La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.
La creciente evidencia apunta a la autofagia como un proceso regulador crucial para preservar la homeostasis de los tejidos. Se sabe que la autofagia está implicada en el desarrollo y regeneración del músculo esquelético, y el proceso autofágico ha sido descrito en varias patologías musculares y trastornos musculares relacionados con la edad. Un bloque recientemente descrito del proceso autofágico que se correlaciona con el agotamiento funcional de las células satélites durante la reparación muscular apoya la noción de que la autofagia activa se combina con la regeneración muscular productiva. Estos datos revelan el papel crucial de la autofagia en la activación de las células satélite durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas, como las distrofias musculares. Aquí, proporcionamos un protocolo para supervisar el proceso autofágico en el adulto Muscle Stem Cell (MuSC) compartimento durante el músculo regenerativas condiciones. Este protocolo describe la metodología de configuración para realizar imágenes de inmunofluorescencia in situ de LC3, aMarcador de utofagia y MyoD, un marcador de linaje miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones controlados y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el compartimiento MuSC, que desempeña un papel central en la orquestación de la regeneración muscular.
La regeneración del músculo esquelético es el resultado de la interacción entre las células madre adultas (Muscle Satellite Cells, MuSCs) y otros tipos de células que intervienen en el proceso regenerativo. La homeostasis muscular y la funcionalidad se mantienen por las señales combinadas que surgen del nicho muscular y las señales sistémicas 1 , 2 . A lo largo de la vida, se han reportado cambios en la funcionalidad MuSC, el nicho muscular y las señales sistémicas, lo que conduce a la disminución de las capacidades funcionales en los ancianos 3 . MuSCs se establecen en un nicho por debajo de la lámina basal y, a la lesión muscular, se activan para reparar los músculos dañados [ 4 , 5] . Para asegurar una respuesta regenerativa productiva, es crucial que las MuSCs coordinen los diferentes procesos necesarios para que la salida de la quiescencia, la auto-renovación y la etapa de expansión proliferativa siganPor la diferenciación miogénica 6 . En los ancianos y en las enfermedades crónicas musculares, todas estas funciones están comprometidas, lo que conduce a la alteración de la funcionalidad muscular 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
La macroautofagia (denominada en lo sucesivo autofagia) está emergiendo como un proceso biológico crucial esencial para preservar la homeostasis tisular 14 . El proceso autofágico incluye mecanismos de tráfico, donde porciones de citoplasma, orgánulos y proteínas se envuelven en vesículas que eventualmente se degradan a través de la vía lisosoma, promoviendo la eliminación de moléculas tóxicas y el reciclaje de macromolCulos Esto proporciona compuestos ricos en energía para apoyar la adaptación de células y tejidos bajo estrés u otras condiciones adversas 15 , 16 . Junto con su actividad de supervivencia celular, la autofagia también puede funcionar como un inductor de la muerte celular, dependiendo del contexto del tejido celular ( por ejemplo, tejido normal frente al cáncer) y el tipo de estímulo de estrés 17 , 18 .
La evidencia reciente indica que la autofagia es necesaria para mantener la masa muscular y la integridad de la miofibra 19 , 20 y se ha reportado que está alterada en diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluyendo la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP> , 28 , 29 , 30. De igual modo, se ha observado una reducción progresiva del proceso autofágico en los ancianos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , después de una pérdida de masa muscular (denominada sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , y en la supervivencia de miofibras 38 .
Una relación estrecha entre la autofagia y el potencial regenerativo de los músculos esqueléticos fue anticipada por un estudio del laboratorio de Wagers, que mostró que una restricción de calorías mejora la disponibilidad y la actividad de MuSC [ 39] . Esto noLa reciente observación de que el eje Foxo3-Notch activa el proceso autofágico durante la auto-renovación [ 40] y la transición de MuSC desde el estado quiescente al estado de proliferación [ 41] . Estos datos concuerdan con la reducción progresiva de la autofagia basal de jóvenes a ancianos y geriátricos MuSCs, en asociación con el descenso numérico y funcional de MuSCs durante el envejecimiento [ 42] .
En un artículo reciente, demostró una estrecha relación entre la autofagia y la regeneración muscular compensatoria que distingue las primeras etapas de la progresión de la DMD. En consecuencia, se observó una reducción del flujo autofágico en etapas posteriores de la progresión de la enfermedad, cuando la regeneración muscular se ve comprometida y deposición de tejido fibrótico se produce. Curiosamente, se demostró que, en condiciones de regeneración, la autofagia se activa en MuSCs y que la modulación del proceso autofágico impacta la activación MuSC y fuNcionalidad 30 .
En conjunto, estos datos ponen de relieve la urgencia de explorar el proceso autofágico en MuSCs durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas ya lo largo de la vida. En este sentido, proporcionamos un protocolo para monitorear el proceso autofágico en MuSCs en condiciones de regeneración muscular mediante la realización in situ de inmunotinción para los microtúbulos asociados a la proteína 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador de autofagia [ 43] , y MyoD, un marcador de Miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones control y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el MuSC, que desempeña un papel clave en la orquestación de la regeneración muscular.
Este protocolo describe cómo monitorear la autofagia en las células madre del músculo esquelético durante la regeneración muscular compensatoria. Varios anticuerpos para la co-tinción de LC3 y MyoD fueron probados, y los que trabajan en las secciones de tejido de ratón y crear resultados exitosos se enumeran aquí (ver Tabla de Materiales ). La permeabilización con metanol (ver paso 3.2.2) es altamente recomendada para la tinción exitosa.
La limitación de est…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por NIAMS AR064873, Epigen Proyecto PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
BD Micro-Fine + 0,5 mL | BD | 324825 | |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Eukitt – Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO – Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |