Summary
Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).
Abstract
L'espansione del tessuto adiposo perivascolare (PVAT), un importante regolatore della funzione vascolare attraverso la segnalazione paracrina, è direttamente correlata allo sviluppo dell'ipertensione durante l'obesità. La portata dell'ipertrofia e dell'iperplasia dipende dalla localizzazione del deposito, dal sesso e dal tipo di fenotipi di APC (Adipocyte Progenitor Cell) presenti. Le tecniche utilizzate per l'APC e l'isolamento dei preadipociti negli ultimi 10 anni hanno drasticamente migliorato l'esattezza in cui le singole cellule possono essere identificate in base a determinati marcatori di superficie cellulare. Tuttavia, l'isolamento di APC e di adipociti può essere una sfida a causa della fragilità della cellula, soprattutto se la cellula intatta deve essere mantenuta per le applicazioni di coltura cellulare.
La selezione delle cellule magnetiche ( MCS) fornisce un metodo per isolare un maggior numero di APC vitali per unità di peso del tessuto adiposo. L'APC raccolto da MCS può essere utilizzato per i protocolli in vitro per espandere la preaDipociti e li differenzia in adipociti attraverso l'uso di cocktail di fattori di crescita che permettono l'analisi del potenziale prolifico e adipogenico conservato dalle cellule. Questo esperimento si è concentrato sui depositi PVAT aortici e mesenterici, che svolgono ruoli chiave nello sviluppo della malattia cardiovascolare durante l'espansione. Questi protocolli descrivono metodi per isolare, espandere e differenziare una popolazione definita di APC. Questo protocollo MCS consente l'utilizzo dell'isolamento in qualsiasi esperimento in cui è necessaria la classificazione delle celle con attrezzature minime o addestramento. Queste tecniche possono aiutare ulteriori esperimenti per determinare la funzionalità di popolazioni cellulari specifiche in base alla presenza di marcatori della superficie cellulare.
Introduction
Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), grazie alla sua prossimità ai vasi sanguigni, è una componente principale di segnalazione paracrina nella funzione vascolare 1 . L'espansione di questo tessuto adiposo dipende dal fenotipo delle cellule progenitrici adipociti (APC) presente 2 , 3 . L'isolamento delle cellule da tessuti adiposi è difficile, poiché gli adipociti primari sono fragili, fluttuanti e di dimensioni variabili. Alcune tecniche di isolamento possono anche alterare il fenotipo e la morfologia delle cellule aumentando la sintesi proteica infiammatoria e riducendo l'espressione genica adipogenica 4 , sottolineando l'importanza di un protocollo che mantiene l'integrità delle cellule.
La cultura delle cellule primarie e delle sottopopolazioni specifiche preadipocitiche fornisce un approccio riduzionista alla crescita in vivo e mantiene un equivalente equipaggiamento genetico cellulare 5 , anche se ilMe con queste cellule è limitata a causa del deterioramento con l'invecchiamento, o senescenza 6 . I preadipociti provenienti da vari depositi adiposi, compresi i depositi sottocutanei e omentali, mostrano anche differenze nella proliferazione 7 , che sottolinea l'importanza di raccogliere le cellule da siti anatomici specifici. Le cellule dei precursori dai depositi adiposi bianchi non PVAT sono stati caratterizzati negli studi precedenti 7 , 8 , 9 , ma meno conosciuti sui fenotipi PVAT APC.
Le tecniche qui descritte consentono l'analisi di popolazioni APC specifiche e definite con un impatto minimo sulla loro morfologia, sulla loro vitalità e sul potenziale di proliferare e differenziare. La selezione di celle magnetiche attivata (MCS) è suscettibile di applicazioni a valle, come la cultura, in quanto le perle si dissolvono senza alterare la cella. MCS è anche economico, e una volta che l'anticorpo conLe centrazioni sono state standardizzate, la necessità di analisi della citometria a flusso è minima. Studi in vitro con precursori PVAT possono anche dare un'occhiata al potenziale che queste cellule primarie possono avere.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo documento seguono le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Michigan State University. Tutti i buffer e i media devono essere protetti dalla luce.
