Summary
传统的平板凝胶电泳(SGE)实验需要复杂的装置和高的化学消耗。这项工作提出了一个协议,描述了一种在短时间内分离DNA片段的低成本方法。
Abstract
板状凝胶电泳(SGE)是分离DNA片段的最常用方法;因此,它广泛应用于生物学等领域。然而,传统的SGE协议相当乏味,实验需要很长时间。此外,SGE实验中的化学消耗量非常高。这项工作提出了一种基于SGE芯片分离DNA片段的简单方法。该芯片由雕刻机制成。两个塑料片用于光信号的激发和发射波长。通过智能手机收集DNA条带的荧光信号。为了验证该方法,分离出50,100和1,000bp DNA梯。结果表明,使用该方法可以在12分钟内解析出小于5,000bp的DNA梯度,分辨率高,表明它是传统SGE方法的理想替代品。
Introduction
板状凝胶电泳(SGE)是DNA片段分离最有效的方法1,2,3,4,5 ,因此被认为是生物化学和生物学分析中的通用工具6,7,8。然而,许多实验表明,SGE受到以下四个问题的限制:(1)分离需要很多小时甚至几天; (2)化学品消耗量非常高; (3)需要复杂的装置( 例如, 2D电泳池,电泳电源和凝胶成像系统); (4)实验完成后,凝胶成像系统只能观察分离的DNA片段。此外,SGE 9中通常使用的溴化乙锭(EtBr)ass =“xref”> 10,是致突变性和致癌性11,12 。因此,在装载含有EtBr的凝胶时,应始终佩戴手套。
与SGE相比,毛细管电泳(CE)具有许多优点,如自动操作,分离时间短,消耗量少等优点,13,14,15,16,17。然而,CE仪器相当昂贵。因此,为了克服这些限制,已经开发了一种用于分离DNA的系统( 图1 )。这样的系统不仅可以大大降低化学消耗,还可以节省SGE实验时间(<8分钟),而且可以通过智能手机对琼脂糖凝胶中的DNA分离过程进行实时跟踪。按照本协议中描述的程序,学生们可以可以设计和制造SGE芯片,在芯片中制备琼脂糖凝胶,用智能手机设置简单的SGE系统,并将DNA迁移过程记录在琼脂糖凝胶中。
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Protocol
SGE芯片的基本设计
- 使用任何透明塑料,如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯。
注:SGE芯片如图1B所示 。 SGE芯片由用于TBE缓冲器的圆柱形孔,用于DNA分离的通道和沿着电极孔嵌入的两条通道组成。 - 使用激光雕刻机在PMMA块中制造SGE通道阵列。
注意:芯片的几何参数取决于要分离的DNA的大小。例如,如果DNA片段小于1,000bp,则SGE芯片的最佳信道参数为2.5mm×4.0mm×90mm(宽×深×长)。 - 基于SGE设计,制造梳子以在芯片中创建用于加载DNA样品的孔。
2.琼脂糖凝胶的制备
- 通过混合10×TBE(1×TBE =89mM Tris,89mM硼酸和2mM EDTA; pH 8.4)和蒸馏水以1:19的比例。
- 制备1.0%琼脂糖凝胶,分离100-bp DNA梯。
注意:0.5x TBE缓冲液中琼脂糖的浓度取决于要分离的DNA片段的大小。 - 将0.1 g琼脂糖放入烧瓶中,加入10 mL 0.5x TBE缓冲液。
注意:制备溶液的体积应小于烧瓶容量的1/3。 - 用防腐膜密封烧瓶,然后在微波(培养基,1.0分钟)中加热琼脂糖/缓冲液混合物。在将烧瓶放入微波炉之前,在爆炸的情况下,在防腐膜中形成一些孔。
- 将2.7mL熔融的琼脂糖溶液倒入SGE芯片的4个通道。将梳子放入琼脂糖溶液中以形成孔。
注意:3分钟后,熔化的琼脂糖溶液将在室温下冷却至凝胶状态。 - 从g去除梳子并加入0.9mL 0.5x TBE缓冲液以覆盖凝胶。
3.在SGE芯片中运行电泳
- 打开LED光源,并在光源上方放置一条425至505 nm的带通滤光片。
- 使用涡旋器混合14.4μL的100bp DNA梯和1.6μL的SYBR Green。
- 在SGE芯片的琼脂糖凝胶的每个孔中加入4μL混合物( 图2 )。
- 将电极放入SGE芯片的两条通道。
- 在SGE芯片上方放置550至700 nm带通滤波器。
- 打开电源。将电压设置为180 V(20 V / cm)。打开智能手机记录DNA片段分离过程( 图3 )。
- 电泳10分钟后,关掉电源和LED灯。
- 清洁SGE芯片。
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Representative Results
图4 , 图5和图6代表了在50,100和1,000bp DNA梯级的凝胶电泳之后的典型结果。实验后,DNA片段分离良好。此外,在SGE芯片的4个通道中分离相同的样品,显示出相同尺寸的DNA片段在每个实验中移动相同的距离。
DNA梯度的分离性能可以通过分析迁移距离与DNA大小对数的关系进行评估;因此,SGE可用于计算未知DNA片段的大小。在图3中 ,发现当DNA大小小于700bp时,迁移距离与DNA大小的对数线性相关。
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图1 :原理 图 和图像。 ( A )实时跟踪DNA分离系统的示意图。它包括作为光源的LED阵列,光学滤波器和CGE芯片。智能手机可以记录DNA迁移过程。 ( B )SGE芯片。 ( C )组装电泳装置。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 :加载凝胶的学生。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图3 :在智能手机上记录迁移的学生。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 :在SGE芯片上分离50-bp DNA梯。 SGE芯片中的通道的几何参数为2.5 mm x 4.0 mm x 90 mm(宽x深x长)。分离电压为120 V. 请点击此处查看此图的较大版本。
图5 :在SGE芯片上分离100-bp DNA梯。 gSGE芯片中的通道的测量参数为2.5 mm x 4.0 mm x 90 mm(宽x深x长)。分离电压为120 V. 请点击此处查看此图的较大版本。
图6 :SGE芯片上1,000-bp DNA梯度的分离。 SGE芯片中通道的几何参数为3.6 mm x 4.0 mm x 90 mm(宽x深x长)。分离电压为180 V. 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
琼脂糖凝胶电泳广泛用于分离DNA,RNA和蛋白质。这项工作提出了一种替代传统凝胶电泳方法的新方法。结果表明,在这样一个小的组装装置中,50,100和1,000bp的DNA梯子可以很好地分离。该方法的优点在于不仅可以将化学消耗少的核酸分开,还可以记录分离过程。尽管DNA片段在图2中看起来很宽,但可以通过优化SGE芯片的参数和琼脂糖凝胶的浓度来改善结果。此外,如果在芯片中使用预制凝胶,则SGE工艺的总时间不超过10分钟。
如果芯片中的通道宽度发生变化,则DNA梯形图的分离性能会有很大差异。例如,当1,000bp的DNA梯子被分离时,DNA带看起来更宽通道的宽度很小。这可能是因为琼脂糖凝胶中的焦耳加热非常高18 ,这影响分离性能。
这里提出的SGE方法非常简单。如果系统被优化,则可以开发便携式迷你SGE设备。这样的设备可以应用于护理实验室测试。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢中国国家自然科学基金(21205078)和中国高等教育博士研究基金(No.20123120110002)的支持。这项工作得到了中国国家重点研究发展计划(2016YFB1102303),中国国家基础研究计划(973计划,2015CB352001)和国家自然科学基金(61378060)的部分支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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