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Developmental Biology

चुंबकीय सक्रिय सेल छंटनी द्वारा पृथक पेरिवस्कुलर ऐडीज टेस्यू से एडिपोसाइट प्रीगेनेटर का विस्तार और एडिपोजेनेसिस प्रेरण

Published: June 30, 2017 doi: 10.3791/55818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

Summary

यहां हम चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमसीएस) का उपयोग करते हुए पेरीविस्कुलर एडिपोज टिशू (पीवीएटी) से एडिपोसाइट प्राइजेंट सेल (एपीसी) की आबादी के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। फ्लोरोसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) की तुलना में इस पद्धति में एडीपीस टिश्यू प्रति ग्राम एपीसी की वृद्धि हुई अलगाव के लिए अनुमति देता है।

Abstract

पेरासिराइन सिग्नलिंग के जरिए संवहनी समारोह के प्रमुख नियामक पेरीविस्कुलर एडिपोज टिश्यू (पीवीएटी) का विस्तार, मोटापा के दौरान उच्च रक्तचाप के विकास से सीधे संबंधित है। हाइपरट्रॉफी और हाइपरप्लासिया की सीमा डिपो स्थान, लिंग, और एडीपोकेट प्राइजनीटर सेल (एपीसी) के प्रोनोटिप्स के प्रकार पर निर्भर करती है। एपीसी और प्रीडिपोसाइट्स अलगाव के लिए पिछले 10 वर्षों में इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों ने सटीकता में काफी सुधार किया है, जिस पर विशिष्ट कोशिका सतह मार्करों के आधार पर व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है। हालांकि, सेल की नाजुकता के कारण एपीसी और एडीओपोसाइट्स का अलगाव एक चुनौती हो सकता है, खासकर अगर कोशिका संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए बरकरार कोशिका को बनाए रखा जाना चाहिए।

मेगनेटिक-सक्रिय सेल सॉर्टिंग ( एमसीएस) एडीपोज ऊतक के वजन इकाई के प्रति अधिक व्यावहारिक एपीसी को अलग करने की एक विधि प्रदान करता है। एमसीएस द्वारा खरीदे गए एपीसी का उपयोग इन विट्रो प्रोटोकॉल में विस्तार करने के लिए किया जा सकता हैडिपोसाइट्स और कोशिकाओं द्वारा बनाए रखने वाले विपुल और एडिपोजेनिक क्षमता के विश्लेषण के लिए अनुमति देने वाले विकास कारक कॉकटेल के उपयोग के माध्यम से उन्हें एडिपोसाइटेज़ में अलग करना। इस प्रयोग ने महाधमनी और एमजेन्ट्रिक पीवीएटी डिपो पर ध्यान केंद्रित किया, जो विस्तार के दौरान हृदय रोग के विकास में प्रमुख भूमिका निभाते हैं। ये प्रोटोकॉल एपीसी की परिभाषित आबादी को अलग करने, विस्तार और भिन्न करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। यह एमसीएस प्रोटोकॉल किसी भी प्रयोग में अलगाव का उपयोग करने की अनुमति देता है जहां सेल सॉर्टिंग की न्यूनतम उपकरण या प्रशिक्षण के लिए आवश्यक है। ये तकनीक सेल की सतह के मार्करों की उपस्थिति के आधार पर विशिष्ट सेल आबादी की कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए आगे प्रयोगों की सहायता कर सकती हैं।

Introduction

रक्त वाहिकाओं से निकटता के कारण पेरिवस्कुलर एडिपोज टिशू (पीवीएटी), vasculature फ़ंक्शन 1 में एक बड़ा पैरासिरेन सिग्नलिंग घटक है। इस वसा ऊतक का विस्तार एडीओपोसाइट प्राइजेंट सेल (एपीसी) के फेनोटाइप 2 , 3 पर निर्भर है। वसा के ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव मुश्किल है क्योंकि प्राथमिक एडिटॉसाइट्स नाजुक, उमंग, और आकार में रेंज हैं। कुछ पृथक तकनीकों में भड़काऊ प्रोटीन संश्लेषण बढ़ाना और एडीजीजनिक ​​जीन एक्सप्रेशन 4 को कम करके सेल फ़िनोटाइप और आकृति परिवर्तन भी बदल सकता है, जो एक प्रोटोकॉल के महत्व पर बल देता है जो कि कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखता है।

