Summary
Questo protocollo mira a presentare un metodo generale per la visualizzazione della lignina, della cellulosa e dell'emicellulosa nelle pareti delle cellule vegetali utilizzando l'analisi Raman e l'analisi multivariata.
Abstract
L'applicazione di Raman imaging alla biomassa vegetale è in aumento in quanto può offrire informazioni spaziali e compositive sulle soluzioni acquose. L'analisi di solito non richiede un'ampia preparazione dei campioni; Informazioni strutturali e chimiche possono essere ottenute senza etichettatura. Tuttavia, ogni immagine Raman contiene migliaia di spettri; Ciò solleva difficoltà quando estrae informazioni nascoste, soprattutto per i componenti con strutture chimiche simili. Questo lavoro introduce un'analisi multivariata per affrontare questo problema. Il protocollo stabilisce un metodo generale per visualizzare i componenti principali, tra cui la lignina, la cellulosa e l'emicellulosa all'interno della parete cellulare delle piante. In questo protocollo sono descritte le procedure per la preparazione del campione, l'acquisizione spettrale e l'elaborazione dei dati. È altamente dipendente dall'abilità dell'operatore durante la preparazione del campione e l'analisi dei dati. Utilizzando questo approccio, un'indagine di Raman può essere eseguita da un utente non specializzato per ottenere higI dati di qualità h e risultati significativi per l'analisi delle pareti cellulari delle piante.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Tagliare un piccolo blocco di tessuto (circa 3 mm x 3 mm x 5 mm) dal campione vegetale ( ad es. Un gambo di pioppo).
- Immergere il tessuto in acqua bollente di deionizzazione per 30 min. Trasferire immediatamente in acqua deionizzata a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti. Ripetere questo passaggio finché il tessuto non si affonda sul fondo del contenitore, indicando che l'aria nel tessuto è stata rimossa e che il tessuto si è ammorbidito.
Nota: Per i campioni che si affondano sul fondo prima di questo passaggio, ripetere generalmente questo ciclo 3-5 volte. - Preparare 20, 50, 70, 90% (v / v) aliquote di polietilenglicole (PEG) in acqua deionizzata, pure pure PEG e mantenere le soluzioni a 65 ° C.
- Incubare il tessuto in una serie di bagni PEG classificati per spostare l'acqua e consentire l'infiltrazione del PEG.
Nota: In genere, PEG con peso molecolare 2.000 (PEG2000) viene utilizzato per l'incorporamento.- Processare il tessuto con g(A) 20% PEG per 1h, (b) 50% PEG per 1,5h, (c) 70% PEG per 2h, (d) 90% PEG per 2 ore e E) 100% PEG per 10 h.
- Preriscaldare una cassetta a 65 ° C in un forno. Versare il PEG contenente il blocco nella cassetta e quindi posizionare il blocco di tessuto in una posizione desiderata utilizzando pinzette o aghi preriscaldati.
- Lentamente raffreddare la cassetta e conservare il tessuto in RT fino all'uso.
- Sezionare il blocco PEG contenente il tessuto bersaglio in un piccolo blocco (circa 1 cm x 1 cm x 2 cm) usando una lama raso tagliente e montarla sul microtomo.
- Tagliare le sezioni sottili dal blocco PEG (tipicamente 3-10 μm).
- Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro da orologio 10 volte per rimuovere la PEG dal tessuto.
- Immergere le sezioni con toluene / etanolo (2: 1, v / v) per 6 ore per rimuovere gli estrattivi. Preparare il liquido di reazione mescolando 65 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di acido acetico e 0,6 g di sodio chloRito in un bicchiere. Aggiungere una sezione e 3 ml di liquido di reazione a una fiala da 5 ml. Avvitare la parte superiore della fiala.
- Scaldare la fiala in bagno d'acqua a 75 ° C per 2 ore per rimuovere la lignina del tessuto. Sciacquare la sezione con acqua deionizzata in un vetro da orologio 10 volte.
- Trasferire la sezione non trattata / delignificata ad una vetrina del microscopio di vetro. Aprire con cura la sezione con spazzole o aghi. Rimuovere l'acqua extra deionizzata con carta velina.
- Immergere la sezione in D 2 O. Coprire il campione con una slitta di copertura in vetro. Sigillare il coperchio della copertura con smalto per prevenire l'evaporazione del D 2 O.
