Summary
Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.
Abstract
Integratie Site (IS) analyses zijn een kritisch onderdeel van de studie van retrovirale integratie sites en hun biologische betekenis. In recente retrovirale gentherapie studies zijn IS-assays, in combinatie met sequentie van volgende generatie, gebruikt als een cel-tracking tool om clonale stamcelpopulaties te identificeren die dezelfde IS delen. Voor de nauwkeurige vergelijking van repopulerende stamcelklonen binnen en over verschillende monsters, zijn de detectiegevoeligheid, data reproduceerbaarheid en hoge doorvoercapaciteit van de assay een van de belangrijkste analysekwaliteiten. Dit werk biedt een gedetailleerd protocol- en data-analyse workflow voor bidirectionele IS analyse. De bidirectionele assay kan tegelijkertijd zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse vector-gastheerverbindingen ordenen. Vergeleken met conventionele unidirectionele IS sequencing benaderingen, verbetert de bidirectionele aanpak de detectiesnelheden van IS en de karakterisering van integratie gebeurtenissen aan beide einden van tHij richt zich op DNA. De hier beschreven gegevensanalysepijplijn identificeert en noemt identieke IS-sequenties door meerdere stappen van vergelijking die de kaart IS sequenties op het referentiegenoom en sequentiefouten bepalen. Met behulp van een geoptimaliseerde testprocedure hebben we onlangs de gedetailleerde repopulatiepatronen van duizenden Hematopoietische Stamcellen (HSC) klonen gepubliceerd na transplantatie in rhesus macaques, die voor het eerst het exacte tijdspunt van HSC-repopulatie en de functionele heterogeniteit van HSC's in de Primaat systeem. Het volgende protocol beschrijft de stap-voor-stap experimentele procedure en data-analyse workflow die identieke IS sequenties nauwkeurig identificeert en kwantificeert.
Introduction
Retrovirussen zetten hun genomische DNA in het gastheergenoom op verschillende plaatsen in. Deze unieke eigenschap, die kan bijdragen tot de ontwikkeling van kanker en andere vormen van virale pathogenese, heeft het ironische voordeel dat deze virussen zeer toegankelijk zijn voor cellulaire engineering voor gentherapie en basisbiologisch onderzoek. De virale integratieplaats (IS) - de locatie op het gastheergenoom waarin een vreemd DNA (virus) is geïntegreerd - heeft belangrijke implicaties voor het lot van zowel de geïntegreerde virussen als de gastheercellen. IS-analyses zijn gebruikt in verschillende biologische en klinische onderzoeksinstellingen om retrovirale integratie site selectie en pathogenese, kankerontwikkeling, stamcelbiologie en ontwikkelingsbiologie 1 , 2 , 3 , 4 te bestuderen. Geringe detectie gevoeligheid, slechte data reproduceerbaarheid, en frequente cross-contaminatie zijn onderDe belangrijkste factoren die de toepassingen van IS-analyses beperken tot huidige en geplande studies.
Er zijn veel IS-analysetechnologieën ontwikkeld. Restrictie-enzym gebaseerde integratie site assays, waaronder Linker-Gemedieerde (LM) Polymerase Chain Reaction (PCR) 5 , inverse PCR 6 en Lineaire Amplification-Gemedieerde (LAM) PCR 7 , zijn het meest gebruikt. Het gebruik van plaatsspecifieke restrictie-enzymen genereert echter een voorspanning tijdens het ophalen van de IS, waardoor slechts een subset van integrogen (een vreemd DNA geïntegreerd in het gastheergenoom) in de nabijheid van de te herstellen restrictieplaats 4 wordt verkregen. Analyse technologieën die vector IS meer grondig beoordelen zijn ook in de afgelopen jaren geïntroduceerd. Deze assays gebruiken verschillende strategieën, waaronder Mu transposon-gemedieerde PCR 8 , nonrestrictive (nr) -LAM PCR 9 , type II-restrictie-enzym-mBewerkte spijsvertering 10 , mechanische afscheiding 11 en willekeurige hexamer-gebaseerde PCR (Re-free PCR) 12 , om genomische DNA's te fragmenteren en IS te amplificeren. Huidige technologieën hebben verschillende niveaus van detectiegevoeligheid, genoomdekking, doelspecifieke eigenschappen, hoge doorstroomcapaciteit, complexiteit van testprocedures en voorspellingen bij het detecteren van de relatieve frequenties van doelwitplaatsen. Gezien de verschillende kwaliteiten van de bestaande analyses en de verschillende doeleinden waarvoor ze kunnen worden gebruikt, moet de optimale assayaanpak nauwkeurig worden geselecteerd.
