケンス分析
- データファイルの準備：
- fasta形式の配列データファイル（補足データのTest_data.fa）、ベクターおよびリンカー配列の検索モチーフ用のtsvファイル（補足データのDemultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv）、および制限酵素情報のためのtsvファイルの3つの入力データファイルを準備する（補充データ中の酵素.tsv）。
注：これらのファイルは、逆多重化、ベクターおよびリンカー配列のトリミング、および内部ベクター配列の除去に必要です（ 図3A ）。計算ワークフローを実装するための詳細な手順は、補足データのREADME.txtファイルに記載されています。
- fasta形式の配列データファイル（補足データのTest_data.fa）、ベクターおよびリンカー配列の検索モチーフ用のtsvファイル（補足データのDemultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv）、および制限酵素情報のためのtsvファイルの3つの入力データファイルを準備する（補充データ中の酵素.tsv）。
- 計算分析：
- デマルチプレクスとトリミングスクリプトを実行します。
注：生のシーケンスは、逆多重化とトリムミンのために処理されますgのベクター、リンカーおよびプライマー配列（補足README.txtファイルのSTEP-1を参照）。 - BLAST様アライメントツール（BLAT; www.genome.ucsc.edu）を使用して、処理された配列を参照ゲノムにマッピングするために、マッピングコマンド（README.txtファイルのSTEP-2を参照）を実行する。
- 定量的IS解析スクリプトを実行します（README.txtファイルのSTEP-3を参照）。
注：2つの出力ファイル（Initial_count_without_homopolymer_correction.txtとFinal_count.txt）が生成されます。マッピングおよびシーケンス列挙戦略の詳細は、補足データのREADME.txtファイルおよび以前の刊行物2,15に記載されています。
- デマルチプレクスとトリミングスクリプトを実行します。
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Representative Results
双方向ISアッセイは、上流（左）および下流（右）ベクター宿主接合部（ 図2 ）の両方について、異なるサイズのPCRアンプリコンを生成した。 PCRアンプリコンのサイズは、インテグロムの上流および下流の最も近いGTACモチーフの位置に依存する。このアッセイはまた、内部DNA PCRアンプリコンを産生した：ポリプリン管の近くのレトロウイルス配列およびプライマー結合部位は、それぞれ、左および右接合PCRの間に同時に増幅された。 PCRアンプリコンバンドは、キャピラリー電気泳動またはアガロース（2％）電気泳動によって視覚化することができます。
配列決定の後、左および右ジャンクション配列の両方を、生の配列（逆多重化およびトリミングベクターおよびリンカーDNAを含む）の前処理、IS配列のゲノムへのマッピング、同一のISの同定および計数のための社内プログラミングスクリプトシーケンス、および誤り訂正手順の適用（ 図3 ）。参照ゲノム中のクエリー配列の5 '末端の位置は、ISとみなされ、各ISの初期カウントに使用される。 2つの一致配列 - 同一インテグラムから生じる上流（左）および下流（右）接合配列 - を決定する基準は、レトロウイルス特異的協調統合のヌクレオチド配列パターンに基づいており、以下の通りである：（i）2つの接合配列反対方向のゲノム上に整列する。 （ii）2つの接合配列のISは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）ベクターについては5bpの重複によって、マウス白血病ウイルス（MLV）ベクターについては4bpの重複によって分離される。 HIVの2つの接合部の最初の5 bpと4 bpのMLV接合部は、逆相補的である。
