Summary
Gefäßendothels steuert dicht Leukozyten Rekrutierung. Unzureichende Leukozyte Extravasation trägt zur entzündlichen Krankheiten des Menschen. Daher ist es notwendig, bessere Therapien für entzündliche Erkrankungen zu entwerfen, auf der Suche nach neuartigen regulatorischen Elemente der endotheliale Aktivierung. Hier beschreiben wir eine umfassende Methodik um neuartige endotheliale Regulatoren zu charakterisieren, die Leukozyten während einer Entzündung des Menschenhandels ändern können.
Abstract
Die endotheliale Schicht ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper durch viele verschiedene Kontrollfunktionen. Verordnung der Entzündungsreaktion durch die endotheliale Schicht unbedingt effizient bekämpfen schädliche Eingaben und Hilfe bei der Wiederherstellung der beschädigten Bereiche. Wenn die Endothelzellen, einer entzündlichen Umgebung, wie die äußere Komponente von Gram-negativen Bakterien Membran, Lipopolysaccharid (LPS), ausgesetzt sind sie zum Ausdruck bringen wasserlöslicher Pro-inflammatorischen Zytokinen, wie Ccl5, Cxcl1 und Cxcl10, und Auslösen der Aktivierung des zirkulierenden Leukozyten. Der Ausdruck der Adhäsionsmoleküle E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 auf der endothelial Oberfläche ermöglicht darüber hinaus das Zusammenspiel und die Adhäsion der aktivierten Leukozyten, die endotheliale Schicht, und schließlich die Extravasation auf das entzündete Gewebe. In diesem Szenario muss die endotheliale Funktion streng reguliert werden, da übermäßige oder fehlerhafte Aktivierung bei der Rekrutierung von Leukozyten zu entzündlichen Erkrankungen führen könnte. Da viele dieser Erkrankungen eine wirksame Behandlung nicht verfügen, müssen neue Strategien mit Fokus auf die vaskuläre Ebene untersucht werden. Wir bieten umfassende Tests, die auf der Suche nach neuartigen endotheliale Regulierungsbehörden nützlich sind, die Leukozyten-Funktion zu ändern. Wir analysieren endotheliale Aktivierung durch verschiedene Techniken, einschließlich Konkretisierung Ziele beteiligt bei der Rekrutierung von Leukozyten (z. B., Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle) mit: Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion () RT-qPCR), Western-Blot, flow Cytometry und Adhäsion Assays. Diese Ansätze bestimmen die endotheliale Funktion im Zusammenhang mit entzündlichen und sind sehr nützlich für Screening-Tests um neuartige endotheliale entzündliche Regulierungsbehörden zu charakterisieren, die potenziell wertvoll für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien durchführen.
Introduction
Die Entzündung ist eine positive biologische Reaktion gegen infektiöse Agenzien, mit dem großen Ziel, den Erreger zu eliminieren und geschädigtes Gewebe zu reparieren. Unter bestimmten Bedingungen, z. B. chronische Infektionen oder Autoimmunerkrankungen beheben Entzündungen nicht. Stattdessen gibt es eine anomale Reaktion mit kontinuierlicher Infiltration der Leukozyten, wodurch eine verlängerte Immunantwort, die führt zu Gewebeschäden, Fibrose, Verlust der Funktion, und die allgemeine, Behinderung und in einigen Fällen zum Tod des Patienten. Diese menschliche Störungen, katalogisiert als entzündliche Erkrankungen beinhalten alle die Blutgefäße für die Kontrolle der Leukozyte Extravasation1,2.
Die Endothelzellen spielen eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der Entzündungsreaktion durch Steuern, Handel mit Leukozyten. Wenn die endotheliale Schicht Entzündungsmediatoren wie LPS ausgesetzt ist, das ruhende Endothel aktiviert und drückt Pro-inflammatorischen Zytokinen (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) und Adhäsionsmoleküle (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1), gefallen Rekrutierung der zirkulierenden Leukozyten an der Infektionsstelle. Die Leukozyten, die dann durch die freigesetzten Zytokine grundiert zu vermitteln, Rollen und Interaktion mit der endotheliale Schicht durch die entsprechenden Klebstoff Gegenstücke: PSGL-1 bis Selektin, α4β1 Integrin VCAM-1 und αLβ2 Integrin ICAM-1. Zu guter Letzt migrieren der Leukozyten auf das Gefäßsystem in Richtung der Schwerpunkt der Entzündung3.
Die wichtige Rolle des Endothels bei der Regulierung der entzündlichen Reaktion wurde an Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, um auszudrücken, die LPS-Rezeptor, Abgabe-wie Empfänger 4 (TLR4), nur auf die Endothelzellen nachgewiesen. Diese endotheliale TLR4 Tiere wurden reagieren zu einer LPS-vermittelte Entzündung und die Infektion erzeugt nach der Inokulation von Bakterien zu erkennen, und folglich zu erreichen Infektion Auflösung und Überleben auf ähnlichem Niveau wie die Wildtyp-Mäusen-4 , 5.
Für das Endothel reguliert Entzündungsreaktion Weg hat postuliert worden, dass die Hemmung in einigen Phasen der Leukozyten-Endothel-Interaktion bei der Reduktion von Trans-endothelialen Migration und eine bessere Prognose für führen würde entzündliche Erkrankungen. In der Tat wurden mehrere Strategien, die Ausrichtung auf die endotheliale Aktivierung und Leukozyten-Endothel-Interaktion entwickelt, Extravasation von Immunzellen zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen6,7zu behindern.