Dit werk bevat gedetailleerde experimentele procedures en een computergegevensanalyse-workflow voor een bidirectionele analyse die de detectiesnelheden en sequentiekwantificatierugtheden aanzienlijk verbetert door tegelijkertijd de IS stroomopwaarts en stroomafwaarts van het geïntegreerde doel DNA te analyseren (zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de analyseprocedures ). Deze aanpak biedt ookS zijn de middelen om het retrovirale integratieproces te karakteriseren (bijvoorbeeld de getrouwheid van de duplicatie van de doelplaats en variaties in de genomische sequenties van stroomopwaartse en stroomafwaartse invoegingen). Andere bidirectionele methoden zijn voornamelijk gebruikt voor het klonen en sequenties van beide uiteinden van het doel DNA 11 , 13 , 14 . Deze analyse is uitgebreid geoptimaliseerd voor de hoge doorvoer en reproduceerbare kwantificering van vectorgemarkeerde klonen, met behulp van de goed gevestigde LM-PCR-methode en berekeningsanalyse-mapping, en voor het kwantificeren van zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse verbindingen. Biregionale analyse met het TaqαI- enzym heeft bewezen bruikbaar voor high-throughput clonale kwantificering in preklinische studies 2 , 15 van stamcellen gentherapie. Dit papier beschrijft een gewijzigde methode met een meer frequente snijder (RsaI / CviQI - motief: GTAC) die verdubbelt tHij kansen om integrogen te detecteren in vergelijking met een Taqal-gebaseerde assay . Gedetailleerde experimentele en data analyse procedures die GTAC motief enzymen gebruiken voor lentivirale (NL4.3 en zijn derivaten) en gamma-retrovirale (pMX vectoren) vector IS analyse worden beschreven. De in de assay gebruikte oligonucleotiden zijn vermeld in Tabel 1 . In het aanvullende document wordt een intern scriptie script voor IS sequentie analyse gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opwaartse (links) - en downstream (rechts) -junctie sequentie bibliotheken genereren
- DNA linkerbereiding:
- Bereid een 10 μL linker-DNA-oplossing op door 2 μL 100 μM LINKER_A-oligo's (eind: 20 μM), 2 μl 100 μM LINKER_B-oligo's (eind: 20 μM), 2 μl 5 M NaCl (eind: 1 M) toe te voegen en 4 μL nuclease-vrij water in een PCR-buis. Zie tabel 1 voor de linker sequenties.
- Incubeer de linker-DNA-oplossing bij 95 ° C gedurende 5 minuten in een PCR-instrument, stop het programma, en zet het PCR-instrument uit. Laat de linker oplossing in het instrument gedurende 30 minuten langzaam afkoelen van het linker-DNA. De linker-DNA-oplossing kan bij 4 ° C worden opgeslagen.
- LTR-specifieke biotine-primer extensie:
- Gebruik een UV-Vis spectrofotometer om de DNA-concentratie en 260/280 nm waarden van het genomische DNA van in vivo te bepalenOf in vitro experimenten. Verdun 1-2 μg monster genomisch DNA tot een eindvolume van 170 μl genomische DNA-oplossing met behulp van nuclease-vrij water.
- Bereid een 200 μL PCR-reactie op door 2,5 μl elk van 10 μM HIV-1-specifieke biotinprimers (L-BP en R-BP in tabel 1 : totaal 10 μL voor vier lentivirusspecifieke primers) te mengen, 20 μL 10X thermostabiele DNA polymerase buffer, 4 μl 10 mM dNTPs (eind: 200 μM van elk dNTP), 3 μL 2,5 U / μl thermostabiel DNA-polymerase en 163 μl genomisch DNA.
OPMERKING: Gebruik voor gammaretrovirale vectoren (pMX-vectoren) 5 μL elk van twee 10 μM pMX-specifieke biotinprimers (L-BP en R-BP: totaal 10 μL) in plaats van de vier hierboven genoemde HIV-1-specifieke biotinprimers. - Verdeel de oplossing in vier PCR-buizen (elk 50 μl) en voer een enkele verlengingscyclus onder de volgende conditie: 94 ° C gedurende 5 minuten, 56 ° C gedurende 3 min, 72 ° C voor 5Min en 4 ° C voor opslag.
- Pool alle vier PCR reacties in een 2 ml microcentrifuge buis en volg de PCR zuivering procedure van de PCR zuiveringsset. Eluten met 50 μl elutiebuffer (5-voudige waterverdunde elueringsbuffer die in de kit wordt geleverd). Ga onmiddellijk met stap 1.3.1 of sla het geëlueerde DNA op -20 ° C op.
- RsaI en CviQI spijsvertering
- Bereid een 100 μL spijsverteringsreactie door het toevoegen van 50 μl DNA (uit stap 1.2.4), 10 μl 10x buffer A en 2 μL (20 U) van RsaI-enzym. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument.
- Voeg 1 μL (10 U) CviQI-enzym aan de reactie toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ° C in een PCR-instrument. Ga onmiddellijk verder met stap 1.4.1
- Blunt einde:
- Bereid een 4,5 μl mengsel dat 2,5 μL DNA Polymerase I groot (klenow) fragment en 2 μL 10 mM dNTPs bevat. Overdracht 181; L van het mengsel aan het DNA-monster uit stap 1.3.2. Het totale volume zal 102 μL zijn. Meng goed door vortexing en incubeer bij 25 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument. Ga onmiddellijk door met stap 1.6.1.
- Bereiding van streptavidine kralen:
- Vortex de streptavidine-kraaloplossing kort en verplaats 50 μL naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis. Verwijder de supernatant met behulp van de magnetische stand en was de kralen met 200 μL bindende oplossing.