IS配列カウントは3つのステップで決定される：（1）IS配列をゲノムにマッピングするマッピング品質を生成し、個々のIS配列を「シングルヒット」、「マルチヒット」、「ノーヒット」および「その他」のグループに分けるBLATを使用する。 （2）BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて、シングルヒット配列と他の準最適マップ配列（マルチヒット、ノットヒットなど）を比較する。 （3）ホモポリマーエラーを含むシークエンシングエラーの特定および修正。マルチヒット配列は、2つ以上のゲノム位置を高いマッピングスコアで整列させることができるIS配列である。クローン集団を同定および定量するために依然として有用であるが、マルチヒット配列は、ゲノム統合部位分布パターン（例えば、遺伝子、反復または他のゲノム文字との関連）を特徴付けるために使用することはできない。まれに、2つの接合シーケンスが異なるマッピング品質を示します。たとえば、「シングルヒット」が表示され、一致するシーケンスに「マルチヒット」が表示されます。このような場合、両方配列は「シングルヒット」配列として扱われる。
異常なクエリーサイズ（QSIZE）との高いパーセントゲノムマッチング（同一性）、またはその逆を示す準最適なマッピングスコアを有するIS配列の一部は、「ヒットなし」から分離され、追加および頻繁に「他の」に分類された手動による再評価。例えば、ゲノムマッピングにBLATを使用する場合、いくつかのIS配列は、最初または最後の5〜10ヌクレオチドのミスマッチヌクレオチドのために異常なQSIZEを示すことがある。これらのシーケンスは、比較的高品質のマッピング結果を有するにもかかわらず、「シングルヒット」または「マルチヒット」ステータスのマッピング基準を満たしていないことが多い。
サンプルの生シーケンスデータファイル（Test_DATA.fa：33,374シーケンス）とサンプル出力データファイルが補足データとして提供されます。ヒト再増殖細胞由来のゲノムDNA1μg、レンチで形質導入ヒト化骨髄/肝臓/胸腺（BLT）マウス17における二量体ベクター（FG12）を、双方向アッセイを用いて分析した。レトロウイルスのISはゲノム全体に見出された。典型的には、レンチウイルスベクターは遺伝子において過剰発現されるが、γ-レトロウイルスベクターは転写開始部位16において過剰発現される（ 図4 ）。 2つのヒト再増殖細胞試料から、上流（左）および下流（右）接合部から合計1,081の配列-851がIS配列として認定された。これらの配列から、左側の93個のユニークなISと右側の接合部の50個のユニークなISが同定された。これらのうち44個が両方の（左右の）接合部で同定され、試験サンプル中に合計99個のユニークな組み込みを示した。 ISは、ランダム事象と比較して遺伝子（66％、 p <0.0001）が有意に富化されている（ 図4A ）。
Oct4、cMyc、Klf4、およびSox2を発現するpMXで形質導入された混合Pmx操作細胞サンプルからは、1,611のIS配列およびユニークな129個の配列が、試験データファイルに含まれていますISが同定された。左右の接合部でそれぞれ65個と76個の固有のISが同定され、12個が両方の接合部にあった。500bp以上のPCRアンプリコンは、パイロシーケンシングプラットフォームではほとんど配列が決定されないが、<500bpのPCRアンプリコンは、一般的に配列長が15であることを除いてよく配列決定されていることが示されている。したがって、500bp以上のPCRアンプリコン由来の配列データを除外して、長さ関連配列決定バイアスを除去した。 <500bpのPCRアンプリコン（定量化可能なベクターインテグロムまたはQVIと呼ばれる）からのデータのみを定量的クローン分析に使用した。ベクトル積分の相対的な検出頻度500bp未満のPCRアンプリコンを生成するIS接合部の配列カウントのみを用いて計算した（ 図 4B〜4D; 表2も参照のこと）。ベクターの約77％をこの戦略によって定量分析することができた（ 図4B ）。その結果、各QVIの計算された周波数は、サンプル（ 図4E ）の真の周波数を1.25倍過大評価することが予想された。