1. Preparazione di buffer, supporti e strumenti
- Preparare la soluzione di Krebs Ringer Bicarbonato-Buffered (KRBB): 135 mM di cloruro di sodio, 5 mM di potassio, 1 mM di solfato di magnesio, 0,4 mM di fosfato di potassio fosfato, 5,5 mM di glucosio, 1% di antibiotico / antimicotico (10,000 unità / ml di penicillina, 10,000 μg / ML streptomicina, 25 μg / mL di amfotericina B) e 10 mM HEPES (pH = 7,4). Questa soluzione è stabile per 3 settimane se conservata sterile e a 4 ° C.
- Preparare collagenasi tipo 1 Soluzione: 1 mg / mL in KRBB con 4% albumina bovina serum (BSA). Questa soluzione deve essere mantenuta a 37 ° C ed è stabile per 4 ore.
- Preparare la soluzione di tampone di lisi di eritrociti: 154 mM di ammonio cloruro, 10 mM di bicarbonato di potassio, E 0,1 mM EDTA. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese.
- Preparare il buffer di blocco MCS: Base media DMEM / F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 5% serum asino normale, 40 μL / mL F (ab) Fragmento Donkey IgG anti-ratto. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese.
- Preparare la soluzione di buffer MCS: salina fosfata-bufferizzata (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA e 2 mM EDTA. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese. La soluzione di de-gas riscaldando a 37 ° C in un contenitore di vetro e poi applicando un vuoto per 15 s. Lasciare inutilizzato tamponato sigillato.
- Preparare il substrato basale di Fraction vascolare Stromal (SVF): il mezzo di equilibrio Dulbecco-modificato (DMEM): F12, 15% Fetal Calf Serum (FCS), 1% antibiotico / antimicotico (10.000 unità / ml penicillina, 10.000 μg / mL streptomicina, 25 μg / ML amfotericina B), 44,05 mM bicarbonato di sodio, 100 μM ascorbico, 33 μM biotina, 17 μM pantotenato, 2 mM L-glutammina e 20 mM HEPES. Conservare sterile e a 4 ° C fino a 2 settimane.
- Preparare APC &(10 ng / mL), fattore di crescita BB (10 ng / mL) e fattore di crescita di fibroblasti di base ( 5 ng / ml). Conservare sterile e a 4 ° C fino a 2 settimane.
- Preparare APC Media: APC Media con 10% FBS, 2,5 μg / mL insulina, 0,5 mM 2-isobutil-1-metillaxantina (IBMX), 1 μM dexametasone e 200 pM T3 (ormone tiroideo triiodotironina). Conservare sterile e a 4 ° C fino a 2 settimane.
2. Isolamento dei progenitori adipociti
- Anestetizzare il ratto secondo gli orientamenti istituzionali. Posizionare il ratto nella ricostruzione dorsale. Confermare la profondità dell'anestesia attraverso un pizzico e la perdita di risposta riflessi a questo doloroso stimolo.
NOTA: Questo protocollo utilizza ratti da 10 settimane di Sprague Dawley e 70 mg / kg di pentobarbital consegnati tramite un'iniezione intraperitoneale. - Effettuare un'incisione mediana verticale wIth forbici lungo lo sterno nell'area toracica e nell'area perineale. Accedere alla cavità addominale ed esporre l'arteria mesenterica superiore, i piccoli vasi di resistenza mesenterica (mPVAT) e l'aorta toracica (aPVAT).
- Eliminate tutte le connessioni alla mesenteria e l'aorta e rimuovete le navi dagli animali. Isolare PVAT usando un microscopio di dissezione e un piatto di Petri riempito con KRBB per visualizzare le vaschette e isolare PVAT.
- In questo esperimento, raccogliere l'adiposità gonadale (GON) per rappresentare un deposito adiposo non-PVAT. Inserire i rilievi grassi isolati su ghiaccio in KRBB con 10 mM HEPES (pH = 7,4).