2. Acquisizione spettrale
- Aprire il software operativo dello strumento del microscopio Raman confocale. Accendere il laser (lunghezza d'onda = 532 nm), mettere a fuoco sulla superficie del silicio cristallino con un obiettivo microscopico 100X e fare clic sul pulsante di calibrazione per calibrare lo strumento.
- Spostare lo strumentoAlla modalità microscopica ottica e accendere la lampada del microscopio. Montare la diapositiva del microscopio sul palco, con la slitta di copertura rivolta verso l'obiettivo.
- Visualizzare il campione con un obiettivo del microscopio 20X e individuare l'area di interesse. Applicare olio di immersione sul coperchio e passare all'obiettivo del microscopio di immersione (60X, apertura numerica NA = 1,35). Focus sulla superficie del campione.
- Passare lo strumento alla modalità di prova Raman e spegnere la lampada del microscopio.
- Scegliere un'area di mappatura utilizzando uno strumento rettangolare. Modifica la dimensione del passo per determinare il numero di spettri ottenuti.
Nota: tenere presente la dimensione del passo (di solito più grande del diametro del punto calcolato dall'apertura numerica dell'obiettivo, teoricamente 1.22λ / NA). Le dimensioni sotto di questo provocheranno un oversampling. - Impostare i parametri ottimali di spettro per ottenere il miglior rapporto segnale / rumore (SNR) e qualità spettrale in un opportuno tempo di acquisizione (generalmente <8 h), depeSulla conformità del campione. In genere, immettere i parametri di imaging nel software dello strumento come nel seguente modo: laser (532 nm), filtro (100%), foro (300), fessura (100), spettrometro (1.840 cm -1 ), scanalature (1200t) Olio 60X) e tempo di acquisizione (2 s).
- Salvare i dati spettrali prima dell'elaborazione dei dati e convertirli in un formato universale ( ad esempio, file TXT).
3. Analisi dei dati
- Caricare i dati spettrali (file TXT) nel software di analisi dei dati ( ad esempio, Matlab). Applicare una tecnica di riduzione del rumore sul set di dati per migliorare il SNR ( ad esempio, l'algoritmo Savitzsky-Golay o l'algoritmo wavelet)
- Utilizzare campioni non trattati per produrre le immagini di lignina e polisaccaridi. Per l'imaging di lignina, considerare il picco spettrale di circa 1.600 cm -1 a causa della vibrazione simmetrica di stretching anulare. Per la formazione di polisaccaridi (inclusa la cellulosa e l'emicellulosa), utilizzare il picco spettrale aIntorno a 2.889 cm -1 a causa dei tratti CH e CH2.
- Utilizzare campioni delignificati per generare le immagini di cellulosa e emicellulosa. Eseguire la risoluzione della curva di auto-modellizzazione (SMCR) sugli spettri acquisiti per discriminare lo spettro di cellulosa e emicellulosa e per rappresentare le loro distribuzioni.
- Eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) e l'analisi clustering sui dati acquisiti per distinguere gli spettri Raman da diversi strati di parete cellulare.
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Representative Results
La figura 1 presenta una panoramica di un tipico sistema micro-Raman per l'imaging Raman di una parete cellulare. Ad esempio, gli spettri Raman originali del pioppo ( Populus nigra L.) presentano significative derive e spicchi di base ( Figura 2a ). Dopo aver eseguito il metodo automatico di pre-elaborazione per il set di dati Raman Imaging (APRI), questi due contaminanti spettrali vengono eliminati con successo ( Figura 2b ). Un tipico spettro di Raman di pioppo è mostrato in Figura 3 e le sue assegnazioni di banda sono elencate nella Tabella 1 . L'immagine Raman di lignina è generata dall'integrazione della regione spettrale da 1.550-1.650 cm -1 , attribuita alla struttura anulare aromatica ( Figura 4a ). La Figura 4d mostra l'immagine Raman di polisaccaridi, whIch viene raggiunto integrando il picco a 2.889 cm -1 . Per l'immagine della cellulosa e dell'emicellulosa, SMCR viene eseguita sui dati di Raman di un campione delignificato. Gli spettri e le immagini corrispondenti sono mostrati in Figura 5 . La Figura 6 presenta i risultati ottenuti mediante analisi PCA e clustering.