प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति और विशिष्ट प्रीडाइपोसाइट उप-जनसंख्याएं विवो वृद्धि में कमी लाने वाला दृष्टिकोण देती हैं और समान सेलुलर आनुवंशिक श्रृंगार 5 रखती हैं, हालांकि काम कर रहे टीआईमैं इन कोशिकाओं के साथ उम्र बढ़ने या शताब्दी के साथ गिरावट के कारण सीमित है चमड़े के नीचे और आंशिक डिपो सहित विभिन्न वसा डिपो से प्रेडियोपोसाइट्स भी प्रसार 7 में अंतर प्रदर्शित करते हैं, जो विशिष्ट शारीरिक साइट्स से कोशिकाओं को एकत्रित करने के महत्व पर जोर देते हैं। गैर-पीवीएटी सफेद वसा डिपो से प्रीकर्सर कोशिकाओं को पिछले 7 , 8 , 9 के अध्ययन में देखा गया है, लेकिन पीवीएटी एपीसी फेनोटाइप के बारे में कम जानकारी है।

यहां वर्णित तकनीक विशिष्ट और परिभाषित एपीसी आबादी के विश्लेषण के लिए उनके आकारिकी, व्यवहार्यता, और पैदा करने और विभेद करने की क्षमता पर न्यूनतम प्रभाव के साथ अनुमति देते हैं। मेगनेटिक-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमसीएस) डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के लिए अनुकूल है, जैसे कि संस्कृति, क्योंकि मोती कोशिका को बदलने के बिना भंग कर देते हैं। एमसीएस भी किफ़ायती है, और एक बार एंटीबॉडी कॉनकेंद्रीकरण को मानकीकृत कर दिया गया है, फ्लो साइटमैट्री एशेज की आवश्यकता कम है पीवीएटी पूर्ववर्तियों के साथ इन विट्रो अध्ययनों में यह संभावना भी हो सकती है कि ये प्राथमिक कोशिकाएं हो सकती हैं।

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Protocol

इस पत्र में वर्णित सभी प्रक्रियाएं मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों का पालन करते हैं। सभी बफ़र्स और मीडिया को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।

1. बफर, मीडिया और उपकरण की तैयारी

  1. क्रेब्स रिंगर बाइकार्बोनेट-बफर्ड समाधान (केआरबीबी) तैयार करें: 135 मिमी सोडियम क्लोराइड, 5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 1 एमएम मैग्नीशियम सल्फेट, 0.4 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट डिबासिक, 5.5 एमएम ग्लूकोज, 1% एंटीबायोटिक / एंटिम्यकोटिक (10,000 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन, 10,000 माइक्रोग्राम) / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 25 माइक्रोग्राम / एमएल एफ़ोटेटरिकिन बी), और 10 एमएम HEPES (पीएच = 7.4)। यह समाधान 3 सप्ताह के लिए स्थिर रहता है जब बाँझ रखा जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. कोलेजनज़ टाइप 1 समाधान तैयार करें: 1 एमजी / एमएल में केआरबीबी में 4% बोवाइन सीरम अल्ब्युमीन (बीएसए) के साथ। यह समाधान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए और 4 घंटे के लिए स्थिर होना चाहिए।
  3. एरीथ्रोसाइट लैस बफर समाधान तैयार करें: 154 एमएम अमोनियम क्लोराइड, 10 मिमी पोटेशियम बायकार्बोनेट, और 0.1 मिमी ईडीटीए एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस तक रखें।
  4. एमसीएस अवरुद्ध बफर तैयार करें: डीएमईएम / एफ 12 मीडिया बेस, 10% फेटालो बोवाइन सीरम (एफबीएस), 5% सामान्य गांड सीरम, 40 μL / एमएल एफ (एबी) फ्रैगमेंट गधा एंटी रट आईजीजी। एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस तक रखें।
  5. एमसीएस बफर समाधान तैयार करें: फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस, पीएच = 7.5), 0.5% बीएसए, और 2 एमएम ईडीटीए। एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस तक रखें। कांच के कंटेनर में 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग के द्वारा डी-गैस समाधान और फिर 15 के लिए एक वैक्यूम आवेदन अप्रयुक्त buffered सील बंद करें।
  6. स्ट्रॉबल वैस्कुलर फ्रेक्शन (एसवीएफ़) बेसल मीडिया तैयार करें: डल्बेको की संशोधित ईगल्स मध्यम (डीएमईएम): एफ 12, 15% भ्रूण काफ्रम सीरम (एफसीएस), 1% एंटीबायोटिक / एंटीम्योटिक (10,000 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन, 10,000 माइग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 25 ग्राम) / एमएल अम्फोटेरिसिन बी), 44.05 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट, 100 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड, 33 सुक्ष्मजीव बायोटिन, 17 माइक्रोन पैंटोथेनट, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 20 मिमी एचईपीईएस। बाँझ रखें और 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 सप्ताह तक रखें।
  7. एपीसी तैयार करेंमीडिया: बेसल मीडिया, एपिडर्मल ग्रोथ कारक 10 एनजी / एमएल सहित अतिरिक्त वृद्धि कारकों के साथ), ल्यूकेमिया निरोधक कारक (10 एनजी / एमएल), प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक बी (10 एनजी / एमएल), और मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक ( 5 एनजी / एमएल) बाँझ रखें और 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 सप्ताह तक रखें।
  8. एपीसी प्रेरण मीडिया तैयार करें: एपीसी मीडिया के साथ 10% एफबीएस, 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 0.5 एमएम 2-आईसोबुटिल-1-मेथाइलैक्सैथीन (आईबीएक्स), 1 माइमी डीएक्सएमेथासोन, और 200 पीएम टी 3 (ट्रायइयोडोथोरोनिन थायराइड हार्मोन)। बाँझ रखें और 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 सप्ताह तक रखें।