- In un cappuccio di biosicurezza, trasferire circa 50 mg di tessuto in un tubo da 1,7 ml con 1 ml di collagene tipo I e mescolare con forbici di tessuto (da 1 a 3 mm pezzi).
- Esempi di digestione mediante incubazione a 37 ° C in un incubatore a rotisserie (o incubatore con un agitatore orbitale) per 1 h. In un cappuccio di biosicurezza, filtrare in sequenza il materiale digerito attraverso 100 e 40 Μm in un tubo da 50 ml. Centrifugare filtrato a 4 ° C per 10 min a 300 × g.
NOTA: Tutte le fasi del protocollo da qui in avanti devono essere eseguite in un cappuccio di biosicurezza per mantenere le cellule sterili. - Versare il supernatante e risospendere i pellet che contengono le cellule SVF in 1 mL di 1X Erythrocyte Lysis Buffer Solution e trasferire in un tubo microfuge da 1,7 mL. Incubare le cellule per 5 minuti a RT protetto dalla luce e centrifugare a 4 ° C per 5 min a 300 x g.
- Versare il supernatante e risospendere il pellet di cellule rimanenti in SVF Basal Media. Raccogliere un sotto-campione da 20 μL per contare le cellule vive con Trypan Blue Solution.
NOTA: il numero di celle SVF isolabili varia per sito. I numeri medi di SVF raccolti per mg di tessuto sono: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Selezione delle cellule magnetiche attivate
_content "> NOTA: isolare APC da SVF sulla base dei marker di superficie delle cellule CD34 e PDGFRα eseguendo tutte le fasi a 4 ° C.- Le cellule di spin per 5 minuti a 300 x g. Versare il supernatante e risospendere il pellet di cellule nel buffer di blocco MCS a 1 x 10 6 cellule / ml e incubare per 20 minuti.
NOTA: Le sospensioni cellulari di 1 x 10 6 - 2 x 10 8 cellule / mL possono essere separati in modo efficace. - Incubare le cellule con 5 μL di miele anti-CD34 coniugato con FITC (1 μg / 1 x 106 cellule) per 30 minuti a 4 ° C. Le cellule di spin per 5 minuti a 300 xg e 4 ° C.
- Incubare con 4 μL microbeads anti-FITC e 96 μL di buffer MCS (volume totale di 100 μL) per 5 minuti a 4 ° C nel buio per separare le cellule CD34 + e CD34.
- Collegare il separatore magnetico al supporto e collocare la colonna MultiSort (MS), con le ali della colonna in avanti, nel separatore. Mettere un 5 mlTubo di raccolta sotto la colonna MS nel supporto tubo superiore.
- Preparare la colonna MS risciacquando con la soluzione MCS Buffer. Applicare 500 μL di buffer MCS in cima alla colonna e lasciare che il buffer scorra. Scartare l'effluente e sostituire il tubo di raccolta.
- Caricare la sospensione cellulare contrassegnata con anticorpi sulla colonna MS preparata. Raccogliere il flusso che contiene le cellule non contrassegnate.
- Lavare la colonna MS con 500 μL di MCS Buffer A3 degasato. Raccogli le cellule non contrassegnate che passano e si combinano con il flusso passato dalla fase precedente.
- Rimuovere la colonna MS dal separatore magnetico e collocarla su un nuovo tubo di raccolta. Pipettare 1 ml di MCS Buffer sulla colonna MS. Immediatamente sciacquare la frazione con le cellule etichettate magneticamente saldamente, ma lentamente, applicando lo stantuffo fornito con la colonna per non permettere gas in eccesso nella colonna.
NOTA: I numeri di cellule isolati variano per sito. Numero medio di CD34 + APC isolati dalla popolazione SVF perMg di tessuto sono: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Le cellule di spin per 5 minuti a 300 × g e 4 ° C. Incubare la frazione CD34 + raccolta in 10 μL di una soluzione 1/200/1 x 106 cellule Rabbit anti-PDGFRα per 30 min a 4 ° C.
