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Cancer Research

वेस्टिबुलर श्वानोमा रिसर्च के लिए एक एकीकृत पद्धति ढांचा

Published: June 20, 2017 doi: 10.3791/55827
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वैस्टिबुलर स्वानोमा और श्वान सेल अनुसंधान में कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए मानव शल्य नमूने के संग्रह और प्रसंस्करण को रूपरेखा देना है।

Abstract

वेस्टिबुलर स्विनमानो, सेरेबेलपोन्टाइन कोण के सबसे सामान्य नवजात हैं, जिससे सभी इंट्राक्रैनील ग्रोथों का 6-8% प्रतिशत होता है। हालांकि ये ट्यूमर प्रभावित व्यक्तियों में से 95% तक संवेदी सुनवाई का कारण बनता है, हालांकि, इस सुनवाई के नुकसान के अधीन आणविक तंत्रों में मायावी नहीं है। यह लेख, हमारे प्रयोगशाला में स्थापित चरणों को रेखांकित करने के लिए विभिन्न प्राथमिक मानव ऊतक नमूनों के संग्रह और प्रसंस्करण की सुविधा प्रदान करता है जो वेस्टइबुलर स्विनमानों के अध्ययन के अभिन्न अंग हैं। विशेष रूप से, यह काम सर्जिकल नमूनों से श्वान और स्वान्नामा कोशिकाओं के संग्रह, प्रसंस्करण और संस्कृति के लिए एक एकीकृत पद्धति ढांचा का वर्णन करता है। यह वर्तमान अनुसंधान के लिए आवश्यक समांतर प्रसंस्करण कदमों के साथ एकीकृत है: ट्यूमर और तंत्रिका स्राव का संग्रह, आरएनए के संरक्षण और एकत्रित ऊतकों से प्रोटीन निकालने, वर्गों की तैयारी के लिए ऊतक का निर्धारण, औरडी जीन थेरेपी के लिए आवेदन के लिए एडीनो-संबंधित वायरस के लिए प्राथमिक मानव कोशिकाओं के जोखिम। इसके अतिरिक्त, यह काम इन ट्यूमर को आंतरिक कान और पिरिल्म से मानव संवेदी उपकला प्राप्त करने का एक अनूठा अवसर के रूप में इकट्ठा करने के लिए ट्रांसलेब्रिन शल्य दृष्टिकोण को हाइलाइट करता है। प्रयोगात्मक गुणवत्ता को बेहतर बनाने के लिए युक्तियां प्रदान की जाती हैं और आम नुकसान को हाइलाइट किया जाता है।

Introduction

वेस्टिबलुलर स्विनमानोमा (वी.एस.), सेरेब्रोप्पटिन कोण के सबसे आम नवप्रतिफल हैं, प्रत्येक 100,000 व्यक्तियों में 1 में निदान किया गया है। हालांकि गैर-मेटास्टैटिक, ये ट्यूमर गंभीर रूप से मरीज की गुणवत्ता 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 को प्रभावित करते हैं। प्रभावित व्यक्ति सामान्यतः सुनवाई हानि, टिन्निटस, और कर्ण पूर्णता की भावना के साथ रहते हैं। ट्यूमर के रूप में लक्षण बढ़ने से कमजोर हो जाते हैं, संतुलन की समस्याएं, चेहरे का पक्षाघात, और अन्य कपाल तंत्रिका कार्यों की हानि होती है। मस्तिष्क संपीड़न के कारण जीवन-धमकाने वाले जटिलताएं भी 7 हो सकती हैं।

वी.एस. के लिए प्रबंधन विकल्प अनिवार्य रूप से स्थैतिक ट्यूमर और स्टेरॉयटेक्टिक विकिरण चिकित्सा या बढ़ती ट्यूमर के लिए सर्जिकल रिसेप्शन

क्योंकि VSs एक परिधीय संवेदी तंत्रिका ( यानी vestibular तंत्रिका) से पैदा होती है, यह महत्वपूर्ण है कि वी.एस.-संबंधित टिप्पणियों की तुलना उपयुक्त नियंत्रण तंत्रिका से उत्पन्न होती है, जैसे मानव महान एरिक्युलर तंत्रिका (जीएएन)। स्वस्थ जीएएन का नियमित रूप से पैराोटिडेक्टोमीज या गर्दन के विच्छेदन के दौरान बलिदान किया जाता है और स्वस्थ श्वॉन सेल फिजियोलॉजी 9 के लिए मजबूत मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

क्योंकि छिटपुट वी.एस. के उपचार या रोकथाम के लिए कोई एफडीए-अनुमोदित दवाएं नहीं हैं, यह आवश्यक है कि शोधकर्ताओं ने अंतर्निहित आणविक मेचचिकित्सीय लक्ष्य की पहचान करने के लिए बीमारी के निस्संदेह वी.एस. पैथोजेनेसिस में भूमिका निभाने वाले प्रोटीन में मर्लिन, वास्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीएजीएफ), साइक्लोओक्सीजेनसेज़ 2 (कॉक्स -2), परमाणु कारक कप्पा बी (एनएफ- κबी), ट्यूमर नेकोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-अल्फा) शामिल हैं। , एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर), और संबंधित सिग्नलिंग अणुओं 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 ।

प्राथमिक मानव वास्टिबुलर स्विनमानों और स्वस्थ तंत्रिका के ऊतकों 18 , 1 9 की संग्रह, प्रसंस्करण, संस्कृति और डाउनस्ट्रीम जांच के लिए हालिया प्रगति और बेहतर प्रोटोकॉल का विस्तार किया गया है। हालांकि, अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल तैयारी को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैंएक एकल डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोग ( जैसे, सेल संस्कृति अकेले) के लिए इस तरह के ऊतकों का आयन। यह लेख कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एकल प्राथमिक मानव वी.एस. या जीएएन नमूने के साथ-साथ प्रसंस्करण के लिए एक एकीकृत पद्धतिगत रूपरेखा प्रस्तुत करता है: सेल प्रकार-विशिष्ट संस्कृति, प्रोटीन निकासी, आरएनए संरक्षण, ट्यूमर स्राक्रियन संग्रह, और ऊतक निर्धारण। यह काम भी सर्जिकल संग्रह और मानव मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ (सीएसएफ) और प्रृमिल्फ़ के प्रसंस्करण के दौरान अनुवादित वी.एस. लर्निंग के बारे में बताता है, क्योंकि इन करीबी से संबंधित ऊतकों को वी.एस. के लिए बायोमार्कर के महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में काम किया जा सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल जीन थेरेपी में उपयोग के लिए इस ऊतक के एक उपन्यास आवेदन के रूप में संस्कृति में प्राथमिक मानव वी.एस. कोशिकाओं के वायरल ट्रांसडकेशन के लिए कदम प्रस्तुत करता है।