2. एडिपोसाइट प्रजनित्र अलगाव

  1. संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार एनेस्थेटीज़ चूहे पृष्ठीय ढहने में चूहा रखें एनेस्टेसिया की गहराई से पैर की अंगुली के माध्यम से और इस दर्दनाक प्रोत्साहन को प्रतिवर्त प्रतिक्रिया के नुकसान की पुष्टि करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल 10-हफ्ते का पुराना स्प्रेग दाऊली चूहों का उपयोग करता है और 70 एमजी / किग्रा pentobarbital एक इंट्राटेरिटीन इंजेक्शन के माध्यम से वितरित करता है।
  2. एक ऊर्ध्वाधर मिडलाइन चीरा बनाओथोरैसिक क्षेत्र में छाल के साथ और पेरिनियल क्षेत्र में कैथरीक कैंची। पेट की गुहा तक पहुंचें और बेहतर मेजेन्ट्रीक धमनी, छोटे स्तनदर्शी प्रतिरोध वाहिकाओं (एमपीवीएटी) और थोरैसिक महाधमनी (एपीवीएटी) का पर्दाफाश करें।
    1. मेसेंटरी और महाधमनी के सभी कनेक्शनों को नष्ट कर दें और पशु से जहाजों को हटा दें। एक विदारक माइक्रोस्कोप और पेट्री डिश का उपयोग करके PVAT को अलग करें, जहाजों को देखने के लिए और पीवीएटी को अलग करने के लिए केआरबीबी से भरा हुआ है।
    2. इस प्रयोग में, गैर-पीवीएटी वसा डिपो का प्रतिनिधित्व करने के लिए गोनाडल (जीओएन) वसा एकत्रित करें। 10 एमएम HEPES (पीएच = 7.4) के साथ केआरबीबी में बर्फ पर पृथक वसा पैड रखें।
    3. बायोसाफेटी हुड में, 1 मिलीलीटर ट्यूशन के बारे में 50 मिलीग्राम ऊतक को 1.7 एमएल ट्यूब में 1 एमएल कोलेजनसेज टाइप 1 समाधान के साथ स्थानांतरित करें और ऊतक कैंची (1-3 मिमी के टुकड़े) के साथ छिद्र करें।
  3. 1 घंटे के लिए Rotisserie इनक्यूबेटर (या एक कक्षीय प्रकार के बरतन के साथ इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा डाइजेस्ट नमूनों। बायोसाफेटी हुड में, क्रमशः 100 और 40 के द्वारा पका हुआ सामग्री फ़िल्टर करें एक 50 एमएल ट्यूब में माइक्रोन सेल स्ट्रेनर्स अपकेंद्रित्र परिणामस्वरूप छानना 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट 300 × ग्राम के लिए
    नोट: यहां से प्रोटोकॉल के सभी चरणों को आगे बढाने के लिए बायोसाफेटी हुड में कोशिकाओं को बाँझ रखने के लिए किया जाता है।
  4. सतह पर तैरनेवाला और resuspend छर्रों 1 एस एरिथ्रोसाइट लैस बफर समाधान के 1 एमएल में एसवीएफ कोशिकाओं युक्त और एक 1.7 एमएल microfuge ट्यूब को हस्तांतरण डालो। आरटी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं, प्रकाश और अपकेंद्रित्र से 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्रा।
  5. सतह पर तैरनेवाला बंद करो और एसवीएफ मूल मीडिया में शेष सेल गोली resuspend। Trypan ब्लू समाधान के साथ लाइव कोशिकाओं की गणना करने के लिए 20 μL उप नमूना लीजिए।
    नोट: एसवीएफ कोशिकाओं की संख्या को अलग किया जा सकता है जो साइट के आधार पर भिन्न होगा। ऊतक प्रति मिलीग्राम एसवेएफ की औसत संख्या हैं: एपीवीएटी = 5.0 ± 2.0x10 3 , एमपीवीएटी = 1.04 ± 0.62x10 4 , जीओएन = 2.4 ± 1.2x10 5 ।