- Centrifugare di nuovo le cellule per 5 minuti a 300 xg e 4 ° C. Incubare le cellule etichettate con 4 μL microbeads IgG anti-coniglio e 96 μL di buffer MCS ripetendo i passaggi da 3.3 a 3.7 per isolare.
NOTA: I numeri di cellule isolati variano per sito. Il numero medio di PDGFRα + APC isolati dalla popolazione CD34 + per mg di tessuto sono: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, che è 0,5-10% della popolazione precedentemente isolata.
- Centrifugare di nuovo le cellule per 5 minuti a 300 xg e 4 ° C. Incubare le cellule etichettate con 4 μL microbeads IgG anti-coniglio e 96 μL di buffer MCS ripetendo i passaggi da 3.3 a 3.7 per isolare.
4. Induzione della cultura cellulare e dell'adipogenesi
- Coltivi la SVFE APC in piastre di coltura a tessuto 6-Well nei supporti basali con sostituzione ogni 2 giorni. Dopo 3 passaggi seriali, piastre in piastre di coltura a tessuto 96-pozzetto nero a 1x10 2 cellule / pozzetto per i test di proliferazione, valutate a 8, 24, 48 e 96 h e a 50.000 cellule / pozzetto in piatti a 24 pozzetti o 10.000 cellule / pozzetto in piastre di coltura a tessuto 48-well per i test di adipogenesi, qualitativi e quantitativi.
- Supplemento basale media APC per 48 h post-confluenza e prima dell'induzione con proteina morfogenica ossea 4 (3,3 nmol / L) come indicato 10 per la differenziazione. Indurre le cellule dopo 48 h di 100% di confluenza (giorno 0) utilizzando il supporto APC Induction per incubare le cellule.
- Dopo 48 h, sostituire i supporti per mantenere le celle nei media APC Induction senza IBMX e deksametasone, per 14 giorni con i cambiamenti di media ogni 48 h.
- Isolamento MCS convalidato da FACS.
- Prendere un campione sottile di 50 μL (50.000 celle) separato magneticamenteE lavare con soluzione FACS.
- Centrifugare le cellule e risospendere in 100 μl di una soluzione 1: 1.000 di IgG Dylight 405 anti-coniglio asina per etichettare le cellule PDGFRα + . Incubare per 30 min protetto dalla luce e a 4 ° C.
- Lavare le cellule e risospendere in 200 μL di soluzione di formaldeide al 2% fino al tempo per l'analisi usando filtri a 488 nm (FITC) e 405 nm (Dylight 405) su un citometro di flusso.
NOTA: L'accumulo lipidico per cellule coltivate viene valutato quantitativamente utilizzando un saggio di fluorescenza adipogenesi lipofile in un microplate reader che misura la fluorescenza e utilizzando preadipociti come calibratori per l'accumulo lipidico. L'accumulo lipidico è anche misurato qualitativamente dalla colorazione dei lipidi e dall'immagine eseguita su un microscopio invertito dotato di una fotocamera, rendendo la percentuale di cellule totali che fanno o non contengono lipidi osservabili. Qualsiasi lettore di piastre che è in grado di misurare la fluorescenza con l'eccitazione a 485 nm e l'emissione a 572Nm è adatto per l'analisi e qualsiasi microscopio con una fotocamera in grado di catturare immagini digitali.
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Representative Results
La capacità proliferativa dei preadipociti e il potenziale adipogenico dei precursori adipociti sono caratteristiche che vengono mantenute in vitro 11 . La proliferazione in vitro di SVF e APC isolati da aPVAT, mPVAT e GON di ratti maschi è stata valutata a 8, 24, 48 e 96 h dopo la placcatura usando un saggio quantitativo del DNA. Nessuna differenza di sito nel tasso di espansione di SVF è stata osservata in qualsiasi momento tranne che per l'APC da aPVAT, che ha avuto meno proliferazione per 96 ore rispetto alle cellule SVF dello stesso sito ( Figura 1 ).