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Protocol

शल्य चिकित्सा से पहले सभी नमूने एकत्र करने के लिए लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, और विश्व मेडिकल एसोसिएशन (हेलसिंकी घोषित) के आचार संहिता के अनुसार प्रयोग किए गए थे। अध्ययन प्रोटोकॉल के सभी वर्गों को मैसाचुसेट्स आई और कान और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल की संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: नीचे अनुभाग 1-7 ऑपरेटिंग कमरे से प्राथमिक मानव वी.एस. या जीएएन नमूने की प्राप्ति पर क्रमिक रूप से करने के लिए तैयार किए गए हैं। प्रसंस्करण हमेशा 1 से शुरू होना चाहिए। फिर, एक नियम के रूप में, आरएनए को पहले संरक्षित किया जाना चाहिए (खंड 2), स्राव के संग्रह के लिए ऊतक की तैयारी के बाद (अनुभाग 3) और प्रोटीन निष्कर्षण (धारा 4)। ऊतक सुसंस्कृत होने के लिए (वी.एस. के लिए अनुभाग 5, जीएएन के लिए धारा 6) पूरक संस्कृति माध्यम में बैठ सकते हैं जबकि खंड 2, 3 और 4 का प्रदर्शन किया जाता है। सेक्शनिंग (खंड 7) के लिए ऊतक का निर्धारण बहुत ही कम है और सीकिसी भी केन्द्रापसारक कदम के दौरान किया जाना चाहिए। ट्रांसमिलेनेबिन वी.एस. रेसिपेशन के दौरान ऑपरेटिंग रूम से पेरिइल्फ़ या सीएसएफ की प्राप्ति के बाद धारा 8 (प्रिलिल्फ़ प्रोसेसिंग) और 9 सीएस (सीएसएफ प्रसंस्करण) किया जा सकता है। धारा 10 (वायरल ट्रांसडक्शन) संस्कृति में वी.एस. या श्वान कोशिकाओं के विकास पर किया जा सकता है।

1. सर्जिकल नमूना की तैयारी और रसीद

नोट: निम्न चरण एक बाँझ वातावरण में किया जाता है, जैसे टिशू कल्चर हूड या लामिनार फ्लो हुड। बुनियादी बाँझ तकनीक के साथ परिचित उम्मीद है।

  1. प्राथमिक मानव वीएस या श्वाइन सेल संस्कृति के लिए माध्यम की तैयारी
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में जमे हुए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल विभाज्य को पिघलना।
    2. डीएमईएम / एफ -12 की 500 मिलीलीटर की बोतल में 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन मिश्रण को जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 1: 100 के अंतिम कमजोर पड़ने का परिणाम है।
    3. डीएमईएम / एफ -12 की 500 मिलीलीटर बोतल में 50 मिलीलीटर विरल एफबीएस को जोड़ें,जिसके परिणामस्वरूप 1:10 के अंतिम कमजोर पड़ने का परिणाम है।
    4. बोतल पर दिनांक, शोधकर्ता के आद्याक्षर, और पूरक जानकारी ( जैसे, 1% पी / एस, 10% एफबीएस) लिखें
    5. रेफ्रिजरेटर में नया संस्कृति माध्यम रखें (4 डिग्री सेल्सियस)
  2. वीएस या जीएएन नमूना की रसीद और सफाई
    1. ऑपरेटिंग कमरे में, एक नमूना कंटेनर में बाँझ खारा में ताजा कटा हुआ वी.एस. या जीएएन नमूना रखें। नमूना को ऑपरेटिंग कमरे से बर्फ पर प्रयोगशाला में एक लामिना का प्रवाह हुड पर ट्रांसफ़र करें।
      नोट: नमूना आकार और वजन प्रासंगिक ट्यूमर के आकार या उत्तेजित तंत्रिका की मात्रा के आधार पर रोगियों के बीच काफी भिन्न होते हैं।
    2. फ्रीज़र से hyaluronidase (25,000 U / mL) और collagenase (3,200 यू / एमएल) के स्टॉक-समाधान aliquots को निकालें और कमरे के तापमान पर एंजाइम्स पिघलना (चरण 5.1.4 या 6.1.6 के लिए आवश्यक है, इस पर निर्भर करता है कि क्या नमूना है एक वी.एस. या एक जीएएन)।
      नोट: लैओफिलाइज्ड एंजाइमों का पुन:एस उत्पाद विवरण शीट्स पर विस्तार से वर्णित है Collagenase 0.02 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.0), 77 मिमी NaCl, और 1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बिन के 0.01% के समाधान में किसी भी कैल्शियम-मुक्त संतुलित नमक समाधान और hyaluronidase में resuspended किया जा सकता है। प्रत्येक लाईफिलाइज्ड एंजाइम के लिए विशिष्ट गतिविधि बहुत भिन्न होती है और पुनरुत्थान से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए।
    3. 1.4 एमएल 1x बाँझ पीबीएस से भरे तीन 1.5 एमएल ट्यूबों की श्रृंखला का प्रयोग करके वी.एस. या जीएएन नमूना तीन बार धोएं। सावधानी से ट्यूब से ट्यूब में बाँझ संदंश के साथ स्थानांतरण करें। प्रत्येक ट्यूब को एक बार बंद करने के बाद नमूना लें, और धीरे से धो लें।
      नोट: 1.5 एमएल ट्यूबों को बाढ़ने से बचने के लिए, ट्यूमर का टुकड़ा बड़ा होने पर, 1.4 एमएल की पीबीएस से कम प्रति ट्यूब का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. नमूना को एक सूखा 60 मिमी पेट्री डिश में रखो और सभी मृत ऊतक ( यानी, स्वादिष्ट भाग, जो कि आमतौर पर सफेद या अपारदर्शी रंग हैं) को दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें और प्रमुख रक्त वाहिकाओं के साथ क्षेत्र।
    5. एफ का प्रयोग करेंआरसीए संरक्षण, प्रोटीन निष्कर्षण, स्राव संग्रह, निर्धारण, और सेल संस्कृति के लिए अलग टुकड़ों में नमूना विभाजित करने के लिए ऑरसेप्स या स्केलपेल ब्लेड (अनुभाग 2 - 6, नीचे देखें)।
    6. सेल संस्कृति (अनुभाग 5/6) के लिए नामित नमूने का टुकड़ा नया 60 मिमी संस्कृति वाला पकवान, जिसमें 5-8 एमएल सर्दी, पूरक डीएमईएम / एफ -12 मध्यम (वैकल्पिक रूप से, पहले संस्कृति डिश का ढक्कन हो सकता है) इस कदम के लिए इस्तेमाल किया)
      नोट: आवश्यक डीएमईएम / एफ -12 माध्यम की मात्रा (चरण 1.1 से) ट्यूमर या तंत्रिका के आकार पर निर्भर करेगी, लेकिन यह 5 से 8 एमएल के बीच आना चाहिए। यह टुकड़ा संस्कृति माध्यम में बैठ सकता है, जबकि बाद के चरणों का प्रदर्शन किया जाता है।

