Summary
Vaskulære endotelet styrer tett leukocytter rekruttering. Utilstrekkelig leukocytter bloduttredelse bidrar til menneskelig inflammatoriske sykdommer. Derfor er romanen regulatoriske elementer av endothelial aktivering nødvendig for å utforme bedre behandling for inflammatoriske lidelser. Her beskriver vi en omfattende metodikk for å karakterisere romanen endothelial regulatorer som kan endre leukocytter handel ved betennelser.
Abstract
Endothelial laget er avgjørende for å opprettholde homeostase i kroppen ved å styre mange forskjellige funksjoner. Regulering av inflammatorisk respons av endothelial lag er viktig å effektivt bekjempe skadelige innganger og bistand i utvinningen av skadede områder. Når endotelceller er utsatt for en inflammatorisk miljø, for eksempel den ytre delen av gram-negative bakterier membran, lipopolysakkarid (LPS), de express løselig pro-inflammatoriske cytokiner, som Ccl5, Cxcl1 og Cxcl10, og utløse de aktivering av sirkulerende leukocytter. I tillegg aktiverer uttrykk for vedheft molekyler E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1 på endothelial overflaten samhandling og vedheft av de aktiverte leukocytter endothelial laget, og til slutt bloduttredelse mot betent vev. I dette scenariet må endothelial funksjonen være regulert tett fordi overdreven eller defekt aktivering i leukocytter rekruttering kan føre til provoserende-relaterte lidelser. Siden mange av disse lidelser har en effektiv behandling, må romanen strategier med fokus på vaskulær laget undersøkes. Vi foreslår omfattende analyser som er nyttige for søk av romanen endothelial regulatorer som endrer leukocytter. Vi analysere endothelial aktivisering med bestemte uttrykk mål involvert i leukocytter rekruttering (som, cytokiner, chemokines og vedheft molekyler) med flere teknikker, inkludert: sanntid kvantitative polymerase kjedereaksjon ( RT-qPCR), western blot, flow cytometri og vedheft analyser. Disse bestemmer endothelial funksjon i inflammatorisk sammenheng og er svært nyttig å utføre screening analyser betegner romanen endothelial inflammatorisk regulatorer som er potensielt verdifulle utforme nye strategier.
Introduction
Betennelse er en gunstig biologisk reaksjon mot smittsomme sykdommer, med store mål å eliminere patogene og reparere skadet vev. Under visse betingelser, for eksempel kroniske infeksjoner eller autoimmune sykdommer, løses betennelse ikke. I stedet, det er en avvikende reaksjon med kontinuerlig infiltrasjon av leukocytter, noe som resulterer i en langvarig immunrespons som fører til vevsskade, fibrose, tap av funksjon, og samlet, funksjonshemming og i noen tilfeller død pasienten. Disse menneskelige lidelsene, katalogisert som inflammatory lidelser, innebærer alle blodkar for kontroll av leukocytter bloduttredelse1,2.
Endotelceller spiller en grunnleggende rolle i regulering av inflammatorisk respons ved å kontrollere leukocytter menneskehandel. Når endothelial laget er utsatt for inflammatoriske mediatorer som LPS, hvile endotelet aktiverer og uttrykker pro-inflammatoriske cytokiner (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) og vedheft molekyler (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1) som tjeneste rekruttering av sirkulerende leukocytter til området infeksjon. De leukocytter primet med utgitt cytokiner deretter megle rullende og samhandling med endotelial laget gjennom korrespondent selvklebende motstykkene: PSGL-1 selectin, α4β1 integrin VCAM-1 og αLβ2 integrin ICAM-1. Til slutt, leukocytter migrere over blodkar mot fokus for betennelse3.
Den viktige rollen endotelet i å regulere betennelsesreaksjon har blitt demonstrert på mus som var genetisk endret for å uttrykke den LPS reseptor, toll-like reseptor 4 (TLR4), bare på endotelceller. Disse endothelial-TLR4 dyrene kunne svare på en LPS-mediert betennelse og oppdage infeksjonen generert etter bakterier inoculation, og dermed oppnå infeksjon oppløsning og overlevelse på samme nivå som vill type mus4 , 5.
For endotelet regulert betennelsesreaksjon veien, har det blitt postulert at hemming på noen stadier av leukocytter-endotelet interaksjon ville føre til reduksjon av trans-endothelial migrasjon og en bedre prognosen for provoserende-relaterte sykdommer. Faktisk, er flere strategier målretting endothelial aktivisering og leukocytt-endotelet samspillet utformet for å hindre bloduttredelse av immunceller som behandling for inflammatoriske lidelser6,7.