3. चुंबकीय सक्रिय सेल छंटनी

_content "> नोट: सीडी34 और पीडीजीएफआरए सेल सतह मार्करों पर आधारित एसवीएफ से 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों का प्रदर्शन करके एपीसी अलग करें

  1. 300 मिनट में 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला बंद करो और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर एमसीएस अवरुद्ध बफर में सेल गोली resuspend और 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: 1 x 10 6 - 2 x 10 8 कोशिकाओं / एमएल के सेल निलंबन प्रभावी रूप से अलग हो सकते हैं
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एफआईटीसी-संयुग्मित माउस एंटी-सीडी34 (1 माइक्रोग्राम / 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) के 5 μL युक्त कोशिकाओं को सेते हैं 300 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्पिन कोशिकाओं
    1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के सीडी34 + और सीडी34 कोशिकाओं को अलग करने के लिए 4 एफसीटी माइक्रोबिड्स के 4 μL और एमसीएस बफर के 96 μL (100 μL का कुल मात्रा) सेते हैं।
  3. स्टैंड में मैग्नेटिक विभाजक को संलग्न करें और मल्टीएसोर्ट (एमएस) कॉलम को डालें, जिसमें स्तंभ पंख फ्रंट से, विभाजक में। 5 एमएल रखेंऊपरी ट्यूब धारक में एमएस कॉलम के तहत संग्रह ट्यूब।
  4. एमसीएस बफर समाधान के साथ धोखाकर एमएस कॉलम तैयार करें। कॉलम के शीर्ष पर एमसीएस बफर के 500 μL को लागू करें और बफर के माध्यम से चलें। प्रवाह और संग्रह संग्रह ट्यूब को त्यागें
  5. तैयार एमएस कॉलम पर सेल निलंबन लेबल एंटीबॉडी लोड करें। अन्तर्निहित कक्षों के माध्यम से प्रवाह के माध्यम से एकत्रित करें
  6. 500 μL डीजेसर्ड एमसीएस बफर 3 एक्स के साथ एमएस कॉलम धोएं। अनिलैब्लेड कोशिकाओं को एकत्रित करें जो पिछले चरण से गुजरते हैं और प्रवाह के साथ गठबंधन करते हैं।
  7. चुंबकीय विभाजक से एमएस कॉलम निकालें और इसे एक नया संग्रह ट्यूब पर रखें। एमएस कॉलम पर 1 एमएल एमसीएस बफर के पिपेट दृढ़ता से चुंबकीय लेबल वाले कोशिकाओं के साथ तुरंत बाहर फ्लश करें, लेकिन धीरे-धीरे, स्तंभ में अतिरिक्त गैस को कॉलम में न देने के लिए कॉलम से आपूर्ति की गई सवार को लागू करना।
    नोट: पृथक सेल नंबर साइट के अनुसार अलग-अलग होंगे। प्रति एसवीएफ जनसंख्या से अलग सीडी34 + एपीसी की औसत संख्याऊतक की मिलीग्राम हैं: एपीवीएटी = 2.6 ± 0.43x10 2 , एमपीवीएटी = 9.6 ± 1.4x10 2 , जीओएन = 1.3 ± 0.22x10 3 ।
  8. 5 मिनट में 300 × जी और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए स्पिन कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक 1: 200 समाधान / 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं खरगोश विरोधी PDGFRα के 10 μL में एकत्रित सीडी34 + अंश सेते
    1. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को फिर से 5 मिनट के लिए 300 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर। पृथक खरगोश आईजीजी माइक्रोबिड के 4 μL और एमसीएस बफर के 96 μL के साथ लेबल कोशिकाओं सेते हैं। 3.3 से 3.7 को अलग करने के लिए चरण दोहराएं।
      नोट: पृथक सेल नंबर साइट के अनुसार अलग-अलग होंगे। पीडीजीएफआर + एपीसी की औसत संख्या सीडी34 + जनसंख्या प्रति मिलीग्राम ऊतक से अलग होती है: एपीवीएटी = 2.4 ± 0.64, एमपीवीएटी = 8.4 ± 2.4, जीओएन = 10.4 ± 1.9, जो 0.5 है - पहले पृथक आबादी का 10%।