2. वी.एस. और जीएएन टिश्यू के आरएनए संरक्षण (मानव संवेदी एपिथेलियम के लिए भी मान्य)

  1. लामिना का प्रवाह हुड के तहत, 1-1.2 एमएल की आरएनए स्थिरीकरण समाधान को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. पीबीएस (चरण 1.2.3) के साथ नमूना धोने के बाद, छोटे पाई को संक्षिप्त रूप से डुबकीआरएनए स्थिरीकरण समाधान में आरएनए संरक्षण (लगभग 3 मिमी 3 वी.एस. या 5 एमएम की जीएएन) के लिए नामित ऊतक की सीई। सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से समाधान में डुबोया गया है।
  3. तैयार करें और एक नया 1.5 एमएल ट्यूब लेबल। नमूना आरएनए स्थिरीकरण समाधान से प्राप्त करें, इसे नई ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में संग्रहीत करें।

3. वी.एस. और जीएएन सिक्रेशन का संग्रह

  1. पहला दिन
    1. पीबीएस (चरण 1.2.3) के साथ नमूना धोने के बाद, रिक्त 1.5 एमएल ट्यूब में स्राव के संग्रह के लिए वीएस या जीएएन का टुकड़ा रखें।
    2. दो अतिरिक्त 1.5 एमएल ट्यूबों और विंदुक तैयार करें प्रत्येक ट्यूब में 500 एमएल डीएमईएम (एफबीएस के साथ पूरक नहीं)
      नोट: डीएमईएम की पहली ट्यूब का उपयोग ट्यूमर स्राक्रिटी को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा, और डीएमईएम की दूसरी ट्यूब एक मिलान नियंत्रण के रूप में काम करेगी। डीएमईएम में स्राव इकट्ठा किया जा सकता है, कोई अन्य विशिष्ट संस्कृति माध्यम नहींसीरम, या पीबीएस के साथ पूरक
    3. एक डीएमईएम युक्त ट्यूबों में से एक कैलिब्रेटेड डिजिटल पैमाने पर रखें। बड़े पैमाने पर तारे, जैसे कि जब ट्यूब पैमाने पर बैठता है, तो यह 0 मिलीग्राम पढ़ता है
    4. स्केल से डीएमईएम की ट्यूब निकालें, ट्यूब में स्राव के संग्रह के लिए निर्दिष्ट नमूने का टुकड़ा रखें, और इसे तौलना परिणाम को ध्यान दें, जो केवल ऊतक के वजन का प्रतिनिधित्व करेंगे।
    5. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, ट्यूब में डीएमईएम की मात्रा 100 μL प्रति 10 मिलीग्राम नमूना समायोजित करें।
    6. इस प्रयोग के लिए योजनाओं के अनुरूप अवधि के लिए ऊतक के नमूने वाले ट्यूब और इसके मिलान नियंत्रण (अकेले डीएमईएम) इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) में रखें। जैविक रूप से उपयोगी मात्रा में ट्यूमर या तंत्रिका स्राव 15 इकट्ठा करने के लिए कम से कम 72 घंटे के लिए ऊतक सेते हैं।
  2. दिन 4
    1. 72 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, से स्राव युक्त माध्यम को हटा देंएक एमएल पिपेट का उपयोग करते हुए नमूना ( यानी, ऊतक-वातानुकूलित माध्यम) दोबारा फ्रीज-पिघलना चक्रों को रोकने के लिए, योजनाबद्ध डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के अनुसार माध्यमों को नए ट्यूबों में विभाजित करते हैं ( उदाहरण के लिए, प्रत्येक एलआईएसए को 50 μL की आवश्यकता वाले 4 कुओं के साथ, 210 μL के अलक्षकों को तैयार किया जा सकता है)।
    2. यदि आवश्यक हो, तो बाद की तारीख में डीएनए निष्कर्षण जैसे अतिरिक्त विश्लेषणों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर मूल ट्यूब (पहले दिन 1 पर लेबल किया गया) में शेष टिशू टुकड़े को फ्रीज करें।
    3. डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशन शुरू होने तक ( जैसे, एलिसा, एलसी-एमएस / एमएस, साइटोकिन एरे, आदि ) ऊतक, स्राव, और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में डीएमईएम को नियंत्रित करें।

4. वी.एस. या जीएएन टिश्यू से प्रोटीन एक्सट्रैक्शन

  1. गढ़वाले आरआईपीए बफर की तैयारी
    1. 15 एमएल ट्यूब में 10 एमएल आरआईपीए बफर के लिए फॉस्फेटस अवरोधक और एक प्रोटीज अवरोधक के एक टैबलेट को जोड़ें; यह दृढ़ हैआरआईपीए बफर
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर आरआईपीए बफर को स्टोर करें और उपयोग करने से पहले गोलियाँ जोड़ें।
  2. प्रोटीन निष्कर्षण
    1. एक नए 1.5 एमएल ट्यूब के लिए 210 माइक्रोन फोर्टिफाइड आरआईपीए बफर (चरण 4.1.1) में स्थानांतरण करें।
    2. पीबीएस (चरण 1.2.3) के साथ नमूना धोने के बाद, प्रोटीन निष्कर्षण (लगभग 3 मिमी 3 वी.एस. या 5 मिमी की जीएएन की लंबाई) को आरआईपीए बफर युक्त ट्यूब के लिए नामित ऊतक के हस्तांतरण में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें कम से कम 10 मिनट के लिए यदि प्रोटीन के फास्फोरिलेटेड रूपों का अध्ययन करते हैं, तो प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ आरआईपीए बफर का पूरक 14 । इस बीच, टिशू प्रसंस्करण के अन्य घटकों के लिए कदम, जैसे निर्धारण (खंड 7), बाहर किया जा सकता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र ठंडा
    4. प्लास्टिक की मूसल का प्रयोग करके, आरआईपीए बफर युक्त ट्यूब में ऊतक को होमोजेनइज़ करें। ऊपरी को 10-15 s के लिए 20% आयाम पर सोना। सुनिश्चित करें कि नमूनाबर्फ पर रहता है, यहां तक ​​कि दौरान sonication
    5. 15 मिनट और 10 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
    6. 50 मिलीलीटर की बढ़ोतरी में 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों पर तैरनेवाला को विभाजित करना (इच्छित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर, किसी भी वेतन वृद्धि का आकार चुना जा सकता है)।
    7. डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशन शुरू होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रोटीन lysate के aliquots स्टोर करें ( जैसे, एलिसा या पश्चिमी ब्लोट्स) 20 , 21