In diesem Bericht beschreiben wir eine gründliche Gruppe von in-vitro- Techniken die endotheliale Aktivität als Reaktion auf den Entzündungsreiz LPS und ihre Rolle bei der Aktivierung von Leukozyten und Haftung auf die vaskuläre Schicht vollständig zu charakterisieren. Die Endothelzellen Modell in dieser Handschrift wurde Lunge Endothelzellen Mauslinie (MLEC-04), wie von Hortelano Et Al. beschrieben 8. the MLEC-04-Zell-Linie in der Literatur soll ein geeignetes System, endotheliale Aktivierung9,10studieren validiert wurde. Basierend auf Forschungsinteressen, diese Ansätze können leicht extrapoliert werden zu jedem Endothelzellen oder Leukozyten Systeme und entzündlichen Profil. Sobald die endotheliale Parameter in den ausgewählten Bedingungen definiert sind, können das System neue Medikamente auf den vorgeschlagenen Experimente auszuwertende Kreislauf Aktivierung testen. Entzündlichen dabei die Endothel-Zellen getestet mit der Verbindung von Interesse können an die Kontrolle der Zellen verglichen werden, und alle sich daraus ergebenden Unterschiede informieren das Medikament prognostische Ergebnis auf Entwicklung und das Fortschreiten der Entzündung. Abschließend möchte ich sagen, schlagen wir einen relevanten System zur Charakterisierung neue Angriffspunkte, die Endothelzellen, die das Design neuartiger vaskulären-spezifische Therapien gegen entzündliche Erkrankungen beeinflussen können.
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Protocol
1. Endothelial Cell Culture
- Mantel 100 mm Gewebekultur Platten mit 2,5 mL Gelatine Gewebekultur behandelt Platten Lösung (autoklaviert, 0,1 % Gelatine in destilliertem Wasser) für 30 min bei 37 ° C; dies kann in das erforderliche Format gut extrapoliert werden. Aspirieren Sie die Gelatine-Lösung und Platten in der Gewebekultur-Haube an der Luft trocknen lassen.
- Gewebe Kulturbedingungen
- pflegen die MLEC-04-Zellen in einem biologischen Brutmaschine (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO 2). Wachsen die Zellen in komplette Medien Dulbecco ' s Modified Eagle Medium: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin (P/S).
- Der Zellen zählen, indem Sie die Standardmethode der Neubauer-Kammer und die 100 mm Gelatine-behandelten Platten in 10 mL komplette Medien, bei einer geringen Dichte von 2-11 x 10 4 Zellen/cm 2 MLEC-04 Zellen hinzufügen. Zellen 1:3 zu teilen, wenn sie Confluence erreichen.
Hinweis: Dies tritt in der Regel nach zwei bis drei Tagen in der Kultur. - Subkultur der Zellen durch das Waschen der Platten mit 10 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefolgt von 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 % Trypsin, 5 mM EDTA) und inkubieren Sie für 3 min bei 37 ° c
- Die Trypsin-EDTA-Reaktion zu stoppen und die suspendierten Zellen durch Zugabe von 10 mL komplette Medien zu erholen. Spin-down der Zellen (300 X g, 5 min), den Überstand verwerfen, entsprechend der zelluläre Pellet in komplette Medien und Subkultur Aufschwemmen.
2. LPS-Behandlung und Mediatoren
- Platte MLEC-04 Zellen in komplette Medien an Sub-Mündung in den folgenden-well-Format: 7 x 10 5 Zellen/gut auf 6-Well Platten und 2,5 x 10 5 Zellen/Brunnen auf 96-Well Platten.
- Brüten die Kultur für 6 h in einer Zelle Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO 2). Wechseln Sie die Zellen zu unvollständige Medien (DMEM-F12, P/S) und lassen Sie über Nacht (ON), synchronisieren und die Zellaktivität zu verringern.
- Entfernen Sie das Medium und testen Sie neuartige pharmakologische Substanzen durch Inkubation der Endothelzellen mit (oder ohne) das Medikament in Frage (z.B. DT 10) verdünnt in den unvollständigen Medien (30 min, 37 ° C); 1,4 mL hinzufügen/sowie für 6-Well-Platte oder 0,14 mL/gut für 96-Well Platten).
- Fordern die Zellen durch die Inkubation Medien (100 ng/mL, Endkonzentration) für den Zeitraum in jedem Assay LPS hinzufügen. PBS als ein Steuerelement verwenden.
3. Bewertung der transkriptionellen Profil auf aktiviert Endothelium von RT-qPCR
- MLEC-04 Samenzellen an Sub-Mündung in 6-Well Kultur Platten (7 x 10 5 Zellen/Na). 6 h (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO 2) inkubieren und fahren Sie anschließend mit Serum Hunger (inkubieren ON).
- Entfernen Sie das Medium und die Endothelzellen Kulturen mit der Droge von Interesse in die unvollständigen Medien (30 min, 37 ° C inkubieren) verdünnt; 1,4 mL hinzufügen/sowie für 6-Well-Platte (30 min, 37 ° C) zu behandeln (oder nicht behandeln).
- Fordern die Zellen durch Zugabe von 100 ng/mL LPS zu den inkubierten Medien (wie in Schritt 2.3 beschrieben) und inkubieren Sie für 6 h. stoppen die Reaktion durch Waschen zweimal mit kaltem PBS und Platten bei-80 ° C bis Probenverarbeitung.
- RNA-Extraktion
- tauen die Platten und fügen Sie 1 mL/Well RNA-Extraktionspuffer (38 % Phenol und 0,8 M Guanidinium erfolgt; siehe Tabelle Materialien). Lassen Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT) unter Unruhe und sammeln Homogenat in 1,5 mL Tuben.
- Fügen Sie 200 µL Chloroform und schütteln sanft für 15 S. Inkubation für 3 min bei RT und Zentrifuge (11.600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Transfer wässrigen Phase zu einer anderen 1,5 mL-Tube. Überstürzen Sie RNA durch Zugabe von 500 µL Isopropanol gefolgt von eine 10 min Inkubation bei RT und dann Zentrifugation (11.600 x g, 4 ° C).
- Den Überstand verwerfen und waschen Sie die Pellets mit 75 % Ethanol von Vortex Agitation und anschließend Zentrifugieren (7.500 x g, 4 ° C).
- An der Luft trocknen die Pellets und solubilisieren RNA in 25 µL reine H 2 O durch Inkubation für 10 min bei 55 ° c halten RNA bei-80 ° C bis Probenverarbeitung.