4. सेल संस्कृति और एडिपोजेनेसिस प्रेरण

  1. संस्कृति एसवीएफऔर एपीसी 6-खैर टिशू कल्चर प्लेट्स में बेसल मीडिया में प्रत्येक 2 दिन प्रतिस्थापन के साथ। 3 सीरियल मार्गों के बाद, 9 8, 24, 48, और 96 घंटे में मूल्यांकन किया जाता है, और 50,000 कोशिकाओं में / अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह प्लेटों में या 1 9 10 में अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें 1x10 2 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्रसार एलेज़ के लिए होती हैं। 10,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 48-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट्स एडिपोजेनेसिस एनाल्स के लिए, जो गुणात्मक और मात्रात्मक हैं।
  2. 48 घंटे के बाद सामंजस्य के लिए एपीसी मूल मीडिया को पूरक और अस्थि morphogenic प्रोटीन 4 (3.3 एनएमओएल / एल) के साथ प्रेरण करने से पहले भेदभाव के लिए 10 संकेत मिलता है। कोशिकाओं को सेवन करने के लिए एपीसी इंडक्शन मीडिया का उपयोग करते हुए 100% संगम (दिन 0) के 48 घंटे बाद कोशिकाओं को प्रेरित करें।
  3. 48 घंटे के बाद, आईबीएमएक्स और डेक्सैमेथेसोन के बिना एपीसी इंडक्शन मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मीडिया को बदलें, मीडिया के साथ हर दिन 48 घंटे बदलता है।
  4. एफएसीएस द्वारा मान्यता प्राप्त एमसीएस अलगाव
    1. चुंबकीय अलग से 50 μL (50,000 सेल) उप नमूना लेंएटेड कोशिकाओं और एफएसीएस समाधान से धोएं।
    2. पीडीजीएफआर + + कोशिकाओं को लेबल करने के लिए गधा विरोधी खरगोश आईजीजी डाइलाइट 405 के 1: 1,000 समाधान के 100 μL में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और resuspend। प्रकाश से 30 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. प्रवाह कोशिकामीटर पर 488 एनएम (एफआईटीसी) और 405 एनएम (डायलइट 405) फिल्टर का उपयोग करके विश्लेषण के लिए समय तक 200 μL 2% फॉर्मलडाइहाइड समाधान में कोशिकाओं को धो लें और फिर से शुरू करें।
      नोट: सुसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा लिपिड संचय मात्रात्मक रूप से एक लिपॉफिलिक एडिपोजेनेसिस प्रतिदीप्ति परख का उपयोग करके एक माइक्रोप्रेट रीडर में प्रतिदीप्ति को मापने और लिपिड संचय के लिए कैलीब्रेटर्स के रूप में प्रीडिपोसाइट्स का उपयोग करके मूल्यांकन करता है। लिपिड संचय को भी लिपिड डाई स्टेनाइजिंग और इमेजिंग द्वारा मापा जाता है, जो एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर कैमरे से लैस होता है, जिसमें कुल कोशिकाओं का प्रतिशत होता है जो लिपिड पिक्चर के साथ करते हैं या नहीं होते हैं। कोई भी प्लेट रीडर जो 485 एनएम पर उत्तेजना और 572 पर उत्सर्जन के साथ प्रतिदीप्ति को मापने में सक्षम हैएनएम विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और साथ ही साथ किसी भी माइक्रोस्कोप को डिजिटल छवियों को कैप्चर करने में सक्षम कैमरा है।

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Representative Results

प्रीडिपोसाइट्स की प्रोलीफ़ामेचर क्षमता और एडिपोसाइट पूर्ववर्ती के एडीजीजनिक ​​क्षमताएं इन लक्षणों में बनाए गए हैं। एपीवीएटी, एमपीवीएटी और पृथक एसवीएफ के एपीसी के इन विट्रो प्रसार में और पुरुष चूहों के जीओएनए का मूल्यांकन मात्रात्मक डीएनए परख के उपयोग के बाद 8, 24, 48 और 96 घंटे में किया गया था। एपीवीएटी से एपीसी को छोड़कर किसी भी समय एसवीएफ विस्तार दर में कोई अंतर नहीं देखा गया था, जो उसी साइट ( चित्रा 1 ) से एसवीएफ कोशिकाओं की तुलना में 96 घ के कम प्रसार था।

मानक शामिल करने से पहले 48 घंटे के लिए बोन मोर्फोजेनिक प्रोटीन 4 (बीएमपी 4) के साथ संगम एपीसी को प्रेरित किया गया। बूंदों में अधिक लिपिड संचय से यह स्पष्ट हो गया था कि फ्लोरोसेंट लिपिड अपस्टेक परख द्वारा मूल्यांकन ( चित्रा 2ए ) और तेल लाल ओ धुंधला हो जाना ( चित्रा 2 बी )।