5. प्राथमिक मानव वी.एस. संस्कृति

  1. पहला दिन
    1. कोशिका संस्कृति के लिए नामित वी.एस. ऊतक को अलग करें (जो संस्कृति के माध्यम से बैठी हुई है, जैसा कि चरण 1.2.6 में वर्णित है) प्रत्येक हाथ में संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके लगभग 1 मिमी 3 टुकड़ों में होता है।
    2. ट्यूमर के टुकड़े वाले मध्यम को 10 एमएल सीरॉलॉजिकल पिपेट के साथ महाप्राणित करें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सभी सामग्री को स्थानांतरित करें।
    3. 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र1,000 xg और 25 डिग्री सेल्सियस
    4. 250 μL कोलाजेनेज (अंतिम एकाग्रता: 160 यू / एमएल) और 50 μL के hyaluronidase (अंतिम एकाग्रता: 250 यू / एमएल) के साथ पूरक डीएमईएम / एफ -12 माध्यम के 4.7 एमएल के संयोजन के द्वारा विसंवहन माध्यम तैयार करें। , 5 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए
      नोट: दोनों एंजाइमों को एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में जमा किया जाना चाहिए, लेकिन इस माध्यम की तैयारी से पहले thawed (चरण 1.2.2)।
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूमर के टुकड़े शंक्वाकार ट्यूब के निचले भाग में एक गोली बनाती हैं। सावधानी से पिपेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. ट्यूमर गोली में ताजा बनाये गए एंजाइम युक्त विघटन माध्यम (चरण 5.1.4) के 2 एमएल जोड़ें। टिशू को जुटाने के लिए कई बार पिपेट करें और मध्यम ट्यूमर के टुकड़े को 60 मिमी संस्कृति डिश में रखें।
    7. 18 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) में संस्कृति डिश रखें।
  2. दूसरा दिन
    1. गर्म डी37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (चरण 1.1 में तैयार) के साथ मेम / एफ -12 मध्यम पूरक।
    2. इनक्यूबेटर (चरण 5.1.7) से वी.एस. संस्कृति युक्त पेट्री डिश निकालें। एक 6 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक 22 जी सुई का उपयोग करना, संस्कृति युक्त माध्यम की महाप्राणण करना और उसे नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करना।
    3. 1,000 मिनट और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
    4. इस बीच, 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में आवश्यक पाई-डी-लाइसिन-और लेमिनेन-लेपित कांच के कवर के टुकड़े रखने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें।
      नोट: सुसंस्कृत कुएं की संख्या नमूना के आकार पर निर्भर करती है; लगभग 24-32 कुओं को 1 सेमी 3 ट्यूमर से सुसंस्कृत किया जा सकता है, इसलिए अधिकांश छोटे ट्यूमर के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं के 8-16 कुओं के लिए योजना उपयुक्त है।
    5. सेंटीफ्यूगेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला ( यानी, एंजाइम-समृद्ध माध्यम) को त्यागें और नए, पूरक डीएमईएम / एफ -12 मध्यम, पूर्व गर्म में अवशिष्ट सेल गोली resuspendचरण 5.2.1 में एड
      नोट: जिस मात्रा में गोली resuspend करने के लिए कदम 5.2.4 में योजना बनाई कुओं की संख्या से निर्धारित किया जाता है, प्रति योजनाबद्ध अच्छी तरह से 1 एमएल मध्यम का अनुमान है।
    6. एक 5 एमएल सीरियल विंदुक का उपयोग करते हुए resuspended सेल मध्यम (5.2.5 कदम) के 2 एमएल महाप्राण। 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक तैयार कण में ट्यूमर सेल युक्त माध्यम के 1 एमएल जमा करें
    7. जब तक ट्यूमर सेल निलंबन समान रूप से सभी तैयार कुओं के बीच विभाजित नहीं हो जाता है तब तक ट्यूमर सेल युक्त माध्यम (2 एमएल की वृद्धि में आकांक्षा, जिसमें से 1 एमएल प्रत्येक नियोजित अच्छी तरह से जमा किया जाता है) को जारी रखने और जमा करना जारी रखें।
    8. रात में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
  3. तीसरा दिन
    1. यदि कूड़े के नीचे उल्लेखनीय मलबे का उल्लेख किया गया है, ध्यान से प्रत्येक पूरक क्षेत्र में मध्यम को नए पूरक डीएमईएम / एफ-12 संस्कृति माध्यम में बदलकर, अनुरक्षण कोशिकाओं को स्थानांतरित न करने की देखभाल करें। यदि नहीं, तो इनक्यूबेटर को प्लेट लौटें और वें में बदलाव करेंदिन 5 पर पहली बार ई माध्यम।
  4. दिन 5-7 और बाद में
    1. हर 3 दिनों में मध्यम बदलें।
      नोट: प्राथमिक मानव वी.एस. और जीएएन कोशिकाओं को आम तौर पर संस्कृति में बनाए रखा जाता है जब तक कि 14 दिनों के या उससे कम उम्र के आसपास के अनुप्रयोगों में इसका उपयोग नहीं किया जाता। इस 1 9 के बाद संस्कृति की शुद्धता कम हो जाती है।