図1：双方向統合サイト分析の概略図細胞DNA（青色）に隣接する二本鎖レトロウイルスDNA（黒および赤）が示される。矢印はオリゴヌクレオチドプライマーを表し、アスタリスクの付いた矢印はビオチンプライマーを表す。リンカーDNAは紫色の線で示されています。簡単に説明すると、左ウイルスのLong Terminal Repeat（LTR）由来のビオチンプライマー（L-BP）および右ビオチンプライマー（R-BP）は、ビオチン化二本鎖IS DNAを生成する。 CviQIおよびRsaIで消化した後、ビオチン化二本鎖DNAをストレプトアビジン - ビオチン特異的結合を用いて濃縮し、リンカーDNAと連結する。ストレプトアビジン捕捉されたリンカー結合ベクター - 宿主接合DNAは、2段階PCR：前増幅（左右の接合部の増幅）、続いてそれぞれ2回の入れ子状のPCR（左と右の接合部を標的とする）によって増幅される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：代表的なPCRアンプリコン画像。 （ A ）キャピラリー電気泳動分析は、PCRアンプpvuIIまたはsfoI消化後のレンチウイルスベクター（FG12）組み込み部位のライコン。上流（左）および下流（右）ベクター宿主接合部についての様々なPCRバンドが示されている。暗い矢印の頭部は、pvuIIまたはsfoI消化後に残る内部ベクターDNAアンプリコンを示す。 DNAサイズマーカー（0.1〜2.5kbp）はMレーン上にある。白抜きの矢印は、アライメントマーカー（15＆5,000 bp）を示しています。 DNAアライメントマーカーは、すべてのチャネルにわたる移動時間変動の較正のために使用される。 （ B ）複数のpMXベクターを形質導入したマウス細胞クローンのガンマ - レトロウイルス（pMX）ベクター組み込み部位。左および右ジャンクションDNAならびに内部ベクターDNAアンプリコン（矢頭）が示されている。暗い矢印および開いた矢印の頭部は、それぞれ、内部ベクターDNAおよびアライメントマーカーを示す。 DNAサイズマーカー（50-1,500 bp）はMレーン上にある。キャピラリー電気泳動の詳細は、同社で見つけることができますプロトコル。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：統合サイトシーケンス分析。 （ A ）計算データ解析のフローチャート。 fasta形式のシークエンスファイル、デマルチプレクスおよびトリミングのための参照配列モチーフを含むファイル、および制限酵素情報を含むファイルの3つのデータファイルが必要です。 Test_DATA.fa（配列データ）、Demultiplexing_Trimming.tsv（検索配列モチーフ）、Enzyme.tsv（制限酵素認識配列）などのサンプルファイルが補足データファイルとして提供されています。パート1の処理された配列（宿主 - ゲノム配列）は、BLATを用いて参照に対してマッピングされる。クエリー配列の5 '末端の位置参照ゲノム中のesは、組み込み部位であると考えられる（ 表2 ）。各ISの配列カウントは、3つのステップで決定される：（1）BLATを用いてIS配列をゲノムにマッピングする。 （2）単一ヒットのIS配列（宿主ゲノムのユニークな部位上に整列する）をゲノムに準最適にマッピングされた他の配列と比較する; （3）シーケンシングエラーの特定と修正。マッピングおよび配列列挙戦略の詳細は、以前の研究2、15に記載されています。 （ BC ）下流（B）および上流（C）ベクター - 宿主接合の2つのサンプル一本鎖DNA配列が示されている。ピロシークエンシングプライマーAおよびB（緑色）は、液滴PCRおよび配列決定に使用される。カラーコードは図1のものと一致します。サンプル下流接合配列（B）は、プライマーA（緑）、MID（緑）、ベクターU5末端（赤）、宿主ゲノム（青）、linker（紫色）、およびプライマーB（緑色）。混合（上流および下流）DNA配列決定において、プライマーAは下流接合部（B）の配列決定に使用され、プライマーBは上流接合部の配列決定に使用される。サンプルアップストリーム接合配列（C）は、プライマーB、MID、ベクターU3末端、宿主ゲノム、リンカーおよびプライマーAを含む。 この図のより大きなバージョンを見るためにここをクリックしてください。