एपीसी की उपज की तुलना करते समय, एमसीएस अलगाव ने एफएसीएस की तुलना में संस्कृति के लिए तैयार अधिक से अधिक कोशिकाओं का उत्पादन किया। ( चित्रा 3 ) महत्वपूर्ण रूप से, एपीसी आबादी (सीडी 34 + और पीडीजीएफआरए + + ) की वितरण और व्यवहार्यता एमसीएस और एफएसीएस के बीच समान थी। पोस्ट अलगाव की गिनती के लिए ट्राईपैन ब्लू धुंधला द्वारा निर्धारित सेल व्यवहार्यता दोनों अलगाव प्रक्रियाओं (एफएसीएस = 71.57% ± 11.0 9; एमसीएस = 79.25% ± 7.47) के समान थी। इन आंकड़ों से पता चलता है कि एपीसी की एमसीएस अलगाव एमसीएस की तुलना में अधिक सक्षम एपीसी पैदा करती है।

आकृति 1
चित्रा 1 : विज्ञापन के विट्रो प्रसार मेंएपोसाइट प्रोजेनिक कोशिका (एपीसी) एनाटोमिकल स्थान से प्रभावित है। स्ट्रोमोल व्हस्कुलर फ्रेक्शन (एसवीएफ) और एपीसी महाभुज और मेसेन्टेरिक परिवस्कुलर एडिपोज टिशू (एपीवीएटी और एमपीवीएटी, क्रमशः) और 10 सप्ताह के पुराने नर चूहों से गोनाडल वसा से अलग थे। कोशिकाओं के प्रसार को सीडिंग के बाद 8, 24, 48 और 96 एच समय अंक पर एक डीएनए मात्रा का ठहराव परख द्वारा मापा गया था। डेटा 8 गु आधारभूत ± SEM (एन = 4) से अधिक गुना वृद्धि के रूप में व्यक्त किया जाता है। महत्व * (पी <0.05) द्वारा दर्शाया गया है। चित्रा को कॉन्ट्रेरा एट अल से संशोधित किया गया 2016 13 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : एडिपोसाइट प्राइजेंट सेल (एपीसी) डिफायंस में कोई भिन्नता नहीं दिखाएंडिपो के बीच की क्षमताएं, लेकिन ग्रोथ लिपिड संचय स्ट्रोमोल व्हस्कुलर फ्रेक्शन (एसवीएफ) की तुलना में। कोशिकाओं को 48 घंटे के संगम और बीएमपी 4 के संपर्क में प्रेरित किया गया, इसके बाद डेक्सैमेथासोन और 3-आईसोबिटिल-1-मेथिलक्स्थनटाइन के लिए 48 घंटे का एक्सपोजर बनाया गया और उसके बाद मीडिया के रखरखाव के माध्यम से 14 दिनों के बाद मीडिया हर 48 घंटे में बदल गया। ( ए ) लिपिड अपतटीय एपीसी के परख जो आंकड़ों को बिना किसी अंतर के प्राथमिकता के अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया है: विभेदित एडीओपोसाइट्स (प्रीडाइपोसाइट्स: एडीओपोसाइट्स) रिलेट्रेंस यूनिट्स (आरएफयू) ± एसईएम (एन = 4) में। ( बी ) एलपीआईडी ​​(ओआरओ अपटेक) ± एसईएम (एन = 4) के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त आंकड़ों के साथ एपीसी और एसवीएफ के तेल लाल ओ (ओआरओ) धुंधला हो जाना। महत्व * (पी <0.05) द्वारा दर्शाया गया है। चित्रा को कॉन्ट्रेरा एट अल से संशोधित किया गया 2016 13 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : व्यवहार्य Adipocyte प्रोजेक्टर कोशिकाओं (एपीसी) की अलगाव यील्ड चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमसीएस) द्वारा बेहतर है। एससीएफ में सीडी34 + ( ए ) और पीडीजीएफआर + + ( बी ) की सतह मार्कर की अभिव्यक्ति एमसीएस और एफएसीएस का इस्तेमाल करते हुए पीरिवस्कुलर एडिपोज टिश्यू (महाधमनी = एपीवीएटी; एमजेन्ट्रिक = एमपीवीएटी) से अलग। डेटा को 50 मिलीग्राम ऊतक ± सेम (एन = 4) से पृथक कोशिकाओं की औसत संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है। महत्व * (पी <0.05) द्वारा दर्शाया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