6. प्राथमिक मानव जीएएन संस्कृति

  1. पहला दिन
    1. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, जीएएन संस्कृति के लिए नामित टिशू से फैक्सैक्स को अलग करें (जो कि संस्कृति माध्यम में बैठे हैं, जैसा कि चरण 1.2.6 में उल्लिखित है)।
      1. एपिन्यूरियम और रेशेदार म्यान से छेदों को अलग-थलग करने से पेरिनेरीयम पर न खींचें। 5 संदंश, जबकि एपिन्यूरियम को नं। 3 संदंश
    2. एक बार fascicles आसपास के एपिनेरियम से पर्याप्त रूप से अलग कर रहे हैं, उन्हें एक नई संस्कृति पकवान में 2 एमएल के ताजा मिश्रणकपटपूर्ण माध्यम
    3. स्कैल्पल ब्लेड का उपयोग करके 1 से 2 मिमी के खंडों में फॉस्सिकिक्स कट करें।
    4. 15 मिलीलीटर ट्यूब की कुल मात्रा 5 एमएल हो जाती है, जिससे ताजा पूरक संस्कृति माध्यम के 3 एमएल युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब में छोटे फेशियल टुकड़े और आसपास के माध्यम को पिपेट करें।
    5. 3 मिनट के लिए नमूना 1000 xg और 25 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र
    6. इस बीच, 5 एमएल के अंतिम मात्रा के लिए पूरक डीएमईएम / एफ -12 मध्यम, 250 μL कोलेजनज के 250 μL, और 50 μL hyaluronidase के संयोजन के द्वारा एक नए 60 मिमी पेट्री डिश में एक श्वान सेल संस्कृति माध्यम बनाओ।
      नोट: -20 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम दोनों स्टोर करें; इस माध्यम की तैयारी से पहले उन्हें कमरे के तापमान पर पिघलना (चरण 1.2.2)।
    7. नमूना के मध्यवर्तीकरण के बाद, फैंकिक्स, शंक्वाकार ट्यूब में एक छोटी सी गोली में गिना जाएगा। सतह पर तैरनेवाला त्यागें
    8. तंत्रिका गोली में ताजा बनाये गए एंजाइम युक्त विघटन माध्यम (चरण 6.1.6) के 2 एमएल जोड़ें। पिपेट ऊपर और घऊतक को जुटाने के लिए और इसे एक नए 60 मिमी संस्कृति डिश में स्थानांतरित करने के लिए कई बार स्वयं।
    9. 20-22 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 ) में डिश रखें।
      नोट: यह वी.एस. नमूनों (चरण 5.1.7) के लिए जरूरी होने की अपेक्षा एक लंबा ऊष्मायन है।
  2. दूसरा दिन
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में डीएमईएम / एफ -12 माध्यम से गर्म पूरक।
    2. एक 6 जीएल सिरिंज से जुड़ी एक 22 जी सुई का इस्तेमाल करना, सेल संस्कृति युक्त माध्यम की महाप्राणण करना और उसे एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करना।
    3. 1,000 मिनट और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
    4. सतह पर तैरनेवाला त्याग दें और नमूना को नए, पूर्व-गर्म, पूरक डीएमईएम / एफ-12 संस्कृति माध्यम में पुन: resppend करें।
    5. एक 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुओं में लेपित कवरलेट्स की आवश्यक संख्या रखने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें
      नोट: 1-सेमी तंत्रिका नमूना प्रति सभ्य कोशिकाओं के दो कुओं की गणना मजबूत संस्कृति विकास को बढ़ावा देता है।
    6. प्रत्येक में संस्कृति युक्त माध्यम के 1 एमएल जोड़ें24-अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से नामित
    7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
  3. तीसरा दिन
    1. यदि कुओं में महत्वपूर्ण मलबे का उल्लेख किया गया है, तो नए पूरक डीएमईएम / एफ-12 संस्कृति माध्यम के माध्यम से सावधानीपूर्वक मिडिय़ों को ध्यान में रखते हुए, पक्षपाती कोशिकाओं को खारिज नहीं करने के लिए सावधानी बरतें। यदि नहीं, तो प्लेट को इनक्यूबेटर पर वापस करें और 5 दिन पहले पहली बार माध्यम बदल दें।
  4. दिन 5-7 और बाद में
    1. हर 3 दिनों में मध्यम बदलें।

7. वी.एस. और जीएएन ऊतक निर्धारण

  1. पिपेट 1-1.2 एमएल का 4% पैराफॉर्मालैडाइहाइड (पीएफए; सावधानी) एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में है।
  2. पीबीएस (चरण 1.2.3) के साथ ट्यूमर या तंत्रिका को धोने के बाद, 4% पीएफए ​​में ऊतक का एक छोटा टुकड़ा (लगभग 3 मिमी 3 वी.एस. या 5 एमएम लंबाई जीएएन) स्थानांतरित करें और 4 डिग्री पर एक प्रकार के बरतन पर ट्यूब रखें सी। यह सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से टी में डूबे हुए हैंवह समाधान
  3. कम से कम 2 एच निर्धारण के बाद, ट्यूब के ट्यूब को टकराने से पुनः प्राप्त करें और आगे की प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ें ( जैसे, पैराफिन में एम्बेडिंग या बाद में इम्यूनोहिस्टोकेमिसरी या इम्यूनोफ्लोरेन्सेंट के लिए इष्टतम काटने के तापमान मिश्रित (ओसीटी)) 22 , 23 , 24 । वैकल्पिक रूप से, ऊतक स्नैप-फ्रोजन हो सकता है, जैसा कि पहले 25 , 26 वर्णित है।

8. ट्रांस्लेबलिन वी.एस. रसीक्शन के दौरान मानव पेरिल्मिप का संग्रह और संग्रहण

  1. बर्फ पर तीन बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब रखें।
    नोट: संदूषण के मामले में एक ट्यूब को बैकअप के रूप में रखा जाएगा।
  2. पीबीएस समाधान के लगभग 1.2 एमएल के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब भरें जो कि 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके दो बार फ़िल्टर किया गया है।
    नोट: एक ट्रांसमिलेनेविना वी.एस. लकीर के दौरान पेरिल्मिप को इकट्ठा करने के लिए, सर्जन को पहले यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सर्जरीकैलोरी क्षेत्र अस्थि धूल, खून, या खारा से मुक्त है। इस उद्देश्य के लिए सर्जन गैर-प्रभावी हाथ में एक Schuknecht 21 या 24 जी चूषण ट्यूब का उपयोग कर सकते हैं।
    पेरुइल्फ़ को निकालने के लिए एक विशिष्ट स्थान पार्श्व सेमीकिरिक्यूलर नहर है (हालांकि, सर्जन की वरीयता के आधार पर, बाद में अर्धवृत्त नहर या गोल खिड़की झिल्ली तक पहुंचा जा सकता है)। सर्जन को अर्धवर्ध खड़ी की नीली रेखा ( यानी, झिल्लीदार भूलभुलैया) की पहचान करने के लिए एक हीरे की बुरी (सतत सक्शन सिंचाई का उपयोग करते हुए) के साथ गलियारे की हड्डी को ध्यान से हटा देना चाहिए। अर्धवृत्त नहर एक 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज से जुड़ी एक लंबी 27 जी सुई का उपयोग करके नीली रेखा के माध्यम से प्रवेश कर लेता है।
  3. शल्य चिकित्सक से धीरे-धीरे एक छोटी राशि की सांस लेने की सलाह लें और फिर शल्य चिकित्सा नर्स को सिरिंज और संलग्न सुई दे।
    नोट: आमतौर पर, पिरियिल्म या उससे कम की एक बूंद एकत्रित की जाती है। यदि मनाया मात्रा बड़ा है, तो नमूना संभवतः अन्य च के साथ दूषित हो सकता हैLUID।
  4. तैयार, खाली 1.5 एमएल ट्यूब और सीधे पीबीएस से भरा ट्यूब खोलने के लिए उपयोग करें। उन्हें खोलते समय ट्यूब लिड्स के अंदर स्पर्श न करें।
  5. सर्जरी नर्स से सिरिंज और संलग्न सुई प्राप्त करें और पूरी तरह से खाली ट्यूब में तरल पदार्थ को शुद्ध करें, ध्यान रखें कि ट्यूब को सुई के साथ स्पर्श न करें।
  6. सिरिंज से सुई को ध्यान से अलग करें सुई की टिप को दूषित न करें और इसे एक हाथ में रखें।
    नोट: सुप्रीममापी की एक बहुत छोटी मात्रा एकत्र की गई है, इसलिए कुछ तरल सूई के लंबे टिप में रह सकते हैं।
  7. दूसरी तरफ, सिरिंज के शरीर में तैयार ट्यूब से 0.2 एमएल की फ़िल्टर्ड पीबीएस समाधान चूसने के लिए सिरिंज (सुई के बिना) का उपयोग करें।
  8. सिरिंज के लिए सुई को फिर से बनाएं पूरी तरह से सुई टिप फ्लश करने के लिए बाँझ पीबीएस का उपयोग कर, perilymph युक्त ट्यूब में सिरिंज निकालना।
  9. पिरिल्म-पीबीएस युक्त ट्यूब और जगह बंद करें बर्फ पर
  10. एक कंफ़ेयर कंटेनर में सुई को निकालना
  11. जितनी जल्दी हो सके में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में perilymph युक्त ट्यूब रखें।