- Menge und Reinheit der RNA
- quantifizieren die RNA-Konzentration durch Messung der Extinktion der Probe bei 260 nm in einem Spektrophotometer (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- Maßnahme bei 230 nm und 280 nm auf die RNA-Reinheit bestimmen.
: Hinweis das Verhältnis bei 260/280 Protein oder Phenol Kontamination. Ein Verhältnis in der Nähe von 2 ist akzeptabel. Das Verhältnis bei 260/230 kennzeichnet EDTA, Kohlenhydrate oder Phenol Verunreinigungen. Zulässig sind Werte zwischen 2.0-2.2.
- RNA checking Integrität
- Run 2 µg Gesamt-RNS und einer RNA ladder auf einem 1,5 % denaturierenden Agarosegel; auf einem Gel-Dokumentationssystem visualisieren (siehe Tabelle der Werkstoffe).
: Hinweis ein 2:1 Verhältnis von klar und scharf 28 s und 18 s rRNA Bands eine intakte RNA. Teilweise abgebaut RNA löst als ein verschmiert aussehen.
- Run 2 µg Gesamt-RNS und einer RNA ladder auf einem 1,5 % denaturierenden Agarosegel; auf einem Gel-Dokumentationssystem visualisieren (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- RT-qPCR
- synthetisieren die komplementäre DNA (cDNA) aus einer einzigen gestrandeten RNA nach Standard-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) 11.
- Evaluate Genexpression durch RT-qPCR
- bereiten das Reaktionsgemisch für jede Probe: Mix 2 µL cDNA, 7 µL fluoreszierende Verbindung, 300 nM nach vorn Grundierung und 300 nM rückwärts-Primer (Tabelle 1) in einem Endvolumen von 13 µL und 96-Well-Reaktion-Platte hinzufügen (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- Dichtplatte mit optischen selbstklebende Abdeckung, Zentrifuge (300 X g, 1 min) und die Reaktion auf eine Real-Time PCR System laufen (hot-Start-95 ° C für 20 s gefolgt von 40 Zyklen: 95 ° C für 3 s und 60 ° C für 30 s) (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- Analyse der Ergebnisse durch relative Quantifizierung der vergleichenden Methode 2 -ΔΔCt mit dem Housekeeping-Gene-Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) oder sauren ribosomale Phosphoprotein P0 (36B4) 12 .
4. Endotheliale Aktivierung mittels Durchflusszytometrie zu bewerten
- die MLEC-04-Zellen, die nach den in Abschnitt 2 beschriebenen Bedingungen zu behandeln und Werten Sie die Änderungen in die Endothelzellen Oberflächenproteine von Durchflusszytometrie.
- Trennen die Zellen nach 6 h der LPS Stimulation mit der beschriebenen Trypsin-EDTA-Verfahren Schritt 1.2.3 und waschen mit den unvollständigen Medien bei 4 ° c
- Zählen die Zellen mit der Neubauer-Kammer-Methode und 10 x 10 4 Zellen in u-Boden-96-Well-Platten. Zentrifuge (300 X g, 5 min) und entsorgen Überstand durch eine 180° Einrasten des Handgelenks von oben nach unten und schnelle Wiederherstellung in seine Ausgangsstellung.
- Fügen Sie 50 µL der ausgewählte Antikörper in den unvollständigen Medien (10 µg/mL, Endkonzentration) verdünnt, um die Zellen und inkubieren (30 min, 4 ° C).
- Waschen die Zellen zweimal wITH die unvollständigen Medien nach dem Verfahren gemäß Schritt 4.3 und inkubieren Sie mit 50 µL 10 µg/ml des entsprechenden sekundären Antikörpers gekoppelt an FITC oder eine ähnliche Konjugat (30 min, 4 ° C in einem dunklen Raum).
- Die Zellen einmal mit den unvollständigen Medien, gefolgt von einem PBS waschen waschen. Die Zellen mit 300 µL PBS mit 1 mL Pipette Tipps zu erholen und in Cytometry Röhren.
- Bewerten die Proben in der Flow-Zytometrie-System (siehe Tabelle der Materialien). Die Zell-Population durch die nach vorne und Seite Streuung Parameter anpassen. Tor der Bevölkerung von Interesse. Passen Sie Tore, basierend auf der negativen Kontrolle von Zellen inkubiert mit Isotype Steuerung an. Analysieren Sie die Ergebnisse als der Anteil der positiven Zellen oder bedeuten Fluoreszenz Intensität 8.
5. Endotheliale Aktivierung durch Western Blot auswerten
- Samen des Endothels an Sub-Mündung in Kultur 6-Well-Platten (7 x 10 5 Zellen/Na) und mit LPS zu behandeln, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Die entzündlichen Proteinexpression analysieren, indem Sie das folgende Protokoll der western-Blot.
- Stoppen die LPS-Stimulation zu unterschiedlichen Zeitpunkten verschiedene Aspekte der endothelialen Antwort aufzuklären:
- festzustellen, die entzündliche Proteine Profil nach 6 h der LPS Stimulation.
- Bestimmen die Zelle alle 15 min über einen Zeitraum von 60 min.
- In beiden Fällen beenden die Reaktion durch Waschen zweimal mit kaltem PBS und speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis Probenverarbeitung.
- Lyse der Zellen und Proteingewinnung
- fügen Sie 200 µL Lyse Puffer in jede Vertiefung (1 % nichtionische Tenside, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, Natrium-Chlorid-150 mM, 30 mM Natrium Pyrophosphat, 50 mM Natriumfluorid, 2,1 mM Natrium Orthovanadate an pH 7.6, ergänzt mit Protease-Inhibitor cocktail) (siehe Tabelle der Werkstoffe).
- Inkubieren für 15 min bei 4 ° C unter schütteln, kratzen Brunnen mit einer Pipettenspitze und sammeln das Homogenat in 1,5 mL Tuben.