वर्तमान प्रयोग का मुख्य फोकस पीवीएटी डिपो से एपीसी के अलगाव, विस्तार और एडीजीजनिक ​​प्रेरण है। यहां हम सतह के मार्करों CD34 और PDGFRα को व्यक्त करने वाले कोशिकाओं की पहचान के आधार पर एपीसी के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन सतह प्रोटीन को पहले एपीसी पर उच्च प्रसार दर के साथ पहचाना गया था और विभिन्न वसा डिपो 14 , 15 में सफेद या भूरे रंग के एडीओपोसाइट्स में अंतर करने की क्षमता। इन विशिष्ट मार्करों के आधार पर कोशिकाओं का चयन करके, हम ऐसे एपीसी आबादी को अलग करने में सक्षम थे, जो एडिओपॉइट फेनोटाइप से मेल खाते हैं जो पीवीएटी चयनित 13 में मनाया जाता है। हमारे प्रयोगों में हम विकास कारक बीएमपी 4 के पूरक के द्वारा एपीसी भेदभाव को बेहतर बनाते हैं। इससे पहले, मैकाओला और सहकर्मियों ने दिखाया कि आंत का वज़न डिपो से विशिष्ट एपीसी आबादी में बीएमपी की गतिविधि कम थीचमड़े के नीचे के डिपो को जब विभेदित किया जाता है, जब तक संस्कृति मीडिया एडीजीजनिक ​​विकास कारक बीएमपी 2 या बीएमपी 4 12 , 16 , 17 , 18 के साथ पूरक नहीं था।

चूंकि वसा ऊतकों से अलग-अलग कोशिकाओं का अलगाव कोशिकाओं की कमजोरी के कारण मुश्किल होता है, चूंकि एमसीएस उपभोग्य सामग्रियों, उपकरणों और प्रशिक्षण संसाधनों की एक छोटी कीमत पर कोशिका अलगाव के लिए एक कुशल पद्धति प्रदान करता है। यह ध्यान रखना जरूरी है कि एपीसी की पैदावार जानवर की उम्र या आकार और मीडिया के तापमान में परिवर्तन और बाँझ अलगाव पर्यावरण को बनाए रखने में विफलता से प्रभावित हो सकती है। मानॉक्सिया में संवर्धन कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव के लिए भी महत्वपूर्ण है, 19 , इस प्रकार ऊष्मायन की स्थिति का रखरखाव संस्कृति अभ्यास के लिए अभिन्न है। सेंटिफिग्यूशन की गति को बढ़ाकर 800 XG किया जा सकता है, यदि टी के दौरान पर्याप्त सेल छल्ले न बनेंवह अलगाव प्रक्रिया एंटीबॉडी की समाप्ति की जांच भी आवश्यक हो सकती है क्योंकि संयुग्मित एफआईटीसी फ्लोरोक्रोम समय के साथ नीचा सकता है। Collagenase प्रकार के बहुत से परिवर्तन I भी पाचन प्रक्रियाओं में परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि बहुत से शक्ति में भिन्नता हो सकती है अगर चूहे के अलावा किसी अन्य प्रजाति का उपयोग करना, अवरुद्ध बफर में विशिष्ट सीरम और आईजीजी भी आवश्यक हो सकता है अगर एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियां यहां इस्तेमाल किए जाने वाले पदार्थों से भिन्न होती हैं।

एफएसीएस पर एमसीएस के फायदों में यह है कि एफएसीएस की तुलना में यह अधिक आर्थिक रूप से व्यवहार्य है क्योंकि किट सस्ती हैं और इसे आसानी से खरीदा जा सकता है। यह एक प्रवाह cytometer के खरीद, रखरखाव और उपयोग प्रशिक्षण से बचा जाता है। एमसीएस का उपयोग करना चयन और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति भागीदारी के लिए फाटकों के समायोजन के बिना विशिष्ट बंधन के लिए भी अनुमति देता है।

इस अध्ययन के लिए एक सीमा यह है कि यह दो प्रीडिपोसाइट सतह मार्करों पर निर्भर था। प्रतिबद्धता और अंतर के अन्य प्रीडिपोसाइट सतह मार्करनौवहन, जैसे कि Zfp423, Sca1, और सीडी 24, को पहचान लिया गया है 20 , 21 ये मार्कर सटीक रूप से विशिष्ट फेनोटाइप की एडीओपोसाइट पूर्वक कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं; हालांकि, यहां इस्तेमाल किए जाने वाले सतह के चिह्नक का चयन किया गया था क्योंकि इन मार्करों को व्यक्त करने वाले कोशिकाओं में भूरा और सफेद दोनों फेनोटाइप 20 , 21 को प्रेरित करने की क्षमता है। इस अध्ययन की एक और सीमा एपीसी संस्कृति में विकास कारकों का चयनात्मक उपयोग था। एडीपीोजेनिजिस 22 की प्रेरण में अन्य वृद्धि कारक कॉकटेल प्रभावी रहे हैं इस अध्ययन में सेल संस्कृति भी इस तथ्य से सीमित थी कि सभी संस्कृति दो-आयामी संस्कृति प्लेटों में की गई थी। यद्यपि यह संस्कृति का आदर्श है, विवो में कोशिकाएं इस तरह से पैदा नहीं होती हैं। त्रि-आयामी वातावरण में संवर्धन आगे हाइपरट्रॉफी और हाइपरप्लासिया के लिए अनुमति दे सकता है क्योंकि यह वसा के प्राकृतिक रूप के प्राकृतिक रूप की प्रतिकृति करता हैराक्चर 23