I denne rapporten beskriver vi en grundig gruppe i vitro teknikker for fullt karakterisere endothelial aktiviteten svar inflammatorisk stimulans LPS og dens rolle leukocytter aktivisering og vedheft på vaskulær laget. Endothelial celle modellen brukes i dette manuskriptet var musen lunge endothelial celle linjen (MLEC-04), som beskrevet av Hortelano et al. 8. den MLEC-04 celle linje har blitt validert i litteraturen til en passende systemet å studere endothelial aktivisering9,10. Basert på forskningsinteresser, disse kan lett ekstrapolert alle endothelial eller leukocytter systemer og provoserende profil. Når endothelial parameterne i de valgte betingelsene er definert, kan systemet teste romanen narkotika på foreslåtte eksperimentering evaluere vaskulær aktiveringen. I denne provoserende sammenheng endotelet cellene testet med sammensatte interesse kan sammenlignes kontrollere forholdene cellene og eventuelle resulterende forskjeller kan informere stoffets prognostiske utfall på utvikling og progresjon av betennelse. For å konkludere, foreslår vi en relevant system for å karakterisere nye stoffet mål til endotelceller, som kan påvirke utformingen av romanen vaskulær-spesifikk terapi mot provoserende-relaterte sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. endothelial cellekultur
- vev kultur behandlet plater
- Coat 100 mm vev kultur plater med 2,5 mL gelatin løsning (autoklaveres, 0,1% gelatin i destillert vann) for 30 min på 37 ° C, dette kan ekstrapolert nødvendig godt formatet. Sug opp gelatin løsningen og la til å air-dry i vev kultur panseret.
- Vev kultur forhold
- dyrke MLEC-04 cellene i en biologisk inkubator (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO 2). Vokse cellene i komplett media av Dulbecco ' s endret Eagle Medium: næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F-12) med 10% fosterets Bovine Serum (FBS) og 100 enheter/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin (P/S).
- Telle celler av Neubauer kammeret standardmetoden, og Legg til MLEC-04 cellene 100 mm gelatin-behandlet plater i 10 mL komplett medier, på en lav tetthet av 2-11 x 10 4 celler/cm 2. Dele cellene 1:3 når de når samløpet.
Merk: Dette skjer vanligvis etter to til tre dager i kultur. - Subkultur cellene ved å vaske platene med 10 mL steril fosfat bufret saltvann (PBS) etterfulgt av å legge 2 mL trypsin-EDTA løsning (0,25% trypsin, 5 mM EDTA) og Inkuber i 3 minutter på 37 ° C.
- Stoppe trypsin-EDTA reaksjonen og gjenopprette suspendert cellene ved å legge 10 mL komplett medier. Nedspinning cellene (300 x g, 5 min), forkaste nedbryting, resuspend av mobilnettet pellets komplett og subkultur riktig.
2. LPS behandling og meglere
- Plate MLEC-04 cellene i komplett medier på sub samløpet til følgende godt format: 7 x 10 5 celler/godt på 6-vel plater og 2,5 x 10 5 celler/godt på 96-brønns tallerkener.
- Ruge kultur 6 h i en celle inkubator (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO 2). Bytte cellene til ufullstendig media (DMEM-F12, P/S) og la overnatting (på) å synkronisere og redusere celle aktiviteten.
- Fjerne media og teste romanen farmakologiske forbindelser ved rugende endotelceller med (eller uten) stoffet i spørsmålet (f.eks DT 10) fortynnet i ufullstendige media (30 min, 37 ° C), legge til 1,4 mL/bra for 6-vel tallerken eller 0.14 mL/vel for 96-brønns plater).
- Utfordrer cellene ved å legge til LPS incubation media (100 ng/mL, siste konsentrasjon) for perioden angitt i hver analysen. Bruke PBS som en kontroll.
3. Evaluering av Transcriptional profil på aktivert endotelet av RT-qPCR
- frø MLEC-04 cellene på sub samløpet i 6-brønnen plater (7 x 10 5 celler/vel). Inkuber 6 h (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO 2) og etterpå fortsetter å serum sult (Inkuber ON).
- Fjerne media og behandle (eller ikke behandler) på endothelial celle kulturer med stoffet rundt fortynnet i ufullstendige media (Inkuber 30 min, 37 ° C), legge til 1,4 mL/bra for 6-vel plate (30 min, 37 ° C).
- Utfordre cellene ved å legge til 100 ng/mL LPS inkubert media (som beskrevet i trinn 2.3) og ruge for 6 h. stoppe reaksjonen ved å vaske to ganger med kaldt PBS og holde platene på-80 ° C til prøve behandling.
- RNA utvinning
- Tin platene og tilsett 1 mL/vel RNA utvinning buffer (38% fenol og 0,8 M guanidinium isothiocyanate, se tabell av materialer). La stå i 30 min ved romtemperatur (RT) under omrøring og samle homogenate i 1,5 mL rør.
- Legge til 200 µL kloroform og agitere forsiktig for 15 s. Incubate i 3 minutter på RT og sentrifuger (11,600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Overføre vandige fasen til en annen 1,5 mL tube. Utløse RNA ved å legge 500 µL isopropanol etterfulgt av en 10 min incubation RT og deretter sentrifugering (11,600 x g, 4 ° C).