- Zentrifugieren der Rohre bei 11.600 x g bei 4 ° c
- Überstand in sauberen 1,5 mL Röhrchen bei-80 ° C bis zur Verarbeitung lagern.
- Maßnahme die Proteinkonzentration von Bicinchoninic Acid Assays nach Standard-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) 13.
- Lösen die 30 µg Gesamt-Protein lysate für jede Probe, indem die Standardtechnik der 0,1 % Dodecyl Natriumsulfat, 10 % Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) 14. Proben laufen, mit 10 mM β-Mercaptoethanol (reduzierenden Bedingungen) oder ohne (nicht-reduzierenden Bedingungen) abhängig von der Antikörper verwendet, um das Protein des Interesses zu erkennen.
- Übertragen die getrennten Proteine aus dem Polyacrylamid-Gel auf einem Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Transfer Membrane mit 0,45 µm Porengröße mit Standardverfahren.
- Nach Transfer, waschen Sie die Membran zweimal mit PBS, 0,1 % Polysorbat-20 (PBS-T) und unspezifischen Bindungsstellen durch Zugabe von 20 mL 2 % BSA in PBS-T für erkannten Phosphoproteine oder 5 % fettfreie Trockenmilch im PBS-T für total Proteine unter Erregung (90 min, verdünnt zu blockieren RT).
- Den ausgewählten Antikörper in 10 mL des entsprechenden blockierende Puffers in der empfohlenen Konzentration zu verdünnen und inkubieren Sie die Membran unter Erregung (ON, 4 ° C). Alternativ legen Sie die Membran in verschlossenen Plastiktüten und 5 mL der verdünnten Antikörper verwendet.
- Nächsten Tag waschen die Membran drei Zeiten (überschüssige PBS-T, 15 min, RT).
- Inkubation die Membran unter Agitation (30 min, RT) mit 10 mL der Korrespondent Sekundärantikörper, Meerrettich-Peroxidase (HRP verpflichtet) verdünnt 1: 10.000 im entsprechenden blockierende Puffer.
- Waschen die Membran dreimal unter Erregung (überschüssige PBS-T, 15 min, RT).
- Inkubieren Sie die Membran 1 min mit 0,1 mL/cm 2 von Peroxidase Substrat verstärkte Chemilumineszenz (ECL). Legen Sie die durchlässige Membran zwischen zwei transparenten Kunststoffplatten, und fügen Sie es in der Chemilumineszenz-Detection-System umfasst eine Charged-Coupled Kamera (CCD).
- Die CCD-Kamera verwenden, um das Signal und seine Software zur Aufnahme von Bildern mit dem addierten Programm erkennen (Bildanzeige angesammelten Signal an alle 30 s Belichtung insgesamt 15 min lang).
- Quantifizieren die Band Intensität von Densitometrie mit ImageJ-Software nach dem Protokoll beschrieben in der Benutzer-Führer- 15.
- Die Probe in der ImageJ-Software öffnen und wählen Sie die Band mit rechteckigen Auswahlwerkzeug.
- Wählen Sie, wie der erste Spur und Presse Gassen Plot um den Profil-Parzellen zu erhalten.
- Begrenzen den Bereich der Gipfel mit der geradlinigen Auswahl.
- Die Größe der einzelnen Bänder zu messen, indem Sie auf der Innenseite jeder Gipfel.
- Stellen die Ergebnisse in Bezug auf Protein Ladekontrolle (β-Actin, Tubulin, etc.).
6. Bewerten, endothelialer Faktor befreit Leukozyten-Aktivierung durch Adhäsion Assays
- die endothelialen konditionierten Medien erhalten.
- Die MLEC-04-Zellen zu behandeln, wie in Abschnitt 2 erläutert und sammeln die Kultur überstand nach 24 h Stimulation mit LPS (100 ng/mL).
- Erfassen die konditionierten Medien von den behandelten MLEC-04 Zellen und Zentrifuge (600 X g). Den Überstand in 0,5 mL Aliquote bleiben bei-80 ° C bis zur Verwendung.
- Leukozyten Adhäsion Assay
- 96-Well-Platten mit 50 µL/Well des ausgewählten extrazelluläre Matrixproteine verdünnt mit PBS-Puffer (mit Ausnahme von Kollagen, das in 0,1 M Essigsäure verdünnt wird) zu beschichten: Fibronektin (1-10 µg/mL ), Laminin (1-10 µg/mL) und Kollagen Typ I (10-40 µg/mL). Leave-ON bei 4 ° c
- Die beschichteten Medien zu verwerfen und blockieren unspezifischen Bindungsstellen an Brunnen mit 150 µL PBS, 1 % BSA Hitze-inaktivierten (1 min., 100 ° C) für 90 min bei RT.
- Brunnen zweimal mit PBS waschen und 100 µL der zuvor gesammelten endotheliale konditioniert Medien (Abschnitt 6.1) in die Vertiefungen hinzufügen.
Hinweis: Platten sind bereit für die Durchführung des Adhäsion Tests. - Kultur der Maus Monocyte-Makrophagen-Zelllinie J774 in einem biologischen Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO 2) mit Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10 % FBS, 1 % P/S.
Hinweis: Die J774 Zellen in Suspension wachsen. - Sammeln die J774 Zellen in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge (300 X g, 5 min). Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der zellulären Pellets mit 10 mL serumfreie Medien. Zählen der Zellen in einer Neubauer-Kammer. Die Zellen (300 X g, 5 min) zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in serumfreien Medien an 15 x 10 4 J774 Zellen pro 50 µL Medien.
- Add 15 x 10 4 J774 Zellen zueinander auch in 50 µL serumfreie Medien und 15 min bei 4 ° C, gefolgt von 1 h bei 37 ° C in der CO 2 Zelle Inkubator inkubieren.
- Waschen die Brunnen zweimal, sanft durch Zugabe von warmen PBS; Zentrifugieren (300 X g, 5 min) und überstand durch eine 180°-Snap des Handgelenks von oben nach unten und schnelle Wiederherstellung in die ursprüngliche Position zu verwerfen. Die beigefügte Zelle zu behebens durch Zugabe von 100 µL/Well von 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer und inkubieren (10 min, RT).