- Resulteer de kralen in 100 μl bindende oplossing en plaats de buis weg van de magnetische stand. Ga onmiddellijk door met stap 1.6.1.
- Streptavidine kraal binding:
- Vervolg 100 μL monster DNA (stap 1.4.1) naar de 100 μL opnieuw gesuspendeerde kraaloplossing (stap 1.5.2) en meng zorgvuldig door pipetteren om eventuele schuimvorming van de oplossing te vermijden. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 3 uur op een roterend wiel of een rol.
- Gebruik de magnetische stand om de kralen te vangen en de supernatant te weggooien. Was de kralen tweemaal in 400 μl wasoplossing en tweemaal in 400 μl 1x T4 DNA ligase buffer (verdund uit 10X oplossing met behulp van nuclease-vrij water).
- Resulteer de kralen in 200 μl 1x T4 DNA ligase buffer (verdund uit 10X oplossing met behulp van nuclease-vrij water) en plaats het weg van de magnetische stand. Ga direct door met stap 1.7.1.
- Linker ligatie:
- Bereid een 400 μl ligatie-reactieoplossing in een 2 ml microcentrifugebuis door 0,5 μl van de DNA linker (stap 1.1.2), 10 μl 10x T4 DNA ligase buffer, 20 μl 5X T4 DNA ligase buffer (die 25% polyethyleen bevat Glycol), 5 μl T4 DNA ligase, 164,5 μL nuclease-vrij water en 200 μl van de opnieuw gesuspendeerde kralen (stap 1.6.3). Plaats de reactiebuis op het roterende wiel en incubeer gedurende 3 uur (of 16 ° C / N) bij RT (22 ° C). Was de kralen tweemaal met de wasoplossing en tweemaal met 1X thermostabiele DNA-polymerasebuffer (verdund uit 10x oplossing met nuclease-vrij water) met behulp van de magnetische stand.
- Resulteer de kralen in 50 μl 1x thermostabiele DNA polymerase PCR buffer en plaats het weg van de magnetische stand. Ga onmiddellijk door met stap 1.8.1 of bewaar bij maximaal één dag bij 4 ° C.
- Pre-amplificatie van zowel de linker als de rechter kruis DNA:
- Bereid een 200 μl PCR-reactie op door 10 μl 10 μM 1L-primer toe te voegen, 10 μl 10 μM 1R-primer, 20 μl 10 μM primer Link1 (Tabel 1), 10 μl 10X thermostabiele DNA polymerase buffer, 4 μl 10 mM dNTP's (eind: 200 μM van elk dNTP), 8 μl (20 U) thermostabiele DNA-polymerase en 88 μl nuclease-vrij water aan de opnieuw gesuspendeerde kralen (50 μl) van stap 1.7.3.
- Aliquot het reactiemengsel in 4 PCR buizen (elk 501; L) en PCR uitvoeren met de volgende conditie: 94 ° C incubatie gedurende 2 minuten; 25 cycli van 94 ° C gedurende 20 s, 56 ° C gedurende 25 s en 72 ° C gedurende 2 minuten; En een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
- Pool alle 4 PCR reacties in een 2 ml microcentrifuge buis en volg de PCR zuivering procedure van de PCR zuiveringsset. Eluten met 50 μl elutiebuffer.
- Bepaal de DNA-concentratie en 260/280-nm waarden met behulp van een UV-Vis spectrofotometer; Het DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot klaar voor de volgende stap. Ga verder met stappen 1.9.1 / 1.10.1 (optioneel) of direct met stappen 1.11.1 / 1.12.1.
- Verwijderen van het interne DNA-amplicon aan de linkerzijde (optioneel):
- Vervoer tot 100 ng PCR DNA-product van stap 1.8.4 naar een 2 ml microcentrifugebuis en pas het volume aan op 10 μL met behulp van nuclease-vrij water.
- Bereid een restrictie-enzymreactie voor die specifiek op de interne D van de linkerzijde richtNA amplicon.
OPMERKING: De reactieconditie kan verschillen afhankelijk van de keuze van het enzym. Bijvoorbeeld, wanneer u het interne DNA van de linkerzijde van NL4.3-gebaseerde lentivirale vectoren verwijdert, voegt u 1 μL pvuII , 2 μl buffer B en 7 μl nuclease-vrij water toe. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument. Ga onmiddellijk door met stap 1.11.1 of opslaan bij -20 ° C.
- Het interne DNA-amplicon van de rechterzijde verwijderen (optioneel):
- Ga verder als in stap 1.9.1.
- Bereid een restrictie-enzymreactie op die specifiek gericht is op het rechter DNA-amplicon van de rechterkant.
OPMERKING: Bij het verwijderen van het interne DNA van de rechterzijde van NL4.3-gebaseerde lentivirale vectoren voegt u bijvoorbeeld 1 μL sfoI , 2 μL buffer B en 7 μL nucleasevrij water toe. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een PCR instrument. Ga onmiddellijk door met stap 1.12.1 of opslaan bij -20 ° C.