9. मानव सीएसएफ का संग्रह और संग्रहण

  1. बर्फ पर तीन (या अधिक) बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब रखें।
    नोट: एक ट्यूब संदूषण या एक नमूना मात्रा के मामले में बैकअप होगा जो उम्मीद से अधिक है।
  2. ड्यूरा मेटर खोलने के बाद, सर्जन से 3 एमएल सिरिंज (संलग्न सुई के बिना) के साथ सीएसएफ को इकट्ठा करने के लिए कहें।
    नोट: प्रदूषण को रोकने के लिए, सीएफएफ संग्रहण को ड्यूरा मेटर के उद्घाटन के तुरंत बाद ले जाना चाहिए।
  3. सर्जन से शल्य चिकित्सा नर्स को सिरिंज को हाथ में लेने के लिए कहें।
  4. सर्जरी नर्स से सिरिंज प्राप्त करें और ट्यूब (एस) में सीएसएफ की आवश्यक मात्रा को पूरी तरह से खाली करें।
  5. ट्यूब (ओं) को बंद करें और उन्हें बर्फ पर रखें
  6. जितनी जल्दी हो सके -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूब (ओं) को रखें।
ई "> 10. प्राथमिक वी.एस. कोशिकाओं के लिए वायरल पारगमन प्रयोग

  1. संदर्भ के रूप में वायरल स्टॉक एकाग्रता का उपयोग करना, प्रस्तावित पारगमन प्रयोग के लिए वांछित जीनोम गणना (जीसी) संख्या और संक्रमण की बहुगुणता (एमओआई) की गणना करना; वायरस स्टॉक सीधे पूरक संस्कृति माध्यम में पतला किया जा सकता है।
    नोट: प्राथमिक सेल ट्रांसडक्शन के लिए उपयुक्त कोई वायरल वेक्टर इस्तेमाल किया जा सकता है; लैंडेगर एट अल देखें (2017) छह अलग एडीनो-संबंधित वायरस serotypes 27 की एक विस्तृत तुलना के लिए इसके अतिरिक्त, जब प्राथमिक मानव कोशिकाओं को संवर्धन किया जाता है, तो सेल की गणना विशेष रूप से कसरत पर चढ़ने से पहले नहीं की जाती है। प्राइमरी वी.एस. कोशिकाओं ने ट्रिप्सिनाइजेशन और पेसिजिंग के लिए अच्छी तरह से प्रतिक्रिया नहीं दी है, इसलिए एक विश्वसनीय एमओआई गणना के लिए, एक चरण विपरीत सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके अच्छी तरह प्रति पक्षपात्र कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, अगर कोशिका संगम के करीब होती हैं, तो उनकी संख्या को मानक सेल घनत्व मानों का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से अनुमान लगाया जा सकता हैएक 24 अच्छी तरह से थाली ( जैसे, 5 x 10 4 प्रति सेल प्रति अच्छी तरह से)।
  2. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत 15 एमएल शंक्वाकार प्रयोगशाला ट्यूब में वांछित वायरस युक्त पूरक माध्यम तैयार करना, जैसे कि वायरस युक्त माध्यम का 1 एमएल ट्रांसडुस्ड होने वाले प्रत्येक कुएं के लिए तैयार किया जाता है। वायरस युक्त मध्यम ऊपर और नीचे पिपेट करें, लेकिन धीरे से अच्छी तरह से मिश्रण करें।
  3. बाँझ संदंश का प्रयोग, मूल 24-अच्छी तरह से प्लेट से एक नई 24-अच्छी तरह से थाली में प्राथमिक वी.एस. कोशिकाओं (चरण 5.2.8) युक्त कवरलाइट स्थानांतरण करें प्रत्येक व्यक्तिगत कंसलिप के हस्तांतरण के बाद, 1 एमएल वायरस युक्त माध्यम जोड़ें। प्रत्येक समय माध्यम को प्लेट में घुमाइये, यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा जाता है कि कोशिकाओं को वायरस से समान रूप से लेपित किया जाता है।
  4. नियोजित प्रयोग की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 सेते हैं।
    नोट: 48-120 घंटे से लेकर इन्क्यूबेशन्स सभी को दिखाए गए पारगमन परिणाम 27 दिखाए गए हैं।

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Representative Results

संस्कृति में प्राथमिक मानव वी.एस. कोशिकाओं, जैसा कि धारा 5 में स्थापित किया गया है, कई डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोगों ( चित्रा 1 ) में रोग से संबंधित प्रक्रियाओं के लिए जानकारीपूर्ण मॉडल के रूप में माना जा सकता है। अनुभाग 6 में सुसंस्कृत स्वस्थ श्वाइन कोशिकाओं की तुलना में प्रत्यक्ष और शिक्षाप्रद बिंदु उपलब्ध है। जैसा कि नीचे उल्लिखित है, इस एकीकृत पद्धति ढांचे के अनुसार प्रोसेस किए गए वीएस और जीएएन के व्यापक आंकड़े पहले प्रकाशित 12 , 13 , 14 , 15 , 27 के कई लेखों में उपलब्ध हैं।

जीन थेरेपी के लिए एडीनो-संबंधित वायरस के साथ प्राथमिक वी.एस. कोशिकाओं के सफल पारगमन को पहली बार ( चित्रा 2 ) के लिए प्रस्तुत किया गया है। प्राइमरी वी.एस. कोशिकाओं को संस्कृति में परिवर्तित किया गया था Ith जीएफपी-व्यक्त एएनसी 80, एडीनो-संबंधित वायरस के पूर्वानुमान वाले पूर्वजों 28 एएनसी 80 को इन विट्रो और विवो में murine cochlear ऊतकों में जीन ट्रांसफ़र के लिए एक अधिकतम कुशल वेक्टर दिखाया गया है। इस वेक्टर के साथ प्राथमिक मानव कोशिकाओं के प्रभावी पारगमन के लिए वी.एस. के लिए जीन थेरेपी में भविष्य के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्राइमरी मानव वेस्टिबुलर श्वानोमा कल्चर के उज्ज्वल फील्ड चित्र
संस्कृति में वी.एस. कोशिकाओं के संगठन में विशिष्ट पैटर्न की पहचान की जा सकती है। स्केल बार = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 2: प्राइमरी मानव वेस्टिबुलर श्वानोमा संस्कृतियों की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवि जीपीपी-व्यक्त एसी 80 को 48 घंटे के लिए 250,000 के संक्रमण की बहुरूपता (एमओआई) पर एक्सपोजर के बाद
हरा = जीएफपी; लाल = फालोइडिन / एफ-एक्टिन (साइटोस्केलेटन का दाग); नीले = डीएपीआई (नाभिक दाग) स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन (ए) और 100 माइक्रोन (बी) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यह पांडुलिपि, वी.एस. अनुसंधान के लिए एक एकीकृत पद्धतिगत रूपरेखा का वर्णन करता है, जो डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए मानव वीएस और जीएएन नमूनों की एक साथ प्रसंस्करण को रूपरेखा करता है। जैसा कि वी.एस. अनुसंधान सटीक चिकित्सा की आयु में प्रवेश करता है, कई शोध प्रश्नों के उत्तर देने में सक्षम रूपों में समान नमूना तैयार करने से व्यक्तिगत रोगियों के लिए विशिष्ट आणविक, सेलुलर, आनुवांशिक, और प्रोटिओमिक अंतर्दृष्टि की खोज सक्षम हो सकती है।

मानवीय श्वान सेल और वी.एस. संस्कृतियों की शुद्धता को समय-समय पर इम्यूनोसायटोकैमिस्ट्री के माध्यम से अच्छी तरह से मूल्यांकन किया गया, जो एसएपीएस मार्कर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग करके डीएपीआई परमाणु दाग 1 के लिए सकारात्मक है। तदनुसार, कोशिकाओं को चढ़ाने के बाद पहले दो सप्ताह के भीतर प्राथमिक मानव श्वान सेल संस्कृतियों पर प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि इस अवधि के दौरान इन कोशिकाओं की शुद्धता उच्चतम है; बाद में, फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को प्रबल होना शुरू होता है। तुमघ। वी। एस। सेल संस्कृतियां संस्कृति में दो सप्ताह में अधिकतर शुद्ध हैं, वी.एस. कोशिकाओं में संपर्क-मध्यस्थता निरोधक की कमी होती है और बाद के चरणों में इसे जारी रहेगा। इसके अतिरिक्त, एक समान ट्यूमर (सेक्शन 5) से वी.एस. ऊतक (खंड 4) और संस्कृति में वी.एस. कोशिकाओं से प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक सीधी माइक्रोएरे की तुलना सफलतापूर्वक दर्शाती है कि वी.एस. संस्कृतियां अपने संबंधित माता-पिता ट्यूमर 19 को एक संतोषजनक उच्च स्तर की जैविक समानता का प्रदर्शन करती हैं। ब्याज की प्रोटीन की सफल मात्रा का ठहराव धारा 4 में उत्पन्न प्रोटीन लाइसिस के पश्चिमी धब्बा के माध्यम से किया जा सकता है और आरएनए स्थिरीकरण समाधान (खंड 2) 12 , 13 , 14 के साथ संरक्षित ऊतकों से प्राप्त आरएनए के क्यूआरटी-पीसीआर के माध्यम से आरएनए टेप की मात्रा का ठहराव।

संस्कृति में वी.एस. और जीएएन कोशिकाओं को रासायनिक रूप से सक्रिय पदार्थों के संपर्क में लाया जा सकता है, जैसे कि नॉनटेरायडियल एंटी-इन्फ्लोमैट्री ड्रग्स, स्मलएल रोग-विशिष्ट आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए या चिकित्सीय लक्ष्य 13 , 14 , 2 9 का परीक्षण करने के लिए आरएनए (सीआरएनए), या प्राकृतिक जैविक यौगिकों को दखलता है। नियमित पूरक संस्कृति माध्यम में उचित मात्रा के बाद रुचि के संयुग्मों को सीधे संस्कृति में कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है। सेलुलर फिजियोलॉजी, ब्रोमोडीयोक्वायरिडिन (ब्रडयू) के प्रसार के लिए लेबलिंग, टर्मिनल डीओक्सीन्यूक्लियोडिडाइड ट्रॅनफेरेस डीयूटीपी निक एंड लेबलिंग (टीएनईएल) एपोप्टोसिस के लिए, और 3- (4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल) के महत्वपूर्ण पहलुओं पर इस तरह के पदार्थों के प्रभाव का आकलन करने के लिए - चयापचय व्यवहार्यता के लिए 2,5-डीफिनेलेटेट्रोजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) में कमी विश्वसनीय विश्वसनीय हैं जो कि इन कोशिकाओं पर आत्मविश्वास के साथ प्रयोग किया जा सकता है। इलाज कोशिकाओं के माध्यम से संस्कृति का ध्यान भी -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और प्रोस्टाग्लैंडीन ई 2 जैसे स्रावित पदार्थों के सापेक्ष स्तर को मापने के लिए जांच की जाती है, जिसमें से सी का स्राव होता हैएक दवा के उपचार से प्रभावित 13 इसके अतिरिक्त, ऊतक निर्धारण (खंड 7) और बाद में ओसीटी या पैराफिन में एम्बेडिंग immunofluorescence assays 13 , 14 के लिए एक मजबूत सब्सट्रेट प्रदान करता है।

खंड 3 में उत्पन्न ट्यूमर या तंत्रिका-वातानुकूलित माध्यम, वी.एस.-स्रावित घुलनशील अणुओं का आकलन करने और बाह्य कोशिकाओं को निकालने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करता है। साइटोकाइन सरण या एलिसा इन स्राक्रनों पर किया जा सकता है, जैसा कि निर्माता के प्रोटोकॉल में दर्शाया गया है, दो प्रकाशित अध्ययन 9 , 12 में उल्लिखित पिछले प्रकाशन 30 में बताए गए अनुसार, विस्तारित कोशिकाएं इन स्राक्रनों से अतिसंवेदनशीलता का उपयोग कर शुद्ध हो सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, स्राव स्वयं का उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए रोगी-विशिष्ट अभिकर्मकों के रूप में किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक प्रयोग में जो सम्मान करता हैवी.एस. से जुड़े संवेदी सुनवाई हानि के तहत एक उपन्यास तंत्र का सृजन किया गया, 72 घंटे (धारा 3) के लिए डीएमईएम में ऊष्मायन के बाद अच्छी सुनवाई वाले वीएस के मरीज़ों की सुनवाई और वी.एस. रोगियों के वी.एस. ऊतक से स्राव एकत्र किया गया। ये ट्यूमर स्राव तब मुरुइन कोक्लेयर स्पंटर्स के लिए लागू किया गया था, और यह पता चला था कि वी.एस. के रोगियों के खराब सुनवाई से ट्यूमर स्राव, सुनवाई 15 के साथ वी.एस. मरीजों से स्राव की तुलना में कॉक्लेयर स्पष्टीकरण को अधिक नुकसान पहुंचाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि 72 घंटों से पहले समय पर इकट्ठा होने वाले स्राव में पर्याप्त क्षति नहीं होती है।