एमसीएस का उपयोग करने की व्यावहारिकता और दक्षता के कारण, यह प्रोटोकॉल पीपीएटी में एपीसी के अलगाव के लिए और साथ ही अन्य सेल प्रकारों के लिए आदर्श है। यह प्रक्रिया प्रीडिपोकित संस्कृतियों में भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक अधिक प्रभावी तरीका प्रदान करती है। आवश्यक न्यूनतम लागत, उपकरण, और प्रशिक्षण की आवश्यकता इस पद्धति को विशिष्ट सतह मार्करों पर आधारित कोशिकाओं को अलग करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में उपयोग करने की अनुमति देती है। भविष्य के अनुप्रयोग अन्य सेल आबादी के अलगाव या अधिक विशिष्ट सेल मार्करों के उपयोग की अनुमति दे सकते हैं। सेल प्रतिबद्धता में वृद्धि कारक कॉकटेल का प्रयोग स्टेम सेल सक्रियण में उपयोगी हो सकता है

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

कॉन्ट्रेरास और वाट लेबोरेटरीज और डॉ विलियम रैफेल। इन प्रयोगों का समर्थन NHLBI F31 HL128035-01 (टिशू पाचन प्रोटोकॉल मानकीकरण), एनएचएलबीआई 5R01HL117847-02 और 2P01HL070687-11A1 (जानवरों), और एनएचएलबीआईआरआरआरएच 0 9 8 9 7847-02 (सेल अलगाव और संस्कृति) द्वारा किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Dissection
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12562-36
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150
Splinter Forceps George Tiemann & Co 160-55
Tissue Scissors George Tiemann & Co 105-400
KRBB Solution
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Potassium Chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 7758-114
Glucose Sigma-Aldrich 50-99-7
Antibiotic/Antimicotic Corning 30-004-CI
HEPES Corning 25-060-CI
Tissue Digestion
Collagenase Type 1 Worthington Biochemical LS004196
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific 9048-46-8
Red Blood Cell Lysis Buffer BioLegend 420301 1X Working Solution
Water Bath Thermo-Fisher Scientific 2876 Reciprocal Shaking Bath
Biosafety Cabinet Thermo-Fisher Scientific 1385
Rotisserie Incubator Daigger EF4894C
100 µm Cell Strainer Thermo-Fisher Scientific 22-363-549 Yellow
40 µm Cell Strainer Thermo-Fisher Scientific 22-363-547 Blue
Hemocytometer Cole-Parmer UX-79001-00
Trypan Blue Sigma-Aldrich 93595
Cell Isolation
OctoMACS Kit Miltenyi Biotech 130-042-108
(DMEM):F12 Medium Corning 90-090 Medium Base
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35016CV USA Origins
Normal Donkey Serum AbCam AB7475
Anti-CD34 Santa Cruz SC-7324 FITC-conjugated
Anti-PDGFRα Thermo-Fisher Scientific PA5-17623
Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 712-007-003
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X Corning 46-013-CM 1X Working Solution
EDTA Fisher Scientific 15575020
Cell Culture
CO2 Cell Incubator Thermo-Fisher Scientific 51030285 Heracell 160i 
6-Well Plates Corning 3516 TC-Treated
48-Well Plates Corning 3548 TC-Treated
96-Well Plates, Black Wall Corning 353376 TC-Treated
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8 TC-Treated
Fetal Calf Serum (FCS) Corning 35011CV USA Origins
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich 50-81-7
Biotin Sigma-Aldrich 58-85-5
Pantothenate Sigma-Aldrich 137-08-6
L-Glutamine Corning 61-030
Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) Prospec Bio CYT-081
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 400-25
Leukemia Inhibitory Factor PeproTech 250-02
Platelet-derived Growth Factor BB Prospec Bio CYT-740
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) PeproTech 450-33
Insulin Corning 25-800-CR ITS Solution
IBMX Sigma-Aldrich 28822-58-4
Dexamethasone Sigma-Aldrich 50-02-2
T3 (Triiodothyronine) Sigma-Aldrich 6893-023
Cell Analysis
CyQUANT Proliferation Assay Thermo-Fisher Scientific C7026
AdipoRed Fluorescence Assay Reagent Lonza PT-7009
Oil Red O Lipid Dye Reagent Sigma-Aldrich O1391 In Solution
M1000 Microplate Reader Tecan
Eclipse Inverted Microscope Nikon
Digital Sight DS-Qil Camera Nikon

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 124 परिवाश्म्य वसा ऊतक एडीपोकीटे पूर्वज एडीपीोजेनेसिस
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Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (124), e55818, doi:10.3791/55818 (2017).

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