- Links-junctie-specifieke versterking:
- Bereid een 50 μL PCR-reactie op door 5 μL DNA van stap 1.8.4 (of uit de optionele stap 1.9.2) te mengen, 5 μl 10 μM 2L-primer (eind: 1 μM), 5 μl 10 μM primer Link2 (Eind: 1 μM), 5 μl 10x thermostabiele DNA-polymerase buffer, 1 μl 10 mM dNTPs (eind: 200 μM van elk dNTP), 2 μl (5 U) thermostabiel DNA-polymerase en 27 μL nuclease-vrij water.
- Voer de PCR uit met de volgende conditie: 94 ° C incubatie gedurende 3 minuten; 8-15 cycli van 94 ° C gedurende 20 s, 56 ° C gedurende 25 s en 72 ° C gedurende 2 minuten; En een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Versterkte DNA kan bij -20 ° C worden opgeslagen. * Cyclusnummer optimalisatie wordt voorgesteld. - Volg de PCR-zuiveringsprocedure van de PCR-zuiveringsset. Eluten met 50 μl elutiebuffer. Bepaal de DNA-concentratie en 260/280 nm waarden.
- Alle procedures zijn identiek aan "Links-kruisingsspecifieke versterking" (stappen 1.11.1-1.11.3), behalve voor het gebruik van verschillende primers; Gebruik de rechter-kruisingsspecifieke primer (2R-primer, zie tabel 1 ) in deze stap.
- Analyseer de variaties van de PCR ampliconlengte door 2% agarosegel-elektroforese of capillaire elektroforese te verrichten ( Figuur 2 ).
OPMERKING: Dit is een essentiële stap om de voltooiing van de testprocedures te bevestigen en een ruwe beoordeling van IS-patronen te maken op basis van de PCR-bandpatronen. Het gezuiverde PCR amplicon uit stappen 1.11.3 en 1.12.3 kan gebruikt worden voor verschillende DNA sequencing platforms. Ga door met de juiste monstervoorbereidingsprocedures voor sequentiebepaling met klassieke ketenbeëindiging (Sanger) of volgende generatie sequencing. Het DNA kan bij -20 ° worden opgeslagen; C.
2. Computational IS Sequence Analysis
- Voorbereiding van gegevensbestanden:
- Bereid drie invoerdatabestanden op: een fasta-formaat volgorde gegevensbestand (Test_data.fa in aanvullende gegevens), een tsv-bestand voor de zoekmotieven voor vector- en linkersequenties (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv in aanvullende gegevens) en een tsv-bestand voor restrictie-enzyminformatie (Enzyme.tsv in aanvullende gegevens).
OPMERKING: Deze bestanden zijn vereist voor het demultiplexeren, afsnijden van vector- en linkersequenties en het verwijderen van interne vectorsequenties ( Figuur 3A ). Uitgebreide stap-voor-stap instructies voor het implementeren van de berekeningswerkstroom worden in het bestand README.txt in de aanvullende gegevens verstrekt.
- Bereid drie invoerdatabestanden op: een fasta-formaat volgorde gegevensbestand (Test_data.fa in aanvullende gegevens), een tsv-bestand voor de zoekmotieven voor vector- en linkersequenties (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv in aanvullende gegevens) en een tsv-bestand voor restrictie-enzyminformatie (Enzyme.tsv in aanvullende gegevens).
- Computational analysis:
- Run demultiplexing en trimmen scripts.
OPMERKING: De ruwe sequentie wordt verwerkt voor demultiplexing en voor de trimminG van de vector-, linker- en primersequenties (zie STEP-1 in het aanvullende README.txt-bestand). - Voer het mapping commando uit (zie STEP-2 in het bestand README.txt) om de verwerkte sequenties op het referentiegenoom te plannen met behulp van een BLAST-achtig uitlijngereedschap (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
- Voer het kwantitatieve IS analyse script uit (zie STEP-3 in het README.txt bestand).
OPMERKING: Twee uitvoerbestanden (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt en Final_count.txt) worden gegenereerd. Meer details over mapping- en sequentie-opnamestrategieën zijn te vinden in het bestand "README.txt" in de aanvullende gegevens en in eerdere publicaties 2 , 15 .
- Run demultiplexing en trimmen scripts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bidirectionele IS-analyse genereerde verschillende grootte van PCR-ampliconen voor zowel de stroomopwaartse (links) en downstream (rechts) vectorhost-kruispunten ( Figuur 2 ). De grootte van een PCR-amplicon is afhankelijk van de locatie van het dichtstbijzijnde GTAC-motief stroomopwaarts en stroomafwaarts van een integroom. De assay produceerde ook interne DNA-PCR-ampliconen: retrovirale sequenties in de buurt van het polypurine kanaal en de primerbindingsplaats werden gelijktijdig versterkt tijdens respectievelijk linker- en rechterkoppeling PCR. PCR-ampliconbanden kunnen worden visualiseerd door capillaire of agarose (2%) elektroforese.