Figura 1: Schema di Raman Imaging per la parete cellulare delle piante. Il campione di sezione (pioppo come esempio) è misurato da un sistema micro-Raman che accoppi un microscopio ottico a uno spettrometro ad alta risoluzione Raman con un rilevatore di un dispositivo accoppiato a carica (CCD). Nell'immagine a campo luminoso, la parete cellulare è organizzata nell'angolo della cella (CC), nella lamella centrale composta (CML) e nella parete secondaria (SW). Convenzionale, un'immagine Raman viene generata da singolo piccoIntegrazione o intensità. Nei dati originali si trovano due contaminanti spettrali ( vale a dire, derive di base e spike cosmiche). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La Raman Spectra Prima ( a ) e Dopo ( b ) Pre-elaborazione da APRI. Due contaminanti spettrali sono stati rimossi con successo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Un tipico spettro Raman della parete cellulare delle pioppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini Raman di Lignina ( a ) e Polisaccaridi ( b ) all'interno della parete cellulare delle pioppi. L'immagine della lignina viene generata integrando il picco intorno a 1.600 cm -1 . L'immagine della polisaccaride è prodotta integrando il picco intorno a 2.889 cm -1 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini Raman di cellulosa ( a ) e emicellulosa ( b ) all'interno della parete cellulare delle pioppi. La SMCR viene eseguita sui dati di Raman di un campione delignified. La delignificazione contribuisce all'esposizione delle caratteristiche spettrali di cellulosa e emicellulosa. La cellulosa è prevalentemente concentrata nel SW, mentre la distribuzione dell'emicellulosa è quasi uniforme per tutta la parete cellulare delle pioppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati PCA e clustering analisi per identificare automaticamente diversi livelli di parete cellulare nella parete cellulare delle pioppi. Usando PCA e analisi clustering, gli spettri sono divisi in quattro parti corrispondenti al lumen cellulare, CC, CML e SW. Lo spettro medio di questi strati è riportato di seguito. I risultati hanno rivelato che la lignina è concentrata lungo il CML e nel CC, mentre i polisaccaridi sono per lo più concentrati nel SW. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Wavenumbers (cm -1 ) | componenti | assegnazioni |
| 1.095 | Cellulosa, emicellulosa | Atomo pesante CC e CO che allunga le vibrazioni |
| 1.123 | Cellulosa, emicellulosa | Atomo pesante CC e CO che allunga le vibrazioni |
| 1.163 | Cellulosa, emicellulosa </ Td> | Atomo pesante CC e CO che si estendono vibrazioni più HCC e HCO piegamento vibrazioni |
| 1.275 | La lignina | ArilO di aril OH e aril O-CH3; Anello guaiacile con gruppo C = O |
| 1.331 | Lignina, cellulosa, emicellulosa | HCC e HCO piegando le vibrazioni |
| 1.378 | Cellulosa, emicellulosa | HCC, HCO e HOC piegando le vibrazioni |
| 1.460 | Lignina, cellulosa, emicellulosa | HCH e HOC piegando le vibrazioni |
| 1.603 | La lignina | Anello arile che si estende vibrazioni, vibrazioni simmetriche |
| 1.656 | La lignina | Anello coniugato C = C vibrazione di stretching dell'alcool coniferiero; C = O vibrazione di allungamento della coniferadeide |
| 2.889 | C, H | CH e CH 2 |
| L, C, H | CH che estende la vibrazione in vibrazioni asimmetriche OCH 3 |
Tabella 1: Posizioni di Raman Peak e assegnazioni di banda
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Discussion
La parete cellulare è un composito organizzato in diversi strati, tra cui l'angolo di cella (CC), la parete secondaria (SW, con gli strati S1, S2 e S3) e la lamella centrale composta (CML, lamella centrale e principale adiacente Parete) che rende difficile ottenere una superficie piana durante la preparazione del campione. Pertanto, i campioni di piante, in particolare l'erba, che hanno una struttura più complessa del legno, spesso devono essere solidificati per consentire una sezione sottile. PEG è una matrice duro ideale per la ricerca di taglio e Raman, in quanto è solubile in acqua. Può essere rimosso facilmente sciacquando con acqua deionizzata. Il PEG utilizzato per l'incorporazione ha diversi pesi molecolari, variabili da 1.000 a 20.000. Più alto è il peso molecolare del PEG, più bassa è la penetrazione 10 . D 2 O contribuirà a ridurre la fluorescenza della lignina e ha un picco significativo a 2.490 cm -1 , ma non eliminerà l'interferenza di fluorescenza. DueI principali segnali di rumore penetrano nei canali, insieme ai segnali reali: 1) la fluorescenza di campione e sfondo, così come le fluttuazioni termiche del CCD, possono portare a derive di base e 2) i raggi cosmici possono influenzare notevolmente i rivelatori sensibili che si manifestano in Spettri come picchi a larghezza di banda stretta. Il metodo APRI è stato sviluppato per affrontare questi problemi 11 . L'APRI comprende i piani adattativi ridotti in modo ridimensionato (airPLS) e l'analisi dei componenti principali (PCA) per eliminare le derive di base e le punte cosmiche usando le caratteristiche spettrali.