図4：双方向統合サイト分析の代表的な例 （ A ）ヒト化マウス再増殖細胞（LV-huMice）におけるレンチウイルスベクターのGenes（refseq）、Alu、およびLINE1（L1）反復におけるインテグレーションの百分率。統合サイトがマップされているヒトゲノム（hg19）に導入する。 LV-huMiceの組込み部位は、遺伝子で有意に過剰発現している（ p <0.0001、カイ二乗近似）（ B ）10,000個のランダムな組込み事象のインシリコ分析。単方向アプローチでは、ランダムインテグラムの約52％がPCRアンプリコンを500bp未満で生成し、一方、双方向アプローチでは77％がPCRアンプリコンを生成した。 500bpより長いPCRアンプリコンは、パイロシーケンシングプラトーでは非効率的に配列されているため、定量的データ解析から除外されるべきである。 （ C ）クローン定量のための戦略。個々のクローンは、同じベクトルインテグラム（またはIS）を共有します。左（x）および右（y）接合の相対頻度は、クローン集団の相対量（定量化可能なベクターインテグロムまたはQVI）を表すために組み合わされる。 Integ 450bp以内にGTACモチーフを持たない飼育場は不適合（dQ）であり、定量分析から除外される。 （ D ）細胞を再増殖させるヒト化マウスの44個のQVIクローンの相対頻度（全てのQVI配列と比較して）を配色（白から赤へ：0〜0.16）で示す。 （ E ）双方向分析によるクローン頻度の過剰推定が予想される。 in silico 10,000のランダム統合解析に基づいて、約20％のdQクローンのためにGTACモチーフ酵素（ RsaIおよびCviQI ）を使用すると、1.25倍の過剰推定が予想される。 TCGAモチーフ酵素（ TaqαI ）を使用した場合、約60％のdQクローンのために2.56倍の過剰推定が予想される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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表1：レンチウイルスおよびガンマ - レトロウイルスベクター組込み部位分析のためのオリゴヌクレオチド。 * 5BioTEG：5 '末端のビオチン修飾。 この表のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表2：代表的な挿入部位配列カウントデータ。 この表のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1マップ：インテグレーションサイト配列は、参照ゲノムのユニークな場所（シングルヒット）または複数の遺伝子座（マルチヒット）にマッピングすることができます。 NA（not available）：配列が検出されなかった。
2 STRD：ゲノム中のクエリー配列の向き
3 QLEN：クエリシーケンスの長さ
4 GLEN：ゲノム中の最も近い利用可能なGTACモチーフから挿入部位までの距離に基づいて計算された、組み込み部位配列の予想される長さ。 GLEN <450 bpは定量分析のために受け入れられる。
5 Total_Count：合計シーケンス数
6統合サイトは、染色体番号（CHR）と右接合部のサイト番号（CHR_SITE1）と左接合部の番号（CHR_SITE2）で示されます。 CHR_SITE1およびCHR_SITE2は、レンチウイルスベクターで5 bp離れており、MLV（pMX）ベクターで4 bp離れている
7サンプルA（L_A）の右ジャンクション（R_A）と左ジャンクションのシーケンスカウント。 （R_B）とサンプルB（L_B）の左ジャンクションのシーケンスカウントは、
*失格（dQ）：GLEN≧450 in silico bp
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Discussion
双方向アッセイは、上流（左）および下流（右）の両方のベクター - 宿主DNA接合配列の同時分析を可能にし、遺伝子治療、幹細胞および癌研究の多くの用途において有用である。 GTACモチーフ酵素（RsaIおよびCviQI）および双方向PCR法を用いることにより、以前のTCGAモチーフ酵素（ TaqαI ）に基づくアッセイ2,15および他のものと比較して、インテグラム（またはクローン集団）を検出する機会が有意に改善される一方向性LM-PCRは5に近づく。双方向アッセイは、特に臨床または小動物モデル研究でしばしば生じる限られたDNAサンプルにおいて、ISの分析を改善する。