Na sequencing werden zowel de linker- als de rechter-kruissequenties geanalyseerd door een eigen programmeringscript voor het verwerken van rauwe sequenties (inclusief demultiplexeren en trimmen van vector- en linker-DNA), afkorting van IS sequenties op het genoom, identificatie en tellen van identieke ISSequenties, en het toepassen van foutcorrectieprocedures ( Figuur 3 ). Locaties van het 5'-uiteinde van de query sequenties in het referentiegenoom worden beschouwd als IS en worden gebruikt voor de initiële telling van elke IS. De criteria die de twee overeenkomende sequenties bepalen, zijn de opwaartse (linker) en stroomafwaartse (rechter) verbindingssequenties afkomstig van hetzelfde integroum, gebaseerd op de nucleotidesequentiepatronen van retrovirusspecifieke gecoördineerde integratie en zijn als volgt: (i) twee verbindingssequenties Uitlijnen op het genoom in tegenovergestelde oriëntaties. (Ii) De IS van de twee verbindingssequenties worden gescheiden door een 5-bp overlap voor humane immunodeficiëntievirus (HIV) -vectoren en een 4-bp overlap voor muizenleukemievirus (MLV) -vectoren. De eerste 5 bp van de twee kruispunten van HIV en 4 bp MLV-kruispunten zijn omgekeerd complementair.
IS-sequentietellingen worden in drie stappen bepaald: (1) mappen van IS sequenties op het genoomMet behulp van BLAT, die de mappingskwaliteit genereren en afzonderlijke IS-sequenties scheidt in "single hit", "multi hit", "no-hit" en "other" groepen; (2) met behulp van het Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) om één-hit-sequenties te vergelijken met andere suboptimaal gekarte sequenties, waaronder multi-hits, no-hits en anderen; En (3) het identificeren en corrigeren van sequentiefouten, inclusief homopolymeerfouten. Multi-hit sequenties zijn IS sequenties die twee of meer genomische posities kunnen afstemmen met een hoge mapping score. Hoewel het nog steeds nuttig is voor het identificeren en kwantificeren van klonale populaties, kunnen de multi-hit sequenties niet worden gebruikt voor het karakteriseren van genomische integratie site distributiepatronen (bijvoorbeeld associatie met genen, herhalingen of andere genomische tekens). In sommige zeldzame gevallen tonen de twee verbindingssequenties verschillende mapping kwaliteiten. Bijvoorbeeld, één toont 'single-hit', terwijl de bijbehorende sequentie 'multi-hit' toont. In zulke gevallen, beideSequenties worden behandeld als "single-hit" sequenties.
Een deel van IS-sequenties met suboptimale mapping scores, die een hoge percentagesidentificatie (identiteit) met een abnormale query-grootte (QSIZE) of vice versa tonen, werden gescheiden van "no-hits" en ingedeeld in "anderen" voor een extra en vaak Handmatige herwaardering. Bijvoorbeeld, bij het gebruik van BLAT voor genoom mapping, kunnen sommige IS sequenties een abnormale QSIZE tonen door miss-matching nucleotiden in de eerste of laatste 5-10 nucleotiden. Deze sequenties voldoen vaak niet aan de mapping criteria voor single-hit of multi-hit status, ondanks het feit dat het een relatief hoogwaardig mapping resultaat heeft.
Een sample raw sequence data bestand (Test_DATA.fa: 33,374 sequences) en sample output data bestanden worden geleverd als aanvullende gegevens. 1 μg genomisch DNA uit humane repopulerende cellen, getransduced with leent Ivirale vectoren (FG12) in een gehumaniseerde beenmerg / lever / thymus (BLT) muis 17 , werden geanalyseerd onder toepassing van de bidirectionele assay. Retrovirale IS werden over het genoom gevonden. Typisch worden lentivirale vectoren oververtegenwoordigd in genen, terwijl gamma-retrovirale vectoren overrepresenteerd zijn in transcriptie startplaatsen 16 ( Figuur 4 ). Van twee menselijke repopulerende celmonsters werden in totaal 1,081 sequenties-851 van de stroomopwaartse (links) en 230 de stroomafwaartse (rechter) kruispunten gekwalificeerd als IS-sequenties. Uit deze sequenties werden 93 unieke IS in de linker en 50 unieke IS in de rechter kruispunten geïdentificeerd. Van deze werden 44 in beide (links en rechts) kruispunten geïdentificeerd, waarbij in totaal 99 unieke integromen in de testmonsters werden weergegeven. IS zijn significant verrijkt in genen (66%, p <0,0001) in vergelijking met willekeurige gebeurtenissen ( Figuur 4A ).