Confluent APC stimolato con proteina Morphogenic Bone 4 (BMP4) per 48 ore prima dell'induzione standard 12 ha mostrato differenziazione. Ciò è stato evidente dal maggiore accumulo lipidico in gocce, valutato sia dal saggio fluorescente di assunzione di lipidi ( Figura 2A ) e la colorazione Red O ( Figura 2 B ).
Quando si confronta la resa di APC, l'isolamento MCS ha prodotto un numero maggiore di cellule pronte per la coltura rispetto a FACS. ( Figura 3 ) Importante, la distribuzione e la vitalità delle popolazioni APC (CD34 + e PDGFRα + ) era simile tra MCS e FACS. La vitalità delle cellule determinata dalla colorazione Trypan Blue per il conteggio dell'isolamento postale era simile per entrambe le procedure di isolamento (FACS = 71,57% ± 11,09; MCS = 79,25% ± 7,47). Questi dati dimostrano che l'isolamento MCS di APC produce un numero maggiore di APC vitali rispetto a MCS.
Figura 1 : Proliferazione in vitro di AdLe cellule progenitrici ipocyte (APC) sono influenzate da una posizione anatomica. La frattura vascolare Stromal (SVF) e APC sono stati isolati dal tessuto adiposo perivascolare aortico e mesenterico (aPVAT & mPVAT rispettivamente) e l'adiposa gonadica da ratti maschi di 10 settimane. La proliferazione delle cellule è stata misurata con un dosaggio di quantificazione del DNA a 8, 24, 48 e 96 ore dopo la semina. I dati sono espressi come aumento della piega per 8 ore di baseline ± SEM (N = 4). Significato è indicato con * (P <0,05). Figura modificata da Contreras et al . 2016 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Le cellule progenitrici adipociti (APC) non mostrano variazioni in differenzaAbilità tra depositi ma maggiore accumulazione lipidica rispetto alla frazione vascolare Stromal (SVF). Le cellule sono state indotte dopo 48 h di confluenza ed esposizione a BMP4 seguita da 48 ore di esposizione a deksametasone e 3-isobutil-1-metilxantina e successivamente sostenute in mezzi di manutenzione per 14 giorni con cambiamenti di media ogni 48 h. ( A ) Saggio di assunzione lipidica di APC differenziato con dati espressi come rapporto tra preadipociti indifferenziati: adipociti differenziati (preadipociti: adipociti) in unità relative di fluorescenza (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) La colorazione dell'olio rosso O (ORO) di APC e SVF con dati espressi come percentuale di cellule con lipide (ORO Uptake) ± SEM (N = 4). Significato è indicato con * (P <0,05). Figura modificata da Contreras et al. 2016 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : La resa di isolamento delle cellule progenitrici di adipociti vive (APC) è migliorata mediante la selezione magnetica delle cellule attivate (MCS). L'espressione del marker di superficie di CD34 + ( A ) e PDGFRα + ( B ) in SVF isolata da tessuti adiposi perivascolari (aortico = aPVAT; mesenterico = mPVAT) utilizzando MCS e FACS. I dati sono espressi come numero medio di cellule isolate da 50 mg di tessuto ± SEM (N = 4). Significato è indicato con * (P <0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'obiettivo principale del presente esperimento è l'isolamento, l'espansione e l'induzione adipogenica di APC dai depositi PVAT. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento di APC basato sull'identificazione delle cellule che esprimono i marker di superficie CD34 e PDGFRα. Queste proteine superficiali sono state precedentemente identificate in APC con elevati tassi di proliferazione e il potenziale di differenziarsi in adipociti bianchi o marroni in vari depositi adiposi 14 , 15 . Selezionando le cellule basate su questi marcatori specifici, siamo stati in grado di isolare popolazioni APC simili da più depositi adiposi che corrispondono al fenotipo adipocitario osservato nel PVAT selezionato13. Nei nostri esperimenti abbiamo migliorato la differenziazione APC completando il fattore di crescita BMP4. In precedenza, Macotela e colleghi hanno dimostrato che specifiche popolazioni APC dai depositi adiposi viscerali avevano meno attività BMP rispetto a quelle provenienti daI depositi sottocutanei quando sono differenziati a meno che il supporto di coltura sia stato