- Verwerfen die Medien sanft und permeabilize der Zellen mit 2 % Methanol mit PBS-Puffer für 2 min bei RT. verwerfen die Medien sanft und färben die Zellen durch Zugabe von 50 µL/Well von 0,5 % Kristallviolett in 20 % Methanol für 90 s bei RT
- Die Platte mit reichlich fließendem Wasser waschen, verwerfen Sie die überschüssige Flüssigkeit und lassen Sie ihn an der Luft trocknen. Die angeschlossenen Zellen durch Digitalkamera gekoppelt mit einem Lichtmikroskop melden.
- Verdünnen die Zelle Färbung durch Zugabe von 100 µL/Well von 0,1 M Natriumcitrat, 50 % Ethanol. Maßnahme der Extinktion bei 545 nm und repräsentieren die Ergebnisse als willkürliche Einheiten der Extinktion oder Prozentsatz der Adhäsion durch die Berücksichtigung von 100 % als Zelladhäsion nach Wells erreicht mit höheren Liganden-Konzentration beschichtet
7. Endotheliale Aktivierung von Leukozyten-Endothel Co Adhäsion Assay zu testen
- MLEC-04-Zellen auf 96-Well Platten zu behandeln, wie in Abschnitt 2 beschrieben und inkubieren Sie mit LPS (6 h, 37 ° C).
- Eindringmittel beschriften J774 Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CSFE).
- Waschen die J774 Zellen mit PBS-Puffer nach dem Verfahren des 6.2.5. Anzahl der Zellen durch die Neubauer Kammer-Methode und 1 x 10 6 Zellen/ml in PBS, 0,1 % BSA Aufschwemmen.
- Inkubation der Zellen mit CFSE (5 µM, Endkonzentration) für 20 min bei 37 ° C. hinzufügen 5 mL unvollständige Medien und inkubieren (5 min, 4 ° C).
- Einmal waschen mit unvollständigen Medien wie in 6.2.5 erklärt., bei 15 x 10 4 Zellen/100 µL Aufschwemmen und fahren Sie mit Co Adhäsion Assay.
- Nach der Endothel-Behandlung Waschen die Brunnen dreimal mit unvollständigen Medien. Fügen Sie CFSE--J774 Zellen (15 x 10 4 Zellen/100 µL hinzu) zueinander endotheliale beschichtet gut. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei 4 ° C, gefolgt von 60 min bei 37 ° c
- Waschen die Brunnen sanft, wie beschrieben in 6.2.7., mit erwärmten PBS und melden die J774 Adhäsion auf die endotheliale Schicht durch die folgenden zwei Methoden:
- Lyse der Zellen in 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1 % SDS (100 µL/Well) und Messen Sie die CFSE--J774 Signal durch Fluorometry (Erregung/Emission = 492 nm/517 nm). Stellen Sie die Ergebnisse als willkürliche Einheiten der Fluoreszenzintensität oder Prozentsatz der Haftung in Bezug auf Positivkontrolle (Signal vom gesamten Zellen hinzugefügt in jede Vertiefung).
- Fixieren den Zellen bei 4 % PFA und Bericht der Befestigung der CFSE--J774 Zellen des Endothels durch die Visualisierung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Anregung/Emission = 492 nm/517 nm).
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Representative Results
Bewertung von LPS-induzierte endothelialer Zellaktivierung durch RT-qPCR
Die Serum verhungert MLEC-04 Zellen wurden von 100 ng/mL von LPS 6 h stimuliert, und die endotheliale Genexpression wurde anhand RT-qPCR durch den Vergleich des Ausdrucks der Aktivierungsmarker auf den ruhenden Zustand. Wie in Abbildung 1Adargestellt, induziert die LPS inkubiert MLEC-04-Zellen die mRNA Expression von ausgewählten Adhäsionsmoleküle Leukozyten Einstellung während der entzündlichen Reaktion (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1) beteiligt. PECAM-1 wurde als interne Kontrolle verwendet, da der Ausdruck in diesem experimentellen Behandlung unverändert ist. Abbildung 1 b stellt die endotheliale Aktivierung von LPS, gemessen durch die erhöhte mRNA Expression von Zytokinen Ccl5, Cxcl10 und Cxcl1. Diese Moleküle sind in der Aktivierung der zirkulierenden Leukozyten, einschließlich ihren Handel auf die endotheliale Schicht und späteren Extravasation auf der Website der Entzündung beteiligt. Die Cytokine, IL4, diente als interne Kontrolle in diesem experimentellen Behandlung.
Abbildung 1: Bewertung der LPS-induzierten endothelialen Zellen Aktivierung durch RT-qPCR. Die MLEC-04-Zellen wurden mit 100 ng/mL von LPS 6 h (roter Balken) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (blaue Balken) angeregt, und die Genexpression wurde durch RT-qPCR analysiert. Diagramme zeigen Falten Induktion von mRNA in Bezug auf die Kontrolle Zustand des ausgewählten endothelialen Adhäsionsmoleküle (A) und Zytokine (B) Leukozyten-Aktivierung und Einstellung während der entzündlichen Reaktion beteiligt. PECAM-1 und IL4 dienten als Negativkontrollen unter dieser Bedingung. Ergebnisse werden ausgedrückt als ± SEM von einem Experiment, aus drei durchgeführt, bedeuten in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Protein-Expression der Adhäsionsmoleküle auf LPS behandelten Endothelzellen
Entzündlichen Stimulation auf die MLEC-04 Zellen wie im vorherigen Abschnitt durchgeführt wurde und die Protein-Expression wurde von western-Blot-Technik untersucht. Die ruhende Endothel präsentiert fast nicht nachweisbare Ebenen der Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und ICAM-1 (bezeichnet als-). In Anwesenheit von LPS (+) ist die endotheliale aktivierte Phänotyp offensichtlich durch die Hochregulierung des Ausdrucks der beschriebenen Marker (Abbildung 2). Die Membranen wurden durch β-Aktin-Erkennung, normalisiert die als laden-Steuerelement verwendet wurde, um die relative Band dichten nach Densitometrie Analyse berechnen.