- Forkaste nedbryting og vaske pellets med 75% etanol vortex agitasjon og deretter sentrifugering (7500 x g, 4 ° C).
- Air-dry pellet og solubilize RNA i 25 µL ren H 2 O av rugende i 10 min på 55 ° C. holde RNA ved-80 ° C til prøve behandling.
- Antall og renhet av
- kvantifisere RNA konsentrasjonen av måler absorbansen av utvalget på 260 nm i et spektrofotometer (se Tabell av materialer).
- Mål på 230 nm og 280 nm å bestemme RNA renheten.
Merk: Forholdet på 260/280 indikerer protein eller fenol forurensning. Forholdet nær 2 er akseptabelt. Forholdet på 260/230 angir EDTA, karbohydrater og fenol forurensninger. Verdier mellom 2.0-2.2 aksepteres.
- Sjekke RNA integritet
- kjører 2 µg totale RNA og en RNA stigen på en 1,5% denaturing agarose gel, visualisere en gel dokumentasjon systemet (se Tabellen for materiale).
Merk: Forholdet 2:1 helt og skarp 28S og 18S rRNA band indikerer en intakt RNA. Delvis degradert RNA løser som en smurt utseende.
- kjører 2 µg totale RNA og en RNA stigen på en 1,5% denaturing agarose gel, visualisere en gel dokumentasjon systemet (se Tabellen for materiale).
- RT-qPCR
- syntetisere komplementære DNA (cDNA) fra en enkelt strandet RNA følge standard protokoll (se Tabell for materiale) 11.
- Evaluer genuttrykk av RT-qPCR
- forberede reaksjonsblandingen hvert utvalg: Bland 2 µL cDNA, 7 µL fluorescerende stoff, 300 nM frem primer og 300 nM omvendt primer (tabell 1) i en siste bind i 13 µL, og legge til 96-brønns reaksjon platen (se Tabell av materialer).
- Seal platen med en optisk selvklebende deksel, sentrifuger (300 x g, 1 min) og kjøre reaksjonen på en Real-Time PCR System (varmt start 95 ° C for 20 s etterfulgt av 40 sykluser: 95 ° C for 3 s og 60 ° C for 30 s) (se Tabell av materialer).
- Analysere resultatene av relativ kvantifisering med metoden komparative 2 -ΔΔCt med housekeeping gener glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) eller sure ribosomal fosfoprotein som P0 (36B4) 12 .
4. Vurdere Endothelial aktivering av flowcytometri
- Behandle MLEC-04 cellene etter forholdene beskrevet i § 2 og vurdere endringer i endothelial overflaten proteiner ved flowcytometri.
- Koble cellene etter 6 h av LPS stimulering med trypsin-EDTA metoden beskrevet i trinn 1.2.3, og vask med ufullstendig media på 4 ° C.
- Telle celler med metoden Neubauer kammer og plasser 10 x 10 4 celler i u-96-brønns bunnplater. Sentrifuger (300 x g, 5 min) og kast supernatant en 180 ° festes håndbevegelse fra topp til bunn og rask utvinning til utgangsposisjonen.
- Legge til 50 µL av valgte antistoffer fortynnet i ufullstendige media (10 µg/mL, siste konsentrasjon) til cellene og ruge (30 min, 4 ° C).
- Vask cellene dobbelt wi. ufullstendig media etter fremgangsmåten i trinn 4.3, og ruge med 50 µL på 10 µg/mL av tilsvarende sekundære antistoffer koplet til FITC eller en lignende konjugert (30 min, 4 ° C i et mørkt rom).
- Vask cellene gang med ufullstendig media etterfulgt av en PBS vask. Gjenopprette cellene med 300 µL PBS med 1 mL pipette-spisser og plasser i cytometri rør.
- Vurdere prøvene i flyt cytometri systemet (se Tabellen for materiale). Justere celle befolkningen av fremover og siden spredning parametere. Gate befolkningen av interesse. Justere gates basert på negative kontrollen fra celler inkubert med isotype kontroll. Analysere resultatene som prosent positive celler eller mener fluorescens intensitet 8.
5. Evaluere Endothelial aktivering ved Western Blot
- frø endotelet på sub samløpet i 6-brønnen plater (7 x 10 5 celler/vel) og behandle med LPS som beskrevet i del 2. Analysere inflammatorisk protein uttrykket av følgende western blot protokollen.
- Stoppe LPS stimulering på ulike tidspunkt å belyse ulike aspekter av endothelial svaret:
- fastslå den inflammatoriske proteiner profilen etter 6 h av LPS stimulering.
- Bestemme cellen signalering hvert 15 min gjennom en 60 min periode.
- i begge tilfeller stoppe reaksjonen ved å vaske to ganger med kaldt PBS og lagre prøvene ved-80 ° C til prøve behandling.