"> Voorbeeld gamma-retrovirus vector (pMX) integratie site sequenties worden ook opgenomen in het test data bestand. Uit een gemengde Pmx-gemanipuleerde celmonster, getransduceerd met pMX die Oct4, cMyc, Klf4 en Sox2, 1.611 IS sequenties en 129 unieke Er werden geïdentificeerd. Van 65 en 76 unieke IS geïdentificeerd in respectievelijk links en rechts kruisingen, waren 12 in beide kruispunten.Het is eerder aangetoond dat PCR-ampliconen van ≥500 bp slecht zijn in het pyrosequencing platform, terwijl PCR-ampliconen van <500 bp over het algemeen goed sequentie zijn, zonder een opmerkelijke vooroordeel ten aanzien van sequentielengsels 15 . Zo werden sequentiedata van ≥ 500 bp PCR amplicons uitgesloten om lengte-geassocieerde sequencing bias te verwijderen. Alleen data van <500 bp PCR amplicon (aangeduid als kwantificeerbaar vector integroom, of QVI) werden gebruikt voor kwantitatieve klonale analyse. De relatieve detectiefrequenties van vectorintegratiesWerden berekend met gebruikmaking van alleen de sequentietellingen van IS-juncties die <500 bp PCR amplicons genereren ( Figuur 4B -4D , zie ook tabel 2 ). Ongeveer 77% van de vectoren kan door deze strategie kwantitatief geanalyseerd worden ( Figuur 4B ). Als gevolg daarvan werden de berekende frequenties voor elke QVI verwacht dat de ware frequenties in het monster ( Figuur 4E ) met 1,25x worden overschat.
Figuur 1: Een schematische weergave van bidirectionele integratie site analyse. Dubbelstrengs retrovirale DNA (zwart en rood) flankeren door cellulaire DNA (blauw) worden getoond. De pijlen vertegenwoordigen oligonucleotide primers, en pijlen met een sterret vertegenwoordigen biotine primers. Linker-DNA's worden aangeduid met paarse lijnen. In het kort, een lineaire verlenging van linksBiotin primers (L-BP) en rechter biotine primers (R-BP) uit de virale Long Terminal Repeat (LTR) genereert biotinylated, double-strand IS DNA. Na vertering met CviQI en RsaI worden het biotinyleerde dubbelstrengs DNA verrijkt met behulp van streptavidine-biotine-specifieke binding en geligeerd met linker-DNA. Streptavidine-gevangen, linker-geligeerde vector-gastheer-verbindings-DNA's worden versterkt door een tweetraps-PCR: pre-amplificatie (amplificatie van zowel de linker als de rechter kruispunten) gevolgd door twee geneste PCR's, die elk naar links en rechts kruisen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve PCR Amplicon Image. ( A ) Capillaire elektroforese analyse toont verschillende lengtes van PCR ampLicons in lentivirale vector (FG12) integratie sites na pvuII of sfoI digestie . Variërende PCR-banden voor stroomopwaartse (links) en stroomafwaartse (rechter) vectorhostverbindingen worden getoond. De donkere pijlkoppen geven aan dat de inwendige vector DNA-ampliconen na pvuII- of sfoI- vertering blijven. De DNA-grootte marker (0,1 - 2,5 kbp) ligt op de M-baan. De open pijlkoppen geven aanwijzingsmarkeringen aan (15 en 5.000 bp). DNA alignment markers worden gebruikt voor het kalibreren van de migratietijdvariatie over alle kanalen. ( B ) Gamma-retrovirale (pMX) vectorintegratieplaatsen in muizencelklonen die zijn getransduceerd met meerdere pMX-vectoren. Links- en rechter-junction-DNA's, evenals interne vector-DNA-ampliconen (pijlkoppen), worden getoond. De donkere en open pijlkoppen geven respectievelijk interne vector DNA en alignment markers aan. De DNA-grootte marker (50-1.500 bp) ligt op de M-baan. Details over capillaire elektroforese zijn te vinden in het bedrijfprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Integratie Site Sequence Analysis. ( A ) Een flowchart voor computergegevensanalyse. Drie gegevensbestanden, waaronder een bestand met snelformaat sequentie, een bestand met referentie sequentie motieven voor demultiplexing en trimming, en een bestand met restrictie-enzym informatie zijn vereist. Voorbeeldbestanden, waaronder Test_DATA.fa (sequentiedata), Demultiplexing_Trimming.tsv (zoeksequentiemotieven) en Enzyme.tsv (restrictie-enzymherkenningssequentie), worden geleverd als aanvullende gegevensbestanden. De verwerkte sequenties (gastheer-genoomsequenties) uit deel 1 worden afgebeeld tegen de referentie met behulp van BLAT. Locaties bij het 5'-einde van de query sequentieEs in het referentiegenoom worden beschouwd als de integratieplaatsen ( tabel 2 ). Volgordecijfers voor elke IS worden bepaald in drie stappen: (1) mappen van IS sequenties op het genoom met behulp van BLAT; (2) het vergelijken van enkelvoudige IS-sequenties (aanpassen op een unieke plaats van het gastheergenoom) met andere sequenties die suboptimaal op het genoom werden toegewezen; En (3) het identificeren en corrigeren van sequencing fouten. Meer informatie over mapping- en sequentie-opnamestrategieën is te vinden in eerdere studies 2 , 15 . ( BC ) Twee enkelvoudige enkelvoudige DNA-sequenties voor de stroomafwaartse (B) en de stroomopwaartse (C) vector-gastheerverbindingen worden getoond. Pyrosequencing primers A en B (groen) worden gebruikt voor druppel-PCR en sequencing. De kleurencodes komen overeen met die in Figuur 1 . De monster stroomafwaartse sequentie (B) bevat Primer A (groen), MID (groen), Vector U5 einde (rood), gastheergenoom (blauw), liNker (paars) en Primer B (groen). In een gemengde (stroomopwaartse en stroomafwaartse) DNA-sequentie wordt Primer A gebruikt voor het sequentiëren van de stroomafwaartse verbindingen (B) en Primer B wordt gebruikt voor het sequentiëren van de stroomopwaartse verbindingen. De bovenstroomse verbindingsreeks van het monster (C) bevat Primer B, MID, Vector U3-einde, gastheergenoom, linker en Primer A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 4: Representatief voorbeeld van bidirectionele integratie site analyse. ( A ) Percentage integratie in genen (refseq), Alu en LINE 1 (L1) herhalingen van lentivirale vectoren in gehumaniseerde muisrepopulerende cellen (LV-huMice), in vergelijking met in siliciumgenererende 10.000 random incidentie gebeurtenissen. Integratie sites worden aangewezenOp het menselijk genoom (hg19). LV-huMice-integratieplaatsen zijn aanzienlijk te zien in genen ( p <0,0001, chi-square approximatie) ( B ) In silico analyse van 10.000 willekeurige integratie gebeurtenissen. Met een unidirectionele benadering genereren ongeveer 52% van de willekeurige integromen PCR-ampliconen van <500 bp, terwijl bij een bidirectionele aanpak 77% een PCR-amplicon van <500 bp gegenereerd in de linker of rechter kruispunten. PCR ampliconen langer dan 500 bp zijn inefficiënt gehersequentieerd met de pyrosequencing platfor 2 , 15 en zouden derhalve uit kwantitatieve data analyses moeten worden uitgesloten. ( C ) Strategie voor klonale kwantificering. Elke afzonderlijke kloon deelt hetzelfde vectorintegroom (of IS). De relatieve frequenties van de linker (x) en rechter (y) kruispunten worden gecombineerd om de relatieve hoeveelheden van de klonale populaties (kwantificeerbare vectorintegraties of QVI) te vertegenwoordigen. integ Rantsoenplaatsen die geen GTAC-motief hebben binnen 450 bp worden gediskwalificeerd (dQ) en verwijderd uit kwantificatieanalyse. ( D ) De relatieve frequenties (ten opzichte van alle QVI-sequenties) van 44 QVI-klonen in gehumaniseerde muizen-repopulerende cellen worden getoond in een kleurenschema (wit naar rood: 0 tot 0,16). ( E ) Verwachte overschatting van klonale frequenties met bidirectionele analyse. Op basis van in 10.000 random randomization analysis van Silico wordt een 1,25-voudige overschatting verwacht bij gebruik van GTAC-motiefenzymes ( RsaI en CviQI ) door ongeveer 20% dQ-klonen. Een 2,56x overmatige schatting wordt verwacht wegens ongeveer 60% dQ-klonen bij gebruik van het TCGA-motiefenzym ( TaqaI ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Oad / 55812 / 55812table1.jpg "/>
Tabel 1: Oligonucleotiden voor Lentivirale en Gamma-retrovirale Vector Integration Site Analysis. * 5BioTEG: Biotin modificatie bij het 5'-uiteinde. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Tabel 2: Representatieve invoegplaats site sequentie telling gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
1 Kaart: integratie site sequenties kunnen worden toegewezen op een unieke locatie (single-hit) of meerdere loci (multi-hit) van het referentie genoom. NA (niet beschikbaar): er is geen volgorde gedetecteerd.
2 STRD: oriëntatie van de query sequentie in het genoom
3 QLEN: de lengte van de query sequentie
4 GLEN: de verwachte lengte van de integratieplaatsreeks, berekend op basis van de afstand van het dichtstbijzijnde beschikbare GTAC-motief in het genoom naar de insertieplaats. GLEN <450 bp worden geaccepteerd voor kwantitatieve analyses.
5 Total_Count: totale volgorde telling
6 Integratieplaatsen worden getoond door een chromosoomnummer (CHR) en een sitenummer voor de rechterkoppeling (CHR_SITE1) en een nummer voor de linkerkruising (CHR_SITE2). CHR_SITE1 en CHR_SITE2 zijn 5 bp uit elkaar voor lentivirale vectoren en 4 bp apart voor MLV (pMX) vectoren
7 Volgorde telt voor de rechter kruising (R_A) en de linkerkruising van monster A (L_A); Volgorde telt voor de rechter kruising (R_B) en de linkerkruising van monster B (L_B)
* Gediskwalificeerd (dQ): GLEN ≥450 in silico bp
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De bidirectionele assay maakt het mogelijk simultaan te analyseren van zowel de stroomopwaartse (links) en downstream (rechts) vector-gastheer-DNA-verbindingssequenties en is bruikbaar in een aantal gentherapie-, stamcel- en kankeronderzoeksoepassingen. Het gebruik van GTAC-motiefenzymes (RsaI en CviQI) en de bidirectionele PCR-aanpak verbetert de kansen om een integraal (of een klonale populatie) te detecteren in vergelijking met eerdere TCGA- motiefenzym ( TaqaI ) gebaseerde assays 2 , 15 en andere Unidirectionele LM-PCR benaderingen 5 . De bidirectionele analyse verbetert de analyse van IS, met name in de beperkte DNA-monsters die vaak voorkomen in klinische of kleine-diermodelstudies.