Abbildung 2: Protein-Expression der Adhäsionsmoleküle auf LPS behandelten Endothelzellen. Repräsentative western-Blot bewertende VCAM-1 und ICAM-1 Protein-Expression in Ruhe (-) im Vergleich zu LPS-behandelt (+) MLEC-04 Zellen. Die β-Aktin diente als ein Steuerelement laden. Das Molekulargewicht des jedes Protein ist in Klammern. Die Werte stellen die semi-Quantifizierung der relativen Band dichten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Endotheliale Oberflächenmarker LPS-vermittelte Entzündung
Die endotheliale Aktivierung im Zusammenhang mit entzündlichen wurde von Durchflusszytometrie ausgewertet, nach 6 Stunden-Stimulation durch LPS (100 ng/mL). In diesem Zustand wurde die Erkennung von Klebstoff-bezogene Moleküle Leukozyten Interaktion beteiligt bewertet. Im linken Bereich der Abbildung 3A stellt basale Ausdruck der angegebenen Marker in den ruhenden MLEC-04-Zellen (rot-Solid Histogramm) im Vergleich zu der Isotype Negativkontrolle (schwarz gepunktete Histogramm). Der rechten Seite der Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse stimuliert MLEC-04 abgeleitet. Die LPS-Behandlung deutlich hochreguliert Ausdruck der Adhäsionsmoleküle E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1 in der Plasmamembran (rot-Solid Histogramm) im Vergleich zu den ruhenden Zustand (schwarz gepunktete Histogramm). Siehe die Zytometrie Profile und zitiert, bevor der Ausdruck PECAM-1 in diesem experimentellen Zustand unverändert ist. Abbildung 3 b zeigt die Quantifizierung Werte als Referenzen verwendet werden, um mögliche Mediatoren der endothelialen entzündliche Reaktion zu bewerten. %: Anteil der positiven Zellen; MFI: meine Fluoreszenzintensität.
Abbildung 3: endotheliale Oberflächenmarker LPS-vermittelte Entzündung. Flow Cytometry Profile der Zelle Adhäsionsmoleküle auf Ruhe und MLEC-04 LPS-stimulierten Zellen. Die linke Tafel zeigt Protein-Expression auf die ruhende Zellen (Antigen beschriftet rot-Histogramm) in Bezug auf das Steuerelement angepasst Isotype (Strg-schwarz Histogramm). Der rechten Seite vergleicht die Kontrolle Zelloberfläche Protein-Expression (schwarze Histogramme) zu den LPS behandelten endothelialen Zellen (rote Histogramm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Signalwege, ausgelöst durch die Stimulation der LPS in Endothelzellen
Die Mechanismen der vaskulären Fach-Aktivierung während einer Entzündung werden durch die Auswertung wichtige Signalmoleküle untersucht. Die MLEC-04-Zellen stimuliert mit LPS zu verschiedenen Zeiten für Proteingewinnung verarbeitet wurden, und der Grad der Aktivierung wurde durch western-Blot-Technik analysiert. Abbildung 4 zeigt, dass die IκBα-α-Repressor von NF-κB-Signalisierung nach 15 min LPS-Inkubation phosphoryliert ist und zum basalen Ebenen nach 1 Stunde kehrt. Auf der anderen Seite der LPS aktiviert ERK 1/2 Signalisierung nach 15 min, das schafft einer wesentlicher Weges endotheliale Aktivierung während der entzündlichen Reaktion beteiligt. Die Membranen wurden durch β-Aktin oder ERK 1/2-Erkennung, normalisiert, die wie die Steuerelemente laden berechnen Sie die relative Band dichten nach Densitometrie Analyse verwendet wurden.
Abbildung 4: Signalwege durch LPS auf Endothelzellen ausgelöst. Die MLEC-04-Zellen stimuliert mit 100 ng/mL von LPS für die Zeiten in der Figur angedeutet und Signalwege ERK 1/2 (P-ERK 1/2) und NF-κB (durch P-IκBα) wurden von western-Blot bewertet. Die ERK 1/2 insgesamt und β-Aktin dienten als Kontrollen in jedem Zustand zu laden. Das Molekulargewicht für jedes Protein ist in Klammern. Die Werte stellen die semi-Quantifizierung der relativen Band dichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehenDiese Zahl.
Regelung des Verhaltens von Endothel mit LPS stimuliert Leukozyten
Die biologische Relevanz der Regulierung der endotheliale Aktivierung auf das Fortschreiten der entzündlichen Reaktion wird durch funktionelle Assays der Leukozyten Leistung bestimmt. Wie im Abschnitt Protokoll beschrieben, sind zwei verschiedene Ansätze für Leukozyten Funktion reguliert durch endothelial Zellen enthalten. Obwohl die Assays verschiedene Aspekte der Entzündungsreaktion (RT-qPCR für Endothelzellen Cytokines freigegeben durch die Leukozyten-Aktivierung und western-Blot für endothelialen Adhäsionsmoleküle in die Leukozyten Interaktion) befragen, werden die gewonnenen Daten Beide bewerten mikroskopische Details der Leukozyten-Anlage. Die Leukozyten-Aktivierung von Endothelzellen lösliche Faktoren ist wichtig für die Entwicklung einer effizienten entzündlichen Reaktion, da es Zelladhäsion auf verschiedene Substrate bevorzugt. Abbildung 5A zeigt die J774 Zelladhäsion auf 0,5 µg/mL Fibronektin beschichtet Brunnen in Reaktion auf die zuvor gesammelten konditionierten Medien aus dem Steuerelement oder LPS behandelten endotheliale Zellen. Die Hellfeld Bilder und photometrische Messungen zeigen, dass die Faktoren in den konditionierten Medien von LPS behandelten Endothel veröffentlicht effizient J774 Aktivierung induzieren ausreichen, wie gezeigt durch die Induktion der Zelle Bindung an Fibronektin. Abbildung 5 b stellt einen Co Adhäsion-Assay, die Fähigkeit der vaskulären Schicht, Leukozyten feste Haftung durch die neuartige Expression von endothelialen Adhäsionsmoleküle unterstützen zu bewerten. Kurz, waren die Serum verhungert subconfluent Kulturen der MLEC-04 Zellen stimuliert mit LPS 6 h mehrmals gewaschen und zusammen mit der Leukozyten-Linie, die J774 zuvor mit der fluoreszierenden Sonde CFSE beschriftet inkubiert. Wie in den Mikrographen und Spectrofluorometric Messungen dargestellt, begünstigt die LPS-vaskuläre Stimulation die Interaktion des CFSE--J774 Zellen, Endothelzellen Monolage.