ステップ1.1-1.7は重要なステップであり、不要な遅延なしに実行する必要があります。これらのステップは通常1日で実行されます。これらのステップの前に酵素を試験することが強く推奨されます。ステップ1.9および1.10はオプションです。これらの工程は、IS配列で付随して増幅される内部ベクターDNA配列を減少させる。 表 1は、野生型NL4.3 HIV-1、NL4.3由来ベクター（FG12 21およびpMXベースのガンマレトロウイルスベクター22を含む）のISを分析するのに適したプライマーセットを提供する。長い末端反復配列（LTR）のヌクレオチド変異に依存して、プライマー設計および実験的アプローチは適切な改変を必要とし得る。
マッピングに使用されるblatソフトウェアはfasta形式とのみ互換性があり、fastqファイルでは機能しません。 fastqファイルをfastaに変換するには、FASTX-ToolkitやBBToolsなどのさまざまなソフトウェアツールを使用します。 Pythonの基本知識を持つユーザーは、Biopythonを使用してfastqファイルをfastaファイルに変換し、blatでそれらをマッピングすることができます。
ISの一部は、双方向Iで検出されないことが予想されるSアッセイであり、検出されたとしても、下流のクローン定量には適格ではない。 GTAC-モチーフ酵素を使用した場合、パイロシーケンシングプラットフォームにより生成された配列データ中のインテグロムの約23％は、定量的IS配列分析の分析基準を通過しなかった（ 図4 ）。包括的ISカバレッジが重要である場合、例えば遺伝子治療環境における遺伝子操作された細胞の安全性モニタリングでは、IS 8,9,10,11,12に無制限のゲノムアクセスがあるアッセイを選択することが推奨されます。制限酵素4 または 18の異なるまたは最適化された組み合わせを有する同じ試料。
無制限のLAM PCRやランダムシャーリングなどの非制限的なゲノムアクセスによるISアッセイoaches 19,20 は、包括的なIS分析のために特に有望である。これらのアプローチは、制御が比較的困難な技術を使用しており、ゲノムDNA断片化およびIS増幅の結果を予測することを困難にしている。一方、よく特徴付けられた制限酵素を用いたISアッセイには2つの大きなメリットがあります：（1）アッセイの結果が酵素反応の特異性と利用可能性により予測可能であるため、アッセイのキャリブレーションと最適化が比較的容易です。参照ゲノム配列。 （2）アッセイ条件が最適化されたら、配列データは非常に再現性がある。最適化された条件での双方向PCRは、大規模かつ正確なクローン定量に有用であることが証明されている2,15。既存のクローン集団の一部のみが制限酵素の偏りのために分析されているが、個体数 lクローンが正確に測定され、それによりサンプル中およびクローンサイズ変動の正確な決定が可能になる。十分な数のクローンが、幹細胞の行動パターンおよび機能的異種性を決定するために生成された。
この双方向PCR手順から製造されたPCRアンプリコンは、任意の下流の配列決定プラットフォームに適している。アッセイの感度が高いため、汚染のない部屋で実験を行うことにより交差汚染を防止するために最大限の注意を払う必要があります。全てのPCR工程について、ネガティブ（テンプレートなし）対照実験を含めることが推奨される。最も慎重に実施しても、サンプル間のクロスコンタミネーションを防ぐことは非常に困難です。したがって、異なるサンプル由来のクローン集団を比較する場合、潜在的に汚染されたデータ23を除去する衝突制御、および低頻度の信頼性の低いクローンのカットオフを使用することが推奨される> 2であり、交差汚染されたDNAからのノイズを最小にする。双方向アプローチは、インテグロムの両端にISデータを生成するため、誤検出の可能性のあるエラーを減らす機会がさらに増えます。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
資金提供は、国立衛生研究所R00-HL116234、U19 AI117941、およびR56 HL126544によって提供された。国立科学財団グラントDMS-1516675;韓国国立研究財団（NRF-2011-0030049、NRF-2014M3C9A3064552）; KRIBBイニシアチブ・プログラムを発表しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
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