- Lyse cellene og protein utvinning
- legge til 200 µL lysis buffer i hver brønn (1% ikke-ioniske surfactant, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM natriumklorid, 30 mM natrium pyrophosphate, 50 mM natrium fluor, 2.1 mM natrium orthovanadate på pH 7.6, supplert med protease hemmer cocktail) (se tabell av materialer).
- Ruge 15 min på 4 ° C under omrøring, skrape brønner med Pipetter tips og samle homogenate i 1,5 mL rør.
- Sentrifuge rør 11,600 x-g 4 ° C.
- Lagre nedbryting i ren 1,5 mL rør ved-80 ° C før behandling.
- Mål protein konsentrasjonen av bicinchoninic syre analysen etter standard protokoll (se tabell av materialer) 13.
- Løse den 30 µg totale protein lysate for hvert utvalg av standard teknikken 0,1% natrium dodecyl sulfat, 10% polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) 14. Kjøre prøver med 10 mM β-mercaptoethanol (redusert betingelser) eller uten (ikke-reduserende betingelser) avhengig av antistoffer brukes til å oppdage protein interessepunkter.
- Overføre atskilt proteiner fra polyakrylamid gel til en polyvinylidene difluoride (PVDF) overføring membran med 0,45 µm porestørrelse bruker standard prosedyre.
- Etter overføring, vask membranen to ganger med PBS, 0,1% polysorbat-20 (PBS-T) og blokkere uspesifikke bindende områder ved å legge til 20 mL 2% BSA fortynnet i PBS-T for oppdaget fosfoproteiner eller 5% ikke-fett tørr melk i PBS-T for totalt proteiner, under omrøring (90 min, RT).
- Fortynne det valgte antistoffet 10 mL av den riktige blokkerende bufferen på anbefalte konsentrasjonen og ruge membranen under omrøring (ON, 4 ° C). Alternativt sted membranen i forseglede plastposer og brukt 5 mL av utvannet antistoffer.
- Neste dag, vaske membranen tre ganger (overflødig PBS-T, 15 min, RT).
- Incubate membranen under omrøring (30 min, RT) med 10 mL av korrespondent sekundære antistoffer bundet til pepperrotperoksidase (HRP) utvannet på 1:10,000 i den riktige blokkerende bufferen.
- Vask membranen tre ganger under omrøring (overflødig PBS-T, 15 min, RT).
- Ruge membranen for 1 min med 0,1 mL/cm 2 av peroxidase substrat forbedret chemiluminescence (ECL). Plasser drenert membranen mellom to gjennomsiktig plast ark, og sette den inn i det chemiluminescence deteksjon systemet som omfatter en Charged-Coupled enhet kamera (CCD).
- Bruker CCD kameraet for å oppdage signalet og programvaren til posten bilder med programmet akkumulative (bilder viser akkumulert signal på hver 30 s eksponering for en totalt 15 min periode).
- Kvantifisere bandet intensiteten av densitometry ved hjelp av ImageJ programvare følger protokollen beskrevet i brukeren guide 15.
- Åpne prøven i ImageJ programvare og velg bandet rundt med rektangulære markeringsverktøyet.
- Velg som første lane og presse plotte baner for å få profil tomter.
- Avgrense området toppene med lineær valg.
- Måle størrelsen på hvert band ved innsiden av hver topp.
- Representerer resultatene med hensyn til lasting protein kontroll (β-utgangen, tubulin, etc.).
6. Evaluere Endothelial faktor løslatt fra leukocytter aktivering av vedheft analyser
- få endothelial betinget media.
- Behandle MLEC-04 cellene som angitt i § 2 og samle kulturen supernatant etter 24 h stimulering med LPS (100 ng/mL).
- Samle betinget media fra behandlet MLEC-04 celler og sentrifuger (600 x g). Holde nedbryting i 0,5 mL dele ved-80 ° C før bruk.
- Leukocytter vedheft analysen
- Coat 96-brønns platene med 50 µL/godt merkede ekstracellulær matrix proteiner fortynnet i PBS (unntatt collagen, som er fortynnet i 0.1 M eddiksyre): fibronectin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL) og kollagen type jeg (10-40 µg/mL). La ON 4 ° C.
- Forkaste belagt media og blokkere uspesifikke bindende områder på brønner med 150 µL PBS, 1% BSA inaktivert (1 min, 100 ° C) i 90 minutter på RT.
- Vask brønnene to ganger med PBS og legge til 100 µL av tidligere innsamlede endothelial betinget medier (inndelingen 6.1) fordelt.
Merk: Platene er klar til å utføre analysen vedheft. - Kultur musen monocytt-macrophage celle linjen J774 i en biologisk inkubator (37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO 2) med Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
Merk: J774 cellene vokse i suspensjon. - Samler J774 cellene i en 15 mL rør og sentrifuger (300 x g, 5 min). Forkast nedbryting og resuspend av mobilnettet pellets med 10 mL serum-frie medier. Telle celler i en Neubauer kammer. Sentrifuge cellene (300 x g, 5 min), forkaste nedbryting og resuspend cellene i serum-free media på 15 x 10 4 J774 celler per 50 µL media.