Per ottenere immagini di distribuzione, dovrebbe essere selezionata l'adattamento lineare dell'intensità / integrazione di picco e dell'intero spettro mediante metodi multivariati. Il primo è adatto ai componenti con picchi di Raman specifici ( ad es. Lignina), mentre quest'ultima è adatta ai componenti con sovrapposizioni spettrali molto forti ( es. Cellulosa e emicellulosa). Le distriLe immagini di lionina e polisaccaridi sono disponibili integrando le cime specifiche di circa 1.600 cm -1 e 2.889 cm -1 , rispettivamente (Figura 4). Tuttavia, le immagini di cellulosa e emicellulosa sono difficili da generare direttamente per l'integrazione di picco a causa della forte sovrapposizione spettrale. L'analisi multivariata permette di ordinare il contenuto informativo convogliato secondo l'ipotesi che i dati originali siano ricostruiti da un numero limitato di fattori significativi 12 . Può quindi essere applicato per discriminare i loro spettri e per produrre immagini Raman corrispondenti. Per i campioni di piante, la presenza di estratti e lignina interferisce con la capacità di ricostruire gli spettri di cellulosa e emicellulosa. È necessario rimuovere queste interferenze prima dell'analisi SMCR dei dati di imaging. SMCR è stato introdotto per la prima volta da Lawton e Sylvester come una tecnica multivariata sviluppata appositamente per risolvere un puro componente fUn insieme di spettri, senza ricorrere a una libreria spettrale, per analizzare i dati di imaging 13 . La classificazione spettrale è importante per comprendere ulteriormente la natura strutturale e chimica della parete delle cellule vegetali. Qui i dati di imaging sono stati sottoposti ad analisi di componenti principali (PCA) e analisi di clustering per distinguere gli spettri Raman da diversi strati di parete cellulare 14 .
Tuttavia, questa tecnica ha due limitazioni. In primo luogo, l'effetto Raman è debole: la tipica trasversa totale di Raman di dispersione è ~ 10-29 cm 2 per molecola, che lo rende vulnerabile alla fluorescenza intensa 15 . Un modo possibile per migliorare il difetto è preparando le sezioni il più debole possibile e applicando un algoritmo di correzione della linea di base, ma i segnali fluorescenti sono difficili da rimuovere. In secondo luogo, il trattamento chimico è una procedura significativa quando si ottengono immagini Raman di celluleUlose ed emicellulosi e può aumentare il rischio di cambiare il contenuto chimico originale. Pertanto, è meglio rimuovere le estrazioni e la lignina il più possibile, senza la struttura della parete cellulare che appare troppo diversa da quella non trattata.
In conclusione, questo protocollo è adatto allo studio della distribuzione di lignina, cellulosa e emicellulosa all'interno della parete delle cellule vegetali. L'utilizzo di immagini Raman per ottenere le informazioni desiderate dipende fortemente dall'abilità dell'operatore durante la preparazione del campione e l'analisi dei dati. Una buona preparazione del campione è essenziale per raccogliere spettri Raman di alta qualità. L'analisi dei dati appropriata fornisce approfondimenti sugli spettri su larga scala e estrae le informazioni nascoste dall'immagine. Come metodo fondamentale, questo protocollo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti dinamici dei principali componenti durante il trattamento chimico, fisico o biologico a livello micro.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2016YDF0600803) per il sostegno finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