Abbildung 5: Leukozyten Interaktion LPS inkubiert endotheliale Monolage von Co Adhäsion Assay. (A) Lichtmikroskopie Bilder zeigen Kristallviolett Färbung der J774 Zellen mit 0,5 µg/mL Fibronektin beschichtet Brunnen in Reaktion auf konditionierte Medien aus der Kontrolle oder dem LPS behandelten Endothelzellen verbunden. Maßstabsleiste, 50 µm. Die photometrische Analyse unten zeigt die Extinktion Messung ausgedrückt als willkürliche Einheiten (AE) ± SEM für ein repräsentatives Experiment laufen in dreifacher Ausfertigung. (B) Fluoreszenz Mikrographen zeigen CFSE--J774 Zellen an der Steuerung oder LPS behandelten MLEC-04 Zellen von Co Adhäsion Assay bewertet befestigt. Maßstabsleiste = 50 µm. Die fluorometrisch Analyse unten zeigt die Fluoreszenzintensität ausgedrückt als willkürliche Einheiten (AE) ± SEM für ein repräsentatives Experiment laufen in dreifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Ziel | NCBI RefSeq ID | Vorwärts-Sequenz (5´-3´) | Umgekehrter Reihenfolge (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | ACT GTG GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA TCC GCA T | GTT CTT GCC KATZE CAG CAC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | CAA AGC ATC CCG TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CAC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG AGB CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | AGT GCA GCA AGA CTC TGG TAC CTA | AGT TCC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG CTA ACC G | GGG KATZE CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CTC CTT TTT GTC CAG |
| E-Selektin | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG ACG AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | CCG ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | CCG CTA CCA TCA CCG TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tabelle 1: Liste der in dieser Studie verwendeten Primer.
| Ausruhen | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| Strg-Taste | 1.79 | 3.5 | 0,55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37.52 | 12.09. | 37.82 | 12.24 |
| E-Selektin | 17.12. | 8,06 | 88.13 | 49.84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204.05 |
| ICAM-1 | 99.76 | 114.81 | 99,82 | 363.89 |
Tabelle 2: endotheliale Oberflächenmarker LPS-vermittelte Entzündung. Quantifizierung der Zelle Adhäsion Moleküle Ausdruck auf die Ruhe- und LPS-stimulierten MLEC-04-Zellen durch Flow-Zytometrie-Analyse. Die repräsentative Werte für jede Markierung entspricht der Anteil der positiven Zellen (%) und mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) in den Ruhe- und LPS-stimulierten Endothelzellen. PECAM-1 wurde als Negativkontrolle unter diesen Versuchsbedingungen verwendet.
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Discussion
Dieses Endothel Protokoll beschreibt eine schrittweise Technologie, die legt den Grundstein für die Erforschung neuartiger Mechanismen an der Regulation der Entzündungsreaktion beteiligt. Diese Ansätze basieren auf der Untersuchung der endothelialen Aktivität angeregt durch LPS und bewerten die entscheidenden Schritte, speziell bei der Rekrutierung von Leukozyten während der entzündlichen Reaktion beteiligt: endotheliale Cytokine Freigabe, endotheliale Haftung Moleküle Ausdruck und Leukozyten Adhäsion der vaskulären Schicht. Sobald die endotheliale Parameter festgelegt sind, kann das System für neuartige Substanzen beteiligt an der Regulation des endotheliale Funktion suchen und infolgedessen entzündliche fortschreiten. Diese regulatorischen Medikamente kann von Interesse für den Pharma-Markt. Die große Projektion dieses sequentielle Protokoll ist zur Errichtung einer Stiftung für die Ausweitung dieser Studies zu verschiedenen Endothelzellen und stimulierende Bedingungen durch Anpassung an ihre relative vaskulären Aktivitätsparametern.
Ausgewählt von diesem Screening Drogen bilden interessante Kandidaten für die Gestaltung neuer therapeutischer Strategien gegen entzündliche Erkrankungen. Auf der einen Seite werden die Verbindungen, die zugunsten der endothelialen Reaktion und zur Rekrutierung von Leukozyten vielversprechend für Immunschwäche Bedingungen16,17. Auf der anderen Seite würde die endothelialen Inhibitoren hervorragende Therapien für chronisch-entzündliche Erkrankungen10darstellen.
Charakterisierung von den Zytokinen stimuliert Endothel zum Ausdruck gebrachten prognostiziert die Entwicklung der Entzündung. Zytokine sind kleine Proteine, die durch die endotheliale Schicht im Zusammenhang mit entzündlichen freigegeben und stark Leukozyten Verhalten zu regulieren. Pro-inflammatorischen Member, z. B. Ccl5, Cxcl10 und Cxcl1, binden Sie an ihre spezifischen Rezeptoren auf der Oberfläche der Leukozyten und signalisieren induzieren Leukozyten Interaktion mit den neu zum Ausdruck gebrachten Adhäsionsmoleküle auf der vaskulären Schicht (E-Selektin, VCAM-1 und ICAM-1), und Migration der Leukozyten, die pathologischen Bereich (Abbildung 1, Abbildung 2, , Abbildung 3),8,10,18. Andere Mitglieder der gleichen Familie der Proteine sind die Auflösung der Entzündung und folglich Gewebereparatur beteiligt. Der Ausdruck dieser Anti-inflammatorische Zytokine ist relevant für chronisch-entzündliche Erkrankungen, denn sie Leukozyten Rekrutierung behindern und Immunität Abstand10,19,20 begünstigen. Wenn mögliche endotheliale entzündliche Regulierungsbehörden auswählen möchten, empfiehlt es sich, dieses Zytokin-Ausdruck-Test durchführen und Auswerten der endothelialen Adhäsion Moleküle Interessenbekundung im Beisein der Verbindungen. In der Tat, analysieren die Ebenen zwischen Anti-inflammatory gegen Pro-inflammatorischen Zytokinen kann als einen prädiktiven Wert für die Progression der Krankheit verwendet werden und zeigt das Medikament von therapeutischem Interesse21.