- Legg til 15 x 10 4 J774 celler til hver bra i 50 µL serum-frie medier og ruge i 15 min på 4 ° C etterfulgt av 1 h på 37 ° C i CO 2 celle inkubator.
- Vask brønnene to ganger, forsiktig ved å legge til varm PBS; sentrifuge (300 x g, 5 min) og kast nedbryting av en 180° snap av håndleddet fra topp til bunn og rask utvinning til utgangsposisjonen. Fastsette den tilknyttede cellens ved å legge 100 µL/godt av 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS og Inkuber (10 min, RT).
- Forkaste media forsiktig permeabilize cellene med 2% metanol i PBS i 2 minutter på RT. Forkast media forsiktig og flekken cellene ved å legge til 50 µL/vel av 0,5% crystal fiolett 20% metanol for 90 s på RT.
- Vaske platen med rikelig vann, kaste overflødig væske og la det til air-dry. Rapporter tilknyttede cellene av digitalt kamera koblet til et lys mikroskop.
- Fortynne cellen flekker ved å legge til 100 µL/godt av 0.1 M natriumsitrat, 50% etanol. Mål absorbansen på 545 nm og representerer resultatene som vilkårlig enheter absorbansen eller prosentandel av vedheft ved å vurdere 100% som celleadhesjon nådd brønner belagt med høyere ligand konsentrasjon
7. Teste Endothelial aktivering av leukocytter-endotelet co vedheft analysen
- Behandle MLEC-04 cellene i 96-brønnen plater som beskrevet i § 2 og ruge med LPS (6 h, 37 ° C).
- Fluorescently merke J774 celler med Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
- Vask J774 cellene i PBS følge fremgangsmåten under 6.2.5. Teller cellene av Neubauer chamber metoden og resuspend på 1 x 10 6 celler/mL i PBS, 0,1% BSA.
- Ruge celler med CFSE (5 µM, siste konsentrasjon) for 20 min på 37 ° C. Legg 5 mL ufullstendig media og ruge (5 min, 4 ° C).
- Vask en gang med ufullstendig media som forklart i 6.2.5., resuspend på 15 x 10 4 celler/100 µL og videre til co vedheft analysen.
- Endotelet behandlingen vaskes brønnene tre ganger med ufullstendig media. Legge til CFSE-J774 celler (15 x 10 4 celler/100 µL) til hver endothelial-belagt godt. Inkuber platen i 10 min på 4 ° C etterfulgt av 60 min på 37 ° C.
- Vask brønnene forsiktig, som beskrevet i 6.2.7., med varmet PBS og rapporter J774 vedheft på endothelial laget av følgende to metoder:
- Lyse cellene i 0.1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 µL/vel) og måle den CFSE-J774-signal ved fluorometry (eksitasjon/utslipp = 492 nm/517 nm). Representerer resultatene som vilkårlig antall fluorescens intensitet eller prosentandel av vedheft forhold til positiv kontroll (signal fra total celler lagt i hver brønn).
- Fikse cellene i 4% PFA og rapporten vedlegget CFSE-J774 cellene på endotelet ved å visualisere under fluorescens mikroskop (eksitasjon/utslipp = 492 nm/517 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluering av LPS-indusert endothelial celle aktivering av RT-qPCR
Serum sultet MLEC-04 cellene ble stimulert av 100 ng/mL av LPS 6 h, og på endothelial genuttrykk ble vurdert ved hjelp av RT-qPCR ved å sammenligne uttrykk for aktivisering markører å hvile tilstand. Som vist i figur 1A, indusert LPS-ruges MLEC-04 cellene mRNA uttrykk for valgte vedheft molekyler involvert i leukocytter rekruttering under inflammatorisk respons (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1). PECAM-1 ble brukt som en intern kontroll fordi uttrykket er uendret under denne eksperimentell behandling. Figur 1B representerer endothelial aktiveringen av LPS målt ved økt mRNA uttrykket av cytokiner Ccl5, Cxcl10 og Cxcl1. Disse molekylene er involvert i aktivering av sirkulerende leukocytter, inkludert deres handel til endotelial lag og senere bloduttredelse til området betennelse. Cytokin, IL4, ble brukt som en intern kontroll under denne eksperimentell behandling.
Figur 1: evaluering av LPS-indusert endothelial celler aktivering av RT-qPCR. Den MLEC-04 celler ble stimulert med 100 ng/mL av LPS 6 h (røde stolper) sammenlignet med betingelsen kontroll (blå barer), og genuttrykk ble analysert av RT-qPCR. Grafene viser fold induksjon av mRNA til vilkåret om kontroll av valgte endothelial vedheft molekyler (A) og cytokiner (B) involvert i leukocytter aktivisering og rekruttering under betennelsesreaksjon. PECAM-1 og IL4 ble brukt som negative kontroller under denne tilstanden. Resultatene uttrykkes som betyr ± SEM fra én prøve av tre utført, utført i tre eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protein uttrykk for vedheft molekyler på LPS-behandlet endotelceller
Inflammatorisk stimulering ble utført på MLEC-04 cellene som beskrevet i forrige del og protein uttrykket ble undersøkt av western blot teknikk. Hvile endotelet presenterer nesten umulig å oppdage nivåene av vedheft molekyler VCAM-1 og ICAM-1 (merket som-). I nærvær av LPS (+) er endothelial aktivert fenotypen tydelig oppregulering av uttrykk for beskrevet markører (figur 2). Membraner var normalisert av β-utgangen gjenkjenning, som ble brukt som kontrollen lasting beregne relative bandet tettheter etter densitometry analyse.