मानव संकीर्णताएं ट्रांसमिलेनेन वीएस रेसक्शन (धारा 8) से गुजरने वाले रोगियों से एकत्रित की गईं, वी.एस. बायोमकारर्स की खोज के लिए एक रोमांचक नए एवेन्यू का प्रतिनिधित्व करती हैं। धारा 8 के अनुसार इकट्ठा किए गए नमूनों को मानव क्रोमेट्फ़ के प्रोटीम को मैप करने के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास-स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) के माध्यम से विश्लेषण किया गया और वीएस के 15 उम्मीदवारों को सफलतापूर्वक सफलता मिलींदांतयुक्त 31 इसी तरह का विश्लेषण संभवतः वी.एस. मरीजों (सेक्शन 9) से प्राप्त मानव सीएसएफ का उपयोग करना संभव हो सकता है।

वी.एस. शोध में एक महत्वपूर्ण विचार उचित नियंत्रण ऊतक का चयन है। पिछला अध्ययनों में क्रैकर तंत्रिका, वास्टिबुलर तंत्रिका और असंबंधित परिधीय तंत्रिका (जैसे सियाटिक तंत्रिका) का इस्तेमाल किया गया है, जो कि चर प्रभाव 22 , 32 है । हालांकि, कई कारणों से अधिक से अधिक प्रासंगिक नियंत्रण 15 के रूप में जीएएनएस के उपयोग के समर्थन के लिए आगे बढ़ जाता है। वेस्टिबुलर तंत्रिका के समान, जीएएन एक परिधीय, संवेदी तंत्रिका है, जो श्वाइन कोशिकाओं द्वारा बनाए गए एक्सॉन्स होते हैं। महत्वपूर्ण बात, एक साहित्य खोज से पता चलता है कि schwannomas जीएएन से विकसित करने के लिए कभी नहीं पाया गया है, इस ऊतक में neoplastic परिवर्तन असंभव बनाने के लिए इसके अतिरिक्त, गहन गर्दन की संरचनाओं तक पहुंचने पर जीएएन का नियमित रूप से बलिदान किया जाता है, अस्पताल-आधारित शोधकर्ताओं को स्वास्थ्य तक आसानी से पहुंच प्रदान करते हैंनियमित रूप से गर्दन के विच्छेदन और parotidectomies के दौरान y नमूनों। हालांकि, व्हीएस सर्जरी के दौरान कॉक्रेलर तंत्रिका का प्रायः बलिदान किया जाता है और आसानी से उपलब्ध हो सकता है, वस्टीब्युलर नसों के करीब निकटता एक ही माइक्रोएनेयरमेंट को साझा करने का जोखिम रखता है, जो पूर्व-ट्यूमरस आणविक परिवर्तनों का प्रदर्शन कर सकता है। अन्य प्रयोगशालाओं ने भी वी.एस. अनुसंधान के लिए पर्याप्त नियंत्रण के रूप में जीएएन का सफलतापूर्वक उपयोग किया है, और इस अभ्यास को जारी रखने की सिफारिश की है 20 , 21 , 22 , 34

सेल प्रकार-विशिष्ट संस्कृति प्रोटोकॉल (खंड 5 और 6) के भीतर एक महत्वपूर्ण लेकिन अक्सर अनदेखी की गई कदम गैर-व्यवहार्य ऊतक और रक्त वाहिकाओं को उचित हटाने है। अधिकतर शुद्धता के मजबूत संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए इन गैर ट्यूमर के ऊतकों को निकालना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जब सेल-युक्त संस्कृति माध्यम को coverslips पर चढ़ाना, यह महत्वपूर्ण है किप्रत्येक कूच में तस्सी की मात्रा पर ध्यान देना प्रत्येक कुएं में घनीभूत ऊतकों के कुछ "विखंडू" वाली कोशिकाओं का एक भी, हल्का घने वितरण हासिल करना विशेष रूप से श्वाइन कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, जिसके लिए पर्याप्त संख्या में सहायक कोशिकाओं को विकसित करना आवश्यक है। पॉली-डी-लाइसिन और लेमीनिन के साथ कवरलेट कोटिंग को कोशिकाओं के कुशल विकास की अनुमति भी मिलती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व-लेपित उत्पादों की तुलना में, जब तकरीबन प्रयोगशाला में लेपित होते हैं, तब कोशिकाओं को अधिक मजबूती से पैदा होता है।

उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन और आरएनए निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए, यह सत्यापित करें कि खंड 2 और 4 के तहत तापमान 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे रहता है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि वी.एस. स्राव के विश्लेषण के बारे में साहित्य दुर्लभ है (खंड 3), नई परियोजनाओं की आवश्यकता हो सकती है आगे नवाचार और ऊष्मायन के विभिन्न लंबाई।

जैसा कि वी.एस. पैथबायोलॉजी को संबोधित करने के तरीकों को आगे बढ़ना जारी है, इस str का उपयोगमौलिक तकनीकों के एक संयोजन के अनुसार, एक मानव नमूने से अधिक मात्रा में जानकारी एकत्र की जा सकती है। वीएस और जीएएन के ऊतकों की सूचित युगपत प्रसंस्करण इस दुर्बल ट्यूमर के खिलाफ प्रभावी औषधीय और आनुवांशिक उपचार की तैयारी के लिए अभिन्न साबित होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेफनेस एंड अदर कम्युनिकेशन डिसऑर्डर ग्रांट आरएपीडीसी 015824 (केएमएस) और टी 32 डी सी 200038 (जेईएस और एसडी) का समर्थन, डिपार्टमेंट ऑफ डिफेन्स ग्रांट डब्ल्यू81 एक्सडब्ल्यूएच -14-1 -00 9 1 (केएमएस), बर्टारेली फाउंडेशन (केएमएस) , नैन्सी साइल्स डे फाउंडेशन (केएमएस), लाउर टिनिटस रिसर्च सेंटर (केएमएस), और बार्न्स फाउंडेशन (केएमएस)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning 354087 Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm Greiner Bio-One 628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered Sigma-Aldrich C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile Corning 3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
DMEM/F-12, 500 mL Thermo Fisher Scientific 11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11231-30 Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox Fine Science Tools 11251-20 Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile EMD Millipore SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023 Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL Thermo Fisher Scientific 15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets Roche 04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific 88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL Variable Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes E&K Scientific EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in BD 301629
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution) Thermo Fisher Scientific AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL Hospira 0409-1966-05
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge Bausch + Lomb N1698 42 Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ Medline DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss 000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. BD 309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL BD 309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL BD 309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe Cole-Parmer CP25013

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References

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Landegger, L. D., Sagers, J. E., Dilwali, S., Fujita, T., Sahin, M. I., Stankovic, K. M. A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research. J. Vis. Exp. (124), e55827, doi:10.3791/55827 (2017).

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