Stappen 1.1-1.7 zijn een kritische stap en moeten zonder onnodige vertragingen worden uitgevoerd. Deze stappen worden meestal op een dag uitgevoerd. Het testen van enzymen voorafgaand aan deze stappen wordt sterk aanbevolen. StapS 1.9 en 1.10 zijn optioneel. Deze stappen zullen interne vector DNA sequenties verminderen die gelijktijdig met IS sequenties worden geamplificeerd. Tabel 1 verschaft primer sets die geschikt zijn voor het analyseren van de IS van wildtype NL4.3 HIV-1, NL4.3-afgeleide vectoren, waaronder FG12 21 en pMX-gebaseerde gammaretrovirale vectoren 22 . Afhankelijk van de nucleotide variaties in de lange terminale herhaling (LTR) sequenties kan het primerontwerp en de experimentele aanpak een goede wijziging hebben.
De blat-software die wordt gebruikt voor mapping is alleen compatibel met vast formaat en werkt niet met fastq-bestanden. Men kan de fastq-bestanden converteren naar fasta met behulp van diverse software-instrumenten, zoals FASTX-Toolkit of BBTools. Een gebruiker met basiskennis van python kan Biopython gebruiken om de fastq-bestanden om te zetten in fasta om ze met blat te mappen.
Er wordt verwacht dat een deel van de IS niet gedetecteerd wordt met de bidirectionele IS-analyse en, zelfs indien gedetecteerd, niet in aanmerking komen voor downstream klonale kwantificering. Wanneer GTAC-motief enzymen werden gebruikt, passeerden ongeveer 23% van de integromen in de sequentiedata die door het pyrosequencingplatform werden gegenereerd niet de analyse criteria voor kwantitatieve IS sequentie analyse ( Figuur 4 ). Wanneer een uitgebreide IS-dekking cruciaal is, bijvoorbeeld bij de veiligheidsbewaking van genecontroleerde cellen in gentherapie-instellingen, is het raadzaam om een test met onbeperkte genoom toegang te kiezen voor IS 8 , 9 , 10 , 11 , 12 of om de Hetzelfde monster met een andere of geoptimaliseerde combinatie van restrictases 4 , 18 .
IS-analyses met onbeperkte genoom toegang, zoals niet-restrictieve LAM PCR en willekeurige scherpende apprOaches 19 , 20 , houden specifieke belofte voor uitgebreide IS analyse. Deze benaderingen gebruiken technologieën die relatief moeilijk te beheersen zijn, waardoor het moeilijk is om de uitkomst van genomische DNA-fragmentatie en IS-amplificatie te voorspellen. Aan de andere kant hebben IS-assays die goed gekenmerkte restrictie-enzymen gebruiken, twee belangrijke voordelen: (1) Het is relatief eenvoudig om analyses te kalibreren en te optimaliseren, omdat de analyseverslagen meer voorspelbaar zijn door de specificiteit van de enzymreactie en de beschikbaarheid van Referentiegenoomsequenties. (2) Sequence data zijn zeer reproduceerbaar zodra de assay voorwaarden zijn geoptimaliseerd. De bidirectionele PCR met geoptimaliseerde omstandigheden heeft bewezen bruikbaar voor grootschalige en nauwkeurige klonale kwantificering 2 , 15 . Hoewel alleen een deel van de bestaande klonale populaties is geanalyseerd door de beperking van het enzym, wordt de hoeveelheid individuen geanalyseerd L-klonen werden nauwkeurig gemeten, waardoor de nauwkeurige bepaling van kloongrootte variaties binnen en over monsters mogelijk werd gemaakt. Een voldoende aantal klonen werden gegenereerd om stamcellen gedragspatronen en functionele heterogeniteit te bepalen.
De PCR-ampliconen die geproduceerd worden uit deze bidirectionele PCR-procedure zijn geschikt voor elk downstream sequencing platform. Vanwege de hoge gevoeligheid van de test dient de grootste zorg te worden genomen om kruisbesmetting te vermijden door experimenten in een besmettingsvrije ruimte uit te voeren. De inclusie van een negatief (no-template) controle experiment wordt geadviseerd voor alle PCR stappen. Zelfs bij de meest voorzichtige praktijk is het voorkomen van kruisbesmetting van monster-naar-monster extreem moeilijk. Bij het vergelijken van klonale populaties uit verschillende monsters is het daarom raadzaam een botsingscontrole te gebruiken, die potentiële verontreinigde gegevens 23 verwijdert en een afsnijding voor lage frequente, onbetrouwbare klonen> 2 om het geluid van kruisbesmet DNA te minimaliseren. De bidirectionele benadering genereert IS-gegevens voor beide uiteinden van de integromes, waardoor een extra mogelijkheid wordt geboden om potentiële valse positieve detectiefouten te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 en R56 HL126544; De National Science Foundation Grant DMS-1516675; De Nationale Onderzoeksstichting van Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); En het KRIBB initiatief programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10 mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2 mL microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100 - 2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50 - 1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