Figur 2: Protein uttrykk for vedheft molekyler på LPS-behandlet endotelceller. Representant western blot evaluering VCAM-1 og ICAM-1 protein uttrykk i hvile (-) i forhold til LPS-behandlet (+) MLEC-04 celler. Β-utgangen ble brukt som en lasting. Molekylvekt hver protein er i parentes. Verdiene representerer den semi kvantifiseringen av relativ bandet tettheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Endothelial overflate markører i LPS-mediert betennelse
Endothelial aktivering i inflammatorisk sammenheng ble evaluert av flowcytometri etter 6 timers-stimulering av LPS (100 ng/mL). I denne tilstanden, ble gjenkjenning av lim-relaterte molekyler involvert i leukocytter samspill evaluert. Det venstre panelet i figur 3A representerer basale uttrykk for den angitte markører i hvile MLEC-04 cellene (rød-solid histogram) sammenlignet med isotype negativ kontroll (svart-prikkete histogram). Det høyre panelet i figur 3A viser resultatene fra stimulert MLEC-04. LPS behandling betydelig upregulated uttrykket av vedheft molekyler E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1 i plasma membranen (rød-solid histogram) sammenlignet med den hvile tilstanden (svart-prikkete histogram). Som vist i cytometri profiler og sitert før, uttrykk for PECAM-1 er uendret i denne eksperimentelle tilstanden. Figur 3B viser kvantifisering verdiene brukes som referanser for å evaluere mulig meglere av endothelial inflammatorisk reaksjon. %: prosentandel av positive celler. MFI: mener fluorescens intensitet.
Figur 3: Endothelial overflate markører i LPS-mediert betennelse. Flow cytometri profiler av celle vedheft molekyler på hvile og LPS-stimulert MLEC-04 celler. Informasjonsvinduet viser protein uttrykk på hvile cellene (Antigen merket-rød histogram) med hensyn til kontrollen isotype matchet (Ctrl-svart histogram). Det høyre panelet sammenligner kontroll celle-overflate protein uttrykket (svart histogrammer) til LPS-behandlet endotelceller (rød histogram). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Signalveier utløst av LPS stimulering i endotelceller
Mekanismene som er involvert i vaskulære kupé aktiviseringen under betennelse er undersøkt ved å evaluere viktig signalnettverk molekyler. MLEC-04 cellene stimulert med LPS i forskjellige perioder ble behandlet for protein utvinning, og graden av aktivisering ble analysert ved western blot teknikk. Figur 4 viser at IκB-α-repressor NF-κB signalnettverk er fosforylert etter 15 min LPS-inkubering, og tilbake til basale nivåer etter 1 time. På den annen side, LPS aktiverer ERK 1/2 signalnettverk etter 15 min, som etablerer en viktig vei i endothelial aktivisering under betennelsesreaksjon. Membraner var normalisert av β-utgangen eller ERK 1/2 gjenkjenning, som ble brukt som lasting kontrollene til å beregne de relative bandet tettheter etter densitometry analyse.
Figur 4: signalnettverk trasé utløst av plater på endotelceller. MLEC-04 cellene stimulert med 100 ng/mL av LPS for klokkeslett vises på figuren og signalveier ERK 1/2 (P-ERK 1/2) og NF-kB (gjennom P-IκBα) ble vurdert ved western blot. ERK 1/2 totalt og β-utgangen ble brukt som lasting kontroller i hver betingelse. Molekylvekt for hver protein er i parentes. Verdiene representerer den semi kvantifiseringen av relativ bandet tettheter. Klikk her for å se en større versjon avDette tallet.