Bindung an seine Zelle Oberfläche Rezeptor löst komplexe intrazelluläre Signalisierung Kaskaden, die unter der Leitung von MAP-Kinasen ERK 1/2 LPS, JNK, und p38 und NF-κB Signalosome induzieren die entzündliche transkriptionelle Programm. Viele dieser Wege sind häufig auf andere entzündliche Reize wie TNF-α oder IL-110,22. Die endotheliale Aktivierung wird bestimmt durch die Erkennung der phosphorylierten Form der MAP Kinase Mitglieder wie für ERK 1/2 in Abbildung 4gezeigt. Darüber hinaus die endotheliale Aktivierung durch LPS induziert enzymatische Aktivität von komplexen, IKKβ, phosphorylates und verschlechtert sich die NF-κB-Inhibitor komplexe IκBα, so dass NF-κB-Effektor Mitglieder des nuklearen Translokation der Korrespondent durchführen transkriptionelle Aktivität (Abbildung 4). Charakterisierung der Mechanismen, durch die Droge Verbindung die endotheliale entzündliche Reaktion betrifft, ist sehr nützlich, nicht nur in beschreibt die Droge, aber auch in der Gestaltung neuer entzündlicher Behandlungen in Kombination mit konventionellen Therapien kompatibel 23.
Verbindungen aus der endothelialen entzündliche Screening-Assays ausgewählt, müssen bestätigen Sie ihre funktionelle Relevanz in die entscheidenden Schritte der Leukozyten Verhalten Assays, weiter geprüft werden, wie letztlich die Zellen für die entzündlichen Erkrankungen verantwortlich sind. Diese Proben analysieren die Leukozyten-Aktivität in zwei verschiedenen experimentellen Einstellungen. Die erste ist bei der Bewertung der Rolle der endothelialen veröffentlicht Zytokine auf Leukozyten-Aktivierung durch Integrin-vermittelte Adhäsion Assays. Die Leukozyten Integrine sind durch die endotheliale freigesetzten Zytokine aktiviert. Somit ist Leukozyten Klebstoff Fähigkeit, Integrin-Liganden eine repräsentative Messung für Leukozyten Funktion8,10,18. Die zweite ist in die Rolle des neu exprimierten endothelialen Adhäsionsmoleküle auf der Leukozyten-Interaktion auf die vaskuläre Schicht durch Co Adhäsion Assays zu studieren. Der endothelialen Adhäsionsmoleküle ausgedrückt im Zusammenhang mit entzündlichen ist unerlässlich für die Rekrutierung von Leukozyten des umgebenden Gewebes. So kommt die Analyse der Leukozyten, die Interaktion mit der endothelialen behandelt Monolage von Zellen einen prognostischen Wert für entzündlichen Verlauf (Abbildung 5)8,10,18. Die Ergebnisse aus diesen Ansätzen abgeleitet würde vorschlagen, dass die ausgewählten Verbindungen ernsthaften Kandidaten bei der Gestaltung künftiger Strategien zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen sind
Die experimentelle Vorschlag hier definiert ist ein vielseitiges Werkzeug für zukünftige Anwendungen wegen seiner Fähigkeit, auf unterschiedliche zelluläre oder stimulierende Systeme zu extrapolieren. Das Verfahren kann von unterschiedlicher Herkunft oder Spezies und seine Funktionalität auf mehrere Immunzellen, sowie verschiedene entzündliche Substanzen wie LPS, TNF-α, Bakterien, Viren, etc.zu testen Endothels geändert werden. Wie im Text beschrieben, müssen Forscher zuerst die endotheliale Aktivierung in ihrem eigenen System, später die Rolle einer ausgewählten Verbindung auf die entzündliche Reaktion zu charakterisieren charakterisieren. Einschränkungen des Protokolls sind die Auswahl einer geeigneten Negativkontrolle und genau die endotheliale Aktivität Parameter, die die Ruhe aus dem angeregten Zustand zu erkennen. Bei die in diesem Dokument beschriebenen Bedingungen für ein anderes System nicht funktionieren, müssen Forscher die Versuchsparameter beheben, indem zusätzliche zeitabhängigen Tests durchführen und ein Konzentrationsgradient von den Entzündungsreiz eine stimulierende Fenster definieren, die für das Testen neuer Medikamente für die Regulierung von der entzündlichen Reaktion ermöglicht.
Abschließend möchte ich sagen, ist diese endotheliale entzündliche Protokoll für die Suche nach n empfohlen.EW endotheliale Regulierungsbehörden Ausrichtung der entzündlichen Reaktion. Durchführung dieses Verfahrens bieten Roman, interessante Verbindungen die studieren seine zukünftigen Anwendungen und Gestaltung innovative vaskulären-spezifische Therapien gegen entzündliche Erkrankungen angewendet werden können, und die könnte möglicherweise von Interesse der Pharma-Markt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von dem Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) und des Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (Grant-Nummer IERPY 1149/16, A.L.; MPY 1410/09, S. Hortelano); von der MINECO durch den Fondo de Investigación de Salud (FIS) (S. Hortelano Nummern PI11.0036 und PI14.0055 gewährt). S. Herranz wurde durch IERPY 1149/16 von ISCIII unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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