completato con i fattori di crescita adipogenici BMP2 o BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Poiché l'isolamento di singole cellule da tessuto adiposo è difficile a causa della fragilità delle cellule, l'utilizzo di MCS fornisce un metodo efficiente per l'isolamento cellulare a un costo più basso di materiali di consumo, attrezzature e risorse di formazione. È importante notare che la resa APC può essere influenzata dall'età o dalla dimensione dell'animale, dai cambiamenti nella temperatura dei supporti e dall'insufficienza di mantenere un ambiente di isolamento sterile. La coltura delle cellule in normossia è anche importante per la proliferazione e la differenziazione 19 , mantenendo così le condizioni dell'aria di incubazione è parte integrante della pratica della cultura. Le velocità di centrifugazione possono essere aumentate a 800 xg se non si formano sufficienti pellicole di cellule durante tIl processo di isolamento. Controllare la scadenza degli anticorpi può anche essere necessaria poiché il fluorochrome coniugato FITC può degradarsi nel tempo. La modifica di un sacco di collagenasi di tipo I può anche richiedere alterazioni alle procedure di digestione poiché i lotti possono variare in potenza. Se si utilizza una specie diversa da ratto, può essere necessario anche specifico siero e IgG nel buffer di blocco se la specie ospite degli anticorpi è diversa da quella utilizzata qui.
Tra i vantaggi di MCS su FACS è che è più economicamente possibile di FACS poiché i kit sono poco costosi e possono essere facilmente acquistati. Ciò evita anche l'acquisizione, la manutenzione e l'addestramento di utilizzo di un citometro di flusso. L'utilizzo di MCS consente anche di legare specificamente senza la regolazione dei cancelli per la selezione e il coinvolgimento della fluorescenza di sfondo.
Una limitazione a questo studio è che si è basata su due marcatori di superficie preadipociti. Altri marcatori di superficie preadipociti di impegno e diffErentiation, come Zfp423, Sca1 e CD24, sono stati identificati 20 , 21 . Questi marker possono identificare con precisione le cellule progenitrici adipociti impegnate di specifici fenotipi; Tuttavia, i marcatori di superficie usati qui sono stati selezionati poiché le cellule che esprimono questi marcatori hanno la capacità di indurre sia fenotipi di colore marrone e bianco 20 , 21 . Un'altra limitazione di questo studio è stata l'uso selettivo dei fattori di crescita nella coltura APC. Altri cocktail di fattori di crescita sono stati efficaci nell'induzione dell'adipogenesi 22 . La cultura cellulare in questo studio è stata anche limitata dal fatto che tutta la cultura è stata fatta in piastre di cultura bidimensionale. Anche se questa è la norma culturale, le cellule in vivo non si proliferano in questo modo. La coltura in ambienti tridimensionali può consentire ulte- riore ipertrofia e iperplasia in quanto replica la forma naturale dello stomaco adiposoStruttura 23 .
A causa della praticità e dell'efficienza dell'utilizzo di MCS, questo protocollo è ideale per l'isolamento di APC e di altri tipi di cellule in PVAT. Questa procedura fornisce anche un modo più efficace per indurre la differenziazione nelle colture preadipocitarie. Il costo minimo, l'attrezzatura e la formazione necessari consentono di utilizzare questo metodo in qualsiasi laboratorio che desideri isolare le cellule in base a marcatori specifici di superficie. Le applicazioni future possono consentire l'isolamento di altre popolazioni cellulari o l'uso di marcatori cellulari più specifici. L'uso di cocktail di fattori di crescita nell'impegno cellulare può essere utile per l'attivazione delle cellule staminali
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Laboratori Contreras e Watt e Dr. William Raphael. Questi esperimenti sono stati supportati da NHLBI F31 HL128035-01 (standardizzazione del protocollo di digestione tissutale), NHLBI 5R01HL117847-02 e 2P01HL070687-11A1 (animali) e NHLBI 5R01HL117847-02 (isolamento e coltura cellulare).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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