Regulering av leukocytter virkemåten av endotelet stimulert med LPS
Biologiske relevansen av regulering av endothelial aktivisering om utviklingen av den inflammatoriske reaksjonen bestemmes av funksjonelle analyser av leukocytter ytelse. Som beskrevet i delen protokollen, inkluderes to ulike tilnærminger for å teste leukocytter funksjonen regulert av endotelceller. Selv om analyser avhøre ulike aspekter av inflammatorisk respons (RT-qPCR for endothelial cytokiner befridd av leukocytter aktivisering og western blot for endothelial vedheft molekyler i leukocytter samspill), er dataene innhentet begge evaluere mikroskopiske detaljer av leukocytter vedlegg. Leukocytter aktiveringen av endothelial løselig faktorer er avgjørende for å utvikle en effektiv inflammatorisk respons, som det favoriserer celle vedheft til flere underlag. Figur 5A viser J774 celle vedheft til 0,5 µg/mL fibronectin belagt brønner svar på tidligere innsamlede betinget media fra kontrollen eller LPS behandlet endotelceller. Lyse feltet bilder og Spektrofotometri målinger indikerer at faktorer i betinget media fra LPS-behandlet endotelet er tilstrekkelig til å indusere effektivt J774 aktivisering, som vist av induksjon av cellen vedlegg fibronectin. Figur 5B representerer en co vedheft analysen vurdere muligheten for vaskulær laget å støtte leukocytter fast vedheft av romanen uttrykket av endothelial vedheft molekyler. Kort, serum sultet subconfluent kulturer av MLEC-04 cellene stimulert med LPS 6 h ble vasket flere ganger og co inkubert med leukocytter linjen J774 tidligere merket med fluorescerende sonden, CFSE. Som vist i micrographs og spectrofluorometric mål, favoriserer LPS-vaskulær stimulering samspillet av CFSE-J774 celler av endotelial monolayer.
Figur 5: leukocytter interaksjon til LPS-ruges endotelial monolayer av co vedheft analysen. (A) * lys bilder viser crystal violet flekker J774 cellene knyttet til 0,5 µg/mL fibronectin belagt brønner svar på betinget media fra kontrollen eller LPS-behandlet endotelceller. Skala bar, 50 µm. Spektrofotometri analysen nedenfor angir absorbansen målingen uttrykkes vilkårlig enheter (a.u.) ± SEM for en representant eksperiment i tre eksemplarer. (B) fluorescens micrographs Vis knyttet CFSE-J774 celler til kontrollen eller LPS-behandlet MLEC-04 celler evalueres av co vedheft analysen. Skala bar = 50 µm. Fluorometric analysen nedenfor angir fluorescens intensiteten uttrykt som vilkårlig enheter (a.u.) ± SEM for en representant eksperiment i tre eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mål | NCBI RefSeq-ID | Videresende sekvens (5´-3´) | Omvendt rekkefølge (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ACT GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT VS |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC KATTEN CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG KATTEN CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-selectin | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabell 1: Liste over primere brukt i denne studien.
| Hvile | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| CTRL | 1,79 | 3.5 | 0,55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09 | 37.82 | 12.24 |
| E-selectin | 17.12 | 8.06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20.51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99.82 | 363.89 |
Tabell 2: Endothelial overflate markører i LPS-mediert betennelse. Kvantifisering av celle vedheft molekyler uttrykk på hvile og LPS-stimulert MLEC-04 cellene av flyt cytometri analyse. Representant verdiene for hver indikator tilsvarer andelen positiv celler (%) og mener fluorescens intensitet (MFI) i hvile og LPS-stimulert endotelceller. PECAM-1 ble brukt som en negativ kontroll under disse eksperimentelle forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne endothelial protokollen beskriver en gradvis teknologi som etablerer grunnlaget for å utforske romanen mekanismer involvert i regulering av inflammatorisk respons. Disse metodene er basert på studier av endothelial aktiviteten stimulert av LPS og evaluere kritiske trinnene involvert i leukocytter rekruttering under inflammatorisk respons, spesielt: endothelial cytokiner utgivelse, endothelial vedheft molekyler uttrykk og leukocytter vedheft på vaskulær laget. Når endothelial parameterne er etablert, systemet kan søke for romanen forbindelser involvert i regulering av endothelial funksjon og følgelig inflammatorisk progresjon. De regulatoriske narkotika kan være av interesse for farmasøytiske markedet. Store projeksjon av denne sekvensielle protokollen er å etablere et grunnlag for å utvide disse studiene endothelial forskjellig og stimulerende betingelser ved å justere til deres relative vaskulær aktiviteten parametere.
Narkotika valgt av dette programmet vil utgjøre interessant kandidater for utforme romanen strategier mot inflammatoriske lidelser. På den ene siden, blir forbindelsene som favoriserer endothelial svaret og bidra til leukocytter rekruttering lovende for immunsvikt forhold16,17. På den annen side, utgjør det endothelial hemmere utmerket terapi for kronisk inflammatorisk sykdommer10.
Karakteristikk av cytokiner uttrykt av stimulert endotelet spår utviklingen av betennelse. Cytokiner er små proteiner utgitt av endothelial laget i inflammatorisk sammenheng og regulere sterkt leukocytter atferd. Pro-inflammatoriske medlemmer, slik som Ccl5, Cxcl10 og Cxcl1, bindes til deres spesifikke reseptorer på leukocytter overflaten og signal å indusere leukocytter interaksjon med nylig uttrykt vedheft molekyler på vaskulær laget (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1), og leukocytter migrasjon til patologisk området (figur 1, figur 2, Figur 3)8,10,18. Andre medlemmer av samme familie av proteiner er involvert i løsningen av betennelse og følgelig reparasjon av vev. Uttrykket av disse anti-inflammatoriske cytokiner er relevant for kronisk inflammatorisk sykdommer fordi de hindrer leukocytter rekruttering og favorisere immunitet klaring10,19,20. For å velge mulig endothelial inflammatorisk regulatorer, anbefales det å utføre denne cytokin uttrykk analysen og evaluere endothelial vedheft molekyler uttrykket i nærvær av forbindelsene rundt. Faktisk, analysere nivåene mellom anti-inflammatorisk versus pro-inflammatoriske cytokiner kan brukes som en logisk verdi for progresjon av sykdommen og avslører stoffet terapeutiske interesse21.
LPS binding til sin celle overflaten reseptor utløsere komplekse intracellulær signalnettverk cascades ledet av kart kinaser ERK 1/2, JNK, og p38 og NF-kB-signalosome for å indusere inflammatorisk transcriptional programmet. Mange av disse er vanlig på andre inflammatoriske stimuli som TNF-α eller IL-110,22. Endothelial aktiveringen bestemmes av oppdager phosphorylated form av kart kinase medlemmene som vist for ERK 1/2 i Figur 4. Videre endothelial aktiveringen av LPS induserer enzymatisk aktivitet av IKKβ komplekset, som phosphorylates og forringer den NF-kB inhibitor komplekse IκB, slik at NF-kB effektor medlemmer av kjernefysiske translokasjon utføre korrespondenten transcriptional aktivitet (Figur 4). Karakterisere mekanismer som påvirker drug sammensatte endothelial inflammatorisk respons er veldig nyttig, ikke bare beskrive stoffet, men også i designe romanen inflammatorisk behandlinger i kombinasjon med kompatibel konvensjonell terapi 23.
Forbindelser valgt fra endothelial inflammatorisk screening analyser, videre må studeres for å bekrefte relevansen fungerende kritiske trinnene av leukocytter atferd analyser, som til slutt cellene er ansvarlige for de inflammatoriske lidelser. Disse analyser analysere leukocytter aktiviteten i to forskjellige eksperimentelle innstillinger. Først er i vurdere rollen endothelial utgitt cytokiner på leukocytter aktivering av integrin-mediert vedheft analyser. Leukocytter integrins er aktivert ved endothelial utgitt cytokiner. Dermed er leukocytter selvklebende evnen å integrin ligander et representativt mål for leukocytter funksjon8,10,18. Andre er i å studere rollen til de nylig uttrykt endothelial vedheft molekylene på leukocytter samspillet av vaskulær laget av co vedheft analyser. Endothelial vedheft molekyler i inflammatorisk sammenheng er viktig for leukocytter rekruttering til omkringliggende vev. Dermed utgjør analysere leukocytter samarbeidsstil endothelial-behandlet monolayer celler en prognostiske verdi for inflammatorisk progresjon (figur 5)8,10,18. Resultatene fra disse tilnærmingene foreslår at de valgte forbindelsene er alvorlig kandidater utforme fremtidige strategier for behandling av inflammatorisk lidelser
Eksperimentell forslaget definert her er et allsidig verktøy for framtidige applikasjoner på grunn av sin evne til å ekstrapolere til forskjellige mobilnettet eller stimulerende systemer. Prosedyren kan endres til endotelet fra ulike opphav eller arter, og teste funksjonaliteten på flere immunceller, samt ulike inflammatoriske stoffer som LPS, TNF-α, bakterier, virus, etc. Som beskrevet i teksten, må forskere først karakterisere endothelial aktivering i deres egen system å karakterisere senere rollen av en valgt sammensetning på betennelsesreaksjon. Begrensningene av protokollen er en passende negativ kontroll og definere nøyaktig endothelial aktivitet parametrene som skjelne hvile fra stimulert staten. I tilfelle at forholdene beskrevet i dette papiret ikke fungerer for et annet system, må forskere feilsøke eksperimentelle parameterne ved å utføre ytterligere tidsavhengige analyser og bruke en konsentrasjon gradient inflammatorisk stimulans definere et stimulerende vindu der for å teste nye legemidler for regulering av inflammatorisk respons.
For å konkludere, anbefales denne endothelial inflammatorisk protokollen for søk av new endothelial regulatorer målretting betennelsesreaksjon. Utføre denne prosedyren gir roman, interessante forbindelser som kan brukes til å studere sin fremtidige anvendelser og utforme nyskapende vaskulær-spesifikke behandlinger mot provoserende-relaterte sykdommer, og som potensielt kan være av interesse til farmasøytiske markedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) og i Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (bevilgning nummer IERPY 1149/16 til Al; MPY 1410/09 til S. Hortelano); av MINECO gjennom Fondo de Investigación no Salud (FIS) (gir tall PI11.0036 og PI14.0055 S. Hortelano). S. Herranz ble støttet av IERPY 1149/16 fra ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z.
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
